一种含有抗 VEGF抗体的药物组合物 技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种药物 组合物， 更具体地， 本发明涉及含有抗 VEGF抗体和化疗药物的药物组合物， 及其在制备 抗癌药物中的用途。 背景技术

化疗药物是治疗癌症最常用的药物之一。 1943年， 耶鲁大学的 Gil man首先将氮芥应用于淋巴瘤的治疗， 揭开了肿瘤化疗的序幕。 直至今日， 获批上市的化疗药物已达上百种， 这些药物能杀死快速分 裂的细胞， 減小肿瘤的体积。 但是， 化疗药物有着较强的毒副作用， 在杀灭肿瘤的同时， 对增生活跃的骨髓、 胃肠道粘膜、 生殖细胞、 毛 发和肝、 肾等脏器均有不同程度的损伤， 更严重时会导致死亡。 据统 计， 因^:疗副反应及并发症引起的死亡率高达 3%~10%。 而且， 化疗 药物还容易产生耐药性， 随着治疗的持续， 癌细胞对化疗药物将不再 敏感。 另外， 大量临床数据表明， 化疗药物仅对特定的人群有良好的 抗肿瘤效果， 在其他人群中效果较差甚至无效。

血管内皮生长因子 ( vascular endothelial growth factor, 简称 VEGF ) 可在体内诱导血管新生。 血管的发生过程对于肿瘤的生长和 转移起着重要作用， 由于 VEGF在血管发生中起着重要的调节作用， 在肿瘤组织内、 外都可以大量分泌 VEGF; 肿瘤组织内的血管内皮细 胞表达 VEGFR明显高于正常内皮细胞。 因此 VEGF特异性抗体可以 显著抑制肿瘤组织的血管密度， 从而抑制肿瘤的生长和转移。

目前， FDA、 欧洲、 中国等国都批准了重组人源化鼠抗 VEGF单 克隆抗体 AVASTIN (安维汀， 贝伐珠单抗， 由美国 Genentech公司开 发的鼠源 VEGF单克隆抗体， 目前已在中国上市）用于治疗结直肠癌、 非小细胞肺癌等适应症。 CN 102002104A公开了一种抗 VEGF的单克 隆抗体， 其亲和力和抗肿瘤活性均优于 AVASTIN, 而且 i玄药物的上市 还将打破 AVASTIN的市场垄断， 降低治疗费用减少病人负担。 发明内容

本发明涉及一种药物组合物。 具体地， 本发明提供了一种包含抗 VEGF抗体和化疗药物的药物组合物， 以及该组合物在癌症治疗中的 用途。

因此， 一方面， 本发明提供一种药物组合物， 包含有效量的抗 VEGF抗体以及化疗药物。

所述抗 VEGF抗体重链可变区的 CDR具有 SEQ ID NO. SEQ ID N0.2和 SEQ ID NO.3所示的氛基酸序列， 和 /或其轻链可变区的 CDR 具有 SEQ ID N0.4、 SEQ ID NO.5和 SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

在一个实施方案中， 所述抗 VEGF抗体重链可变区氨基酸序列如 SEQ ID NO.7所示， 轻链可变区如 SEQ ID N0.8所示的氨基酸序列。 在另一个实施方案中， 所述抗 VEGF抗体的重链可变区由 SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列经过取代、 缺失和 /或添加一个或更多个氨基 酸衍生且与 SEQ ID NO. 7的氨基酸序列至少有 95%、 96%、 97%、 98% 或 99%的一致性， 且其轻链可变区由 SEQ ID N0.8所示的氨基酸序列 经过取代、缺失和 /或添加一个或更多个氨基酸衍生且与 SEQ ID NO. 8 的氨基酸序列至少有 95%、 96%、 97%、 98%或 99%的一致性， 且所 述抗 VEGF抗体具有特异性结合 VEGF的活性。

在一个实施方案中， 所述抗 VEGF抗体重链可变区氨基酸序列如 SEQ ID NO.9所示， 轻链可变区如 SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。 在另一个实施方案中， 所述抗 VEGF抗体的重链可变区由 SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列经过取代、 缺失和 /或添加一个或更多个氨基 酸衍生且与 SEQ ID NO. 9的氨基酸序列至少有 95%、 96%、 97%、 98% 或 99%的一致性， 且其轻链可变区由 SEQ ID NO.10所示的氨基酸序 列经过取代、缺失和 /或添加一个或更多个氨基酸衍生且与 SEQ ID NO. 10的氨基酸序列至少有 95%、 96%、 97%、 98%或 99%的一致性， 且 所述抗 VEGF抗体具有特异性结合 VEGF的活性。 在本发明的一个实施方案中， 所述抗 VEGF抗体为赛伐珠单抗， "赛伐珠单抗 "是指 CN102002104A 公开的抗 VEGF 的单克隆抗体 EPI0030, 由保藏编号为 CGMCC No.3233的细胞株产生。

在本发明的一些实施方案中 , 所述抗 VEGF抗体可以选自单链抗 体、 双链抗体、 嵌合抗体、 人源化抗体、 以及上述抗体的衍生物、 功 能等同物和同源物， 抗体的抗原结合片段和含有抗原结合结构域的 任 何多肽。

