以下、本発明を詳細に説明するため試験� ��を挙げるが、本発明はこれらによってなん� ��限定されるものではない。

(試験例1)
正常ヒト角膜上皮細胞の細胞数増加に対する 効果
1.使用細胞
 正常ヒト角膜上皮細胞(KURABO)を用いた。

2.被験物質溶液の調製方法
 被験物質として、[3-[2-[4-イソプロピル-2-(4-� ��リフルオロメチル)フェニル-5-チアゾリル]� �チル]-5-メチル-1,2-ベンズイソキサゾール-6-� �ル]オキシ酢酸(以下、化合物Aと称する)を用� ��た。化合物Aは、培養液中での最終濃度の200 倍濃度になるようにエタノール(和光純薬)に� ��解し、使用直前まで-80 ℃で保存した。
 なお、化合物Aによる細胞数増加効果検討の ための細胞培養液として、EpiLife(KURABO)にHCGS� �殖添加剤セット(KURABO)に含まれるインスリン 、ハイドロコーチゾン、トランスフェリンを 添加した培養液(基礎培地)を用いた。

3.試験方法
1)細胞培養および化合物Aの添加
 液体窒素中に凍結保存された正常ヒト角膜� ��皮細胞を解凍し、その細胞数を計数した後� ��その全量をHCGS増殖添加剤セット(インスリ� �、マウス由来上皮成長因子mEGF、ハイドロコ� ��チゾン、トランスフェリン、ウシ脳下垂体� ��出物)の全てを添加した4 mLのEpiLife(完全培� �)中に移してよく懸濁した。この細胞懸濁液� ��フィブロネクチンコート24ウェルプレート(B ecton Dickinson)に、細胞数が2×10 ⁴ cells/500μL/穴となるように播種した(底面面積� ��2 cm ² であるため、1×10 ⁴  cells/cm ² )。
 細胞播種完了後、培養皿を37℃、5% CO ₂ 、95% air、100% humidityに設定した培養器内で24 時間培養し、ついで培養液を400μLの基礎培地 (HCGS増殖添加剤のうち、インスリン、ハイド� ��コーチゾン、トランスフェリンを添加したE piLife)に交換した。
 さらにその24時間後、培養液を下記の培養� �、各400μLに交換した。
〔1〕基礎培地のみ(無添加群)
〔2〕基礎培地+mEGF(最終濃度:1ng/mL;陽性対照群 )
〔3〕基礎培地+化合物A(最終濃度:0.1nM、1nM、0. 01μM、0.1μM;化合物A添加群)
 なお、全ての培養液中のエタノール濃度を0 .5%に統一させるため、培養液〔1〕および〔2� ��に対しては1mLあたり5μLのエタノールを添加 した。
2)細胞数測定
 化合物Aによる刺激開始から24時間後、各穴� ��培養上清を除去し、ついで各穴に10%のCell C ounting Kit-8(DOJINDO)を添加した基礎培地を200μL� ��つ分注した。分注後、培養皿を37℃、5% CO ₂ 、95% air、100% humidityに設定した培養器内に� �して2時間加温した。100μLの上清を96穴組織� �養用培養皿(Corning)に移した後、各穴の450 nm� ��吸光度をマイクロプレートリーダー(大日本 住友製薬)を用いて測定し、これを細胞数増� �の指標とした。

4.統計学的解析
 無添加群の吸光度の平均値を100%としたとき の、陽性対照群、化合物A添加群の値を算出� �、無添加群と化合物A添加群および陽性対照� ��との比較をDunnettの多重比較検定法(片側)を� ��いて行なった。検定の結果、危険率5%未満� �場合を有意と判定した。

5.試験結果
 各群の細胞数増加効果を表1に示した。測定 した吸光度から無添加群の細胞数を100%とし� �場合、陽性対照群および化合物A添加群の細� ��数は無添加群のそれよりも有意に高く、こ� ��らの群では細胞数が増加していることが示� ��された(p<0.01)。この試験結果より、化合� �Aは正常ヒト角膜上皮細胞の細胞数を増加さ� ��ることが明らかとなった。

