La présente invention a pour objet des plantes transgéniques résistantes ou tolérantes aux virus à ADN pathogènes chez les plantes.

L'invention a plus particulièrement pour objet les semences issues de ces plantes transgéniques, et susceptibles de germer en plantes présentant ce critère de résistance ou de tolérance aux virus à ADN phytopathogènes. L'invention vise également les procédés d'obtention de ces plantes et semences.

Les virus à ADN phytopathogènes sont essentiellement représentés par les virus à ADN simple brin (ss) et les virus à ADN double brin (ds).

Les virus à ADN double brin comprennent principalement les Badnavirus et les Caulimo virus.

Les virus à ADN simple brin comprennent principalement les géminivirus et d'autres virus à ADN ss exotiques.

Parmi ces virus à ADN phytopathogènes, les géminivirus ont été particulièrement étudiés. Ce sont des virus de plantes dont l'impact sur la production agronomique est considérable dans de nombreuses régions tropicales et subtropicales (Harrison, 1985). Ce sont des virus à ADN circulaire simple brin, caractérisés par une structure unique dans le monde viral: une capside en forme de double icosaèdre (Francki et al , 1980). Suivant leur organisation génomique on distingue d'une part les géminivirus à génome bipartite constitué de deux molécules d'ADN, A et B d'environ 2.8 kilobases (kb) chacune (cas de African Cassava Mosaic Virus (ACMV) et du Tomato Golden Mosaic Virus (TGMV)), d'autre part les géminivirus à génome monopartite à une seule molécule d'ADN d'environ 2.8 kb (cas du Maize Streak Virus (MSV), du Wheat Dwarf Virus (WDV) et du Beet Curly Top Virus (BCTV)). Selon le vecteur de transmission du virus deux sous-groupes sont identifiés. Certains géminivirus sont transmis par l'aleurode (ou mouche blanche) Bemisia tabaci, et jusqu'à une date récente étaient tous considérés à génome bipartite (ACMV, TGMV). Les autres géminivirus sont transmis par des ciccadelles (Cicadulina sp.) et ont tous un génome monopartite (MSV, WDV et BCTV); pour une revue voir Lazarowitz, 1992a.

Le virus du jaunissement et de l'enroulement des feuilles de la tomate (ou virus TYLC pour Tomato Yellow Leaf Curl Virus, encore désigné TYLCV) constitue une exception à cette classification. En effet, bien qu'il soit transmis

par Bemisia tabaci, son génome est monopartite (Kheyr-Pour et al., 1991; Navot et al., 1991). Seul un isolât de TYLCV thaïlandais a été décrit comme ayant un génome bipartite (Rochester et al., 1990).

Le TYLCV est responsable d'importants dégâts dans les cultures de tomates, les pertes pouvant atteindre 50 à 60% (Allex et al, 1994). Sur cette espèce, les symptômes caractéristiques comportent un rabougrissement de la plante, un enroulement et un jaunissement des feuilles, un aspect buissonnant dû au raccourcissement des entre-noeuds et un arrêt de la croissance florale. Cette maladie, qui affecte déjà de nombreuses régions (Bassin méditerranéen, Moyen et Proche Orient, Extrême sud asiatique et l'Afrique sahelienne), est actuellement en expansion (Czosnek et al, 1990). La France métropolitaine est, pour le moment, épargnée mais les Antilles françaises sont touchées depuis deux ans (Hostachy et Allex, 1993).

L'analyse de la séquence du génome viral du TYLCV révèle l'existence de six cadres ouverts de lectures (ou ORF pour "Open Reading Frame") pouvant coder pour des produits de taille supérieure à 10 kDa. Ces ORFs se trouvent tant sur le brin viral (ORFs VI et V2) que sur le brin complémentaire (ORFs Cl, C2, C3 et C4) (Kheyr-Pour et al, 1991); voir Fig.l.

La transcription du génome viral des géminivirus est bidirectionnelle (Hanley-Bowdoin et al , 1988; Accotto et al , 1989). Elle a lieu de part et d'autre de la région intergénique (RI), ou région commune aux deux composants d'ADN des virus à génome bipartite. La RI d'environ 200 nucléotides (nt) présente une séquence d'environ 30 nt qui pourrait adopter une structure en tige- boucïe. V?. ^r analyse mutât ionnelle, cette structure potentielle en tige-boucle s'est révélée essentielle à la replication de l' ADN viral.

La replication du génome viral passe par une forme intermédiaire double brin, dans les noyaux des cellules infectées (Davies et Stanley, 1989). La présence, au niveau de la structure potentielle en tige-boucle, d'un nonanucléotide très conservé chez tous les géminivirus (TAATATTAC) et similaire au site de clivage du produit de gène A du bactériophage φX174, suggère un mode de replication selon le modèle de cercle roulant (Stenger et al , 1991; Saunders ef al, 1991).

Le gène Cl (ou ALI) est le seul gène viral essentiel à la replication de l'ADN viral (Elmer et al, 1988). Tous les autres facteurs nécessaires à la replication de l'ADN viral sont d'origine cellulaire. La protéine Cl ne présente aucune homologie de séquence avec les ADN polymérases connues. L'analyse de la séquence déduite en acides aminés de la protéine Cl révèle l'existence d'un motif consensus de fixation de nucléosides triphosphate (NTP) ou P-loop

(pour "phosphate loop" ou boucle phosphate), GXXXXGKT/S (G≈glycine, K≈lysine, T≈thréonine, S≈Ser, X≈tout acide aminé), qui est conservé parmi les ADN et ARN hélicases (Gorbalenya et Koonin, 1989). Les rôles de la protéine Cl dans la replication ne sont pas encore connus. Cependant, plusieurs publications convergent dans le sens de fonctions multiples associées à la protéine Cl. La protéine ALI du TGMV se fixe à une séquence spécifique d'environ 50 nt au niveau de la région commune (Fontes et a , 1992). Cette protéine possède également une activité d' autorégulation par répression de sa propre transcription (Sunter et al, 1993). Une activité ATPase ainsi qu'une capacité de fixation spécifique à l'ATP in vitro ont été récemment montrées pour la protéine Cl du TYLCV exprimée sous forme de fusion avec la Glutathion-S- Transférase (GST) dans Escherichia coll. Cependant, le(s) rôle(s) possible(s) de cette activité ATPase in vivo n'est (ne sont) pas encore élucidé(s). Par ailleurs, une activité in vitro de coupure et de ligation de la protéine GST-C1 du TYLCV au niveau du nonanucléotide conservé a été montrée. Cette double activité de clivage et de ligation in vitro est indépendante de l'activité ATPase, puisque des mutants défectifs pour leur activité ATPase in vitro possèdent toujours la capacité de cliver et de lier in vitro l'ADN viral.