"化疗药物"是在癌症的治疗中使用的化合物，� ��何具有抗癌活性 的化疗药物可根据本发明使用。 所述化疗药物可以选自： 烷化剂， 如 尼莫司汀、 卡莫司汀、 洛莫司汀、 环磷酰胺、 异环磷酰胺和甘磷酰芥 等； 抗代谢药， 如去氧氟尿苷、 多西氟鸟啶、 5-氟尿嘧啶 （ 5-Fu ) 及 其衍生物、 巯嘌呤、 硫鸟嘌呤、 吉西他滨、 羟基脲、 曱氨蝶呤、 安西 他滨等， 其中所述 5-氟尿嘧啶衍生物选自替加氟、 卡莫氟、 去氧氟脲 苷、 阿托氟啶、 5-氟尿嘧啶二肽衍生物、 高分子 5-氟尿嘧啶等； 抗生 素， 如放线菌素 D、 多柔比星、 柔红霉素、 表柔比星、 丝裂霉素、 培 洛霉素、 平阳霉素、 吡柔比星等； 植物药， 如伊立替康、 三尖杉酯碱、 喜树碱、 羟基喜树碱、 长春瑞滨、 紫杉醇、 长春碱、 长春地辛、 长春 酰胺、 替尼泊苷、 依托泊苷等； 抗肿瘤激素药， 如阿他美坦、 阿那曲 唑、 氨鲁米特、 来曲唑、 福美坦、 甲他孕酮等； 门冬酰胺酶； L-天冬 酰胺酶； 铂类化疗药物， 如卡铂、 顺铂、 奈达铂、 奥沙利铂、 草酸铂 等； 维曱酸； 曱苄肼衍生物， 如丙卡巴肼等； 葸醌类， 如米托蒽醌等； 取代脲类， 如羟基脲等。

其中， 优选 5-氟尿嘧啶 （ 5-Fu ) 或其衍生物、 铂类化疗药物、 卡 培他滨、 紫杉醇、 多西他赛、 伊立替康和吉西他滨。 更优选， 选自 5- 氟尿嘧啶（5-Fu ) 或其衍生物如替加氟、 卡莫氟、 去氧氟脲苷、 阿托 氟啶、 5-氟尿嘧啶二肽衍生物、 高分子 5-氟尿嘧啶等、 铂类化疗药物 如卡铂、 顺铂、 奈达铂、 奥沙利铂、 草酸铂等。 最优选 5-氟尿嘧啶、 奥沙利铂和顺铂。

另一方面， 本发明提供上述的药物组合物在制备抗癌症药 物中的 用途。 所述癌症包括但不限于： 实体瘤， 淋巴瘤、 母细胞瘤、 肉瘤、 白血病或淋巴组织恶性疾病。 所述实体瘤更具体包括鳞状细胞癌 （如 上皮鳞状细胞癌）， 肺癌（包括小细胞肺癌、 非小细胞肺癌， 肺腺癌以 及肺鳞癌）， 腹膜癌、 肝细胞癌、 胃癌 （包括胃肠癌）， 胰腺癌， 神经 母细胞癌， 宫颈癌， 卵巢癌， 肝癌， 膀胱癌， 肝细胞癌， 乳腺癌， 结 肠癌， 结直肠癌， 子宫内膜癌或子宫癌， 唾液腺癌， 肾细胞癌， 前列 腺癌， 曱状腺癌， 外阴癌， 以及各种头颈癌等。 其中， 所述癌症优选 以下疾病： 结直肠癌、 乳腺癌、 非小细胞肺癌、 肾细胞癌、 胶质母细 胞瘤、 非霍奇金淋巴瘤、 黑色素瘤、 肝癌、 多发性骨髓瘤、 卵巢癌和 头颈部癌。 更优选地， 选自非小细胞肺癌和结直肠癌。 所述癌症可以 是转移性癌症。

本发明的优点在于，将有效量的抗 VEGF抗体以及化疗药物组合， 两者具有协同抗肿瘤的效果， 而且能显著降低化疗药物的毒副作用。 联合应用本发明的赛伐珠单抗和 5-Fu、 奥沙利铂或顺铂后， 疗效明显 提高； 尤其是， 赛伐珠单抗不但改善了小鼠的一般状态， 还明显降低 了 5-Fu、 奥沙利铂的致死性， 合用组未见小鼠死亡。 说明赛伐珠单抗 不但对 5-Fu、 奥沙利铂和顺铂有明显的增效作用， 还有潜在的减毒作 用。 发明概述

