【발명의 명칭】

플루옥세틴 및 비타민 C를 유효성분으로 함유하는 중추신경계 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물

[기술분야]

본 발명은 플루옥세틴 ( f luoxet ine) 및 비타민 C vi tamin C)를 유효성분으로 함유하는 뇌혈관장벽 장애 및 중추신경계 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

[배경기술】

신경조직에는 특정한 물질들이 혈관으로부터 들어가는 것을 막는 일종의 장벽이 존재한다. 이러한 기능적인 장벽을 뇌혈관장벽 (blood-brain barr ier : BBB, 또는 뇌혈관 관문)이라고 한다. 뇌혈관장벽은 신경의 미세 환경의 항상성을 유지하는 뇌 모세혈관이 매우 분화되어 있는 형태이다. 뇌혈관장벽은 신경조직에 있는 모세혈관이 다른 조직에 비해 낮은 혈관 투과성을 유지함으로써 쓸모없는 물질들의 이동을 최소한으로 유지할 수 있도록 형성된 구조이다. 뇌혈관장벽을 이루는 주된 구조는 모세혈관 내피세포 (capi l lary endothel ial cel l )에 있는 폐쇄연접 (t ight junct ion) 또는 폐쇄띠 (zonula occluden)로 구성되어 있다. 내피세포의 세포질에는 다른 여러 부위의 모세혈관에서 볼 수 있는 창 ( fenestra)이 없으며, 포음소포 (pinocytot ic vesicle)도 아주 드물게 존재한다. 신경조직에 필요한 작은 분자량의 물질은 세포막에 있는 운반물질 (carr ier)과 결합하여 내피를 통해 뇌실질로 들어간다. 뇌혈관장벽은 이은이나 단백질， 기타 물질이 중추신경계 환경으로 불특정 유입되는 것을 차단하므로， 이러한 장벽으로서의 역할은 혈액으로부터 공급되는 해로운 성분들로부터 신경원을 보호하며 필수적인 물질들은 투과되도록 한다. 뇌경색 및 외상과 같은 뇌 손상의 대부분은 뇌혈관장벽의 붕괴와 연관되며 이는 신경원의 이차적인 손상을 초래한다. 따라서， 뇌혈관장벽의 발생 기전과 조절에 대한 연구는 중추신경계 질환을 이해하고 치료하는데 매우 중요하다. 또한， 많은 종류의 약물과 대사물질이 뇌혈관장벽을 투과하지 못하므로， 뇌혈관장벽의 적절한 조절은， 치매를 포함한 여러 가지 뇌질환을 치료함에 있어서 약물을 적재적소에 투여할 수 있는 아주 중요한 부분이 된다고 할 수 있다. 일반적으로, 뇌혈관장벽은 뇌의 항상성을 보호하는 작용을 하는 기관으로 간주될 수 있다. 뇌혈관 장벽의 기능장애는 뇌 장애와 관련이 있다. 예를 들어， 혈관인성 뇌부종은 가장 흔한 형태의 뇌부종으로 모세혈관의 투과성이 증가되어 발생한다. 뇌혈관장벽이 어떤 원인으로 느슨해지면서， 혈청 단백질에 대한 투과성이 증가되어 혈장 여과액이 세포 사이 공간으로 빠져나가 뇌부종이 발생한다. 이는 발작， 뇌 감염， 두부 외상， 뇌 종양 및 다발성 경화증과 같은 장애들에 있어 불능 및 죽음의 주요 원인이다. 또한， 다발성 경화증은 활성화된 자동반웅 T 세포가 활성화된 뇌혈관장벽을 통과한다. CNS 내에서， 이 T 세포는 수초께 대해 표적화된 염증 반웅을 유도하고 뇌혈관장벽의 파멸을 유발하여， 파멸된 뇌혈관장벽으로 자동항체 및 보체 인자가-유입되어 탈수초화 공정을 초래한다. 또한， 세포 외 유체 내에서의 신경전달물질과 미세한 이온들의 균형이 깨지게 되면， 뉴런 신호전달의 손상을 초래하고， 이에 인식 기능화의 손상, 신경 정신 장애 또는 간질성 발작이 초래된다. 또한， 혈류로의 뇌혈관장벽 전반에 걸친 손상된 독성 단백질 제거는 최근 알츠하이머병과 같은 신경퇴행 장애 및 크루츠펠트 -제이야콥병 및 BSE와 같은 프라이온 질병의 병인이다. 따라서， 기능장애 뇌혈관장벽의 치료는 뇌 장애의 치료를 위한 새로운 해결책으로 제시되고 있다. 플루옥세틴 ( f luoxet ine)은 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 계열의 항우울제로， 우울증， 강박 장애, 폭식증， 신경성 무식욕증 및 공황장애의 치료제로 사용되고 있다. 항우울제로의 효과 이외에 플루옥세틴에 대하여， 마우스에서의 최대 전격경련 시험에서 카르바마제핀, 페니토인 및 아멜틀리드 (ameltolide)의 항경련 효과를 증가시킨다는 것이 보고되었고 (Leander, J.D. , 1992, Epilepsai 33:573-576), 플루옥세틴이 동시에 투여된 항간질성제의 효과를 증가시킬 수 있기 때문에 간질 문제를 갖는 우울증 환자의 치료에도 유용할 수 있다고 보고되었다. 최근 들어， 허혈성 외상 (ischemic injury) 후에 항 -염증 효과를 나타내어 신경보호 효과로 사용될 수 있음이 보고되었고 (Lim, CM. et. al, 2009， J. Neurosci . Res. 87, 1037-1045) , 척추손상 (spinal cord injury) 후에 매트릭스 메탈로프로테이나제 (matrix metal loproteinase, 醒 P)의 활성을 억제하여 혈관척수장벽 (blood spinal cord barrier)의 파괴를 예방할 수 있음이 보고된바 있다 (Lee, J.Y. et . al, 2012, Brain 135, 2375-2389) .

비타민 C vitamin C)는 인체의 기능과 건강 유지를 위한 미량 원소 중의 하나로 아스코르반산 (ascorbic acid)이라고도 불리운다. 비타민 C는 인체가 감염에 대해서 저항하며 상처를 치유하고 조직을 건강하게 유지할 수 있도록 도우며， 항산화제 중의 하나로서 자유기에 의한 세포손상을 방지하는 것으로 알려져 있다. 뇌혈관 장벽의 파괴 및 감각장애의 치료에 대하여， 비타민 C가 지속적인 압박으로 인하여 유발된 뇌혈관장벽 및 감각 신경의 손상을 개선하는 효과를 나타내는 것미 보고된바 있다 (J-LLin a/, 2010， jcbfm 30, 1121-1136). 그러나, 상기 플루옥세탄 및 비타민 C가 뇌혈관장벽 장,애의 손상을 개선하는 효과에 대하여는 보고된 바가 없다. 이에， 본 발명자들은 낮은 농도의 조성물을 투여하면서 보다 효과적으로 뇌혈관장벽 장애 및 중추신경계 질환을 치료하기 위한 방법을 연구하기 위해 노력한 결과， 플루옥세틴 또는 비타민 C의 단독투여에서 뇌혈관장벽 및 뇌척수장벽의 파괴에 대한 개선효과를 나타내지 않는 낮은 농도의 플루옥세틴 및 비타민 C을 흔합하여 척수손상 (spinal cord injury) 및 일시적 전뇌허혈 (transient global ischemia) 동물모델에 동시투여하였을 때， 척수손상 동물모델에서 뇌척수장벽의 투과성 증가 억제 효과， MP— 9 활성 억제 효과 및 혈관 세포 유입 완화 효과를 나타내고， 일시적 전뇌허혈 동물모델에서 뇌혈관장벽 파괴 억제 효과 및 기억력 회복 효과를 나타내는 것을 확인하였으며， 상기 효과들은 동일 농도의 플루옥세틴 또는 비타민 C의 단독투여보다 현저한 효과를 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