Tous les cultivars de tomate sont sensibles au TYLCV. Actuellement, la lutte contre le virus porte, sans grand succès, sur le vecteur B. tabaci par utilisation d'insecticides et par protection des champs et des serres avec des filets à maille très fine. Il est donc urgent de développer d'autres méthodes de lutte plus efficaces. C'est ainsi que des résistances naturelles chez des espèces sauvages de tomate (Lycopersicon chilense, L. kirsiitum, L. .peruvianum) sont recherchées en vue de les introduire dans l'espèce domestique L. esculentum

(Zakay et al, 1990). Un gène de tolérance (absence de symptômes mais replication de l'ADN viral) a été cartographie par RFLP sur le chromosome 6 de L. chilense et appelé Ty-1 (Eshed et al, 1992). Ces programmes d'introgression sont de très longue haleine en raison des nombreux rétrocroisements à réaliser. De nouvelles stratégies utilisant le génie génétique des plantes ont donc été adoptées en parallèle à la génétique classique. Deux approches ont été utilisées pour obtenir des plantes transgéniques tolérantes ou résistantes aux géminivirus (Frischmuth et Stanley, 1993). La première consiste à exprimer des séquences antisens du gène ALI du TGMV dans des plantes de tabac entraînant ainsi une réduction des symptômes dûs à ce virus (Day et al,

1991). La deuxième approche repose sur l'inhibition du mouvement de l'ACMV in planta par l'expression d'une protéine de mouvement recombinante et défective du TGMV (von Arnim et al, 1992).

Un des buts de la présente invention est de fournir un nouveau procédé d'obtention de plantes génétiquement transformées qui soient résistantes ou tolérantes aux virus à ADN pathogènes chez ces plantes.

Un autre but de la présente invention est de fournir des plantes transgéniques résistantes ou tolérantes aux virus à ADN.

Un autre but de la présente invention est de fournir des semences transgéniques susceptibles de donner lieu à la formation, par germination, de plantes transgéniques résistantes ou tolérantes aux virus à ADN. L'invention est illustrée à l'aide des figures suivantes: - figure 1: organisation génomique du TYLCV de Sardaigne (TYLCVsar), encore désigné dans la suite de ce texte "STYLCV";

- figure 2: représentation des plasmides pTY Ala, His, Arg, du plasmide pBMCl-S et des plasmides pCl Ala, His, Arg;

- figure 3: mutations construites dans le génome du STYLCV; - figure 4: replication des mutants dans le site de liaison aux NTP du

STYLCV;

- figure 5: graphe représentant l'étude d'un effet ir ns-dominant de la mutation K en R, test d'activité NPT H;

- figure 6: graphe représentant l'effet de la transfection des génomes viraux mutants (pTYAla, pTYHis, pTYArg) sur la replication du virus sauvage

(pTYLCV);

- figure 7: graphe représentant l'effet de la cotransfection de constructions permettant l'expression à haut niveau des protéines Cl mutées (pClAla, pClHis, pClArg) sur la replication du virus sauvage (pTYNéo); - figure 8: représentation des plasmides pTYLCV et pGEXCl;

- figure 9: clonage de l'ORF Cl en aval du promoteur 35S dans le plasmide pGA492;

- figure 10: transformation de disques foliaires de N. benthamiana et obtention de plantes transgéniques exprimant l'ORF Cl sauvage ou muté; - figure 11: schéma simplifié d'explication de l'obtention des plantes de la première génération FI;

- figure 12: replication de l'ADN du STYLCV dans des protoplastes de tomate;

- figure 13: séquences nucléotidiques mutées Cl* (dérivées par mutation de la séquence, à savoir l'ORF Cl, codant pourde la protéine Cl ou Rep du

STYLCV) codant pour les protéines mutées RepK227A _f R _ep K227H _et ReρK227R ₎ encore désignées dans la suite de ce texte par mutation Ala, His et Arg respectivement.

L'invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques dérivées par mutation (encore désignées séquences nucléotidiques mutées) de séquences nucléotidiques présentes dans le génome d'un virus à ADN pathogène chez les plantes, lesdites séquences nucléotidiques mutées comportant une (ou plusieurs) mutation(s) telle(s) qu'elle(s) est (sont) susceptible(s) d'induire un phénotype négatif dominant pour la replication du virus pathogène, et ou la diffusion de ce virus dans une plante, et/ou la distribution de ce virus d'une plante vers d'autres plantes, notamment par l'intermédiaire de vecteurs tels que des insectes, à savoir que ces séquences nucléotidiques mutées susmentionnées sont susceptibles d'inhiber totalement ou partiellement la replication et/ou la diffusion et/ou la distribution du virus pathogène, pour l'obtention (notamment par mise en oeuvre de procédés tels que décrits ci-après) de plantes transgéniques résistantes ou tolérantes au virus à ADN phytopathogène susmentionné. Les séquences nucléotidiques mutées selon l'invention correspondent avantageusement à tout ou partie des séquences nucléotidiques contenues dans le génome des virus à ADN phytopathogènes suivants:

- les virus à ADN double brin, et plus particulièrement:

* les badnavirus, tels que CSSB (pour Cacao swollen shoot badnavirus), DB (pour Dasheen badnavirus), CB (pour Commelina badnavirus),

YIBSB (pour Yam internai brown spot badnavirus), SPLCB (pour Sweet potato leaf curl badnavirus), BSB (pour Banana streak badnavirus), RTB (pour Rice tungro badnavirus), et SB (pour Sugarcane badnavirus);

* les caulimovirus, tels que PCSC (pour Peanut chlorotic streak caulimovirus), CMC (pour Cauliflower mosaic caulimovirus), SCMC (pour

Soybean chlorotic mottle caulimovirus), SPC (pour Sweet potato caulimovirus), CVMC (pour Cassa va vein mosaic caulimovirus), et MMC (pour Mirabilis mosaic caulimovirus);

- les virus à ADN simple brin, et plus particulièrement: * les géminivirus, notamment:

. le sous-groupe I (membre-type MSV pour Maize streak virus), comprenant les isolats suivants:

. . MSV, ou virus des stries du maïs,

. . CSMV (pour Chloήs striate mosaic virus), ou virus de la mosaïque striée du Chloήs,

. . DSV (pour Digitaria streak virus), ou virus des stries du Digitaria, . . MiSV (pour Miscanthus streak virus), ou virus des stries du Miscanthus,

. . WDV (pour Wheat dwarf virus), ou virus du nanisme du blé, . . PanSV-Ken (pour Panicum streak virus-Kenya), . . SSV-N (pour Sugarcane streak virus-Natal), ou virus Natal des stries de la canne à sucre, . le sous-groupe II (membre-type BCTV pour Beet curly top virus), comprenant les isolats suivants:

. . BCTV, ou virus de l'enroulement de l'apex de la betterave, . . TPCTV (pour Tomato pseudo-curly top virus), ou virus du pseudo¬ enroulement de l'apex de la betterave, . . BSDV (pour Bean summer death virus), ou virus de la mort estivale du haricot,

. . TYDV (pour Tobacco yellow dwarf virus), ou virus du nanisme et jaunissement du tabac,

. . TLRV (pour Tomato leafroll virus), ou virus de l' enroulement des feuilles de tomate,

. le sous-groupe lu (membre-type BGMV pour Bean golden mosaic virus), comprenant les isolats suivants:

. . BGMV, ou virus de la mosaïque dorée du haricot, . . AbMV (pour Abutilon mosaic virus), ou virus de la mosaïque de YAbutilon,

