OCDIA NÃO INVASIVO , E SEUS USOS

Caxspo da invenção

[I] Ά presente invenção trata de uma composição e formulação farmacêutica para prevenção e tratamento ocular Ά&Ο. invasivo, sendo a invenção aplicada na medicina,, mais especificamente no campo da o talmologia . E um ob eto adicional o uso.

Fimdamsri tos d ínv&nção :

{21 Os tratamentos atuais disponíveis para a retinopatia diabética (RD) são invasivos, como a fotocoagulação a laser, injeções intravítrea de drogas anti- angíogênicas e vitrectomia . No entanto a formulação de um colírio que seja capaz de permear as barreiras oculares atingindo a retina, prevenindo ou até mesmo tratando as alteraçoes causad s ela RD se faz ecessário .

[31 O documento JP2Q112 6464A apresenta uma composição de lipossomas altamente estáveis e capazes de carrear seguramente um fármaco para o segmento posterior do olho-, na forma farmacêutica de colírio. Esses lipossomas devem, ter os seguintes componentes funcionais: um fosfolipidio estrutural de alta temperatura de transição de fases, ( gel-Iíquido cristalino) uma substância que reforce a membrana lipossomai, e um composto seIante que é fármaco não esferoidal com ação antinflamatória . Os lipossomas possuem diâmetro médio menor ou igual a 1 micrornetro ou podem ser cobertos com um polímero e/ou conterem composto carregado positiva ou negativamente sobre a superfície. Observe-se que na tecnologia descrita no mencionado documento, o processo de produção dos lipossomas não é escalonável, o que não garante que as propriedades sejam mantidas quando se necessitar produzir maiores volumes, mesmo para ensaios pré- clínicos. A invenção proposta apresenta coroo uroa primeira vantagem o fato da composição lipossomai ser mais simples, compreendendo somente um componente sendo o processo de preparação dos lipossomas simples e esealonávei, passível de implementação no setor industrial. Além disso, o uso tópico do tempol nanoestruturado em lipossomas de EPC + Tempo! nas fases precoces da RD e os experimentos funcionais e histológicos em modelo de RD experimental comprovam, o efeito protetor na retina.

[4] O documento US20.il/000.8421Al trata de lipossomas rígidos, compostos de três ciasses de componentes: fosfolipídío estruturai, substância com carga negativa e substância reforçadora da membrana iipossomal. A ciass de fosfolípidio, compreende no mínimo 1 fosfoíipídio de 12 a IS átomos de carbono. A substância reforçadora deve ter um esqueleto esferoidal . A estrutura Iipossomal deve ter temperatura de transição de fases (ge.l-líquido cristalino) maior que 20 °C, e. diâmetro médio sub-micrométrico (igual ou inferior a 60Gnm) . Os lipossomas também são capazes de encapsular fármacos hidro ílicos ou hidrofóbicos para o tratamento de várias doenças. A tecnologia baseia-se no fato ds que, para atingir o segmento posterior do olho, a estrutura dos lipossomas deve ser rígida. São estabelecidas uma medida de rigidez e u a faixa ampla aceitável que é função da altura da partícula absorvida sobre o substrato e do diâmetro médio da partícula. Essas propriedades são dependentes da composição dos lipossomas, Ã forma farmacêutica é a de gotas para instilação nos olhos (colírio) . Ressalte-se que o processo de produção dos lipossomas não é escalonávei, o que não garante que as propriedades sejam mantidas quando se necessitar produzir maiores volumes, mesmo para ensaios pré-clínícos . A invenção proposta apresenta como vantagem o fato de compreender um composição lipossomai mais simples com somente um componente (EPC) que, por possuir baixa temperatura cie transição d fases, produz lipossomas flexíveis sendo o processo de preparação dos ^: lipossomas simples e escalonávei, passível de implementação no setor industrial.