 培養正常ヒト角膜上皮細胞に化合物Aを添 加した際の細胞数の変化を、無添加群の平均 値を100%とした際の値として示している(平均� ��±標準偏差、N=3-4)。表中の**は無添加群に対 する有意差(p<0.01)を示す。

(試験例2)
角膜上皮創傷治癒促進作用の検討
1.使用動物
 雄性日本白色種家兎(北山ラベス)を用いた� �実験動物の使用にあたっては、動物を用い� �生物医学研究に関する原則(International Guiding  Principles for Biomedical Research involving Animals) に従った。

2.被験物質点眼液の調製方法
 被験物質として化合物Aを用いた。化合物A� �、0.0005%になるように下記の基剤に溶解した� ��の、または0.005%になるように下記の基剤に� ��濁したものを点眼液として使用した。
  リン酸二水素ナトリウム二水和物   0.05� �g
  塩化ナトリウム           0.45 g
  超純水               適量
  ポリソルベート80          0.05 mL
  水酸化ナトリウム        � � 適量     
  全量                50 mL(pH 7.0)
 なお、化合物A投与群の対照として、薬剤を 含まない上記の基剤点眼群を設定した。

3.実験方法
1)角膜上皮掻爬
 セラクタール(2% xylazine;バイエル):ケタラー ル(5% ketamine;第一三共)=1:1混合液の筋肉内注� �(1mL/kg)により動物に全身麻酔を施した後、塩 酸オキシブプロカイン点眼液(ベノキシール� �眼液0.4%;参天製薬)を点眼し、眼球を脱臼さ� �た。直径10mmのトレパンを用いて角膜中央部� ��角膜上皮上に直径10mmの刻印を施し、実体顕 微鏡下、ハンディルーターを用いて刻印した 円周内の角膜上皮全層を掻爬した。掻爬後、 生理食塩液(大塚製薬工場)を用いて角膜表面� ��洗浄し、眼球を眼窩内に復位させて角膜上� ��掻爬処置を完了した。
2)投与
 角膜上皮掻爬当日は1日2回、翌日以降、試� �終了までは1日4回、処置眼に対し、化合物A� �眼液または点眼液基剤をそれぞれ1回50μLず� �、マイクロピペットを用いて点眼した。
3)評価
 全個体の角膜上皮掻爬が完了した時点を試� ��開始時間(0時間目)とし、その40、48、56、64� �間後の角膜上皮欠損面積を定量することに� �り、角膜上皮の修復を評価した。すなわち� �各時点で処置眼に0.1%フルオレセインナトリ� ��ム(和光純薬)溶液を10μL点眼し、ただちにブ ルーフィルターを取り付けたスリットランプ を用いて動物の前眼部写真を撮影することに より、フルオレセイン染色された角膜上皮欠 損領域を記録した。現像された写真をコンピ ュータにデジタル画像として保存し、画像解 析ソフト(Image-Pro Plus)を用いてフルオレセイ� ��染色された角膜上皮欠損部の面積を測定し� ��。

4.統計学的解析
 各時点で測定された角膜上皮欠損面積につ� ��て、各個体ごとにその初期値を100%とした際 の値を算出し、これを残存する角膜上皮欠損 の割合とした。各時点での残存角膜上皮欠損 の割合について、基剤点眼群と化合物A点眼� �との比較をt検定を用いて行なった。検定の� ��果、危険率5%未満を有意であると判定した� �

5.試験結果
 基剤点眼群および0.0005%、0.005% 化合物A点眼 群の測定各時点での残存する角膜上皮欠損の 割合を表2に示す。角膜上皮掻爬の40時間後に 、角膜上皮欠損の割合が0.005% 化合物A点眼群 で有意に小さくなっていることが示された。 また、48時間後では、0.0005%および0.005% 化合� ��A点眼群で有意に小さくなっていることが示 された。この試験結果から、化合物Aを点眼� �ることにより、欠損した角膜上皮の修復が� �進されることが明らかとなった。