本发明提供的药物组合物， 是将有效量的抗 VEGF抗体和化疗药 物组合。 该药物組合物对癌症有显著的治疗效果， 而且能降低化疗药 物的毒性， 改善病人的一般状态。 組合物中的抗 VEGF抗体选自赛伐 珠单抗。 CN102002104A已经公开了赛伐珠单抗与 Avastin相比与 VEGF结合的亲和力更强， 在结肠癌 HCT-116细胞和人非小细胞肺癌 NCI-H460细胞模型上显示出了更为卓越的抗癌活� ��。 本发明的赛伐 珠单抗对人结肠癌 Ls-174t棵小鼠移植瘤的疗效优于 Avastin, 而且还 表现出了出乎意料优越的改善小鼠一般状态的 作用， 表现为荷瘤小鼠 体重增长； 相反地， Avastin给药组出现了体重下降的现象。 钕药物组合物对非小细胞肺癌和结直肠癌特别 有效， 对于乳腺 癌、 肾细胞癌、 胶质母细胞瘤、 非霍奇金淋巴瘤、 黑色素瘤、 肝癌、 多发性骨髓瘤、 卵巢癌和头颈部癌等癌症也有令人惊奇的效果 。

本发明的赛伐珠单抗和 5-氟尿嘧啶 （5-Fu ) 联合使用， 小鼠肿瘤 体积显著性的减小， 不仅如此， 对比 5-Fu组 5/6的死亡率， 合用组未 见小鼠死亡。 并且合用组小鼠体重回升， 一般状态良好。 本发明的赛 伐珠单抗和奥沙利铂的药物组合物显示了卓越 的抗肿瘤活性和出乎意 料的低毒性。 本发明的赛伐珠单抗和顺铂的药物组合也体现 同样的协 同抗肿瘤活性和毒性的降低。 术语与定义

除非另有定义， 本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术 人 员所理解的相同含义。 关于本领域的定义及术语， 专业人员具体可参 考 Current Protocols in Molecular Biology ( Ausubel )。 氣基酸残基的缩 写是本领域中所用的指代 20个常用 L-氨基酸之一的标准 3字母和 /或 1字母代码。

术语"抗体"和"免疫球蛋白"在本文中可以互换� �用。 这些术语均 为本领域技术人员所熟知的术语， 具体是指由能特异结合抗原的一种 或多种多肽构成的蛋白质。 抗体的一种形式构成了抗体的基本结构单 元。 这种形式是四聚物， 它由两对完全相同的抗体链构成， 每一对都 有一个轻链和一个重链。 在每对抗体链中， 轻链和重链的可变区联合 在一起共同负责结合抗原， 而恒定区则负责抗体的效应器功能。

目前己知的免疫球蛋白多肽包括 κ和 λ轻链， 以及 α, γ ( IgG IgG ₂ , IgG ₃ , IgG ₄ )， δ, ε和 μ重链或它们的其它类型等价物。 全长的 免疫球蛋白"轻链"（大约 25kDa或大约 214 个氨基酸）包含一个由 NH ₂ 末端上大约 110 个氨基酸形成的可变区， 以及一个 C00H末端上的 κ 和 λ恒定区。 全长的免疫球蛋白"重链"（大约 50kDa 或大约 446 个 氨基酸）， 同样包含一个可变区 （大约 116 个氨基酸） ， 以及重链恒 定区之一， 例如 γ (大约 330个氨基酸）。 术语"抗体"和"免疫球蛋白"包括任何同型体的� �体或免疫球蛋 白， 或保持与抗原特异结合的抗体的抗原结合片段 ， 包括但不限于

Fab, Fv, scFv和 Fd片段、 嵌合抗体、 人源化抗体、 单链抗体以及包 含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合 蛋白质。 抗体可以被标 记和检测， 例如， 可以通过放射性同位素、 能产生可检测物的酶、 荧 光蛋白质、 生物素等等进行标记并被检测。 抗体还可以结合于国相载 体， 包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。 该术语还包括 Fab' 、 Fv 、 F(ab') ₂ 和 /或其它能与抗原特异性结合的抗体的抗原结� �片段和 单克隆抗体。

"抗 VEGF抗体"是与 VEGF以足够的亲和力以及特异性结合的抗 体。 在本发明的一个实施方案中， 所述的 "抗 VEGF抗体"是赛伐珠单 抗。 赛伐珠单抗是 CN102002104A公开的抗 VEGF的单克隆抗体 EPI0030, 制备方法参见说明书实施例的部分。

术语"特异性结合"是指抗体或其抗原结合片段� ��抗原形成在生理 条件下相对稳定的复合物。 确定抗体与抗原是否特异性结合的方法是 本领域周知的， 包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。与 人 VEGF 特异性结合的抗体也可以与其他抗原 （例如， 来源于其他 （非人） 物 种的 VEGF分子） 具有交叉反应性。

术语"单克隆抗体 （MAb ) "和"单抗"在本文中可以互换使用， 是 指对于特定抗原的抗体的同类群体并且该抗体 仅包含一种类型的抗原 结合位点并且只结合抗原决定簇上的一个表位 。 通过本领域技术人员 所公知的方法可以获得对于特定抗原的单克隆 抗体。 例如单克隆抗体 可以通过杂交瘤法， 或者重组 DNA法制备。

