La présente invention concerne un nouveau médicament utile plus particulièrement comme agent broncho¬ dilatateur, ainsi que les procédés pour sa préparation.

La théophylline est l'un des médicaments broncho dilatateurs lesplus utilisés,en particulier dans le traitement des crises d'asthme ainsi que dans» le traitement de fond de la maladie asthmatique.

La théophylline agit par augmentation du taux intracellulaire d'AMP cyclique en inhibant sa dégradation par la phosphodiestérase. C'est cet accroissement qui est responsable du relâchement de la fibre musculaire lisse, et notamment de la fibre bronchique, base de l'effet broncho-dilatateur du médicament.

De plus la théophylline inhibe la dégranulation des mastocytes, empêchant ainsi la libération des médiateur chimiques du broncho-spasme.

Outre la broncho-dilatation, la théophylline provoque un relâchement de la fibre lisse digestive, un effet analeptique cardiaque, une vaso-dilatation artérielle un effet diurétique, une action psycho-analeptique, une stimulation des centres respiratoires.

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L'un des inconvénients majeurs de la théophylline est que la marge existant entre les doses thérapeutiques efficaces et les doses toxiques est relativement faible, ceci gêne, bien entendu, la prescription. En outre la

5.. théophylline présente de nombreux effets indésirables, notamment en cas de surdosage, à savoir nausées, vomissements céphalées, excitation, insomnies, tachycardie, qui sont ttotamment liés aux activités annexes de ce produit.

Néanmoins, malgré ces inconvénients, ce produit

102 reste le traitement de choix dans les crises d'asthme et le traitement de fond des maladies asthmatiques.

La présente invention a pour objet un nouveau produit pharmaceutique qui peut être utilisé comme broncho¬ dilatateur et notamment dans le traitement de l'asthme, tant

T ^" 5Ξ au-niveau de la crise que comme traitement de fond, éven¬ tuellement utilisé en remplacement de la théophylline dans ses autres applications de même type.

La présente invention repose sur la mise en évidence de l'activité broncho-dilatatrice du composé

20 dénommé Hispiduline de formule :

ainsi que ses éthers méthyliques et son dérivé déméthylé. C'est pourquoi la présente invention concerne les composés précédents à titre de médicaments, les compo¬ sitions pharmaceutiques les contenant et leur utilisation, 5 en particulier, dans la préparation de compositions broncho¬ dilatatrices, en particulier anti-asthmatiques.

Il convient de remarquer qu'outre leurs propriét broncho-dilatatrices, les composés selon l'invention présen d'autres propriétés pharmacologiques, notamment des propri¬ étés anti-inflammatoires locales. L'Hispiduline et ses dérivés mentionnés précé¬ demment sont également utiles dans les compositions pour application topique externe, qu'elles soient cosmétiques ou dermatologiques.

L'Hispiduline en elle-même est connue et a déjà été isolée à partir des plantes, mais sans qu'on ait pu mettre en évidence l'activité pharmacologique qui sera décrite ci-après.

L'Hispiduline peut être obtenue de différentes façons. Tout d'abord, il est possible d'en effectuer la synthèse par des procédés qui ont déjà été décrits ou par l'adaptation de procédés qui sont également connus.

En particulier, les synthèses suivantes sont connues pour la préparation de l 'Hispiduline : . la synthèse par réaction de Hoesch sur l'irétol, Phadke et al., Indian J. Chem. 5_, 131 (1967) ; . la synthèse par condensation type Baker - Venkataraman, Fukui et al., J. Sci. Hiroshima Univ., Ser. A-Il, ,33 , 305 (1969) ; . la synthèse de Iinuma et al., Chem. Pharm. Bull., 32 , 4935 (1984) ; . la synthèse de Ahluwalia et al., Indian J. Chem., 14B, 592 (1976).

Les rendements de ces synthèses sont faibles mais permettent la préparation de l 'Hispiduline.

Les exemples ci-après donneront une idée des procédés qui peuvent être mis en oeuvre pour la synthèse de l'Hispiduline.