[발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

본 발명의 목적은 낮은 농도의 플루옥세틴 ( f luoxet ine) 및 비타민 CCvi tamin C)를 포함하는 뇌혈관장벽 (brain blood barr ier , BBB) 장애 및 중추신경계 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법】

상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 플루옥세틴 ( f luoxet ine) 및 비타만 CCvi tamin C)를 유효성분으로 함유하는 뇌혈관장벽 (brain blood barr ier， BBB) 장애의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한， 본 발명은 플루옥세틴 및 비타민 C를 유효성분으로 함유하는 중추신경계 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한， 본 발명은 플루옥세틴 및 비타민 C를 유효성분으로 함유하는 뇌혈관장벽 장애의 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

또한， 본 발명은 플루옥세틴 및 비타민 C를 유효성분으로 함유하는 중추신경계 질환의 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

또한， 본 발명은 플루옥세틴 및 비타민 C를 뇌혈관장벽 장애에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌혈관장벽 장애의 치료 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 플루옥세틴 및 비타민 C를 중추신경에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 중추신경계 질환의 치료 방법을 제공한다.

또한， 본 발명은 유효한 양의 플루옥세틴 및 비타민 C를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌혈관장벽 장애의 예방 방법을 제공한다.

또한， 본 발명은 유효한 양의 플루옥세틴 및 비타민 C를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 중추신경계 질환의 예방 방법을 제공한다.

또한， 본 발명은 뇌혈관장벽 장애의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 용도로 사용하기 위한 플루옥세틴 및 비타민 C를 제공한다.

또한， 본 발명은 중추신경계 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 용도로 사용하기 위한 플루옥세틴 및 비타민 C를 제공한다.

또한, 본 발명은 뇌혈관장벽 장애의 예방 및 개선용 건강 식품의 용도로 사용하기 위한 플루옥세틴 및 비타민 C를 제공한다.

또한， 본 발명은 중추신경계 질환의 예방 및 개선용 건강 식품의 용도로 사용하기 위한 플루옥세틴 및 바타민 C를 제공한다.

【유리한 효과】

본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C는 단독투여시 뇌혈관장벽 장애 개선에 대하여 유의적인 효과를 나타내지 않는 농도로 알려진 극미량의 플루옥세틴 및 비타민 c를 흔합하였을 때， 척수손상 및 일시적 전뇌허혈 동물모델에서 상기 단독투여에 비하여 뇌혈관장벽 파괴에 대한 상승효과 (synergy ef fect ) 및 적은 농도의 화합물 투여를 통한 부작용 감소 효과를 나타내므로， 본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C을 포함하는 조성물은 뇌혈관장벽 장애의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 척수손상 후의 뇌척수장벽 (Blood-spinal cord barr ier , BSCB) 손상에 대한 플루옥세틴 ( f luoxet ine) 및 비타민 CCvi tamin C) 동시 -치료 (co-treatment )의 뇌척수장벽 투과성 증가 억제 효과를 나타낸다; 도 1A는 에반스 블루 (evans blue)가 침착된 척수손상 동물모델의 척수를 나타내며; 및

도 1B는 상기 척수손상 동물모델의 척수에서 정량한 에반스 블루 색소 (dye)의 양을 나타낸다. *는 음성대조군에 비해 유의한 차이를 나타내는 결과를 표시한 것이다.

도 2는 척수손상 후의 매트릭스 메탈로프로테이나제 -9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)에 대한 플루옥세틴 및 비타민 C동시—치료의 활성 억제 효과를 나타낸다;

도 2A는 척수손상 동물모델에서의 MMP-9 및 MMP-2의 효소 활성을 나타내며; 및

도 2B는 상기 MMP-9단백질 활성의 상대적인 강도 (relative intenrity)를 나타낸다. *는 음성대조군에 비해 유의한 차이를 나타내는 결과를 표시한 것이다.

도 3은 척추 손상 후 플루옥세틴 및 비타민 C 동시-치료에 따른 대식세포 (macrophage) 마커의 발현을 나타낸다;

도 3A는 척추손상 동물모델에서의 ED-1 단백질의 발현을 나타내며; 및 도 3B는 상기 ED-1 단백질의 상대적인 강도를 나타낸다. *는 음성대조군에 비해 유의한 차이를 나타내는 결과를 표시한 것이다.

도 4는 척추손상 후 플루옥세틴 및 비타민 C 동시-치료에 따른 염증세포 침윤 (inflitration) 완화 효과를 나타낸다;

도 4A는 척추손상 동물모델에 비타민 C 및 플루옥세틴 투여 개시 1 일 후의 호중구 (neutrophil)마커인 미엘로퍼옥시다아제 (myeloperoxidase, MPO) 및 5 일 후의 ED-1의 세포 내 발현을 나타내며 ;

도 4B는 척추손상 동물모델에서 MP0 및 ED-1의 세포 내 발현에 대한 상대적인 강도를 나타내고， *는 음성대조군에 비해 유의한 차이를 나타내는 결과를 표시한 것이며; 및

도 4C는 MP0 및 ED-1의 발현 정도를 측정한 척수 조직의 위치의 표시를 나타낸다.

도 5는 일시적 전뇌허혈 (transient global ischemia) 후의 뇌혈관장벽 (brain blood barrier, BBB)에 대한 플루옥세틴 및 비타민 C 동시-치료의 파괴 (disruption) 억제 효과를 나타낸다;

도 5A는 에반스 블루가 침착된 일시적 전뇌허혈 동물모델의 전뇌를 나타내며; 및

도 5B는 상기 일시적 전뇌허혈 동물모델의 전뇌에서 정량한 에반스 블루 색소 (의 양을 나타낸다. *는 음성대조군에 비해 유의한 차이를 나타내는 결과를 표시한 것이다.

도 6은 일시적 전뇌허혈 후의 해마-의존적 단기 기억력 (hi ppocampal -dependent short-term memory)에 대한 플루옥세틴 및 비타민 C 동시-치료의 기억력 회복 효과 확인을 나타낸다;

도 6A는 Y-미로 (Y-maze) 실험에서 일시적 전뇌허혈 동물모델의 자발적 변경를 (spontaneous alternat ion)의 백분율을 나타내며; 및

도 6B는 상기 일시적 전뇌허혈 동물모델이 총 통로에 돌어간 횟수 (total arm entry)를 나타낸다. *는 정상군에 비해 유의한 차이를 나타내는 결과를 표시하며， #는 음성 대조군에 비해 유의한 차이를 나타내는 결과를 표시한다. 도 7은 일시적 전뇌허혈 동물모델의 해마 조직을 나타낸다.

도 8은 일시적 전뇌허혈 동물모델의 해마 CA1 뉴런 지역 내에서 남아있는 신경세포 (preserved cell)의 비율을 나타낸다. #는 음성 대조군에 비해 유의한 차이를 나타내는 결과를 표시한다.

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

이하， 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명은 플루옥세틴 (fluoxetine) 및 비타민 (Xvitamin C)를 유효성분으로 함유하는 뇌혈관장벽 장애의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 플루옥세틴 및 비타민 C는 1:500 내지 1:10의 비율로 흔합되는 것이 바람직하며， 구체적으로 1:200 내지 1:50의 비율로 흔합되는 것이 보다 바람직하고， 더욱 구체적으로 1:100의 비율로 흔합되는 것이 가장 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.