在一些实施方案中， 本发明的抗 VEGF抗体包括抗体的抗原结合 片段如 Fv、 scFv ( sc指单链）、 Fab、 F(ab，） 2、 Fab，、 scFv-Fc片段或 者双抗体 （diabody )、 或者通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够 增加半寿期的任何片段， 所述化学修饰例如添加聚 （亚烷基） 二醇如 聚乙二醇 （"聚乙二醇化， PEG化"）（被称为 Fv-PEG、 scFv-PEG. Fab-PEG, F(ab')2-PEG 或 Fab'-PEG的聚乙二醇化片段）（ "PEG" 为 聚乙二醇）， 所述片段具有 VEGF结合活性。 优选地， 所述抗体的抗 原结合片段将由其来源抗体的重或轻可变链的 部分序列构成或者包含 它们， 所述序列足以保留与其来源抗体相同的结合特 异性和充分的亲 和力。

在一些实施方案中， 本发明的抗 VEGF抗体可以是人抗体或人源 化抗体， 以降低在人中的抗原性。 人抗体或人源化抗体的制备方法是 本领域技术人员公知的。

与来源序列相比， 本发明公开的抗 VEGF抗体可以在重链和轻链 序列中包舍一个或更多个 （例如 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或 10 个或更多个）氨基酸取代、 缺失和 /或添加。 在一个实施方案中， 本发 明的抗 CD48抗体可在重链和轻链序列包含一个或更多� �（例如 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或 10个或更多个）保守性氨基酸替换。 本领域 普通技术人员从本文公开的重链和轻链序列出 发可容易地产生包含一 个或更多个改变的多种抗体。 一旦得到， 可容易地检测包含一个或更 多个改变的抗体的一个或更多个期望性质， 例如结合特异性提高、 结 合亲和力增加、 拮抗或竟争生物学特性 （根据具体情况） 的提高或增 强、 免疫原性降低等。 以这种一般方式得到的抗体涵盖在本发明内。

本发明所述的抗体序列一致性可以使用序列分 析软件测量。 蛋白 质分析软件使用分配给多种替换、 缺失和其他改变 （包括保守氨基酸 替换） 的相似性计量来匹配相似序列。 例如， GCG软件包含程序如 Gap和 Bestfit, 其可用缺省参数来确定密切相关的多肽。 也可用使用 缺省或推荐参数的 FASTA比较多肽序列。当将本发明的序列与包含� �� 量来源于不同生物体的序列的数据库进行比较 时， 另一优选算法是使 用缺省参数的计算机程序 BLAST, 尤其是 BLASTP或 TBLASTN。 参 见， 例如 Altschul等（1990) J. Mol. Biol. 215:403-410和 Altschul等 (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402。

术语"有效量 "指可有效治疗哺乳动物中的疾病或病症的药� �量。 对于癌症， 药物有效量可减少癌细胞数量； 减小肿瘤体积； 抑制 （即 减慢到一定程度并优选停止） 癌细胞浸润到周围器官中； 抑制 （即减 慢到一定程度并优选停止）肿瘤转移； 在一定程度抑制肿瘤生长； 和 / 或在一定程度上緩解一或多种与肿瘤相关的症 状。 药物可以组织已存 在的肿瘤的细胞的生长或杀死这些肿瘤细胞， 所述药物可以使细胞抑 制剂或细胞毒性剂。对于癌症治疗，体内效力 可例如通过评估生存期， 疾病进展时间， 反应率， 反应时间， 和 /或生活质量来测定。

术语 "化疗药物 "是在癌症的治疔中使用的化合物， 任何具有抗癌 活性的化疗药物可根据本发明使用。 所述化疗剂可以选自： 烷化剂， 如尼莫司汀、 卡莫司汀、 洛莫司汀、 环磷酰胺、 异环磷酰胺和甘磷酰 芥等； 抗代谢药， 如去氧氟尿苷、 多西氟鸟啶、 5-氟尿嘧啶 （5-Fu )、 巯嘌呤、 硫鸟嘌呤、 氟鸟苷、 替加氟、 吉西他滨、 卡莫氣、 羟基脲、 甲氨蝶呤、 安西他滨等； 抗生素， 如放线菌素 D、 多柔比星、 柔红霉 素、 表柔比星、 丝裂霉素、 培洛霉素、 平阳霉素、 吡柔比星等； 植物 药， 如伊立替康、 三尖杉酯碱、 喜树碱、 羟基喜树碱、 长春瑞滨、 紫 杉醇、 长春碱、 长春地辛、 长春酰胺、 替尼泊苷、 依托泊苷等； 抗肿 瘤激素药， 如阿他美坦、 阿那曲唑、 氨鲁米特、 来曲唑、 福美坦、 甲 他孕酮等； 门冬酰胺酶； L-天冬酰胺酶； 铂类化疗药物， 如卡铂、 顺 铂、 奈达铂、 奥沙利铂等； 维曱酸； 曱苄肼衍生物， 如丙卡巴肼等； 蒽醌类， 如米托蒽醌等； 取代脲类， 如羟基脲等。

本发明涉及本发明的药物組合物制备抗癌症药 物中的用途。 所述 药物可以用改善转移、 递送、 耐受性等的合适载体、 赋形剂和其他试 剂配制。 所采用的剂型可以包括例如： 片剂、 粉剂、 糊剂、 膏剂、 凝 胶剂、 蜡状物、 油、 脂质、 含脂质嚢泡、 DNA綴合物等。 所述药物的 施用方式根据具体应用而不同， 包括但不限于静脉内、 皮下、 皮内和 肌内注射、 滴注等。 附图说明