Le produit peut, en outre, être préparé par extraction à partir de différentes plantes dans lesquelles il est connu que se trouvent des quantités variables d'Hispiduline. 5 Parmi ces plantes, il faut citer notamment plusieurs espèces appartenant aux genres botaniques :

Ambrosia

Arnica

Baldvina Ta Centaurea

Digitalis

Eupatorium

Flourensia

Helenium 15 Iva

Nepeta

Millingtonia

Plantago

Scutellaria 20 Salvia, etc.

Les exemples ci-après mettront en évidence des processus d'extraction permettant de préparer une Hispiduline utilisable à titre de médicament.

En particulier, à partir de la plante, un 5 premier extrait à l'alcool, éther ou cétone est ensuite traité par un solvant chloré. Cet extrait au solvant chloré contient 1'Hispiduline qui peut être séparée par chromatographie.

L'Hispiduline, comme la théophylline, θ peut être utilisée dans des compositions pharmaceutiques applicables par différentes voies, en particulier

1 'Hispiduline peut être administrée par voie orale, par voie rectale ou même par injection.

Il est également possible de prévoir, notamment dans le traitement des crises asthmatiques, l'utilisation de la voie aérosol.

La mise en forme galénique de 1 'Hispiduline peut être réalisée par des processus connus et avec des excipients adaptés à chacune des voies mises en oeuvre, tenant compte des propriétés de solubilité de 1 'Hispiduline. Les posologies mises en oeuvre dépendront, bien entendu, de l'état du patient et du type de maladie qui doit être traité et de la nature du traitement, traitement de fond, traitement des crises paroxystiques.

Compte tenu de l'activité très importante de 1 'Hispiduline, la posologie à mettre en oeuvre sera moins contraignante qu'avec des produits tels que la théophylline

Les exemples ci-après permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention. EXEMPLE 1

Préparation de 1 'Hispiduline par extraction de fleurs d'Arn a) On fait macérer 50 kg de fleurs séchées d'Arnica montana dans de l'alcool éthylique à 60°. L'extrac tion est effectuée par lot de 17 kg, successivement 300, 200, 180 et 150 1 d'alcool éthylique.

L'extrait est alors traité avec un mélange d'eau et dichloro éthane (400 1 CH ₂ Cl ₂ /200 1 H ₂ 0) . L'extraction est effectuée par 6 kg.

La phase CH ₂ C1 ₂ représentant environ 1,7 kg, c'est-à-dire 3,4 % du poids total de la plante, contient la fraction active Hispiduline.

Cette phase CH ₂ C1 ₂ va être fractionnée par chromatographie afin d'en isoler 1'Hispiduline.

On utilise pour ce faire une colonne de 220 mm d'une hauteur d'environ 1 ,50 m contenant 19 kg de silice 7734 Merck 60 préparé avec un volume d'hexane d'environ

100 1. Le produit est fixé sur la silice par mise en pâte avec celle-ci.

On effectue ensuite une élution avec les solvants suivants : Solvant Volume Extrait % CH _^ Cl-, % d'inhibition

^~ Tï) (g) - hexane 200 0 toluène 200 390 23 27,5

CH ₂ C1 ₂ 550 690 40,5 65

100 ) éther 500 220 j 19 62

54 ) AcOEt 200 70 41

MeOH 150 207

L'Hispiduline se trouve dans la fraction éther, à la fois par chromatographie et par mesure de l'inhibition de l'agrégation plaquettaire sur plaquettes de lapins (qui est proportionnelle à la teneur en Hispidulin

Le produit ainsi obtenu est, après analyse et comparaison avec des échantillons préparés par la technique synthétique qui sera décrite ci-après, identifié à 1'Hispiduline ayant les propriétés physico-chimiques suivantes :

- P.M. : 300

- Point de fusion : 287-290°C - ϋV : 275 nm, 338 n

- Microanalyse : 64 % C ; 4 % H ; 32 % 0

- Cristallise dans MeOH

- C.C.M. : dp à 366 nm, visible à 254 nm jaune à H ₂ SO.

Rf : 0,28 à H ₂ C1 ₂ 95 / Me0H5,

EXEMPLE 2 Activité pharmacologique

Les propriétés _es plus remarquablesde l 'Hispidulin sont, comme cela a été dit précédemment, la relaxation du tonus de base du muscle lisse et l'inhibition de la dégranulation i munologique des mastocytes. ^Ces propriétés faisant de 1 'Hispiduline un broncho-dilatateur de choix supérieur à la théophylline avec laquelle elle sera comparée dans les exemples qui suivent.