 ウサギ眼に対して角膜上皮掻爬処置を施� ��た後、残存する角膜上皮欠損の割合(%)を、� ��個体ごとにその初期値を100%として算出した 値を示している(平均値±標準偏差、N=6)。表� �の*は基剤点眼群に対する有意差(p<0.05)を� �す。

(試験例3)
マイボーム腺上皮細胞の細胞数増加に対する 効果
1.サルマイボーム腺上皮細胞の調� ��
 D-PBS中に保存された摘出サル眼瞼をクリー� �ベンチ内に移し、以下のとおり、無菌的に� �胞調製操作を行なった。
 摘出眼瞼を80%のエタノール中に30秒間浸漬� �た後、1%のpenicillin-streptomycin(Invitrogen)を添加� ��たD-PBS中で3回洗浄し、minimum essential medium(M EM; Invitrogen)中に移した。実体顕微鏡下で眼� �のマイボーム腺組織を取り囲む脂肪組織お� �び筋組織を除去し、これを、0.3U/mL collagenase  A(Roche Diagnostics)および2.4U/mL dispase II(Roche  Diagnostics)を含むMEM中に移して37℃で4時間、つ いで4℃で終夜、振盪した。酵素処理した組� �を実体顕微鏡下におき、睫毛および眼瞼結� �組織を除去してマイボーム腺組織を単離し� �。単離した腺組織に4mLのtrypsin-EDTA(Invitrogen)� �添加して37℃で10分間加温した。加温後、こ� ��に10%のFBS(Invitrogen)を含むMEMを5mL加えて酵素� ��応を停止させ、ついで、21Gの注射針を付け� ��注射筒で5回、吸引排出を繰り返して組織構 成細胞を分散させた。細胞分散液を、100μm、 ついで、40μmのナイロンフィルター(Cell Strain er; Falcon)に供し、これに含まれる酵素処理で きなかった細胞塊などを除去した。フィルタ ーを通過させた細胞懸濁液は50mLの遠沈管に� �収し、室温、1,500回転、5分間の遠心分離に� �した。遠心分離により得た目的細胞を含む� �胞層に、0.5%のbovine serum albumin(BSA; Sigma-Aldri ch)を含むD-PBSを80μL添加して細胞を十分に懸� �させた後、これに、20μLのAnti-Fibroblast Microbe ads(Militenyi Biotec)を加えて室温で30分間静置し た。抗体との反応終了後、これに0.5%のBSAを� �むD-PBSを2mL添加して、再度、室温、1,500回転� ��5分間の遠心分離に供した。遠心分離により 得た目的細胞を含む細胞層に、0.5%のBSAを含� �D-PBSを1mL添加して細胞を十分に懸濁させ、あ らかじめ、カラム洗浄液(2mMのEDTA(同仁化学)� �よび0.5%のBSAを含むD-PBS)を用いて平衡化して� ��いたLD column(Militenyi Biotec)にこれを滴下し� �。ついで、2mLのカラム洗浄液をLD columnに滴� ��した。細胞懸濁液滴下直後からカラム洗浄� ��滴下終了までの間、カラムに吸着しなかっ� ��抗体非標識の目的細胞(非線維芽細胞)を50mL� ��沈管に回収した。遠沈管に回収した細胞を� ��室温、1,500回転、5分間の遠心分離に供して� ��清を除去した。この沈渣を、5mL のDefined Ke ratinocyte Serum Free Mediumに懸濁させ、室温、1, 500回転、5分間の遠心分離に供して上清を除� �した。再度、沈渣を3mLのDK-SFMに懸濁させ、� �温、1,500回転、5分間の遠心分離に供して上� �を除去した後、これを2 mLのDK-SFMに懸濁させ て、コラーゲン処理を施した6ウェル細胞培� �用マルチウェルプレートに播種した。播種� �た細胞は、Defined keratinocyte-Serum Free Medium(DK -SFM;Invitrogen、添付されたSupplementを調製プロ� �コルどおりに添加)を用いて、37℃、5% CO ₂ 、95% air、100% humidityに設定した培養器(SANYO)� ��で培養し、培養液は細胞がサブコンフルエ� ��トに達するまで48時間ごとに新しいものに� �換した。