图 1. 赛伐珠单抗、 Avastin对人结肠癌 Ls-174t裸小鼠移植瘤的疗 效

图 1. 赛伐珠单抗、 Avastin对荷瘤棵小鼠 （Ls-174t ) 体重的影响 图 3. 赛伐珠单抗与 5-氟尿嘧啶 (5-Fu)合用对人结肠癌 Ls- 174t裸 小鼠移植瘤的疗效。

图 4. 赛伐珠单抗与 5-氟尿嘧啶 (5-Fu)合用对荷瘤裸小鼠

( Ls-174t ) 体重的影响。

图 5. 赛伐珠单抗与奥沙利铂合用对人结肠癌 Ls-174t棵小鼠移植 瘤的疗效。

图 6. 赛伐珠单抗与奥沙利铂合用对荷瘤棵小鼠 （Ls- 174t ) 体重 的影响。

图 7. 赛伐珠单抗与顺铂合用对人结肠癌 HT-29棵小鼠移植瘤的 疗效

图 8. 赛伐珠单抗与顺铂合用对荷瘤棵小鼠 （HT-29 )体重的影响 图 9, 赛伐珠单抗与顺铂合用对棵小鼠 （HT-29 )移植瘤的抑制作 用

图 10. 实验终点时荷瘤鼠 （HT-29 ) 照片

图 11. 实险终点时肿瘤 （HT-29 ) 照片 具体实施方式

本发明公开了一种含有抗 VEGF抗体和化疗药物的药物组合物， 及其在制备抗癌药物中的用途， 本领域技术人员可以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。 特别需要指出的是， 所有类似的替换和改动 对本领域技术人员来说是显而易见的， 它们都被视为包括在本发明。 本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行 了描述， 相关人员明显 能在不脱离本发明内容、 精神和范围内对本文所述的方法和应用进行 改动或适当变更与组合， 来实现和应用本发明技术。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的 技术方案， 下面结 合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。 实施例 1: 制备本发明所述人源化 VEGF单抗 通过杂交瘤细胞技术制备兔单克隆抗体。 有关实验方案参见 US

Patent: 7,429,487, 特別是 Example 1-4。

首先通过重组技术制备 IgG Fc-hVEGF-A (Human VEGF165)融合 蛋白， 其中 IgG Fc序列为兔源。 将 IgG Fc-hVEGF-A的 DNA序列克隆 入 pTT5质粒， 瞬时转染该质粒进入 ΗΕΚ 293-6Ε细胞株， 无血清培养细 胞， 收集培养上清液， 用 Protein A柱纯化瞬时表达的IgG Fc-hVEGF-A 融合蛋白。

用纯化的 IgG Fc-hVEGF-A (作为抗原组分）与完全弗氏佐剂混合 进行皮下多点注射， 对新西兰白兔（ New Zealand rabbits )进行首次免 疫，此后每三周 1次用纯化蛋白和不完全弗氏佐剂混合后皮下� �射对兔 进行加强免疫，在取脾脏前 4天用抗原加 PBS对兔静脉注射进行最终免 疫。

根据美国专利 US7429487的方法， 将兔脾细胞与免疫脾细胞来源 相同的永生化 HRGTP-的 B淋巴细胞 240E-W2细胞按 2: 1比例融合， 在 96孔板中以 HAT培养基培养， 然后进行杂交瘤细胞歸选， 所得细胞克 隆进入新的 IgG Fc-hVEGF-A结合筛选。

鉴定筛选过程分为 2个阳性克隆筛选步 ： ①将 IgG Fc-hVEGF-A 抗原固定化于 96孔酶联免疫吸附板上， 加入克隆表达上清孵育 1 h后， 用 PBS洗涤 3次， 使用酶标记的抗体鉴定具有 IgG Fc-hVEGF-A结合活 性细胞克隆上清， 从而获得可与 IgG Fc-hVEGF- A直接结合的阳性克 隆。 ②随后将步驟①中的阳性克隆转移入 24孔板培养， 以获得更多的 表达产物。 将 IgG Fc-VEGFR2 ( KDR/Flk-1 )胞外区固定化于 96孔酶联 免疫吸附板上， 加入 IgG Fc-hVEGF-A和克隆表达产物共同孵育 lh, 再 用 PBS洗涤 3次， 使用酶标记的抗体检测 IgG Fc-hVEGF-A的含量， 以 鉴定克隆对 VEGF- VEGFR2 结合活性的抑制作用， 从而鉴别出能够阻 断 VEGF-VEGFR2结合的阳性克隆。