Les mesures ont été effectuées de la façon suivante : Les trachées utilisées proviennent de cobayes mâles albinos ou bien sont des échantillons de tissus pulmonaires provenant d'interventions chirurgicales sur des patients humains.

Les trachées ou les muscles lisses pulmonaires humains sont préparés et découpés en spirale. Les spirales sont fixées par leur extrémité de façon à obtenir une force de 8 g pour la trachée de cobaye et 2 à 8 g pour la bronche humaine. Elles sont stockées chacune dans une cuve à organe isolé remplie de 10 ml de tampon Tyrode oxygéné (95 % d'0 ₂ , 5 % de C0 ₂ ) et thermostatées à 37°C. Après 90 minutes d'équilibration la longueur des spirales est mesurée. Des capteurs isométriques et des physiographes sont utilisés pour enregistrer les changements de force.

5§i§≤§_=i22_ l_-_-=2G1---_:--. §-2§ ^S . ^e . L'effet relâchant d'une molécule sur le tonus de base a été observé en l'ajoutant sur la préparation du muscle préalablement équilibré.

La relaxation d'une contraction induite est effectuée en stimulant les préparations avec la dose maximale d'agoniste, en l'occurrence l'histamine. Quand le plateau est atteint, les molécules à étudier sont ajoutées dans le bain à des concentrations croissant toutes les 5 minutes.

Enfin, l'inhibition des contractions est mesurée de la façon suivante :

Pour observer l'inhibition les préparations sont cαnvtractées avec l'un des agonistes choisis à la dose maximale ou submaximale, puis lavées. Elles sont préincubées pendant 30 minutes avec la molécule à étudier et contractées dans- les mêmes conditions que précédemment. Les hauteurs des contactions à l'agoniste, avant et après l'incubation, sont mesurées.

Çf_i21_ _. l_des_réEonses

Les préparations n'étant pas homogènes, il était nécessaire d'uniformiser les réponses obtenues en tenant compte des variations précédentes. Les réponses obtenues sont exprimées en g/mm , après avoir divisé la réponse mesurée en g par le rapport poids humide/longueur.

Pour les protocoles d'inhibition, la contraction après incubation est exprimée en % de la première contrac- tion qui exprime un pourcentage d'inhibition.

La relaxation est exprimée en pourcentage de la contraction maximale obtenue avec l'agoniste utilisé. La concentration permettant d'obtenir 50 % de la réponse maximale (EC50) caractérise la sensibilité de la préparatio à la molécule étudiée et est mesurée par interpolation de la courbe obtenue (pourcentage de relaxation en fonction du logarithme décimal de la concentration) .

Les résultats observés ont été les suivants : RELAXATION DU TONUS DE BASE DU MUSCLE - TRACHEE DE COBAYE

PRODUITS REPONSE (g/mm ² ) (X + SEM) (N) RAPPOR

Tampon - 0,05 + 0,02 (8) 1

Théophylline 10 ^-4 M - 0,12 + 0,04 (13) 2,5

Hispiduline 10~ ⁴ M - 0,24 + 0,04 (8) 5

RELAXATION D'UNE CONTRACTION INDUITE PAR HISTAMINE

TRACHEE DE COBAYE - COURBES DOSE-REPONSE SIGNIFICATIVEMENT

SUPERPOSABLES

rσ HISPIDULINE THEOPHYLLINE

EC 50 8 + 2 x 1θ ^"5 M 5,5 + 1 x 1θ ^"5 M

ïS^i^i-=i ^Q __.^ë_-ï _-^i2£ ^§ !îliI ^§ ti 2-.i^yD l 3i9__ë-_. ⁰ ^ ^es

5⧣22∑£§§__.âe_la_mg§lle_OSSeUSe_des_SOuriS

Pour la mesure de l'inhibition de cette 15 dégranulation, on a utilisé deux marqueurs de dégranulation

- un marqueur enzymatique : la β-hexosaminidase,

- le médiateur libéré : Paf.acéther.