2.被験物質溶液の調製方法
 被験物質として化合物A、[4-[3-[2-(4-トリフル オロメチル)フェニル-4-イソプロピル-5-チア� �リル]プロピオニル]-2-メチルフェノキシ]酢� �(以下、化合物Bと称する)または[4-[3-[2-(2-ヒ� �ロキシ-4-クロロフェニル)-5-イソプロピル-4-� ��キサゾリル]プロピオニル]-2-メチルフェノ� �シ]酢酸(以下、化合物Cと称する)を用いた。� ��験物質は、培養液中での最終濃度の200倍濃� ��になるようにエタノール(ナカライテスク)� �溶解し、使用直前まで-80℃で保存した。
 なお、被験物質による細胞増殖促進効果の� ��討には、DK-SFMからこれに添付されたsupplement を除いた培養液を基礎培地(basal DK-SFM)として 用いた。また、細胞増殖促進効果確認のため の陽性対照として、基礎培地に添付のsupplemen tを添加した培養液(complete DK-SFM)を用いた。

3.試験方法
1)培養皿のコラーゲン処理
 培養皿使用の前日に、培養皿の各穴に0.01%� �I型コラーゲン(新田ゼラチン)を50μLずつ分注 して試験直前まで4℃でコーティングを行な� �た。試験当日、I型コラーゲン溶液を除去し� ��後、D-PBSを用いて3度、培養皿底面を洗浄し� ��これをコラーゲン処理培養皿として試験に� ��いた。
2)細胞培養および被験物質の添加
 試験には、直径3.5cmの培養皿でサブコンフ� �エントになるまで培養し、液体窒素中で凍� �保存しておいたサルマイボーム腺上皮細胞� �用いた。セルバンカー(日本全薬工業)に懸濁 して凍結保存しておいた細胞を解凍した後、 50mL遠沈管に移して10倍量のcomplete DK-SFMを添� �した。室温、1,500回転、5分間の遠心分離に� �して細胞層を回収した後、得られた細胞濃� �が3×10 ⁶ 細胞/mLとなるように適量のcomplete DK-SFMを添� �して細胞を懸濁させた。この細胞懸濁液を� �コラーゲン処理した96穴組織培養用培養皿の 底面面積(0.32 cm ² )あたりの細胞数が6×10 ⁴ 細胞/cm ² となるよう、各穴に64μLずつ分注した。細胞� ��種完了後、培養皿を37℃、5% CO ₂ 、95% air、100% humidityに設定した培養器内に� �し、24時間培養した。培養液を100μLのbasal DK -SFMに交換してさらに24時間の培養を行い、次 いで培養皿の各穴の培養液を各100μLの下記培 養液に交換して、その培養皿を培養器内に戻 し、細胞刺激を開始した。
〔1〕基礎培地のみ(basal DK-SFM、無添加群)
〔2〕基礎培地+supplement(complete DK-SFM、陽性対� ��群)
〔3〕基礎培地+化合物A(最終濃度:0.01μM、0.1μM および1μM;化合物A添加群)
〔4〕基礎培地+化合物B(最終濃度:0.01μM、0.1μM および1μM;化合物B添加群)
〔5〕基礎培地+化合物C(最終濃度:0.01μM、0.1μM および1μM;化合物C添加群)
 なお、全ての培養液中のエタノール濃度を0 .5%に統一させるため、培養液〔1〕および〔2� ��に対してはそれぞれ1 mLあたり5μLのエタノ� ��ルを添加した。
3)細胞数測定
 初回の細胞刺激の48時間後、培養液を新た� �調製した上記〔1〕~〔5〕の培養液に交換し� �。その48時間後、もう一度培養液を新たに調 製した上記〔1〕~〔5〕の培養液に交換した。 さらにその48時間後、各穴の培養上清を除去� ��、ついで各穴に10%のCell Counting Kit-8(DOJINDO)� ��添加した基礎培地を100μLずつ分注した。分� ��後、培養皿を37℃、5% CO ₂ 、95% air、100% humidityに設定した培養器内に� �して2時間加温した。2時間の加温後、マイク ロプレートリーダー(大日本住友製薬)を用い� ��450nmの吸光度を測定し、これを細胞数増加� �指標とした。