[5] O documento US2013/2l6606Ai descreve formulações de lipossomas para tratamento ocular cuja doença é glaucoma.. Os lipossomas são compostos de no mínimo um lipídio, um esterol, um. esfíngolipldíc, dentre outros lipídios, e ura composto da classe das prostaglandinas cuja função: é diminuir a pressão intraocuía . Os lipossomas são do tipo SUVs ou LOVs, cuja faixa de tamanhos vai de 20 a 30ônm. A form.ulaçãc pode conte um ou vários lipídios. Ressalte-se que. os lipossomas restringem~se ao transporte de composto do tipo prostaglandína e liberá-lo de modo sustentado. Ainda, o processo de produção dos lipossomas não é escalonávei, não garantindo que as propriedades sejam, mantidas quando se necessitar produzir maiores volumes, mesmo para ensaios pré- clínicos. A invenção proposta difere do citado documento tanto na composição iipídica (a invenção usa somente EPC corne lipídio) _r quanto no fármaco encapsulado e na doença a ser tratada. Os lipossomas da presente invenção earrea o fármaco Tempo1 cuja função é a de proteger a retina através da prevenção do estresse oxidativo nas fases precoces da. retinopatia diabética (RD) . A proposta invenção diferencia- se, ainda, pois o processo de produção dos lipossomas é controlado e escalonávei, o que significa ser passível de transposição de escala para maiores volumes, mantendo as propriedades dos lipossomas. A transposição de escala facilita a implementação do processo no setor Industrial.

[6j O documento WO20Q5/051328A2 se refere à administração direta aos olhos .(injetáveis, colírios, inserts, lentes de contato, gel e outras formas líquidas) de hidroxilaminas (derivados de nitróxidos) para doenças oftalmológicas tais coroo degeneração macular relacionada à idade (DMRI), glaucoma, retínopatias , uveites, entre outras. É defendido que as hidroxilaminas são preferíveis aos nitróxidos como agentes terapêuticos baseados na ausência de toxicidade. A invenção proposta difere do documento mencionado principalmente pelo fato de utilizar o tempai, na forma oxidada e não reduzida (Tempol-H) nanoestruturado na prevenção dos sintomas precoces da RD. Além disso:, a tecnologia proposta possui a vantage de não ser um método invasivo para os pacientes.

[7] O documento US7825134 apresenta uma formulação de colírio com hidroxilaminas (Tempoi-H) para o tratamento principalmente de catarata, mas também abrange outras desordens oculares como DMRI, retínopatias, glaucoma, entre outras. A tecnologia proposta é mais simples uma vez: que não houve a necessidade de reduzir o tempo! . Além disso, a incorporação do fármaco era. nanopartícuias auxilia a sua penetração ocular.

[8] Seria útil se o estado da técnica propusesse uma composição e formulação farmacêutica que fosse capaz cie prevenir e _: tratar de forma não invasiva compreendendo tempo.!, oxidado e EEC.

Breve descrição da invenção :

[9] A presente invenção trata de uma composição e formulação farmacêutica para prevenção e tratamento ocular não invasivo, sendo a invenção aplicada na medicina, mais especificamente no campo da oftalmologia. É um objeto adicional o uso.

[10] A composição farmacêutica ocula compreende os segui tes componentes--

- tempol oxidado- com concentração de ImM encapsulado em lipossomas convencionais flexíveis cora diâmetro médio variável entre 50 e 200n.m, preferencialmente entre 50 e lOOnm? compreendem fosfolipídios com temperatura de transição de fases abaixo da temperatura corpórea, preferencialmente fosfatídilcolina de ovo (E.PC) com concentração variável entre 1 e. 20-m , preferencialmente 2mM;

- veiculo composto de solução salina.

[11] to mulação preferencia.1 compre.ende :

- tempol oxidado com concentração de ImM em lipossomas convencionais flexíveis com diâmetro médio de 60 am, compreendem fosfatídilcolina de ovo (EPC) com concentração de. 2 mM; e

- solução salina q.s.p.

Breve descr ão da.s fzgnras :

[12] Figura 1: Esquema do aparato experimental pa a a produção de lipossomas pré-formados por meio de processo que utiliza agitação mecânica de alto nível de cisaihamento, sendo 1) reservatório contendo suspensão lipídica CE.PC} ; 2) bomba peristáltíca; 3) tanque contendo tempol diluído em solução salina; 4) agitado mecânico do tipo Uítra-Turrax® .