Les expériences sont effectuées schématiquement de la façon suivante : 0 On constitue, à partir de cellules de moelle osseuse de fémurs de souris par cultures successives, une culture virtuellement pure en mastocytes.

L'expérience proprement dite est effectuée de la façon suivante : 5 Protocole expérimental

Les mastocytes en suspension dans du tampon tyrode gélatine (TG) , après comptage, sont distribués de façon à avoir 1 x 10 cellules/tube dans 100 μ.1.

100 μl IgE anti-DNP (dilué au 1 /100/aliquot) 0 sont ajoutés de façon à sensibiliser les cellules.

Les tubes sont incubés 1.heure à 37°C dans une étuve avec CO- et agités manuellement toutes les 15 minutes. Les cellules sont lavées 3 fois par centrifugation à 300 g pendant 5 minutes avec du TG. Lors de la dernière centri¬ fugation, les cellules sont resuspendues dans 400 μl de TG avec l'albumine de sérum bovin (BSA).

Après une incubation des cellules pendant 15 minutes au bain-marie, avec 50 μl des solutions à tester ou 50 μl des solvants utilisés (tubes témoins) , 50 μl d'antigène DNP ( ~Ag_J7 finale = 40 ng/ml) sont ajoutés C dans les tubes dits stimulés,- et 50 μl de tampon TG BSA sont ajoutés aux tubes dits non stimulés, et l'incubation est poursuivie pendant 5 minutes sous agitation. La réaction est arrêtée dans la glace par l'addition de 10 μl d'EDTA (4 mM concentration finale) . ra ^* Les tubes sont centrifugés à 300 g pendant 5 minutes à 4°C. Les surnageants sont récupérés et les culots repris dans 500 μl de TG BSA et soniqués 3 fois 5 secondes. Dosage de la libération de la β-hexosaminidase

20

50 μl de surnageant ou de solution culot sont additionnés à 450μl de substrat β-hexosaminidase et mis 1 heure à 37°C au bain-marie, sans agitation. La réaction est arrêtée avec 1,5 ml de solution d'arrêt pour chaque tube.

25

L'activité de la β-hexosaminidase dans les culots et les surnageants est mesurée au spectrophotomètre à 410 nm et le pourcentage net de libération a été calculé selon la formule :

DO surnageant activé - DO contrôle x 100

30 (DO surnageant activé + DO culot) - DO surnageant contrô

(DO = densité optique) .

Dosage de la libération de Paf. céther

Les surnageants sont testés directement sur l'agrégation des plaquettes lavées de lapin et traitées par l'aspirine (0,1 M pendant 15 minutes).

La mesure est effectuée dans un agrégamètre en présence du complexe CP/CPK.

Une gamme étalon est effectuée avec des quantités connues de Paf.acéther synthétique.

Les résultats sont exprimés en équivalent ng de Paf.acéther calculés par rapport à la gamme précédente.

La quantité de Paf. des témoins, cellules stimulées dans du sérum physiologique, est maximale dans ces tubes et sera le 0 % d'inhibition de la libération de Paf. Le pourcentage d'inhibition des autres tubes pourra être ainsi déduit.

Les résultats observés sont les suivants :

6-HEXOSAMINIDASE Paf.ACETHER

PRODUITS CI 50 RAPPORT CI 50 RAPPOR Théophylline 4,5 ⁺ 1 ,5 x 10 -4 M 2,2±0,8 x 10~ ⁴ M 1 (N ≈ 4) (N = 3)

Hispiduline 4,911 x 1θ ^"5 M 10 4,8*1 x 10~ ⁵ M 5 (N = 5) (N = 4)

N = nombre d'expériences

On a, en outre, vérifié qu'aux doses très forte d'Hispiduline, c'est-à-dire 10~ M, ou de la théophylline, = -3 10 M, il n'y avait pas de lyse cellulaire.

Des résultats des expériences précédentes, il ressort que 1'Hispiduline se présente, dans le domaine des agents broncho-dilatateurs, comme très supérieure à la théophylline. 0

EXEMPLE 3

Des essais ayant été conduits avec la pectolinarigénine

OH O ont montré que sur le muscle lisse de trachée de cobaye

-4 la pectolinarigénine à 10 M relâche à 70 % une contraction maximale due à l'hista ine.