상기 플루옥세틴은 0.1 내지 10 mg/kg으로 포함되는 것이 바람직하며， 구체적으로 0.5 내지 5 mg/kg으로 포함되는 것이 보다 바람직하고， 더욱 구체적으로 0.8 내지 2 mg/kg으로 포함되는 것이 가장 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.플루옥세틴이 10 mg/kg 초과로 포함되는 경우에는 단독으로도 상기 뇌혈관장벽 장애에 대한 예방 및 치료효과를 나타내고， 10 mg/kg 이하로 경우에는 단독으로 상기 뇌혈관장벽 장애에 대한 예방 및 치료효과를 나타내지 않으나， 본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C 동시투여에서는 플루옥세틴이 10 mg/kg 이하인 경우에도 상기 뇌혈관장벽 장애에 대한 상승효과 (synergy ef fect ) 및 부작용 감소 효과를 나타내므로 효과적이다.

상기 비타민 C는 10 내지 500 mg/kg으로 포함되는 것이 바람직하며， 구체적으로 50 내지 200 mg/kg으로 포함되는 것이 보다 바람직하고， 더욱 구체적으로 70 내지 150 mg/kg으로 포함되는 것이 가장 바람직하나， 이에 한정되지 않는다. 비타민 C가 500 mg/kg 초과로 포함되는 경우에는 단독으로도 상기 뇌혈관장벽 장애에 대한 예방 및 치료효과를 나타내고 (J i a-Li Lin et . al， Jouanl of cerebral blood f low & metabol i sm (2010) 30， 1121-1136) , 500 mg/kg 이하로 경우에는 단독으로 상기 뇌혈관장벽 장애에 대한 예방 및 치료효과를 나타내지 않으나, 본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C 동시투여에서는 비타민 C가 500 mg/kg 이하인 경우에도 상기 뇌혈관장벽 장애에 대한 상승효과 및 부작용 감소 효과를 나타내므로 효과적이다.

상기 뇌혈관장벽 장애는 척수손상， 만성 또는 급성 뇌졸중， 뇌경색， 뇌종양， 뇌부종， 뇌 허혈， 알츠하이머병 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다/ 본 발명의 구체적인 실시예에 있어서， 본 발명자들은 래트 (rat )에 척수손상 (spinal cord injury)을 유발한 후， 1 mg/kg 플루옥세틴 및 100 mg/kg 비타민 C을 동시투여하여 척수손상 동물모델을 제조하였고， 척수손상 후의 뇌척수장벽 (Blood-spinal cord barr i er , BSCB) 손상에 대한 투과성 증가 억제 효과를 확인한 결과, 플루옥세틴 및 비타민 C를 동시투여하였을 때 음성 대조군, 비타민 C 단독투여군 및 플루옥세틴 단독투여군에 비해 투과성 증가를 약 50% 수준으로 억제함으로써， 척수손상 후 뇌척수장벽 손상에 대하여 약 2 배의 현저한 치료효과를 나타내는 것을 확인하였다 (도 1 참조) .

또한， 본 발명자들은 상기 척수손상 동물모델쎄서 뇌척수장벽의 파괴 및 염증 반응에 관여하는 것으로 알려진 腿 P-9의 효소 활성을 확인을 확인한 결과 플루옥세틴 및 비타민 C를 동시투여하였을 때 음성 대조군, 비타민 C 단독투여군 및 플루옥세틴 단독투여군에 비해 匪 P-9의 효소 활성을 약 50% 수준으로 억제함으로써， 뇌척수장벽의 파괴 및 염증 반웅에 대하여 약 2 배의 현저한 치료효과를 나타내는 것을 확인하였다 (도 2 참조) .

또한， 본 발명자들은 상기 척수손상 동물모델에서 혈액 세포 유입 완화 효과를 확인하기 위하여 대식세포 (macrophage) 마커인 ED-1 및 호중구 (neutrophi l ) 마커인 미엘로퍼옥시다아제 (myeloperoxidase , MP0)의 발현을 확인한 결과， 플루옥세틴 및 비타민 C를 동시투여하였을 때 음성 대조군， 비타민 C 단독투여군 및 플루옥세틴 단독투여군에 비해 ED-1 단백질의 발현을 약 25% 수준으로 억제하여 정상군과 유사한 정도를 나타내므로, 현저한 효과를 나타내는 것을 확인하였으며 (도 3 참조) , 음성 대조군에 비해서 상기 마커의 세포 내 발현을 약 60%수준으로 억제하는 것을 확인하였다 (도 4참조) . 또한， 본 발명자들은 마우스에서 일시적 전뇌허혈 ( trans ient global i schemia)을 유발한 후， 1 mg/kg 플루옥세틴 및 100 nig/ kg 비타민 C을 동시투여하여 일시적 전뇌허혈 동물모델을 제조하였고， 상기 일시적 전뇌허혈 동물모델에서 뇌혈관장벽 (brain blood barr ier , BBB)의 파괴 (di srupt ion) 억제 효과를 확인하기 위해 에반스 블루를 쥐에 주사하고 손상된 뇌 장벽을 투과하여 전뇌로 유입된 에반스 블루의 양을 조사한 결과, 플루옥세틴 및 비타민 C를 동시투여하였을 때 음성 대조군， 비타민 C 단독투여군 및 플루옥세틴 단독투여군에 비해 투과성 증가를 약 50% 수준으로 억제함으로써， 일시적 전뇌허혈로 인한 뇌 장벽손상에 대하여 약 2 배의 현저한 치료효과를 나타내는 것올 확인하였다 (도 5 참조) .

또한， 본 발명자들은 상기 일시적 전뇌허혈 동물모델에서 해마-의존적 단기 기억력 (hippocampal—dependent short-term memory)의 회복 효과를 확인한 결과， 플루옥세틴 및 비타민 C를 동시투여하였을 때 음성 대조군， 비타민 C 단독투여군 및 플루옥세틴 단독투여군에 비해 단기 기억력이 유의적으로 상승하는 것을 확인하였으며 (도 6 참조)， 해마 조직의 CA1 뉴런 지역의 세포 손상도가 감소하여 뉴런 세포가 정상군과 유사한 수준으로 회복되는 현저한 효과를 나타내는 것을 확인하였다 (도 7 및 8 참조) .

따라서， 본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C의 동시투여는 플루옥 ^" 세틴 또는 비타민 C의 단독투여에서 뇌혈관장벽 및 뇌척수장벽의 파괴에 대한 개선효과를 나타내지 않는 낮은 농도에서도 현저한 효과를 나타내고, 이는 낮은 농도의 화합물 투여로 인한 상승효과 (synergy ef fect ) 및 부작용 감소 효과를 나타내므로， 본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C는 뇌혈관장벽 장애의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제， 증량제， 결합제， 습윤제， 붕해제， 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제， 환제， 산제, 과립제， 캡슐제 등이 포함되며， 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면， 전분， 탄산칼슘， 수크로오스 (sucrose) 또는 락토오스 ( lactose) , 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한， 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘， 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제， 내용액제， 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데， 흔히 사용되는 단순 회석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제， 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액， 비수성용제， 현탁용제， 유제， 동결건조제제 또는 좌제 등이 _. 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol ) , 폴리에틸렌 글리콜， 을리브 오일과 같은 식물성 기름， 에틸을레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol ) , 마크로골， 트원 (tween) 61， 카카오지， 라우린지， 글리세를, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며， 비경구 투여시 피부외용 또는 복강내， 직장, 정맥， 근육， 피하， 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하며， 가장 바람직하게는 피부외용으로 사용한다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서， "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 /위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며， 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류， 중증도 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간， 투여 경로 및 배출 비율， 치료기간，동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며， 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별 건강상태， 식이， 투여시간， 투여방법， 배설율 및 질환의 증증도에 따라 그 범위가 다양하며， 하루 1 ~ 6회 투여될 수 있다. 그러나 투여 경로， 비만의 중증도, 성별， 체증， 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 단독으로， 또는 수술， 방사선 치료, 호르몬 치료， 화학 치료 및 생물학적 반웅 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 플루옥세틴 및 비타민 C를 유효성분으로 함유하는 중추신경계 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 플루옥세틴 및 비타민 C는 1 :500 내지 1 : 10의 비율로 혼합되는 것이 바람직하며, 구체적으로 1 : 200 내지 1 : 50의 비율로 흔합되는 것이 보다 바람직하고， 더욱 구체적으로 1 : 100의 비율로 흔합되는 것이 가장 바람직하나， 이에 한정되지 않는다..