. . ACMV (pour African Cassava mosaic virus), ou virus de la mosaïque du manioc africain,

. . CLCV (pour Cotton leaf crumple virus), ou virus du froissement des feuilles de coton, . . EuMV (pour Euphorbia mosaic virus) ou virus de la mosaïque de l'Euphorbe,

. . HYVMV (pour Honeysuckle yellow vein mosaic virus), ou virus de la mosaïque et nervures jaunes du chèvrefeuille,

. . ICMV (pour Indian Cassava mosaic virus), ou virus de la mosaïque du manioc indien,

. . MLCV (pour Melon leaf curl virus), ou virus de l' enroulement des feuilles du melon,

. . MYMV (pour Mungbean yellow mosaic virus), ou virus de la mosaïque jaune du haricot, . . PYMV (pour Potato yellow mosaic virus), ou virus de la mosaïque jaune de la pomme de terre,

. . SLCV (pour Squash leaf curl virus), ou virus de l'enroulement des feuilles de la courge,

. . TGMV (pour Tomato golden mosaic virus), ou virus de la mosaïque dorée de la tomate,

. . TLCV (pour Tomato leaf curl virus), ou virus de l' enroulement de la feuille de tomate, notamment TLCV-Aus et TLCV-Ind pour Tomato leaf curl virus Australia et India respectivement,

. . TYDV (pour Tomato Yellow Dwarf Virus), ou virus du nanisme et jaunissement de la tomate,

. . TYLCV (pour Tomato yellow leaf curl virus), ou virus de l'enroulement et du jaunissement de la feuille de la tomate, notamment le STYLCV, pour TYLCV de Sardaigne, dont les sous-ensembles, notamment

STYLCV-Sp (Espagne), comme le STYLCV-Sp-Murcia, le STYLCV-Si (Sicile) ou encore l'ITYLCV, pour TYLCV d'Israël, dont notamment les sous- ensembles ITYLCV-Eg (Egypte) et ITYLCV-Jo (Jordanie),

. . ThTYLCV pour TYLCV de Thaïlande, . . . AToLCV (pour Australian tomato leaf curl virus),

. . IToLCV (pour Indian tomato leaf curl virus), dont notamment les sous-espèces IToLCV-ND (New Delhi) et IToLCV-Bg (Bengalore),

. . TYMV (pour Tomato yellow mosaic virus), ou virus de la mosaïque jaune de la tomate, . . Tom GV (pour Tomato géminivirus MX3),

. . ToLCrV (pour Tomato leaf crumple virus),

. . ToMoV-Flo (pour Tomato moitié virus Florida),

. . Virus du "Chino del Tomate,

. . WCSV (pour Watermelon chlorotic stunt), ou virus du rabougrissement et de la chlorose de la pastèque,

. . CLCV (pour Cotton leaf curl virus), ou virus de l' enroulement des feuilles du coton,

. . CGMV (pour Cowpea golden mosaic virus), ou virus de la mosaïque dorée du Vigna, . . EYMV (pour Eggplant yellow mosaic virus), ou virus de la mosaïque jaune de l'aubergine,

. . BCaMV (pour Bean calico mosaic virus MoV2),

. . PhVCMV (pour Bean calico mosaic virus P. vulgaris),

. . BDMV (pour Bean dwarf mosaic virus), . . PepGV (pour Pepper géminivirus MX1),

. . PHV (pour Pepper huasteco virus),

. . BYVMV (pour Bhendi (Okra) yellow vein mosaic virus),

. . CYVMV (pour Croton yellow vein mosaic virus),

. . HYMV (pour Horsegram yellow mosaic virus), . . DYMV (pour Dolichos yellow mosaic virus), . . PMTV-T (pour Pepper mild tigre virus-T), . . SGMV (pour Serrano golden mosaic virus), . . JMV (pour Jatropa mosaic virus),

. . LIYV (pour Lettuce infectious yellow virus).

* les virus exotiques à ADN simple brin, et plus particulièrement les petits virus isométriques (comportant 1 à 7 composants génomiques), tels que SCSV (pour Subterranean clover stunt virus, décrit par Chu and Helms dans Virology 167, 38-48, 1988), CFDV (pour Coconut foliar decay virus, décrit par Kohde et al., dans Virology 176, 648-651, 1990), FBNYV (pour Faba bean necrotic yellow virus, décrit par Katal et al., dans Ann. Appl. Biol., 123, 628-647, 1993), MVDV (pour Milk vetch dwarf virus, décrit par Sano et al., dans Abstr. 6th, Plant. Path. Congress, Montréal, pp. 305, Abst. 17.2.27, 1993), et BBTV (pour Banana bunchy top virus, décrit par

Harding et al., J. Gen. Viral., 74, 323-328, 1993).

Pour une revue des virus à ADN, notamment simple brin, phytopathogènes comportant des séquences nucléotidiques dont sont susceptibles d'être dérivées par mutation les séquences nucléotidiques de l'invention, on peut se référer aux ouvrages suivants:

- "Classification and Nomenclature of Viruses", Fifth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Edited by Francki, Fauquet, Knudson and Brown; Archivés of Virology, Supplementum 2, Springer-Verlag Wien, New York, 1991, - "Viruses of Tropical Plants", Alan Brunt, Karen Crabtree and Adrian

Gibbs, 1990, Edited by C.A.B. International, Wallingford, Oxon, OX10 8DE, UK,

- "Virus Taxonomy, the VIth Report of the ICTV"; Murphy FA, Fauquet CM, Bishop DHL, Ghabrial SA, Jarvis AW, Martelli GP, Mayo MA, Summers MD (eds) (1995), Springer-Verlag, Wien, New-York, pp. 570.

Les séquences nucléotidiques mutées selon l'invention, caractérisées par un phénotype négatif dominant pour la replication et/ou diffusion et/ou distribution d'un virus à ADN phytopathogène, sont avantageusement choisies parmi celles non pathogènes susceptibles d'inhiber totalement ou partiellement la replication et/ou diffusion et/ou distribution dudit virus pathogène, lorsque ces séquences nucléotidiques mutées, sont cotransfectées avec ledit virus pathogène dans des cellules de plantes, notamment dans des protoplastes de plantes sensibles aux virus phytopathogènes en question.

Les séquences nucléotidiques mutées selon l'invention sont avantageusement choisies parmi celles susceptibles d'inhiber totalement ou partiellement la replication dudit virus pathogène, notamment dans les conditions de cotransfection de protoplastes susmentionnées. L'invention vise plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de séquences nucléotidiques mutées codant pour une (ou plusieurs) protéine(s) susceptible(s) d'inhiber totalement ou partiellement la replication dudit virus pathogène.

Les séquences nucléotidiques mutées susmentionnées sont avantageusement choisies parmi celles codant pour une (ou plusieurs) protéine(s) possédant un phénotype négatif dominant pour la replication dudit virus pathogène, notamment lorsque des vecteurs, tels que des plasmides comprenant ces séquences nucléotidiques mutées, intégrées dans leur génome, ainsi que les éléments nécessaires pour la transcription de ces dernières, notamment un promoteur approprié, sont cotransfectés avec ledit virus pathogène, ou avec des constructions géniques, telles que des plasmides, contenant le génome dudit virus pathogène, dans des protoplastes ou tout autre cellule ou milieu propice à leur replication.