[13] Figura 2: Teste de citotoxicidad do tempol nas concentrações de 1 - IQmM ^' na linhagem celular humana do epítélío pigmentado da retina (ARPE-19) realizado através do método de thíazolyl blue tetrazolium bromide (ΜΪΤ) após 72 minutos da adição.

[14] Figura 3 Teste de viabilidade celular em .ARPE-19 para determinar citot.oxicids.de das diferentes formulações de n-an.oparticu.las de tempol (NT) enumeradas de 1 a 5 (NT 1 a 5) realizado através- do método de thiazolyl blu tetrazolium bromide ( TT) após 2 horas da adição. Foram testadas as amostras com ρΉ final após o preparo ou ajustado para 7,4 cora ácido clorídrico.

[151 Figura 4: Representação do ensaio de permeabilidad das nanopartícuias de tempol através da monocamada de ARPE-19 obtida no sistema Transwell Insert {HTS ₍ Gostar; Corning Inc, Y, USA) . Após 5 dias de crescimento celular para. a formação da monocamada (100% de confluência) , as formulações foram, adicionadas na porção apical. Após 2 horas as amostras de meio foram coletadas na porção basal e apical. 0 t mpai presente nas amostras foi detectado por meio de espectroscopia de. ressonância paramagnética eietrônica EPR) .

[13] Figura 5: Identificação de tempol por meio de espectroscopia de ressonância paramagnética eietrônica (EPR) nas amostras coletadas no ensaio de permeabilidade celular. Os espectros representam a forma característica triplete do nitróxido tempol. As amostras foram, denominadas de 1 à 5 de acordo com a concentração de lipídios e método de obtenção das nanopartícuias f MT1 â 5 ) . O eixo X corresponde ao magnetismo em Gaus.s, que estabelece a relação entre o fluxo de campo eíétrico que passa através de uma superfície fechada com. a carga elétríca que existe dentro do volume limitado por esta superfície; e o eixo Y é a absorção em unidade arbitrária. Legenda: IA: amostra coletada na parte, apical de células tratadas com NTl; 2A: amostra coletada na parte apical de células tratadas com NT2; 3.Ά: amostra coletada na parte apical de células tratadas com N 3; 4¾; amostra coletada na parte apical de células tratadas com. NT4; 5A: amostra coletada na parte apical de células tratadas com MT5; 1B; amostra coletada na parte basal de células tratadas com NTl; 2B: amostra coletada na parte basal de células tratadas com N 2 ; 3B: amostra coletada na parte basal de. células tratadas com NT3; 4B: amostra coletada na parte basal de células tratadas com NT4; 5E: amostra coletada na parte basal de células- tratadas com NT5-.

{14] Figura 6: Eletrorretinograma dos animais estudados. Gráficos em barras representativos obtidos através da médi ± desvio padrão dos valores de amplitude da "onda b" (A) , tempo Implícito da "onda b" (B ) e o tempo de total de resposta da "onda a" até o pico de culminação da ^v, onda b" (C) sob estímulos luminosos de Odb. No eletrorretinograma (D) ê possível visualizar as variações entre os grupos. Legenda: Ve melho- KY (rato normotenso) ; Azul Royai- SHR (rato hipertenso) ; Verde- SHR DM (rato hipertenso diabético) Azul Celeste^ SHR DM NT4 (rato hipertenso diabético tratado com N ) ; Lilás- SHR DM NT5 (rato hipertenso diabético tratado com NT5 } .