상기 플루옥세틴은 0. 1 내지 10 mg/kg으로 포함되는 것이 바람직하며, 구체작으로 0.5 내지 5 mg/kg으로 포함되는 것이 보다 바람직하고， 더욱 구체적으로 0.8 내지 2 mg/kg으로 포함되는 것이 가장 바람직하나， 이에 한정되지 않는다. 플루옥세틴이 10 mg/kg 초과로 포함되는 경우에는 단독으로도 상기 뇌혈관장벽 장애에 대한 예방 및 치료효과를 나타내고， 10 mg/kg 이하로 경우에는 단독으로 상기 뇌혈관장벽 장애에 대한 예방 및 치료효과를 나타내지 않으나， 본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C 동시투여에서는 플루옥세틴이 10 mg/kg 이하인 경우에도 상기 중추신경계 질환에 대한 상승효과 및 부작용 감소 효과를 나타내므로 효과적이다.

상기 비타민 C는 10 내지 500 mg/kg으로 포함되는 것이 바람직하며， 구체적으로 50 내지 200 mg/kg으로 포함되는 것이 보다 바람직하고, 더욱 구체적으로 70 내지 150 mg/kg으로 포함되는 것이 가장 바람직하나， 이에 한정되지 않는다. 비타민 C가 500 mg/kg 초과로 포함되는 경우에는 단독으로도 상기 뇌혈관장벽 장애에 대한 예방 및 치료효과를 나타내고， 500 mg/kg 이하로 경우에는 단독으로 상기 뇌혈관장벽 장애에 대한 예방 및 치료효과를 나타내지 않으나， 본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C 동시투여에서는 비타민 C가 500 mg/kg 이하인 경우에도 상기 뇌혈관장벽 장애에 대한 상승효과 및 부작용 감소 효과를 나타내므로 효과적이다.

상기 중추신경계 질환은 척수손상, 만성 또는 급성 뇌졸중， 뇌경색， 뇌종양， 뇌부종 뇌허혈， 알츠한이머병 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C의 동시투여는 플루옥세틴 또는 비타민 C의 단독투여에서 뇌혈관장벽 및 뇌척수장벽의 파괴에 대한 개선효과를 나타내지 않는 낮은 농도에서도 현저한 효과를 나타내고， 이는 낮은 농도의 화합물 투여로 인한 상승효과 및 부작용 감소 효과를 나타내므로， 본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C는 중추신경계 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

또한， 본 발명은 플루옥세틴 및 비타민 C를 유효성분으로 함유하는 뇌혈관장벽 장애의 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

또한， 본 발명은 플루옥세틴 및 비타민 C를 유효성분으로 함유하는 증추신경계 질환의 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

상기 플루옥세틴 및 비타민 C는 1 : 500 내지 1 : 10의 비율로 흔합되는 것이 바람직하며， 구체적으로 1 : 200 내지 1 : 50의 비율로 흔합되는 것이 보다 바람직하고， 더욱 구체적으로 1 : 100의 비율로 흔합되는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 플루옥세틴은 0. 1 내지 10 mg/kg으로 포함되는 것이 바람직하며, 구체적으로 0.5 내지 5 nig/kg으로 포함되는 것이 보다 바람직하고ᅳ 더욱 구체적으로 0.8 내지 2 mg/kg으로 포함되는 것이 가장 바람직하나， 이에 한정되지 않는다. 플루옥세틴이 10 mg/kg 초과로 포함되는 경우에는 단독으로도 상기 뇌혈관장벽 장애에 대한 예방 및 치료효과를 나타내고， 10 mg/kg 이하로 경우에는 단독으로 상기 뇌혈관장벽 장애에 대한 예방 및 치료효과를 나타내지 않으나， 본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C 동시투여에서는 플루옥세틴이 10 mg/kg 이하인 경우에도 상기 뇌혈관장벽 장애 및 중추신경계 질환에 대한 상승효과 및 부작용 감소 효과를 나타내므로 효과적이다.

상기 비타민 C는 10 내지 500 mg/kg으로 포함되는 것이 바람직하며， 구체적으로 50 내지 200 mg/kg으로 포함되는 것이 보다 바람직하고， 더욱 구체적으로 70 내지 150 mg/kg으로 포함되는 것이 가장 바람직하나， 이에 한정되지 않는다. 비타민 C가 500 mg/kg 초과로 포함되는 경우에는 단독으로도 상기 뇌혈관장벽 장애에 대한 예방 및 치료효과를 나타내고， 500 mg/kg 이하로 경우쎄는 단독으로 상기 뇌혈관장벽 장애에 대한 예방 및 치료효과를 나타내지 않으나， 본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C 동시투여에서는 비타민 C가 500 mg/kg 이하인 경우에도 상기 뇌혈관장벽 장애에 대한상승효과 및 부작용 감소 효과를 나타내므로 효과적이다.

상기 뇌혈관장벽 장애 및 중추신경계 질환은 척수손상, 만성 또는 급성 뇌졸중， 뇌경색， 뇌종양， 뇌부종， 뇌허혈， 알츠하이머병 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C의 동시투여는 플루옥세틴 또는 비타민 C의 단독투여에서 뇌혈관장벽 및 뇌척수장벽의 파괴에 대한 개선효과를 나타내지 않는 낮은 농도에서도 현저한 효과를 나타내고， 이는 낮은 농도의 화합물 투여로 인한 상승효과 및 부작용 감소 효과를 나타내므로， 본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C는 뇌혈관장벽 장애 및 중추신경계 질환의 예방 및 개선용 건강식품의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 .특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제， 육류, 소시지， 빵, 비스킷， 떡， 초콜릿， 캔디류， 스낵류，과자류，피자，라면，기타 면류， ¾류，아이스크림류를 포함한 낙농제품， ^' 각종 스프, 음료수， 알코올 음료 및 비타민 복합제， 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며， 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C는 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 흔합량은 그의 사용 목적 (예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로， 건강식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0. 1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며， 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 플루옥세틴 및 비타민 C를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드，' 예를 들어， 포도당， 과당등; 디사카라이드ᅳ예를 들어 말토스， 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드， 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 둥과 같은 통상적인 당， 및 자일리를， 소르비를， 에리트리를 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미게 (타우마틴， 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제 (사카린， 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C는 여러 가지 영양제， 비타민, 광물 (전해질)， 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제， 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등)， 펙트산 및 그의 염， 알긴산 및 그의 염， 유기산, 보호성 콜로이드 증점제， pH 조절제， 안정화제， 방부제， 글리세린， 알코올， 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C는 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한과육을 함유할 수 있다. 이라한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C 100 중량부 당 0. 1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다. 또한， 본 발명은 플루옥세틴 및 비타민 C를 뇌혈관장벽 장애에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌혈관장벽 장애의 치료 방법을 제공한다. 또한， 본 발명은 플루옥세틴 및 비타민 C를 중추신경에 걸린 개체에 투껴하는 단계를 포함하는 중추신경계 질환의 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C의 동시투여는 플루옥세틴 또는 비타민 C의 단독투여에서 뇌혈관장벽 및 뇌척수장벽의 파괴에 대한 개선효과를 나타내지 않는 낮은 농도에서도 현저한 효과를 나타내고, 이는 낮은 농도의 화합물 투여로 인한 상승효과 및 부작용 감소 효과를 나타내므로， 본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C는 뇌혈관장벽 장애 및 중추신경계 질환의 치료 예방 방법으로 사용될 수 있다. 또한， 본 발명은 유효한 양의 플루옥세틴 및 비타민 C를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌혈관장벽 장애의 예방 방법을 제공한다.