L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de séquences nucléotidiques mutées présentant un phénotype négatif dominant sur la replication de virus à ADN phytopathogènes, et susceptibles de coder pour une (ou plusieurs) protéine(s) mutée(s) correspondant à une (ou plusieurs) protéine(s) essentielle(s) pour la replication dudit virus, ou correspondant à un fragment de cette (ou ces) protéine(s) essentiel pour la replication du virus, et comportant une (ou plusieurs) mutation(s).

Avantageusement, les séquences nucléotidiques mutées selon l'invention sont susceptibles de coder pour une protéine mutée correspondant à une protéine qui, normalement chez un virus, est susceptible :

- de se lier spécifiquement avec des séquences nucléotidiques du génome du virus, notamment dans la région intergénique (RI) telle que définie ci-dessus dans le cas des géminivirus, et/ou

- de réprimer la transcription de son propre gène, à savoir du gène codant pour cette protéine, et/ou

- d'avoir une action d'endonucléase spécifique capable de cliver et de lier le génome viral au niveau de son origine de replication, afin d'initier et de terminer la replication d'ADN, et/ou

- de posséder une activité NTPase (c'est-à-dire d'hydrolyse de nucléosides triphosphate) nécessaire pour la replication du génome viral, et/ou

- d'être phosphorylée par les kinases de plantes, ou correspondant à tout fragment de cette protéine susceptible de posséder au moins une des propriétés susmentionnées, ladite protéine comportant une (ou plusieurs) mutation(s). Les séquences nucléotidiques mutées selon l'invention sont plus particulièrement choisies parmi celles codant pour une protéine mutée inactive pour la replication virale, par opposition à la protéine active à laquelle elle correspond, cette dernière étant essentielle pour la replication virale.

En particulier, les protéines mutées selon l'invention ne possèdent pas au moins une des propriétés susmentionnées de la protéine dont elles dérivent par mutation.

L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de séquences nucléotidiques mutées codant pour une protéine mutée dérivant de la protéine Rep (encore désignée protéine Cl ou ALI) d'un poids moléculaire d'environ 40 kDa, essentielle pour la replication du génome des géminivirus

(notamment ceux décrits ci-dessus), et possédant au moins l'une des propriétés susmentionnées.

Avantageusement, la protéine mutée selon l'invention est dépourvue, en totalité ou en partie, de l'activité NTPase de la protéine dont elle dérive, notamment de l'activité ATPase de la protéine Rep des géminivirus dont elle dérive.

Une telle protéine mutée à activité NTPase nulle ou insuffisante pour permettre la replication virale, est codée par une séquence nucléotidique mutée, avantageusement obtenue par substitution et/ou suppression d'un (ou plusieurs) nucléotide(s) appartenant à des enchaînements de nucléotides codant pour tout ou partie des sites de fixation de nucléoside triphosphate au sein du génome du virus phytopathogène dont on souhaite inhiber la replication, et/ou par addition d'un (ou plusieurs) nucléotide(s) au sein des enchaînements de nucléotides susmentionnés. Avantageusement, la (ou les) mutation(s) effectuée(s) sur les enchaînements de nucléotides susmentionnés conduit (conduisent):

- à la substitution et/ou suppression de l'un au moins des acides aminés soulignés dans l'une des deux séquences peptidiques suivantes correspondant à des sites de fixation des NTP situés sur une (ou plusieurs) protéine(s) virale(s) essentielle(s) pour la replication, et plus particulièrement la protéine Rep:

-Giy-X-X-X-X-GJLy.-Lyi-Ihι/Seι < 25-100 > Δ5β/GJu-Δiφ/<jlu- -Gly-X-Gly- ys-Thr/Ser < 25-100 > Δiφ/GJu-ΔîipJCilu- < 25-100 > représentant un enchaînement d'environ 25 à environ 100

acides aminés quelconques,

X représentant un acide aminé quelconque,

- et/ou à l'addition d'un (ou plusieurs) acide(s) aminé(s) en un (ou plusieurs) site(s) des séquences peptidiques susmentionnées. Avantageusement, la mutation est effectuée par substitution de la lysine représentée sur les séquences peptidiques susmentionnées, notamment par l'aianine, l'arginine ou l'histidine, et de préférence par l'alanine.

L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de la séquence nucléotidique mutée codant pour une protéine Cl inactive correspondant à la protéine Cl active des géminivirus, dans laquelle la lysine située entre les positions 220 et 235 de ladite protéine Cl active est remplacée par l'alanine, l'arginine ou l'histidine, pour l'obtention de plantes résistantes ou tolérantes aux géminivirus.

L'invention a plus particulièrement encore pour objet l'utilisation des séquences nucléotidiques mutées codant pour une protéine Cl inactive correspondant à la protéine Cl active des différents isolats du virus TYLC, telles que les séquences nucléotidiques Cl* représentées sur la figure 13, dans lesquelles la lysine en position 227 est remplacée par l'alanine, l'arginine ou l'histidine, (à l'exception d'un isolât israélien du virus TYLC (ITYLCV) pour lequel il semblerait que la lysine en question soit en position 225), pour l'obtention de plantes, notamment de tomates, résistantes ou tolérantes aux virus TYLC.

De préférence, la protéine Cl inactive susmentionnée des géminivirus, notamment des virus TYLC. correspond à la protéine Cl active, dans laquelle la lysine, située à l'une des positions indiquées ci-dessus, est remplacée par une alanine.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'au moins une séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, pour la transformation de cellules de plantes en vue de l'obtention de plantes transgéniques résistantes ou tolérantes aux virus à ADN phytopathogènes.

Par plantes transgéniques résistantes aux virus à ADN phytopathogènes, on entend toute plante chez laquelle, après infection par lesdits virus, on ne détecte pas d'une part, les symptômes pathologiques caractéristiques de l'infection d'une plante non transgénique sensible auxdits virus, et d'autre part l'ADN desdits virus au sein des cellules desdites plantes transgéniques.

Par plantes transgéniques tolérantes aux virus à ADN phytopathogènes, on entend toute plante chez laquelle, après infection par lesdits virus, on ne détecte pas les symptômes pathologiques caractéristiques de l'infection d'une plante non

transgénique sensible auxdits virus, mais chez lesquelles de l'ADN desdits virus peut être détecté dans les cellules desdites plantes transgéniques (dans des quantités plus faibles que dans le cas de l'infection d'une plante sensible à ces virus).

Les séquences nucléotidiques mutées selon l'invention sont avantageusement utilisées pour la transformation de protoplastes, ou encore pour la construction de vecteurs, tels que des plasmides, ou pour la transformation de bactéries telles que Agrobacterium tumefaciens, susceptibles de transformer à leur tour des cellules de plantes.