4.統計学的解析
 無添加群の吸光度の平均値を100%としたとき の、陽性対照群、各被験物質添加群の各群の 値を算出し、無添加群と各被験物質添加群お よび陽性対照群との比較をDunnettの多重比較� �定法(片側)を用いて行なった。検定の結果、 危険率5%未満の場合を有意と判定した。

5.試験結果
 各群の細胞数増加促進効果を表3に示した。 測定した吸光度から無添加群の細胞数を100%� �した場合、各被験物質添加群での細胞増殖� �、無添加群よりも有意に高く、細胞が増加� �ていることが示唆された。細胞数増加促進� �果を確認するための陽性対照群では、有意� �はないが、細胞数を増加させる傾向が認め� �れた。この試験結果より、各被験物質はサ� �マイボーム腺上皮細胞の細胞数を増加させ� �ことが明らかとなった。

 培養サルマイボーム腺上皮細胞に各被験� ��質またはsupplement(陽性対照)を添加した際の� ��胞数の変化を、無添加群の平均値を100%とし た際の値として示している(平均値±標準偏差 、N=5または10)。表中の**は無添加群に対する� ��意差(p<0.01)を示す。

(試験例4)
正常ヒト角膜上皮細胞の細胞数増加に対する 効果
1.使用細胞
 正常ヒト角膜上皮細胞(KURABO)を用いた。
2.被験物質および調製方法
 被験物質として、化合物Bまたは化合物Cを� �いた。化合物Bおよび化合物Cは、それぞれ培 養液中での最終濃度の200倍濃度になるように エタノール(和光純薬)に溶解し、使用直前ま� ��-80℃で保存した。
 なお、化合物Bおよび化合物Cによる細胞数� �加効果検討のための細胞培養液として、EpiLi fe(KURABO)にHCGS増殖添加剤セット(KURABO)に含ま� �るインスリン、ハイドロコーチゾン、トラ� �スフェリンを添加した培養液(基礎培地)を用 いた。

3.試験方法
1)細胞培養および被験物質の添加
 液体窒素中に凍結保存された正常ヒト角膜� ��皮細胞を解凍し、その細胞数を計数した後� ��その全量をHCGS増殖添加剤セット(インスリ� �、マウス由来上皮成長因子mEGF、ハイドロコ� ��チゾン、トランスフェリン、ウシ脳下垂体� ��出物)の全てを添加した4mLのEpiLife(完全培地) 中に移してよく懸濁した。この細胞懸濁液を フィブロネクチンコート24ウェルプレート(Bec ton Dickinson)に、細胞数が2×10 ⁴ cells/500μL/穴となるように播種した(底面面積� ��2cm ² であるため、1×10 ⁴  cells/cm ² )。細胞播種完了後、培養皿を37℃、5% CO ₂ 、95% air、100% humidityに設定した培養器内で24 時間培養し、ついで培養液を400μLの基礎培地 (HCGS増殖添加剤のうち、インスリン、ハイド� ��コーチゾン、トランスフェリンを添加したE piLife)に交換した。さらにその24時間後、培養 液を下記の培養液、各400μLに交換した。
〔1〕基礎培地のみ(無添加群)
〔2〕基礎培地+mEGF(最終濃度:1ng/mL;陽性対照群 )
〔3〕基礎培地+化合物B(最終濃度:0.01μM、0.1μM 、1μM;化合物B添加群)
〔4〕基礎培地+化合物C(最終濃度:0.01μM、0.1μM 、1μM;化合物C添加群)
 なお、全ての培養液中のエタノール濃度を0 .5%に統一させるため、培養液〔1〕および〔2� ��に対しては1mLあたり5μLのエタノールを添加 した。
2)細胞数測定
 化合物Bまたは化合物Cによる刺激開始から24 時間後、各穴の培養上清を除去し、ついで各 穴に10%のCell Counting Kit-8(DOJINDO)を添加した基 礎培地を200μLずつ分注した。分注後、培養皿 を37℃、5% CO ₂ 、95% air、100% humidityに設定した培養器内に� �して2時間加温した。100μLの上清を96穴組織� �養用培養皿(Corning)に移した後、各穴の450nmの 吸光度をマイクロプレートリーダー(大日本� �友製薬)を用いて測定して、これを細胞数増� ��の指標とした。