- 또한, 본 발명은 유효한 양의 플루옥세틴 및 비타민 C를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 중추신경계 질환의 예방 방법을 제공한다.

본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C의 동시투여는 플루옥세틴 또는 비타민 C의 단독투여에서 뇌혈관장벽 및 뇌척수장벽의 파괴에 대한 개선효과를 나타내지 않는 낮은 농도에서도 현저한 효과를 나타내고， 이는 낮은 농도의 화합물 투여로 인한 상승효과 및 부작용 감소 효과를 나타내므로， 본 발명의 폴루옥세틴 및 비타민 C는 뇌혈관장벽 장애 및 중추신경계 질환의 예방 방법으로 사용될 수 있다. 또한， 본 발명은 뇌혈관장벽 장애의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 용ᅵ도로 사용하가위한 플루옥세틴 및 비타민 C를 제공한다.

또한, 본 발명은 중추신경계 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 용도로 사용하기 위한 플루옥세틴 및 비타민 C를 제공한다.

본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C의 동시투여는 플루옥세틴 또는 비타민 C의 단독투여에서 뇌혈관장벽 및 뇌척수장벽의 파괴에 대한 개선효과를 나타내지 않는 낮은 농도에서도 현저한 효과를 나타내고， 이는 낮은 농도의 화합물 투여로 인한 상승효과 및 부작용 감소 효과를 나타내므로， 본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C는 뇌혈관장벽 장애 및 중추신경계 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 용도로 유용하세 사용될 수 있다. 또한， 본 발명은 뇌혈관장벽 장애의 예방 및 개선용 건강 식품의 용도로 사용하기 위한 플루옥세틴 및 비타민 C를 제공한다.

또한， 본 발명은 중추신경계 질환의 예방 및 개선용 건강 식품의 용도로 사용하기 위한 플루옥세틴 및 비타민 C를 제공한다.

본 발명의 폴루옥세틴 및 비타민 C의 동시투여는 플루옥세틴 또는 비타민 C의 단독투여에서 뇌혈관장벽 및 뇌척수장벽의 파괴에 대한 개선효과를 나타내지 않는 낮은 농도에서도 현저한 효과를 나타내고， 이는 낮은 농도의 화합물 투여로 인한 상승효과 및 부작용 감소 효과를 나타내므로， 본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C는 뇌혈관장벽 장애 및 중추신경계 질환의 예방 및 개선용 건강 식품의 용도로 사용될 수 있다. 이하， 본 발명을 실시예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.

단， 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>척수손상 (spinal cord injury) 동물모델의 제조

<1-1>척수손상동물모델의 제조

성체 수컷 스프라귀 다우레이 래트 (Sprague Dawley rat ) (샘타코， 한국)에 클로랄하이드레이트 (500 mg/kg)를 복강 주입하여 마취한 후， 흉추 8 번 내지 10번 부분을 노출시켰다. 그런 다음，상기 마취한 래트의 흉추 에 10 g무게의 추를 일정 높이에서 떨어뜨려 인간 척수손상과 유사한 외상을 주고， 외상 강도를 컴퓨터에서 수치화할 수 있게 고안된 NYU 임팩터 ( impactor) (Routes , 사이텍 코리아)를 사용한 척수 외상 동물모델을 수행하였다. 컴퓨터에 나타나는 손상 강도에 대한 데이터를 통하여 정해진 오차 범위 내에 일정한 손상이 가해진 것을 확인한 후 상처부위를 봉합하고 포비딘 액으로 소독한 다음， 케이지 (cage)에 2마리씩 넣어 사육하였고， 하루 3회 인위적으로 방광을 마사지하여 배뇨를 도왔다.

<1-2>플루옥세틴 (fluoxetine) 및 비타민 (Xvitamin C)의 투여

상기 실시예 <1-1〉에서 척수손상을 유발한 후， 플루옥세틴 ( f luoxet ine) 및 비타민 CCvitamin C)를 생리식염수에 녹여 1 mg/kg 및 100 mg/kg의 농도로 복강주사로 하루에 한 번씩 5 일 동안 동시 투여하였다. 음성 대조군으로는 플루옥세틴 및 비타민 C를 포함하지 않는 생리식염수를 투여하였고， 비교 대조군으로는 플루옥세틴 또는 비타민 C를 각각 생리식염수에 녹여 1 mg/kg 또는 100 mg/kg의 농도로 단독 투여하였다.

<1-3> 척수조직 절편의 준비

상기 실시예 <1-2>에서 준비한 동물모델에서 우심방 (right atrium)을 통해 관류 (perfusion)를 시행하여 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)로 고정하고， 척수 신경을 절단한 후 OCT 화합물 (opt imum cutt ing temperature compound)에 포매 (embedding)하였고， 저온 유지 장치 (Cryostat )를 사용하여 절단하였다. RNA 및 단백질 분리를 위하여 절단한 척수 조직은 PBS로 관류 (perfusion)하여 손상부위를 중심으로 1 cm 절단하였으며， 액체 질소에 동결시켜 사용할 때까지 -80°C에 보관하였다.

<실시예 2>척수손상후의 뇌척수장벽 (Blood-spinal cord barrier , BSCB)손상에 대한 플루옥세틴 및 비타민 C 동시 -치료 (co-treatment)의 뇌척수장벽 투과성 증가 억제 효과 확인

플루옥세틴 및 비타민 C를 흥시에 처리하였을 때 척수손상 후의 뇌척수장벽 손상에 대한 공동 -치료 효과를 확인하기 위하여， 에반스 블루 (evans blue)를 이용하여 뇌척수장벽 파괴에 따른 투과성의 변화를 확인하였다.

구체적으로， 상기 실시예 <1-2>과 동일한 방법을 수행하여 준비한 척수손상 동물모델에 생리식염수에 녹인 2%에반스 블루를 5 i 씩 복강주사하고 3 시간 후에 인산완충식염수 (phosphate buffered sal ine , PBS)로 관류 (per fusion)한 후， 손상된 척수에서 뇌척수장벽 투과성의 변화를 확인하였다. 그런 다음， 상기 실시예 <1— 3>와 동일한 방법을 수행하여 손상부위를 중심으로 4 匪 크기의 척수조직을 절단하였고， 50% 트리클로로초산 용액 (trichloroacetic acid solution)을 가하여 조직을 분쇄한 후， 10,000 xg에서 10 분간 원심분리 하여 상층액올 수득하였고， 620 nm의 들뜸

^' 파장 (excitation wavelength) , 680 nm의 방줄 파장 (emission wavelength)에서 형광을 측정하였다. 정상군으로는 척수손상을 유발하지 않은 동물모델을 사용하였고， 음성 대조군으로는 플루옥세틴 및 비타민 C를 포함하지 않는 생리식염수를 투여하였으며， 비교 대조군으로는 플루옥세틴 또는 비타민 C를 각각 생리식염수에 녹여 1 mg/kg 또는 100 mg/kg의 농도로 단독 투여하였다. 그 결과， 도 1에서 나타난 바와 같이 극미량의 비타민 C 또는 플루옥세틴을 각각 단독 처리하였을 때에는 뇌척수장벽의 파괴 정도가 음성 대조군과 유사하게 나타난 것에 비해， 극미량의 비타민 C 또는 플루옥세틴을 동시 -처리하였을 때 놔척수장벽의 파괴에 대한 억제 효과가 유의적으로 상승하는 것을 확인하였다 (도 1 a 및 b).