L'invention a également pour objet l'utilisation susmentionnée de toute séquence nucléotidique mutée telle que décrite ci-dessus, dérivée par mutation d'une séquence nucléotidique présente dans le génome d'un virus à ADN phytopathogène appartenant à une famille déterminée, telle que la famille des géminivirus, pour l'obtention de plantes transgéniques résistantes ou tolérantes à une ou plusieurs sous-espèces et/ou espèces virales appartenant à cette même famille, et plus particulièrement à une ou plusieurs sous-espèces et/ou espèces virales appartenant à un même sous-groupe au sein de cette famille, tel que le sous-groupe m, ou appartenant à un même membre d'un sous-groupe déterminé au sein de cette famille, tel que les TYLCV.

A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de la séquence nucléotidique mutée codant pour une protéine Cl inactive correspondant à la protéine Cl active de l'espèce STYLCV, dans laquelle, la lysine en position 227 est remplacée par l'alanine, l'arginine ou l'histidine (telle que représentée sur la figure 13), pour l'obtention de plantes, notamment de tomates, résistantes ou tolérantes aux géminivirus tels que ceux appartenant aux TYLCV, notamment aux virus comme le STYLCV et l'ITYLCV, notamment l'ITYLCV-Jo, ou encore des géminivirus non TYLCV, notamment l'ACMV ou le BGMV. L'invention a également pour objet tout procédé d'obtention de plantes, notamment de tomates, transgéniques résistantes ou tolérantes aux virus à ADN phytopathogènes, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de transformation de cellules de plantes, à l'aide d'au moins une séquence nucléotidique mutée selon l'invention, le cas échéant, insérée dans un vecteur ou une bactérie tels que définis ci-dessus, suivie de la régénération des plantes à partir des cellules ainsi transformées.

A titre d'illustration, un procédé tel que décrit ci-desssus consiste à introduire une séquence nucléotidique mutée selon l'invention dans une cellule

de plante, notamment dans un protoplaste, le cas échéant par l'intermédiaire d'un vecteur (tel qu'un plasmide), la plante transgénique étant obtenue par division des cellules ainsi transformées (procédé par utilisation d'ADN nu).

Un autre procédé consiste à transformer des cellules de plantes à l'aide de bactéries telles qμ'Agrobacterium tumefaciens, elles-mêmes transformées par au moins une séquence nucléotidique mutée selon l'invention, notamment suivant la méthode de coculture ou des disques foliaires.

Pour une revue des méthodes utilisables pour l'obtention de plantes transgéniques de l'invention, on peut se reporter à l'article de Potrykus paru dans Biotechnology, juin 1990, 535-542.

Le procédé selon l'invention, est avantageusement réalisé par transformation des cellules d'un fragment d'une plante, notamment de disques foliaires, à l'aide de bactéries Agrobacterium tumefaciens, transformées par un vecteur tel que défini ci-dessus, suivie de la régénération des plantes à partir des cellules ainsi transformées, notamment à partir de bourgeons formés à la périphérie des disques foliaires susmentionnés.

L'invention concerne également les cellules transgéniques de plantes possédant un ADN hétérologue intégré de façon stable dans leur génome, ledit ADN hétérologue contenant le cas échéant un promoteur reconnu par les polymérases desdites cellules de plantes, et au moins une séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, ladite séquence nucléotidique mutée étant capable d'inhiber totalement ou partiellement la replication et/ou la diffusion et/ou la distribution de virus à ADN phytopathogènes, notamment capable de coder, sous le contrôle dudit promoteur, pour une protéine susceptible d'inhiber totalement ou partiellement la replication et/ou la diffusion et/ou la distribution de virus à ADN phytopathogènes au sein desdites cellules transformées, les cellules de Nicotina tabaccum cultivar BY2 (pour bright yellow 2, décrites par Nagata et al, 1992) étant exclues.

L'invention vise plus particulièrement les cellules de plantes telles que définies ci-dessus, qui peuvent être régénérées en une plante transgénique résistante ou tolérante à une ou plusieurs souches de virus à ADN phytopathogènes, et capable de produire des semences, elles-mêmes résistantes ou tolérantes auxdits virus.

Avantageusement, les cellules de plantes selon l'invention, sont transformées selon un procédé tel que décrit ci-dessus.

L'invention a également pour objet les semences transgéniques possédant un ADN hétérologue intégré de façon stable dans le génome de leurs cellules, ledit ADN hétérologue contenant le cas échéant un promoteur reconnu par les

polymérases desdites cellules, et au moins une séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, ladite séquence nucléotidique mutée étant capable d'inhiber totalement ou partiellement la replication et/ou la diffusion et/ou la distribution de virus à ADN phytopathogènes, notamment capable de coder, sous le contrôle dudit promoteur, pour une protéine susceptible d'inhiber totalement ou partiellement la replication et/ou la diffusion et/ou la distribution de virus phytopathogènes au sein desdites cellules transformées.

Avantageusement, les semences selon l'invention, sont capables de germer en une plante résistante ou tolérante aux virus à ADN phytopathogènes, et plus particulièrement à ceux définis ci-dessus.

De préférence, les semences selon l'invention, sont transformées par un procédé tel que décrit ci-dessus.

L'invention a également pour objet les plantes transgéniques résistantes ou tolérantes aux virus à ADN phytopathogènes comportant un ADN hétérologue intégré de façon stable dans le génome de leurs cellules, ledit ADN hétérologue contenant le cas échéant un promoteur reconnu par les polymérases desdites cellules de plantes, et au moins une séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, ladite séquence nucléotidique mutée étant capable d'inhiber totalement ou partiellement la replication et/ou la diffusion et/ou la distribution de virus à ADN phytopathogènes, notamment capable de coder, sous le contrôle dudit promoteur, pour une protéine susceptible d'inhiber totalement ou partiellement la replication et/ou la diffusion et/ou la distribution de virus phytopathogènes au sein desdites cellules transformées, les plantes de Nicotina benthamiana ainsi transformées étant exclues. Avantageusement, les plantes selon l'invention, sont capables de produire des semences résistantes aux virus à ADN phytopathogènes.

L'invention vise plus particulièrement les plantes susmentionnées, telles qu'obtenues par mise en oeuvre d'un procédé tel que décrit ci-dessus.

Les plantes transgéniques selon l'invention résistantes ou tolérantes aux virus à ADN phytopathogènes, notamment à l'un au moins des virus à ADN décrits ci-dessus, telles qu'obtenues par transformation de leurs cellules avec au moins une séquence nucléotidique mutée selon l'invention, sont avantageusement choisies parmi les plantes suivantes: Ageratum spp., notamment Ageratum conyzoides, Arabidopsis spp., notamment Arabidopsis thaliana, Arachis spp., notamment Arachis hypogaea, Asparagus spp., notamment Asparagus officinalis, Avena spp., notamment Avena sativa et Avena byzantina, Beta spp., notamment Beta vulgaris, Brassica spp., notamment Brassica oleracea vars capitata, Brassica napus et Brassica râpa, Cajanus spp.,