4.統計学的解析
 無添加群の吸光度の平均値を100%としたとき の、陽性対照群、化合物Bまたは化合物C添加� ��の値を算出し、無添加群と化合物Bまたは化 合物C添加群および陽性対照群との比較をDunne ttの多重比較検定法(片側)を用いて行なった� �検定の結果、危険率5%未満の場合を有意と判 定した。

5.試験結果
 各群の細胞数増加効果を表4に示した。測定 した吸光度から無添加群の細胞数増加を100%� �した場合、陽性対照群、化合物B添加群およ� ��化合物C添加群の細胞数は、無添加群のそれ よりも有意に高く、これらの群では細胞数が 増加していることが示唆された(p<0.01)。こ� ��試験結果より、化合物Bおよび化合物Cの両� �は正常ヒト角膜上皮細胞の細胞数を増加さ� �ることが明らかとなった。

 培養正常ヒト角膜上皮細胞に化合物Bまた は化合物Cを添加した際の細胞数の変化を、� �添加群の平均値を100%とした際の値として示� ��ている(平均値±標準偏差,N=4)。表中の**は無 添加群に対する有意差(p<0.01)を示す。

(試験例5)
角膜上皮細胞およびマイボーム腺上皮細胞で のPPARsの発現
1.使用細胞
 サルマイボーム腺上皮細胞は(試験例3)と同� ��の方法で調製、培養したものを用いた。ヒ� ��角膜上皮細胞(クラボウ)は正常ヒト角膜上� �細胞増殖用無血清基礎培地(EpiLife; クラボウ )を用いて37℃、5% CO ₂ 、95% air、 100% humidityに設定した培養器内で 培養したものを用いた。ウサギ角膜上皮細胞 は、以下の方法で調製、培養したものを用い た。
 安楽死させたウサギから摘出した眼球から� ��膜を切り出してDulbecco’s phosphate buffered sa line(D-PBS; Invitrogen)中に保存し、これをクリー ンベンチ内に移した。以下の細胞調製操作は 全て無菌的に行なった。
 摘出角膜片を1%のpenicillin-streptomycin(Invitrogen) を添加したD-PBS中で3回洗浄し、minimum essential  medium(MEM; Invitrogen)中に移した。MEM中に浸漬� ��た角膜片の角膜内皮細胞およびデスメ膜を� ��科手術用ナイフ(Alcon)で剥離し、剥離後の角 膜片(角膜実質および角膜上皮)を2.4U/mLとなる ようにdispase II(Roche Diagnostics)を添加したMEM� �移した。これを37℃で1時間加温し、その後� �dispase II処理した角膜片をMEM中に移した。MEM 中に浸漬した角膜片の角膜上皮を眼科用手術 ナイフで剥離し、角膜片残渣(角膜実質)をMEM� ��ら取り除いた。剥離した角膜上皮細胞を含� ��MEMを50mLの遠沈管に回収し、室温、1,500回転� ��5分間の遠心分離に供して上清を廃棄するこ とにより、角膜上皮細胞層を得た。角膜上皮 細胞層に1mLのtrypsin-EDTA(Invitrogen)を添加してよ く混合した後、37℃で5分間加温して細胞間の 接着を乖離させた。これに10%のfetal bovine ser um(FBS; Invitrogen)を含むMEMを9mL添加して酵素反� ��を停止させ、再度、室温、1,500回転、5分間� ��遠心分離に供して角膜上皮細胞層を得た。� ��られた角膜上皮細胞層に1mLの正常ウサギ角� ��上皮細胞増殖用無血清液体培地(RCGM2; クラ� ��ウ)を添加して細胞を懸濁させ、9mLのRCGM2を� ��加した直径10cmの細胞培養用培養皿(IWAKI)に� �種した。播種細胞は37℃、5% CO ₂ 、95% air、100% humidityに設定した培養器(SANYO)� ��で培養した。培養液は試験当日まで48時間� �とに新しいものに交換した。