将所筛选的阳性克隆的杂交瘤细胞裂解， 提取 mRNA后逆转录得 cDNA。 以此 cDNA为模板， 釆用 PCR方法分別扩增出兔 IgG抗体的轻 链和重链可变区核酸序列， 对重链可变区、 轻链可变区进行分析， 其 编码的重链可变区含有 SEQ ID NO.1的亲本序列 （ Ser Asn Asn Asp Val Met Cys Trp )、 SEQ ID N0.2的亲本序列 ( Gly Cys lie Met Thr Thr Asp Val Val Thr Glu Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Ser ) 和 SEQ ID N0.3的亲本序 列（ Arg Asp Ser Val Gly Ser Pro Leu Met Ser Phe Asp Leu Trp )、 轻链可 变区含有 SEQ ID N0.4的亲本序列（ Gin Ala Ser Gin Ser Val Tyr Gly Asn Asn Glu Leu Ser ), SEQ ID N0.5的亲本序列 （ Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser ) 和 SEQ ID NO.6的亲本序列 （ Gly Gly Tyr Lys Ser Tyr Ser Asn Asp Gly Asn Gly )。 轻链核酸序列被克隆入 pTT5质粒。 重链可变区核酸序 列被克隆入已有重链恒定区的 pTT5质粒。 共转染轻、 重链质粒至 ΗΕΚ 293-6Ε细胞株， 培养 5天后， 用 Protein Α纯化上清， 最终获得重组表达 的兔抗人 VEGF165单克隆抗体。 采用上述阳性克隆筛选方法， 对表达 的重组抗体进行亲和力确认。

人源化技术参见美国专利 US 7,462,697 , 特别是优化实施方式的 详细描述部分 ( DETAILED DESCRIPTION OF PREFERRED

EMBODIMENTS )。

采用美国专利 US7，462，697所描述的技术，用人序列 VKI-2-l-( U ) -A20— JK4和 VH3-1-3-3-21— JH4作为参比序列。 表达的兔抗 VEGF单抗 序列经人源化后， 各得到 4个版本的 VK和 VH。 轻链可变区包括

VK-HZDK如 SEQ ID NO.12 ) VK-HZD2(如 SEQ ID NO.14 )、VK-HZD5 (如 SEQ ID NO.16 ) 和 VK-HZD6 (如 SEQ ID NO.8 ); 重链可变区包 括与 VH-HZDK如 SEQ ID NO.11 )所示、 VH- HZD2(如 SEQ ID NO.13 )、 VH- HZD5 (如 SEQ ID NO, 15 ) 和 VH- HZD6 (如 SEQ ID NO.7 )。 与 VK-HZD1比较， VK-HZD2在 CDR1区具有 2个不同的残基。在 VK-HZD1 和 VK- HZD2 N端添加 2个额外的氨基酸残基后即分別成为 VK-HZD5和 VK-HZD6。 VH-HZD1与 VH-HZD2的 71位残基不同， VH-HZD1的 71位 是 K, VH-HZD2的 71位是 R。 VK(H)- HZD1和 VK(H)-HZD 2序列中含有 兔源信号肽， 而 VK(H)-HZD5和 VK(H)-HZD6的序列中含有人源信号 肽。

将 4个版本的 VK和 VH的 DNA序列通过人工合成后分别克隆 进已有人 CK序列和人 CH序列的 pTT5质粒中，通过人信号肽表达抗 体。 将上述两个质粒共转染 ΗΕΚ 293-6Ε 细胞， 瞬时表达人源化抗 VEGF抗体，使用实施例 1中的筛选方法，选定亲和力适宜的 HZD-V6 克隆作为最终使用的克隆， 其表达的人源化抗 VEGF 抗体称为 EPI0030, 其氨基酸序列如 SEQ ID N0.9所示的重链和 SEQ ID NO.10 所示的轻链。

为提高产量， 获得工业用生产细胞株， 将氨基酸序列如 SEQ ID NO.9所示的重链和 SEQ ID NO.10所示的轻链表达质粒共转染入中国 仓鼠卵巢细胞株 （CHO ), 于 2009年 8月 20 日保藏在中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址为北京市朝阳区大屯路， 保 藏编号为 CGMCC No.3233。

实施例 2. 赛伐珠单抗、 Avastin单用对人结肠癌 Ls- 174t棵小鼠移 植瘤的 效评价

实验材料和动物： 赛伐珠单抗由江苏先声药物研究有限公司提 供； Avastin购自 Genentecli Co. ； BALB/cA-nude棵小鼠， 6-7周， 购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

配制方法： 赛伐珠单抗、 Avastin均用生理盐水配成所需浓度。 实验步骤： 棵小鼠皮下接种人结肠癌 Ls-174t细胞， 待肿瘤生长 至 60-200 mm3后，将动物随机分组 (d0)。给药剂量和给药方案见表 1。 每周测 2 - 3次瘤体积， 称鼠重， 记录数据。 肿瘤体积 （V )计算公式 为：

V = l/2xaxb ²

其中 a、 b分别表示长、 宽。

T/C(%)=(T-T0)/(C-C0)xl00 其中 T、( 为实验结束时的肿瘤体积； T0、 CO为实验开始时的肿瘤体积。

表 1. 赛伐珠单抗、 Avastin对人结肠癌 Ls-174t棵小鼠移植瘤的 疗效

dO: 第一次给药时间； P值指与对照相比。 对照组 n=12, 治疗组 n=6。

IV： 静脉注射； IP: 腹腔注射。

结果： 赛伐珠单抗单药明显抑制人结肠癌 Ls-174t棵小鼠移植瘤 的生长， 抑制作用有明显的剂量依赖性； Avastin同样剂量依赖地抑制 Ls-174t生长， 但其疗效明显不及赛伐珠单抗（P<0.05 vs 7.5 mg/kg 赛 伐珠单抗组）（图 1 )。 荷瘤小鼠对赛伐珠单抗和 Avastin均能较好地耐 受； 事实上， 赛伐珠单抗还能改善荷瘤小鼠的一般状态， 表现为体重 增长 （图 2 )。 实施例 3. 赛伐珠单抗单用或与 5-氟尿嘧啶合用对于人结肠癌 Ls- 174t棵小鼠抑制瘤的疗效评价