notamment Cajanus cajan, Cannabis spp., notamment Cannabis sativa, Capsicum spp., notamment Capsicum annuum, Castanospermum spp., notamment Castanospermum australe, Citrullus spp., notamment Citrullus colocynthis et Citrullus lanatus, Cocos spp., notamment Cocos nucifera, Cola spp., notamment Cola chlamydantha et Cola gigantea var. glabrescens, Crown spp., notamment Croton lobatus, Cucumis spp., notamment Cucumis melo var. cantalupensis et Cucumis melo, Curcubita spp., notamment Cucurbita maxima, Cucurbita moschata, et Cucurbita pepo, Cynanchum spp., notamment Cynanchum acutum, Datura spp., notamment Datura stramonium, Dioscorea spp., notamment Dioscorea alata, Euphorbia spp., notamment Euphorbia fulgens, Euphorbia heterophylla, Euphorbia peplus et Euphorbia pulcherrima, Glycine spp., notamment Glycine max et Glycine hispida, Gossypium spp., notamment Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum, Gossypium thurberi et Gossypium herbaceum, Helianthus spp., notamment Helianthus annuus, Hibiscus spp., notamment Hibiscus cannabinus, Hibiscus esculentus et Hibiscus sabdariffa, Hordeum spp., notamment Hordeum vulgare et Hordeum distichon, Indigofera spp., notamment Indigofera hirsuta, Ipomoea spp., notamment Ipomoea batatas, Jatropha spp., notamment Jatropha gossypifolia, Jatropha multifida et Jatropha podagrica, Lablab spp., notamment Lablab purpureus, wiwi spp., notamment ma usitatissimum, Lonicera spp., notamment

Lonicera japonica, Lycopersicon spp., notamment Lycopersicon esculentum, Lycopersicon hirsutum et Lycopersicon pimpinellifolium, Macroptilium spp., notamment Macroptilium lathyroides, Macrotyloma spp., notamment Macrotyloma uniflorum, Malva spp., notamment Λfû va parvifiora, Malvastrum spp., notamment Malvastrum coromandelianum, Manihot spp., notamment

Manihot esculenta et Manihot glaziovii, Medicago spp., notamment Medicago sativa, Musa spp., notamment IUÛ sapientum, Nicotiana spp., notamment Nicotiana tabacum, Oryza spp., notamment t9ryzα art/vu, Phaseolus spp., notamment Phaseolus acutifolius, Phaseolus lunatus et Phaseolus vulgaris, Pwwm spp., notamment .PÛIOTI sativum, Raphanus spp., notamment Raphanus sativus, Saccharum spp., notamment Saccharum qfficinarum, Secale spp., notamment 5é?cα/c? céréale, Sida spp., notamment Λ ^' Λz rhombifolia, Solanum spp., notamment Solanum melongena et Solanum tuberosum, Sorghum spp., notamment Sorghum bicolor et Sorghum vulgare, Spinacia spp., notamment Spinacia oleracea, Theobroma spp., notamment Theobroma cacao, les Triticales

(croisements blé x seigle), Triticum spp., notamment Triticum aestivum, Triticum durum et Triticum vulgare, Vicia spp., notamment Vicia faba et Vϋc/û sativa, Vigna spp., notamment V^nα angularis, Vigna mungo, Vigna radiata et

Vigna unguiculata, Vitis spp., notamment Vitis vinifera, Zea spp., notamment Zea mays.

L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de l'obtention de N. benthamiana et de tomates transgéniques résistantes à l'infection par les TYLCV, et plus particulièrement par les STYLCV et les

ITYLCV.

I) OBTENTION DE MUTANTS NEGATIFS DOMINANTS DANS LE SITE DE LIAISON AUX NTP DE LA PROTEINE Cl DU TYLCV, UN GEMINIVIRUS

A) MATÉRIEL ET MÉTHODES a) Mutagénèse dirigée pTYLCV est un clone infectieux de l'isolât de Sardaigne du TYLCV (STYLCV) dans lequel le génome viral entier est clone au site SstI du vecteur pUCllδ. La mutagénèse dirigée à été réalisée sur ce clone, produisant les plasmides pTYAla, pTYHis, pTYArg; portant respectivement la mutation correspondant au changement de K^2 _en A, H et R (Fig.2).

Principe (Kunkel, 1985) : Un oligonucléotide mutagène est hybride à l'ADN simple-brin circulaire uridinylé soumis à la mutagénèse. La synthèse du deuxième brin s'effectue in vitro, puis la contre-sélection du brin uridinylé se fait par transformation dans E. coli et réparation de l'hybride double-brin in vivo. L'étape in vitro est réalisée en présence de fragments de restriction recouvrant le plasmide, de façon à rrùnimiser la longueur du brin complémentaire néosynthétisé, ce qui diminue les risques d'introduction de nouvelles mutations. l/-Obtention de l'ADN simple-brin uridynilé :

On transforme la souche E. coli BW313 (Hfr lysA dut-ung-thi-1 recA spoTl), infectée par le "phage helper" M13K07, par le plasmide à mutagéniser (pTYLCV). Ces bactéries produisent alors de l'ADN simple-brin uridynilé, la bactérie étant déficiente pour les fonctions dUTPase et Uracile-N-Glycosilase, et encapsidé sous forme simple-brin grâce aux fonctions codées par le phage M13K07 et à leur action en trans sur l'origine de replication de M13 contenue dans pUCllδ. Les "phagemides" obtenus sont collectés par une première centrifugation de la culture bactérienne (10.000 rpm, 10 min), traitement du surnageant au PEG 8000 20% et NaCl 2,5M (300ml/ml), suivis d'une deuxième centrifugation (6000 rpm, 20 min). Les protéines sont extraites par traitement au phénol/chloroforme et l'ADN est précipité à l'éthanol (Sambrook et al, 1989).

2/-Hybridation avec l'oligonucléotide mutagène et synthèse du deuxième brin :

La séquence des oligonucléotides utilisés est la suivante : mutation K en A : CCGGACAGGAfîCGAC(£ACGTG)GGCC. mutation K en H : CCGGACAGGA£A!AC(£ACGTG)GGCC. mutation K en R : CCGGACAGGAAG.GAC(£ACGTG)GGCC.

Les parenthèses indiquent l'emplacement du nouveau site de restriction P/n/T.

Des fragments de restriction du pTYLCV ainsi que l'oligonucléotide phosphorylé (en excès molaire de 25 par rapport au fragment de restriction correspondant) sont hybrides sur l'ADN simple-brin uridynilé. Le deuxième brin est alors synthétisé (Klenow 10 unités, Ligase 800 unités, ATP 500 μM, dNTPs 500 μM, Tris lOmM, MgC12 5mM, DTT 500 μM). On transforme ensuite une souche E. coli DH5α (supE44 ΔlacU169 (φ801acZΔM15) hsdR17 recAl endAl gyrA96 thi-1 relAl) qui va réparer l'ADN en dégradant préférentiellement le brin uridynilé. Le brin nouvellement synthétisé utilise comme matrice le brin complémentaire contenant la mutation, ce qui l'introduit ainsi sur les deux brins.

b) Cassettes d'expression des ORF Cl mutées L'expression à haut niveau des protéines Cl mutées est réalisée par sous- clonage des fragments portant la mutation dans le plasmide pBMCl-S, en plaçant les ORF Cl sous dépendance d'un promoteur fort, dérivé du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV). Le plasmide pBMCl-S contient l'ORF de Cl clonée dans un vecteur non réplicatif représenté sur la Fig.2.