<실시예 3> 척수손상 후의 매트릭스 메탈로프로테이나제 -9(matrix metal loproteinase-9, M P-9)에 대한플루옥세틴 및 비타민 C동시-치료의 활성 억제 효과 확인

플루옥세틴 및 비타민 C를 동시에 처리하였을 때 척수손상 개선에 대한 동시 -치료 효과를 확인하기 위하여， 자이모그래피 (zymography)를 수행하여 뇌척수장벽의 파괴 및 염증 반영에 관여하는 것으로 알려진 MMP-9의 활성도를 확인하였다.

구체적으로， 상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법을 수행하여 10 urn크기의 척수 조직 절편을 준비한 다음， 1%옥틸페녹시 폴리에톡시 에탄올 (octylphenoxy polyethoxy ethanol, Nonidet P-40, NP-40)， 150 mM NaCl , 0.5% 소듐 디옥시콜레이트 (sodium deoxycholate), 0.1% SDS 및 50 mM 트리스 (trisKpH 8.0)를 포함하는 용해 완충용액 (Lysis Buffer)에 상기 척수 조직 절편을 가하여 세포 내 단백질을 수득하였다. 수득한 세포 내 단백질 30 을 노백스 10¾젤라틴 자이모그램 젤 (Novex 10% gel at in zymogram gel; 제품 번호: EC61752, Invitrogen사， 미국)에 로딩 (loading)하고， 4°C에서 100 V조건으로 전기영동을 수행하여 단백질을 분리하였다. 그런 다음, 상기 젤을 ₂ ᅳ _5% 트리톤 χ- ₁₀ ο의 재결합 완충용액 (renaturing buffer)에 넣고 상온에서 30 분간 인큐베이션 (incubat ion)한 후， 0.2 M NaCl , 5 mM CaCl ₂ , 0.02% Brii35 및 50 mM 트리스 (tris)(pH 8.5)를 포함하는 현상 완충용액 (developing buffer)에 넣어

37°C에서 24 시간 동안 방치하였다. 방치 후， 0.5% 쿠사미 블루 (Comassie blue)로 24 시간 염색하고, 40% 메탄올 (methanol) 및 10%(acetic acid)를 포함하는 탈색 완충용액 (destaining buffer)에 두어 염색 및 탈색하여， 자이모그램 젤에서 선명하게 ^' 나타내는 밴드가 유의적인 젤라티네이즈 (gelatinase) 활성을 나타내는 것으로 판단하였다. 정상군으로는 척수손상을 유발하지 않은 동물모델을 사용하였고， 음성 대조군으로는 플투옥세틴 및 비타민 C를 포함하지 않는 생리식염수를 투여하였으며， 비교 대조군으로는 플루옥세틴 또는 비타민 C를 각각 생리식염수에 녹여 1 mg/kg 또는 100 mg/kg의 농도로 단독 투여하였다.

그 결과， 도 2에서 나타난 바와 같이 극미량의 비타민 C 또는 플루옥세틴을 각각 단독 처리하였을 때에는 MMP-9 단백질의 활성 정도가 음성 대조군과 유사하게 나타난 것에 비해, 극미량의 비타민 C 또는 플루옥세틴을 동시 -처리하였을 때 MMP-9 단백질의 활성 효과적으로 감소하는 것을 확인하였다 (도 2 a 및 b).

<실시예 4>척수손상후플루옥세틴 및 비타민 C동시-치료의 혈액 침윤 (blood infiltration) 완화효과확인

<4-1>척추손상후플루옥세틴 및 비타민 C동시-치료에 따른 대식세포 마커 발현의 확인

플루옥세틴 및 비타민 C를 동시에 처리하였을 때 척추 손상 후의 동물모델에서 염증세포의 혈관 유입 효과를 확인하기 위하여， 대식세포 (macrophage) 마커인 ED-1의 발현 정도를 웨스턴블럿 (Western blot)으로 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법을 수행하여 10 im 크기의 척수 조직 절편을 준비한 다음， 1%옥틸페녹시 폴리에록시 에탄올 ( _oc t _y lphenoxy polyethoxy ethanol, Nonidet P-40, NP-40) , 150 mM NaCl , 0.5% 소듐 디옥시콜레이트 (sodium deoxycholate) , 0.1% SDS 및 50 mM 트리스 (tris pH 8.0)를 포함하는 용해 완층용액 (Lysis Buffer)에 상기 척수 조직 절편을 가하여 세포 내 단백질을 수득하여 SDS-PAGE로 분리하였다. 그런 다음， 니트로셀를로오즈 막 (nitrocel lulose membrane)에 이동 (transfer )하여 ED-l(Serotec 사， 미국)을 처리하여 제조사의 프로토콜에 따라 반웅한 후， 2차 항체로 발색하여 ED-1 단백질을 수득하였다. 발현을 비교하기 위한 대조군으로는 류블린 (tubulin) 단백질의 발현올 확인하였으며， 정상군으로는 척수손상을 유발하지 않은 동물모델을 사용하였고， 음성 대조군으로는 플루옥세틴 및 비타민 C를 포함하지 않는 생리식염수를 투여하였으며， 비교 대조군으로는 플루옥세틴 또는 비타민 C를 각각 생리식염수에 녹여 1 mg/kg 또는 100 mg/kg의 농도로 단독 투여하였다.

그 결과， 도 3에서 나타난 바와 같이 극미량의 비타민 C 또는 플루옥세틴을 각각 단독 처리하였올 때에는 ED-1의 발현 정도가 음성 대조군과 유사하게 나타난 것에 비해, 극미량의 비타민 C 또는 플루옥세틴을 동시 -처리하였을 때 ED-1의 발현 정도가 정상군에 유사한 수준으로 감소하는 것을 확인하였다 (도 3).

<4-2>척추손상후플루옥세틴 및 비타민 C동시-치료에 따른 혈관세포 유입 완화효과의 확인

플루옥세틴 및 비타민 C를 동시에 처리하였을 때 척추 손상 후의 동물모델에서 혈액세포 유입 완화 효과를 확인하기 위하여， 호중구 (neutrophil) 마커인 미엘로퍼옥시다아제 (myeloperoxidaseᅳ MP0) 및 대식세포 마커인 ED-1을 면역조직화학염색 (i瞧 unohistochemistry staining) 방법으로 확인하였다. 구체적으로， 상기 실시예 <1-2〉에서 준비한 척수손상 동물모델에서, 플루옥세틴 및 비타민 C 처리 후 1 일 및 5 일 후에 상기 실시예 <1-3>와 동일한 방법을 수행하여 10 크기의 척수 조직 절편을 준비한 다음， 면역조직화학염색올 위한 1차 항체로 미엘로퍼옥시다아제 (myeloper oxidase , MPO; Dako 사， 미국) 및 ED-l(Serotec 사, 미국〉을 각각 처리하여 제조사의 프로토콜에 따라 반웅한 후， 2차 항체 (Jackson 사， 미국)로 발색하여 MP0 및 ED-1을 확인하였다. 음성 대조군으로는 척수손상 동물모델에 플루옥세틴 및 비타민 C를 포함하지 않는 생리식염수를 투여하였다.