实验材料和动物: 5- Fu上海恒瑞医药有限公司提供。 动物和其 他材料参见实施例 1。

配制方法: 5-Fu用生理盐水配制。

实验歩骤: 详细步骤参见实施例 1的实验步骤。 给药剂量和给药 方案见表 2。

表 2. 赛伐珠单抗单用或与 5-氟尿嘧啶 (5-Fu)合用对人结肠癌

d0: 第一次给药时间； P 值指与对照相比。 对照组 n=12, 治疗组 n=6(

IV： 静脉注射； IP: 腹腔注射。

结果: 单独应用 5-Fu对 Ls-174t有一定疗效， 抑瘤率为 33.4% (dl l), 但毒性很大， 至给药后第 15天 （dl 5 ), 5-Fu组的 6只小鼠中 5只死亡。 合用赛伐珠单抗后， 疗效明显增加 （图 3 ); 联合用药的疗 效相比于单药的赛伐珠单抗或 5-Fu， 有显著性差异 （ P<0.01 vs 2.5 mg/kg 赛伐珠单抗， d8和 dl l ); 更为重要的是， 实验结束时， 合用 组没有 1只小鼠死亡，说明赛伐珠单抗不但改善了小� �的一般状态（体 重增长， 图 4 )， 还明显降低了 5-Fu的致死性。

结论: 赛伐珠单抗对 5-Fu有明显的增效作用， 还有潜在的减毒作 用。 实施例 4. 赛伐珠单抗单用或与奥沙利铂合用对于人结肠 癌

Ls- 174t棵小鼠抑制瘤的疗效评价

实验材料和动物: 奥沙利铂由江苏豪森医药股份有限公司提供； 动物和其他材料参见实施例 1。

配制方法: 奥沙利铂用 5 %葡萄糖溶液配制。

实验步骤: 参见实施例 1的实验步骤， 给药剂量和方案见表 3。 表 3. 赛伐珠单抗单用或与奥沙利铂合用对人结肠癌 Ls-174t棵小

dO: 第一次给药时间； P值指与对照相比。 对照组 n=12, 治疗组 η=6<

IV： 静脉注射； IP: 腹腔注射 结果: 单独应用奥沙利铂对 Ls- 174t有一定疗效，抑瘤率为 30.1 % (dl l) , 但毒性很大， 至给药后第 15天 （dl 5 ), 奥沙利铂组有 2只小 鼠死亡。 合用赛伐珠单抗后， 疗效明显增加 （图 5 ); 联合用药的疗效 相比于单药的赛伐珠单抗或奥沙利铂，均有显 著性差异（P<0.01 vs 2.5 mg/kg 赛伐珠单抗， d8和 dl l ); 更为重要的是， 实验结束时， 合用 组没有 1只小鼠死亡，并且赛伐珠单抗还能改善荷瘤� �鼠的一般状态， 表现为体重增长（图 6 )， 说明赛伐珠单抗明显降低了奥沙利铂的致死 性。

结论: 赛伐珠单抗对奥沙利铂有明显的增效作用， 还有潜在的减 毒作用。 实施例 5. 赛伐珠单抗单用或与顺铂合用对于人结肠癌 HT-29棵 小鼠抑制瘤的疗效评价

实验材料和动物: 赛伐珠单抗由江苏先声药物研究有限公司提 供； 阳性对照药物： 注射用顺铂（冻干型） 由齐鲁制药有限公司提供； 实验动物： BALB/c - nude棵小鼠， SPF级， 5-6周， 雌性， 由上海斯 莱克实验动物有限责任公司提供。

配制方法: 赛伐珠单抗和顺铂均用无菌生理盐水配置成所 需浓 度。

实验方案: 将实验动物分为 7组， 每组 6只

1. Control, 给予生理盐水， i.v., b丄 wx3。

2. 顺铂， 6mg/kg: 0.1ml/10g, i.p., qwx3 (药物浓度 0.6mg/ml )

3. 赛伐珠单抗， 2.5mg/kg: 0.1ml/10g, i.v., b丄 wx3。 （药物浓度 0.25mg/ml )

4. 赛伐珠单抗， 5mg/kg: O. lml/l Og, i.v., b.i.wx3 ₀ (药物浓度 0.5mg/ml )

5. 赛伐珠单抗， 7.5mg/kg: O. lml/lOg, i.v.， b.i.w <3。 （药物浓度 0.75mg/ml )

6. 赛伐珠单抗， l Omg/kg: 0.1 ml/1 Og, i.v., b丄 wx3。 （药物浓度 1.0mg/ml)