Le site Sstl2860 ^a été détruit de ce vecteur par l'ADN polymérase du phage T7. Le fragment HmdlH-Scαl, dans lequel le site SstI est supprimé, est substitué au fragment HwάTfl-Sα-I correspondant dans pBMCl-S: ainsi est obtenu le plasmide pBMCl-S(SstΙ). Ensuite, le fragment Sstl365-Bα HIu7o de ce dernier plasmide a été remplacé par un fragment Sstl-Bg/II de pTYAla, pTYHis, ou pTYArg donnant respectivement les plasmides pClAla, pClHis et pClArg. On crée alors un nouveau site en position 1170, clivable par Mbol ou BstYl (Fig. 2).

c) Détermination de la séquence des mutants obtenus

La méthode de terminaison de chaîne (Sanger et al, 1977; Sanger, 1981) (Kit Pharmacia -T7 Sequencing kit) a été utilisée avec pour matrice de l'ADN double-brin obtenu par maxipréparation d'ADN plasmidique (Sambrook et al,

1989). Les réactions sont déposées sur un gel d'acrylamide 6% dénaturant pour lequel on réalise un gradient d'épaisseur (0.2 mm en haut et 0.6 mm en bas des plaques) de façon à avoir une bonne résolution des bandes sur une plus grande partie du gel. La migration s'effectue en tampon TBE à 2000 V, avec un dispositif de thermostat permettant de maintenir les plaques à 50 °C, ce qui donne une migration plus régulière.

d) Lignée cellulaire et préparation de protoplastes

La lignée cellulaire BY2 est une suspension cellulaire dérivée de Nicotiana tabacum L cv Bright Ye ^' llow 2 (Kato et al, 1972; Nagata et al, 1992). Elle est diluée (2 : 100) tous les 7 jours dans un milieu dérivé du milieu de Murashige & Skoog (Sigma) supplémenté en KH2PO4 (200 mg/1), myo-Inositol (100 mg/1) thiamine-HCl (lmg/1), saccharose (30 g/1), 2,4-D (0,2mg/l) MES (2g/l), pH 5,8. La culture est maintenue en agitation constante (130 rpm) à 26°C et à l'obscurité.

Pour la préparation de protoplastes, les cellules d'une suspension de 100 ml de trois à quatre jours (ensemencement de 2 à 3 ml dans 100ml) sont récoltées par filtration, lavées dans du mannitol 0.4 M puis transférées dans 50 ml de la solution enzymatique suivante: 1 % Cellulase Onozuka RS, 0.1 % Pectolyase, mannitol 0.4 M, pH 4,5 à 5,5. La digestion de la paroi cellulaire se fait à 28°C, sous agitation (60 rpm) et à l'obscurité. L'obtention des protoplastes (1 à 2 h) est contrôlée sous microscope (apparition de cellules sphériques). Les protoplastes sont ensuite collectés par centrifugation (100g, 2 min), lavés, comptés en cellule de Fuchs-Rosenthal et repris en milieu MaMg (450 mM mannitol, 15 mM MgCl2, 0.1% MES, pH 5.6) à la densité finale de

2.10 ⁶ protoplastes dans 300 ml.

e) Transfection des protoplastes

Chaque transfection est effectuée avec 2.10^ protoplastes et 15 mg d'ADN (plasmide circulaire ou ADN viral linéaire double-brin). Le mélange

ADN/protoplastes est incubé 20 min avec 600 ml de PEG 1500 à 25% dans la solution suivante: 0,1 M MgCl ₂ , 6H ₂ O; 0,45 M Mannitol, 0,02M Hepes, pH 6. Les protoplastes sont ensuite rincés, repris dans 10 ml de milieu K3 (Nagy et al, 1976) et transférés dans deux boites de Pétri de diamètre 5,5 cm. Les protoplastes transfectés sont incubés à 28°C en obscurité sans agitation et récoltés après 3 et 5 jours de culture.

f) Extraction d'ADN total des cellules transfectées

Les cellules sont collectées par centrifugation (100 g, 5 min), lavées et remises en suspension dans 300 μl de tampon d'extraction (0.1M NaCl, 0.1M Tris-HCl pH8, 50 mM EDTA, 0.5% SDS) puis placées à -20°C.

Elles sont ensuite broyées dans ce tampon (broyeur Heidolph). Les protéines sont extraites par traitement au phénol-chloroforme (Sambrook et al, 1989) et les acides nucléiques sont précipités à l'éthanol (Sambrook et al, 1989). Les ADNs sont repris dans du tampon TE et leur concentration est déterminée par densité optique mesurée à 260 nm.

g) Electrophorèse, transfert sur membrane et hybridation des ADNs extraits

L' electrophorèse en gel d'agarose 1% est réalisée sans bromure d'éthidium, en déposant 10 μg d'ADN par puits. Les conditions de migration sont les suivantes: 30 min à 60 volts puis environ 16 heures à 25 volts, en tampon TBE. Le gel est dépuriné en présence d'HCl 0,25 N et traité pour un transfert alcalin sur membrane Hybond-N (Amersham). La sonde utilisée correspond au génome total du STYLCV. Le marquage au 32p est obtenu par amorçage aléatoire (Kit Amersham Megaprime).

h) Extraction des protéines et test d'activité néomycine phosphotransférase

La méthode utilisée dérive de la méthode décrite par Reiss et al, 1984.

L'activité NPT II est décelée in situ sur un gel de protéines non dénaturant par la phosphorylation de la kanamycine au [γ -32p] ATP.

Les protoplastes (une demi boite de Pétri) sont centrifugés et repris dans un tampon contenant 60% glycérol, 8% β-mercaptoéthanol, lOOmM Tris pH6,8, 0,1 % SDS, 1 % bleu de bromophénol, 1 % bleu de xylène-cyanol. Les protéines totales sont quantifiées par la méthode de Bradford (BIO-RAD); des quantités égales de protéines sont alors déposées sur gel d'acrylamide sans SDS (gel de tassement : acrylamide 3,5%; bisacrylamide 0,12 %; Tris-HCl 0.1 M pH6.8 / gel de séparation : acrylamide 10%; bisacrylamide 0,33%; Tris-HCl 0.4 M pH8.8). La migration est réalisée à 13,5 mA dans un tampon contenant 25 mM Tris-OH, pH 8,8; 191 mM glycine pendant 16 heures environ. Le gel est alors rincé à l'eau et équilibré dans le tampon de réaction (67 mM Tris-maléate; 42 mM MgCl2; 400 mM NH4CI; pH 7.1). On coule ensuite sur le gel de protéines un gel d'agarose 1 % contenant le sulfate de kanamycine (10,5 μg/ml) et 50 à 100 μCi [γ-32p] ATP. Après 30 min de réaction, la kanamycine phosphorylée

est transférée par capillarité sur papier échangeur d'ions Whatman P81. Le papier P81 est ensuite traité (lmg/ml protéinase K, 1% SDS) pour diminuer les bandes parasites de phosphorylation de protéines cellulaires, rincé en tampon phosphate (10 mM K2PO4 pH 7.4) à 80°C séché et placé en autoradiographie.