그 결과， 도 4 에서 나타난 바와 같이 플루옥세틴 및 비타민 C을 동시 투여한 척수손상 동물모델에서 음성 대조군에 비해 MP0 및 ED-1의 발현이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다 (도 4) .

<실시예 5> 일시적 전뇌허혈 (transient global ischemia) 동물모델의 제조

<5-1> 일시적 전뇌허혈 동물모델의 제조

아산화질소 (ni trous oxide) 및 산소 (oxygen)의 비율이 70:30인 공기 조건에서 몸무게 33 내지 37 g의 8 주령 성체 수컷 CD1 마우스 (Orient 시 ^ᅵ ， 한국)에 2% 이소플루란 ( i sof lurane)을 주입하여 마취되도록 유도한 후， 1% 이소플루란으로 마취를 유지하면서 이전에 공지된 바를 따라 상기 마우스에 일시적 전뇌허혈을 유발하였다 (Kim, D.H. et . al， 2009. Food Chem. Toxicol . 47, 1473-1479. ) . 상기 준비한 일시적 전뇌허혈 동물모델은 케이지 (cage)에 4 마리씩 넣어 자유롭게 물 및 사료를 섭취할 수 있도록 하면서 23±1 ⁰ C의 지속적인 온도 및 60±10 >의 지속적인 습도의 환경에서 12시간 빛 /어둠 주기로 사육하였다. <5-2>플루옥세틴 및 비타민 C의 투여

상기 실시예 <5-1>에서 일시적 전뇌허혈을 유발한 후， 풀루옥세틴 및 비타민 C를 생리식염수에 녹여 1 mg/kg 및 100 mg/kg의 농도로 복강주사로 하루에 한 번 씩 7 일 동안 동시투여하였다. 음성 대조군으로는 플루옥세틴 및 비타민 C를 포함하지 않는 생리식염수를 투여하였고， 비교 대조군으로는 플루옥세틴 또는 비타민 C를 각각 생리식염수에 녹여 l mg/kg 또는 100 mg/kg의 농도로 단독 투여하였다.

<실시예 6>일시적 전뇌허혈 후의 뇌혈관장벽 (brain blood barrier， BBB)에 대한 플루옥세틴 및 비타민 C동시-치료의 파괴 (disruption) 억제 효과 확인

플루옥세틴 및 비타민 C를 동시에 처리하였을 때 일시적 전뇌허혈 후의 뇌혈관장벽 파괴에 대한 공동 -치료 효과를 확인하기 위하여， 에반스 블루를 이용하여 일시적 전뇌허혈 동물모델의 전뇌 (whole model )에서 장벽 파괴에 따른 투과성의 변화를 확인하였다.

구체적으로， 상기 실시예 <5-2>과 동일한 방법을 수행하여 동물모델에 일시적 전뇌허혈을 유발하고， 7 일 후 상기 동물모델에 생리식염수에 녹인 2% 에반스 블루를 0.5 씩 복강주사하여 상기 <실시예 2〉와 동일한 방법을 수행하여 일시적 전뇌허혈 후 전뇌에서의 뇌혈관장벽 투과성의 변화를 확인하였다. 정상군으로는 일시적 전뇌허혈을 유발하지 않은 동물모델을 사용하였고， 음성 대조군으로는 플루옥세틴 및 비타민 C를 포함하지 않는 생리식염수를 투여하였으며， 비교 대조군으로는 플루옥세틴 또는 비타민 C를 각각 생리식염수에 녹여 1 mg/kg 또는 100 mg/kg의 농도로 단독 투여하였다. 그 결과， 도 5에서 나타난 바와 같이 극미량의 비타민 C 또는 플루옥세틴을 각각 단독 처리하였을 때에는 뇌혈관장벽의 파괴로 인한 투과성의 상승 수준이 음성 대조군과 유사하게 나타난 것에 비해， 극미량의 비타민 C 및 플루옥세틴을 동시 -처리하였을 때 뇌혈관장벽의 파괴에 대한 억제 효과가 유의적으로 상승하는 것을 확인하였다 (도 5 a 및 b) .

<실시예 7 일시적 전뇌허혈 후의 기억력 손상 (memory impairment)에 대한 플루옥세틴 및 비타민 C동시-치료의 기억력 회복 효과 확인

<7-1> 일시적 전뇌허혈 동물모델의 선별 일시적 전뇌허혈이 유발된 마우스 중에서 플루옥세틴 및 비타민 C가 나타내는 기억력 회복 효과를 확인하기 위하여， 일시적 전뇌허혈 동물모델을 선별하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <5-1>과 동일한 방법으로 마우스에 일시적 전뇌허혈을 유발한 다음, 오메가플로 FLO-Nl(0megaf lo FL0-N1 ; omegawave 사， 일본)을 사용하여 일시적 전뇌허혈이 유발된 마우스의 뇌 혈류 (cerebral blood f low)를 측정하여 정상 마우스의 뇌 혈류와 비교하였을 때 20% 미만으로 감소한 마우스를 선별하였다. 선별한 마우스는 상기 실시예 <5-2>과 동일한 방법을 수행하여 플루옥세틴 및 비타민 C을 7 일간 투여하여 일시적 전뇌허혈 동물모델을 준비하였다. 정상군으로는 일시적 전뇌허혈을 유발하지 않은 동물모델을 사용하였고， 음성 대조군으로는 플루옥세틴 및 비타민 C를 포함하지 않는 생리식염수를 투여하였으며， 비교 대조군으로는 플루옥세틴 또는 비타민 C를 각각 생리식염수에 녹여 단독 투여하였다.

그 결과， 하기 [표 1]과 같이 정상군， 음성대조군， 비타민 C 또는 플루옥세틴 단독 투여군, 및 비타민 C 및 플루옥세틴 동시투여군을 선별하였다 (표 1) . 상기 선별된 음성대조군， 비타민 C 또는 플루옥세틴 단독 투여군， 및 비타민 C및 플루옥세틴 동시투여군은 정상군과 비교하였을 때， 20% 미만의 뇌혈류량을 나타내므로 각 군 간의 허혈 정도에 유의적인 차이를 나타내지 않는 것을 확인하였다.

【표 1】

일시적 전뇌허혈 동물모델의 뇌혈류 (cerebral blood f low)

정상군 음성대조군 단도투여군 비타민 C 및 플루옥세틴 비타민 C 플루옥세틴

동시투여군

100 18.50 18.27 15.68 18.82

100 17.47 18. 12 17.74 13.88

100 13.63 19.43 15.29 18.53 100 18.52 13.82 12.37 17.75

* 정상군의 뇌혈류를 100%로 하였을 때， 폐색 (occlusion) 동안 감소된 뇌혈류의 비율을 나타낸다.

<7-2> 일시적 전뇌허혈 후의 해마-의존적 단기 기억력 (hippocampaHiependent short-term memory)에 대한 플루옥세틴 및 비타민 C동시-치료의 기억력 회복 효과 확인

일시적 전뇌허혈 후에 나타나는 해마-의존적 단기 기억력에 대한 루옥세틴 및 비타민 C 동시-치료의 회복 효과를 확인하기 위하여， Y-미로 실험을 수행하였다.