[15] Figura 7: Imunohistoquiímica. para nitrotíresina em cortes de tecido de retina dos animais estudados. A formação de nítrotirosína pode ser observada em marrom nas regiões das plexiformes e no .segmento dos fotorreceptores . *P-0,01 versos WKY e *P=a,005 versos SHR; #p«=0,01 versos SHR DM. Legenda: camada de células ganglionares (CCG) , camada plexlfoxme interna {CPI), camada nuclear interna (CNI), camada piexiforme externa (CP _. E) , camada nuclear externa (CNR) , -segmento dos fotorreceptores (SF).

fl6] Figura 8: Expressão da proteína GFAP. Figura representativa de uma banda de Western blot para GFAP (51 kDa) em lísado total do tecido retiniano dos grupos estudados. A actina (43 kDa.) foi usada como controle interno de pipetagera. Legenda: KY= controle normotenso; SHR= controle hipertenso; SHR-DM- hipertenso diabético; SHR-DM RT4= hipertenso- diabético tratado com N 4 ; SHR-DM NT5- hipertenso diabético tratado- com N 5. Oescxlção detalhada da Invenção

[17] A presente invenção descreve uma composição e formulação farmacêutica para prevenção e tratamento ocular não invasivo. É um objeto adicional o uso.

[18] A composição farmacêutica ocular compreende, os seguintes componentes :

- tempol oxidado com concentração de ImM encapsulado e lipossomas convencionais flexíveis com diâmetro médio variável entre 50 e 2.Q0nm, pref rencialmente entre 50 e lOOnm; compreendem, fosfolipídios co temperatura de transição de fases abai o da temperatura corpórea, preferencialmente fosfatidilcolina de ovo (EFC) com concentração variável entre 1 e 2DmM, referencialmente 2m.M;

- veículo composto de solução salina.

[19] Além destes componentes, a composição da presente invenção ainda pode compreender componentes aditivos utilizados em colírios para proporcionar alguma, característica desejável não alcançada com os componentes já citados que sejam compatíveis com os lipossomas, tais corne, o ácido hialurônico para produzir viscosidade, agentes conservantes, tampões, espessantes, entre outros.

A formulação preferencial compreende:

tempo! oxidado com concentração de ImM em lipossomas convencionais flexíveis com diâmetro médio de 60 n , compreendem fosfatidilcolina de ovo (EPC) com concentração de 2 mH; e

~ solução salina q.s.p.

[203 A composição e a formulação têm uso preventivo no tratamento de retinopatia diabética, podendo seu uso ser extrapolado para outras patologias oculares. [21] Foram realizados testes das formulaçõe in vi iro em linhagem celular do epitélio pigmentado da retina, ARPE-19. O epitélio pigmentado da retina está possivelment envolvido na far acocinética de substâncias hidrofil.icas oculares. As formulações preferenciais foram selecionadas de acordo com baixa citotoxicidade (morte celular ≤10%) e a capacidade de permeação. Posteriormente, a eficácia das formulações lipossoinais selecionadas foi observada ern ensaios in vivo em modelo experimental de RD.

[22] Foram desenvolvidas cinco formulações que diferiram nas concen raçõ s do fos oli ídio, do diluente (etanol, solução salina ou meio de cultura Du.l.becco's Modified Eagle Médium. (DMEM) ) , e no método de associação do fosfolipídio ao tempo1 ΙιτιΜ (adição gradual ou mistura conjunta) . As formulações foram denominadas nanopartículas Í T) e enumeradas de 1 a 5 (NT 1 a 5} . Posteriormente, essas formulações foram caracterizadas quanto á citotoxicidade, diâmetro médio e permeabilidade.

[23] 1 e 2

Preparo da solução mãe de concentração 200 mM de fosfatídilcolina de ovo (EPC) (Lipoid E80- Egg phospholípids with 80% phosphatídylcholíne) (19 gramas diluídos em 100 ml de etanol ) ;

- Adição graduai de 10 ml da solução mãe de EPC ao tempo! lmM (17,25 mg) em solução salina (.90 m.L) (para os ensaios in vivo) ou em. melo de cultura (DMEM) (para os ensaios ia vitxo) . A concentração final de EPC na formulação foi 20mM e tempol lmM. A adição foi feita por meio de bomba peristáltica á vazão 0,3 ml/s, com posterior homogeneização e redução de tamanhos dos iipossomas por meio de agitação mecânica de alto nível de cisal aroento (agitador do- tipo ϋΐ tra-Turrax) em. rotação 24000 rpm por 15 minutos (figura D ;