2.試験方法
1)細胞からの全RNAの抽出
 TRIzol Reagent(Invitrogen)の常法に従って各細胞� ��らの全RNAを抽出した。
2)抽出全RNAからのcDNA作製
 DNA-free(Ambion)の常法に従って抽出した全RNAの DNase処理を37℃で30分間行ない、ゲノムDNAを除 去した。
 抽出全RNAからのcDNA作製はSuperscript II Reverse  Transcriptase(Invitrogen)の常法に従って行なった 。すなわち、DNase処理した1μgの全RNAから、ラ ンダムプライマー(Invitrogen)を用いてこれらに 相補するcDNAを作製した。
3)PPARs遺伝子の増幅(Polymerase Chain Reaction; PCR)
 PPARs遺伝子のPCRはPlatinum PCR SuperMix(Invitrogen) の常法に従って行なった。PPARsプライマーは� ��既知のヒト、チンパンジー、カニクイザル� ��ウシ、マウスなどの配列を参考に、PCR産物� ��約200bpsとなるように設計した。
PPARα:GTAGAATCTGCGGGGACAAG (sense)  (配列番号1)
   :GTTGTGTGACATCCCGACAG (antisense)(配列番号2)
PPARδ:TTCCTTCCAGCAGCTACACA (sense)  (配列番号3)
   :GATCGTACGACGGAAGAAGC (antisense)(配列番号4)
PPARγ:CTCCGTGGATCTCTCCGTAA (sense)  (配列番号5)
   :GATGCAGGCTCCACTTTGAT (antisense)(配列番号6)
 PCR反応は、94℃で2分15秒間反応させた後、94 ℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で30秒間の3段� ��の反応を35回繰り返すことで完了させた。PC Rの反応後の試料を2%のアガロースゲルを用い た電気泳動に供し、ついでゲル内に分離され たDNAをSYBR Gold(Molecular Probes)を用いて染色し� ��。染色されたDNAをUVトランスイルミネータ� �上で発光させ、この画像をデジタルデータ� �して保存した。

3.試験結果
 電気泳動後の染色されたDNAのバンドを図1に 示す。本試験の結果、ヒト角膜上皮細胞およ びサルマイボーム腺上皮細胞にはPPARα、PPARδ およびPPARγの全てが発現していることが確認 された。なお、ウサギ角膜上皮細胞ではPPARδ の発現のみが確認された。Bonazziらはウサギ� �膜上皮細胞にはPPARsのうちPPARαおよびPPARβ(=� �)が発現すると報告しているが(Bonazzi A. et a l., J. Biol. Chem. (2000); 275 (4): 2837-2844)、そ� ��報告の中で、彼らは特殊な方法を用いてPPAR αを検出していることから、ウサギ角膜上皮� ��胞でのPPARα発現量は非常に少ないと推測さ� ��る。