구체적으로， 검고 불투명한 (opaque) 폴리비닐 플라스틱 (polyvinyl plastic)으로 구성된 벽 높이 12 cm, 길이 40 cm 및 넓이 3 cm의 통로가

120°각도로 연결된 3통로의 수평상 미로 (three-arm horizontal maze)를 이전에 공지된 바를 따라 제작하였다 (Kim, D.H. et. al, 2009. Food Chem. Toxicol. 47, 1473-1479.). 그런 다음， 상기 실시예 <그1>에서 선별한 마우스를 제작한 미로의 한 통로에 위치시키고， 8 분 동안 각 통로에 들어간 순서 (예를 들면， ABCCAB) 및 횟수를 기록하여， 모든 세 통로를 연이어서 선택하는 횟수 (예를 들면， ABC, CAB 또는 BCA)를 자발적 변경률 (spontaneous alternation)으로 정의하였고 변경률의 백분율은 하기 [수학식 1]을 사용하여 계산하였다. 매 실험 후에는 남아있는 채취 (odor)를 제거하기 위해 상기 미로를 물로 세척하였다.

1】 ^{X 1UU}

상기 총 통로에 들어간 횟수는 운동활성 (locomotor activity)을 나타낸다.

그 결과， 도 6 에서 나타난 바와 같이 모든 실험군에 따른 운동활성에 대하여 유의적인 차이를 나타내지 않았으나 (도 6 a), 음성 대조군에서 기억력 감퇴가 나타나는 것을 확인하였으며， 이에 비해 플루옥세틴 및 비타민 C의 동시투여에서 유의적인 기억력 회복 효과를 나타내는 것을 확인하였다 (도 6 b).

<7-3> 일시적 전뇌허혈 후의 해마 세포 손상에 대한 플루옥세틴 및 비타민 C동시-치료의 회복 효과 확인

일시적 전뇌허혈 후에 나타나는 해마 세포 손상에 대한 플루옥세틴 및 비타민 C 동시-치료의 회복 효과를 확인하기 위하여， 해마 CA1 뉴런 지역을 염색하였다.

구체적으로， 상기 <실시예 6〉과 동일한 방법을 수행하여 수득 및 보관한 뇌를 30 pm 관상면 (coronal plane)으로 절단하여， 젤라틴 -코팅 술라이드 (gelatin-coated slide)에 올려놓고， 0.5% 크리스탈 바이올랫 (crystal violet)으로 염색한 다음, 70%， 80%, 90%, 100% 및 10W 알코올을 순서대로 가하여 탈수하였다. 탈수 후, 자일렌 (xylene)을 가하고 커버슬립 (coverslip)으로 덮어 해마의 CA1 뉴런 세포 지역을 관찰하였다. 정상군으로는 척수손상을 유발하지 않은 동물모델을 사용하였고， 음성 대조군으로는 플루옥세틴 및 비타민 C를 포함하지 않는 생리식염수를 투여하였으며， 비교 대조군으로는 플루옥세틴 또는 비타민 C를 각각 생리식염수에 녹여 단독 투여하였다.

그 결과， 도 7 및 도 8에서 나타난 바와 같이 극미량의 비타민 C 또는 플루옥세탄을 각각 단독 처리하였을 때에는 해마 조직의 뉴런 세포의 손상 정도가 음성 대조군과 유사하게 나타난 것에 비해， 비타민 C또는 플루옥세틴을 동시 -처리하였을 때 뉴런 세포의 손상 정도가 현저하게 회복되어 정상군과 유사한 수준을 나타내는 것올 확인하였다 (도 7 및 도 8).

<제조예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1>산제의 제조 7 본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C 0. 1 g 유당 1.5 g 탈크 0.5 g 상기의 성분들을 흔합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2>정제의 제조

본 발명의 플루옥세틴 및 비.타민 C 0. 1 g 락토오스 7.9 g 결정성 셀를로오스 1.5 g 마그네슘 스테아레이트 0.5 g 상기의 성분들을 흔합한 후 직타법 (di rect tablet ing method)으로 정제를 제조하였다.

<1-3>캡슐제의 제조

본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C 0. 1 g 옥수수전분 5 g 카르복시 셀를로오스 4.9 g 상기의 성분들을 흔합하여 분말을 제조한 후， 상기 분말을 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라 경질 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4>주사제의 제조

본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C 0. 1 g 주사용 멸균 증류수 적량 pH조절제 적량 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 (2 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

<1-5> 액제의 제조 본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C 0. 1 g 이성화당 10 g 만니를 5 g 정제수 적량 통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고， 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 흔합하였다. 그 다음 정제수를 가하여 전체 100 로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다. <제조예 2>건강식품의 제조

<2-1>밀가루 식품의 제조

본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C 0.5 ~ 5.0중량부를 밀가루에 첨가하고， 이를 흔합한 흔합물을 이용하여 빵， 케이크， 쿠키， 크래커 및 면류를 제조하였다.

<2-2>스프 및 육즙 (gravies)의 제조

본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C 0. 1 ~ 5.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품， 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다. <2-3>그라운드 비프 (ground beef)의 제조

본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

<2-4>유제품 (dairy products)의 제조

본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C 5 ~ 10 중량부를 우유에 첨가하고， 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다. <2"5>선식의 제조

현미， 보리， 참쌀， 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 50 메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩， 검정깨， 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 50 메쉬와 분말로 제조하였다.

본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C를 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무， 열풍간조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 50메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류， 종실류 및， 본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C을 하기의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류 (현미 30 중량부, 율무 15 중량부， 보리 20 중량부) ,

종실류 (들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부)，

본 발명의 삼백초 추출물， 이의 분획물， 이로부터 분리된 [화학식 1]의 화합물， 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 (3 중량부) ,

영지 (0. 5 중량부)，

지황 (0. 5 중량부)

<2-6>건강보조식품의 제조

본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C 100 nig

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 //g

비타민 E 1 .0 mg

비타민 B1 0. 13 nig

비타민 B2 0. 15 mg

비타민 B6 0. 5 nig

비타민 B12 0. 2 i g

비타민 C 10 nig

비오틴 10 iig 니코틴산아미드 1.7 nig ᄋ 시— 50 i g 판토텐산 칼슘 0.5 nig 무기질 흔합물

황산제 1철 1 .75 nig 산화아연 0.82 mg 탄산마그네슘 25.3 mg 제 1인산칼륨 15 nig 제 2인산칼슘 55 nig 구연산칼륨 90 nig 탄산칼슘 100 nig 염화마그네슘 24.8 mg 상기의 비타민 및 미네랄 흔합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 흔합 조성하였으나， 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며， 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 흔합한 다음，과립을 제조하고，통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

<제조예 3>건강 음료의 제조

본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C 100 nig 구연산 100 nig 올리고당 100 nig 매실농축액 2 mg 타우린 100 nig 정제수를 가하여 전체 500 mi 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 흔합한 다음， 약 1시간 동안 85°C에서 교반 가열한 후， 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 1 ί용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 넁장 보관하여 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 흔합 조성하였으나，수요계층，수요국가,사용 용도 등 지역적， 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

【산업상 이용가능성】

상술한 바와 같이， 본 발명은 플루옥세틴 및 비타민 C의 동시투여는 플루옥세틴 또는.비타민 C의 단독투여에서 뇌혈관장벽 및 뇌척수장벽의 파과에 대한 개선효과를 나타내지 않는 낮은 농도에서도 현저한 효과를 나타내고， 이는 낮은 농도의 화합물 투여로 인한 상승효과 및 부작용 감소 효과를 나타내므로， 본 발명의 플루옥세틴 및 비타민 C는 뇌혈관장벽 장애 및 중추신경계 질환의 예방 및 예방 및 치료용 약학적 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.