- Repouso sob refrigeração (4~8°C) por no mínimo 4 horas;

- Etapa adicional de homogeneização e redução de tamanhos dos lipossomas através de passagem em microfluidizador de microcanais de cerâmica operando a alta pressão

(Microfluidics®} ;

- Coleta da dispersão lípídica homogeneizada e divisão em duas partes para a etapa de ultra-fíItração, sendo a primeira sem lavagem e a segunda seguida de lavagem com solução salin .

[24] NT 1 == Sem Lavagem: Ultra-filtração da dispersão d lipossornas em uma célula de ultra-filtração Amicon operando com membrana de tamanho de poros 30n.m. Redução do volume em. até 5% comparado ao iniciai;

[25] NT 2 ~ Com Lavagem: Ultra-filtração da dispersão de lipossomas- em uma célula de ultrafiltração Amicon operando com. membrana de tamanho de poros 30.nm. Redução do volume das partículas em até 5% comparado ao inicial. Posterior lavagem coiti so1ução salina .

- Estocagem das formulações a 4-8 °C por no mínimo 12 horas antes do uso.

- O pH inicial foi mantido ou ajustado para 7,4 de acordo com os experimentos in vítro.

[26] __3

- Preparo da solução mãe de concentração 100 m de EPC (Lipoid EB0- Egg phospholipids with 80% ph sphatidylcholxne) (9,5g em 0,1 ml de etanol e. 99,9 ml de solução salina (para os ensaios in vivo) ou meio de cultura DMEM (para os ensaios in ítro) .

- Adição gradual de í ml da solução mãe de EPC ao tempol ImM (17,25 mg) em solução salina (99 rnL) (para os ensaios in ¾rivo). ou em meio de cultura DMEM (para os ensaios in vítro) · A concentração final de EPC na formulação foi 1 mM e tempol ImM. A adição foi feita por meio de bomba peristáltica à vazão 0,3 ml/s, com posterior homogeneização e redução de tamanhos dos lipossomas por meio de agitação mecânica de alto nível de cisalhamento (agitador do tipo Ultra-Turrax) em rotação 24000 rpm por 15 minutos (figura 1) ;.

- Repouso sob refrigeração (4-8 ^'* C) por no mínimo 4 horas;

- Etapa adicional de homogeneização e redução de tamanhos dos li ossomas através de passagem em microfluidizador de mícrocanais de cerâmica operando a alta pressão (Microfluidics©) ;

- Estocagem da formulação 4-8°C por no mínimo 12 horas antes do uso.

- O pH inicial foi mantido ou ajustado para 7,4 de acordo •com os experimentos in vitro.

[27] T 4

- Preparo da solução mãe- de concentração 2000 m de EPC (Lípoid E80- Egg phospholipids with 80%: phosphatidylcholine) (1,9 g em 1 ml de etanol) .

- Adição gradual de 0,1 ml da solução mãe de EPC ao tempol tempol ImM (17,25 mg) era solução salina (99,9 ml) (para os ensaios in vivo) ou em meio de cultura DMEM (para os ensaios in v tro) . A concentração final de EPC na formulação foi 2 mM e tempol ImM. A adição foi feita por meio de bomba peristáltica â vazão 0,3 ml/s, com posterior homogeneização e redução de tamanhos dos lipossomas por meio de agitação mecânica de alto nível de cisalhamento (agitador do tipo Ultra-Turrax) em rotação 24000 rpm por 15 minutos (figura 1) ;

- Repouso sob refrigeração (4 ^' -8°C) por no mínimo 4 horas

- Etapa adicional de homogeneização e redução de tamanhos dos lipossoma através de passagem em microfluidizador de microcanais de cerâmica operando a alta pressão (Microfluidics®) ;

- Estocagem da formulação a 4-8 °C por no mínimo 12 horas antes do uso»

- O pH iniciai foi mantido ou ajustado para 7, de acordo com os experimentos in vibra.