7. 赛伐珠单抗， 2.5mg/kg+ 顺铂 6mg/kg: i.p qwx3+ i.v., b.i.w<3。

实^ ^方法：

1. HT-29裸鼠移植瘤模型

a) 复苏并扩增 HT-29细胞；

b) 传代 3次后， 待扩增到足够的细胞， 收集细胞， 用不舍血清 的 M5 A培养基配成浓度为 2xl0 ⁷ cell/ml的单细胞悬液；

c) 棵鼠背部右侧皮下接种， 0.1ml/只， 即每只棵鼠接种细胞数 为 2χ10 ⁶ ;

d) 共接种 62只棵鼠， 接种后观察出瘤情况和肿瘤大小。

2.分组： 待肿瘤长至体积 170mm ³ 左右时， 从 62只棵鼠中选出 42 只肿瘤体积相近、 形状较好的棵鼠， 分成 7組， 每组 6只；

3.给药： 分組后当天给药， 设为 dayO, 给药方式同实验方案。

4.测量： 每周测量 3次肿瘤体积和体重。 day21, 取血清， 处死棵 鼠， 取出肿瘤称重、 拍照， 计算抑瘤率。 肿瘤用中性福尔马林固定。

检测指标及计算方法：

1. 肿瘤体积（tumor volume , TV), 计算公式为： TV = l/2xaxb ² 其中 a、 b分別表示长、 宽。

2. 相对肿瘤体积 ( relative tumor volume, RTV ), 计算公式为： RTV = TV _t /TV _lo

其中 TV,为分笼给药时（即 c^)肿瘤体积， TV _t 为每一次测量时的 肿瘤体积。

3. 相对肿瘤增殖率 T/C (%), 计算公式为：

TRTV

T/C (%) = lOO

CRTV

TRTV: 治疗组 RTV ； C _RTV : 空白对照组 RTV。

4. 瘤重抑瘤率 IR ( %), 计算公式为： ^TW— ί TW

IR ( % ) = x lOO

CTW

T _TW : 治疗组瘤重 ； C _TW : 空白对照组瘤重； TW(tumor weight): 肿瘤重量。

实验结果：

实验期间， 相比化疗药物顺铂， 赛伐珠单抗各剂量组动物耐受良 好 （表 4 )。 实验开始时各組别肿瘤体积的组内 RSD基本在 1/5以内， 试验终点时， Control组的肿瘤体积 1200mm ³ 左右， 阳性药 (顺铂 ) 在 HT- 29模型上表现出较好的抑瘤效应， 相对 Control组， 其 T/C = 42.3%, 结果有统计学显著性。 表明本次实验体系可靠。 赛伐珠单抗 在 2.5mg/kg, 5mg/kg, 7.5mg/kg剂量范围内在 HT-29模型上显示了良 好的量效关系， 但剂量超过 7.5mg/kg后， 到 10mg/kg, 肿瘤抑制作用 未进一步增强。 并且各剂量在 b.i.w的给药方案下均表现了较强的肿 瘤抑制作用， 在高剂量时， 肿瘤抑制作用可达 80%。 赛伐珠单抗与顺

H - 铂联用的肿瘤抑制作用强于二者分别单用， 且差异有统计学显著性。 赛伐珠单抗各给药剂量组， 动物的体重均增长正常， 给药期间， 动物 o 状态良好， 动物表现了对赛伐珠单抗良好的耐受情况。 （图 7-11 )

结论: 赛伐珠单抗对顺铂有明显的增效作用， 还有潜在的减毒作 用。

表 4. 赛伐珠单抗单用或与顺铂合用对人结肠癌 HT-29裸小鼠移植 瘤的疗效 剂 动

T/C 里 物 体重 (g) TV (纖 ³ ) TV (%)

(%) 组别 m 数

开 取

d0 d21 d0 d21

kg 始 后

18.8±0. 20.3± 1. 74.8±26.

Control 6 6

4 2 6

18.9±0. 14,3士1. 179.8±43 529.9±I3 296.8±52 42.3 顺铂 6 6 6

4 0 .4 3.0 .0 ** 赛伐珠单抗 2, 6 6 19.2±0. 21,4±1. 167.1±27 609.0±13 365.4±66 52.1 -2.5 5 8 1 .7 5.4 .9 赛伐珠单抗 18.6±0. 2 Ι .0±0· 169.3±28 385.1±78 230.0±42 32.8

5 6 6

-5 8 9 .9 .1 .4 ** 赛伐珠单抗 7. 18.2±0. 20.9±1. 174.7±30 269.6±75 154.8±35 22.1

6 6

-7.5 5 7 2 .7 .1 .4

赛伐珠单抗 18.8±0. 21 ,6士0. 172.2±30 240.0±68 152.3±21 21.7

10 6 6

- 10 6 6 .5 .2 .2 **

2.

赛伐珠单抗 18.8±0. 177.0±31 322.6±77 1 S7.S±61 26.8

5+ 6 6

+顺铂 6 .6 .6 .8 **

6

*:P<0.05 **:P<0.01

以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领 域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出 若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。