[28} T 5

- Preparo da solução mãe de concentração 1000 M de EPC (Lipoid E8Q- Egg phospholiplds with 80% phosphãtidylcholine) .{ ^• 9,5g em 9,9 mi de DME + 0,1 ml de etanol para os ensaios ín vitro ou 9,9 ml de solução salina + 0,1 ml de etanol para os ensaios in vivo) ;

- Mistura de 1 ml da solução mãe de EPC com tempollmM (17,25 mg) diluído em solução salina (99 mL} solução salina (para os ensaios in viva) ou com. meio de cultura DMEM (para os ensaios in vitro) . A concentração final de EPC na formulação foi 10,99 mM e tempo! IjnM. Homogeneização e redução de tamanhas dos .lipossomas por meio de agitação mecânica de alto nível de císalhamento (agitador do tipo Ultra-Turrax) em rotação 24000· rpm por 15 minutos (figura 1} ;

- Repouso sob refrigeração (4-8°C) por no mínimo 4 horas;

- Etapa adicionai de homogeneização e redução de tamanhos dos lipossomas atra és de passagem em microf.luidizador de microcanais de cerâmica operando a alta pressão (Microfluidics©)

- Estocagem da formulação a 4-8 °C por no mínimo 12 horas antes do uso.

- O pH inicial foi mantido o ajustado para 7,4 de acordo com os experimentos in vitro,

[29] O teste de viabilidade celular em cultura ARPE-19 através do método de thiazoiyl blue tetrazolium bromide (MTT) demonstrou ausência de citotoxicidade do tempol nas concentrações de 1-10 mM durante 2 horas de exposição (figura 2) . As formulações foram submetidas ¹ ao teste de citotoxicidade através do método de i TT após 2 horas da adição. As amostras ST2 pH=7,4; NT3 pK=8,7; N 4 pH=8, 6 e 7,4; NT5 pR-8,7 apresentaram citotoxicidade inferior a 10%, ou seja, apropriada para os estudos in vitro (figura 3) .

[30] O tamanho dos lipossomas encapsulando tempol obtidos nos diferentes processos das formulações selecionadas pelo teste de citotoxicidade, foi caracterizado por meio do seu diâmetro médio hidrodinâmico, medido por meio de espalhamento de luz utilizando laser de alta potência, em equipamento Zetasizer®. Todas as formulações atingiram, dimensões nancmétricas (tabela 1).

Tabela 1. Diâmetro médio hidrodinâmico dos lipossomas encapsulando tempol nas formulações NT2-NT5.

[31] A permeação das nanopartieulas de tempol foi verificada através da capacidade de. atravessar a barreira externa da retina, ou seja, a monocamada de células do epítéi.i.o pigmentado da retina. Para este ensaio, as células ARPE-19 (8xl0 ⁶ ) foram semeadas em inserts com filtros de poliéster transparente com poro de 0,4 pm e área de crescimento de 0,33 cm ² (I-ITS, Gostar; Corniiiglnc, Y, USA) em placas de 24 wells _\ figura 4). Após 5 dias de crescimento c lular para a formação da monocamada (100% de confluência), as formulações foram adicionadas na porção apical. Após 2 horas, as amostras de meio foram coletadas na porção basal. O tempol presente nas amostras foi detectado através do ensaio com. espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica (EPR) (figura 5) . Dentre os tripletes observados, os maiores espectros obtidos na parte basal correspondem às formulações NT 4 e 5 (nas cores preto e vermelho) . Portanto, baseado nestes experimentos, concluímos que os inventos NT4 e N 5 foram os mais eficazes, por apresentaram maior permeabilidade através da monocamada de células ARPE-19 (figura 5) e baixa citotoxicídade (figura 3).

[32] As formulações de colírio N e RT5 foram submetidas a ensaios in vivo. A única diferença no método de preparo destas soluções foi a substituição da diluição do tempol com meio DMEM pela solução salina. Para os testes de eficácia deste invento, foram utilizados ratos com 4 semanas de idade, espontaneamente ipertensos (SHR) submetidos ou não a indução do diabetes (DM) com estreptozotoc na (50mg/kg) e seu controle normotenso (WKY) divididos nos seguintes grupos: WKY; SHR; SHR-DM; SHR-DM N 4; SHR-DM N 5. O tratamento com o colírio teve inicio após a confirmação do diabetes. Após 20 dias de tratamento, os animais foram submetidos à avaliação funcional da retina através do exame de eletrorretinografia e posteriormente sacrificado para obtenção de tecido de retina e extrato protéico. O objetivo foi reproduzir com este tratamento tópico, os parâmetros observados era trabalho do nosso grupo previamente publicado (Rosales et al. _: , 10VS 2010) , onde a in eção intraperitoneal de tem o1 foi eficaz em reduzir os marcadores estruturais da RD como a expressão da proteína acidica fibrilar glial (GFAP) e aumento de formação de nitrotírosina. Os dados fisiológicos destes animais encontram-se na tabela 2.

Tabela 2. Dados fisiológicos dos animais estudados. Pressão arterial sistoiica (PAS) e porcentagem de hemoglobina glicada total (HbA ( % ) .

Legenda: WKY: rato normotenso SHR : rato hipertenso; SHR DM rato hipertenso diabético; SKR DM N 4 : rato hipertens diabético tratado com nanoparticula de tempol 4; SHR DM N 5 rato hipertenso diabético tratado com nanoparticula d t mpol 5.

[33] O eletrorretinograma (ERG) demonstrou uma disfunção retiniana detectado pela diminuição da amplitude da "onda b" nos animais SHR comparados aos animais WKY (P=0.0009], e nos animais SHR DM em relação ao seu controle SHR (Ρ=0.ϋ5) , ou seja, a deflexão positiva gerada pelas células de Muller que representa a atividade eiétrica das células bipolares esteve reduzida (figura 6R e D) . O: tratamento dos animais SHR DM com o colírio NT4 preveniu esta alteração comparado ao SHR D ⁽ P=0.05) (figura €A e D). O tempo implícito de resposta da "onda b" e total foram maiores nos animais SHR DM em relação aos controles (P<0.0003 e P<0.0004, respectivamente) e prevenidos com ambos os colírios NT4 e M 5 (P<0.GQ3 e P<0.01, respectivamente) (figura 6B, C, D). O tratamento tópica com a formulação NT5 preveniu parcialmente a amplitude da "onda b" (figura 6A, D), porém sem significância estatística (P-0.1). Com estes resultados concluímos que as alterações na função retiniana nos animais DM foram prevenidas com o tratamento tópico de nanoparticula de tempol, em especial com a formulação N .

[34] Para verificarmos a presença do estresse oxidatívo^nitrosativo neste modelo e o efeito do uso tópico das nanoparticulas de tempol., verificamos a formação de nitrotirosina através do método de imunohi.stoquim.ica, promovido pela reaçâo de peroxinitrito ou dióxido de nitrogénio nos resíduos de ti osina da proteína. Como esperado, foi observado um aumento na positividade para nitrotirosina no grupo SHR DM comparado aos controles WKY e SHR (Ρ≤0,01ϊ . Assim como os resultados do ERG, o tratamento com N 4 foi preventivo (P=0., 01} e a N 5 demonstrou uma tendência (?=0,0-9), porém não significativa (figura 7).

[35] A avaliação de um marcador precoce de P.D foi obtida através de ensaios de Western Blotting para verificação da expressão de GFAP. Os resultados^ preliminares demonstram um aumento na expressão de GFAP no grupo SHR DM em relação aos controles e o efeito protetor do tratamento com os colírios NT 4 e NT5 (figura 8) .

[36] .0 uso tópico: da NT4 foi capaz de prevenir marcadores precoces de RD (nitrotirosina e GFAP) e consequentemente promover efeitos protetores na retina funcional observado pelo ERG. No entanto, a formulação NT-5 apresentou tendências nos parâmetros avaliados.