B) RÉSULTATS a) Obtention et séquençage des mutants dans le motif de liaison aux NTP de la protéine Cl.

La protéine Cl du TYLCV contient le motif GX4GKT de liaison aux NTP (résidus 221 à 228).

Trois mutations ont été introduites dans le clone infectieux pTYLCV pour remplacer la Lys^27 (K) par trois acides aminés différents: Ala (A), His (H) et Arg (R) (Fig. 3). Les oligonucléotides mutagènes ont été conçus de manière à introduire au voisinage de la mutation recherchée un site de restriction unique pour l'enzyme Pm I (mutation silencieuse), afin de faciliter la sélection des clones présentant la mutation. Afin de confirmer la présence de la mutation désirée et de s'assurer qu'aucune autre mutation ne s'est produite dans cette région, plusieurs clones indépendants ont été séquences pour chacune des mutations (Ala, His et Arg).

b) Deux des mutants obtenus sont déficients pour leur replication.

La replication des mutants a été étudiée par transfection de protoplastes obtenus à partir de la suspension cellulaire de tabac BY2. Les différents génomes viraux sauvage (pTYLCV) ou mutés (pTYAla, pTYHis, pTYArg) ont été excisés de leur plasmide vecteur par l'enzyme Sst I, et sont donc transfectés sous forme double-brin linéaire. Après 3 et 5 jours de culture, on recherche l'apparition des formes réplicatives du virus par extraction des acides nucléiques totaux, electrophorèse, transfert sur membrane et hybridation avec une sonde correspondant à l'ADN viral. Les résultats sont présentés en Fig. 4 pour le clone viral infectieux et les mutants pTYAla et pTYArg. L' autoradiogramme résultant de l'analyse selon Southern a été quantifié à l'analyseur d'images (Bio- Image, Millipore). Les valeurs rapportées sur le graphe correspondent au rapport entre la densité optique (DO) des bandes correspondant aux formes réplicatives et la somme des DOs des bandes correspondant aux formes virales transfectées et aux formes réplicatives. On étudie donc le pourcentage de formes réplicatives par rapport aux formes virales totales.

La figure 4 représente le pourcentage de formes réplicatives après trois (en noir) et cinq (en blanc) jours de culture des cellules transfectées. pTYLCV:

génome viral sauvage; pTYAla, pTYArg : génomes viraux mutés correspondant au changement de K en A et R respectivement.

On constate que le mutant pTYAla présente un taux de formes réplicatives bien inférieur à celui du virus sauvage (environ d'un facteur 12). Quant au mutant pTYArg, il présente une réduction d'un facteur 3 par rapport au sauvage. Un effet similaire a été observé lors d'une autre expérience. Les expériences n'ont pas été réalisées avec le mutant pTYHis.

La replication des mutants pTYAla et pTYArg est altérée, ce qui indique que le site potentiel de liaison aux NTP joue un rôle important dans le fonctionnement de la protéine Cl .

c) Recherche d'un effet /nzπ<r-dominant des protéines Cl mutées sur la replication par le biais de l'expression du gène rapporteur NPT II :

L'effet trans -dominant sur la replication de l'ADN viral peut être observé de deux façons, soit par accumulation d'ADN viral néosynthétisé, soit par accumulation d'une "protéine-rapporteur" codée par un virus recombinant. Le gène rapporteur utilisé ici est le gène codant pour la néomycine phospho- transférase II (NPT H), introduit à l'emplacement des phases de lecture VI et V2 du TYLCV. Un tel génome viral remanié (pTYnéo) a les mêmes capacités de replication qu'un génome non modifié dans des cellules isolées. Le test d'activité NPT II est quantitatif: le produit phosphorylé de la réaction, et donc l'intensité de la tache en autoradiographie dans le cas d'utilisation de γ-32p ATP, est proportionnel à la quantité d'enzyme présente (Reiss et al, 1984). En supposant que l'intensité de l'activité NPT II augmente avec le nombre de génomes viraux répliqués, nous avons étudié l'activité NPT II en présence des différentes constructions.

Afin de rechercher un effet trans-dominant, nous avons cotransfecté des protoplastes de tabac d'une part avec les génomes viraux sauvages et mutés (pTYLCV, pTYAla, pTYHis, pTYArg) et d'autre part avec les génomes viraux sauvages et les cassettes d'expression des ORF Cl mutées (pClAla, pClHis, pClArg). On constate une nette diminution de l'expression du gène NPT II en présence du virus mutant pTYArg (d'un facteur 37 à 3 jours). De même, l'expression de la protéine Cl mutée (pCl Arg) à haut niveau inhibe la replication d'un facteur 2,5 (Fig.5). Nous pouvons voir cependant que, dans tous les cas, les valeurs de l'expression NPT II diminuent entre 3 et 5 jours. La construction portant le gène NPT II étant réplicative, on ne devrait pas observer une telle baisse de l'expression. Cette cinétique suggère que le promoteur de VI et V2 est régulé

en fonction du cycle viral. Cette méthode de détection de la replication virale est donc trop indirecte et non appropriée, et ne sera pas poursuivie pour l'étude des mutants pTYHis et pTYAla.

d) Les génomes viraux mutés dans le site de liaison aux NTP inhibent la replication du génome sauvage.

La replication virale est étudiée cette fois par quantification des formes virales réplicatives accumulées dans les cellules cotransfectées avec les génomes viraux sauvages (pTYLCV) et mutés (pTYAla, pTYHis, pTYArg). La méthodologie utilisée est la même que pour l'étude de la replication des mutants.

La présence des virus mutants influe sur la replication du virus sauvage (Fig. 6): En effet, les mutants pTYAla et pTYArg diminuent la replication virale d'un facteur 30 et 5,5 respectivement. Pour le mutant pTYHis, l'effet n'est pas très important (facteur 1,4). Ces résultats ne sont le fruit que d'une seule expérience, sauf pour le mutant pTYArg où l'expérience a été répétée et a donné des résultats concordants.

Nous pouvons voir, avec les mutants pTYAla et pTYArg, qu'à 5 jours, la différence dans le taux de formes réplicatives entre le virus sauvage et les mutants est moins prononcée qu'à 3 jours. Ceci peut être expliqué par une accumulation progressive de molécules échappant à l'inhibition, qui ne serait donc pas complète dans ce système.

Les mutants pTYAla et pTYArg semblent donc inhiber la replication du virus sauvage. Toutefois, il est difficile d'attribuer de façon rigoureuse cet effet inhibiteur aux protéines Cl mutées. En effet, un phénomène de dilution des protéines Cl fonctionnelles doit avoir lieu et interférer avec l'efficacité de replication. La protéine Cl produite par le génome sauvage va en effet assurer la replication de son propre génome mais aussi celle des génomes mutants, et donc se voir répartie sur deux fois plus de molécules matrices que dans le contrôle utilisé ici (pUC 118) où le génome viral sauvage est cotransfecté avec un plasmide auquel Cl ne se lie pas. Il sera intéressant de réaliser un contrôle supplémentaire, dans lequel un virus sauvage est cotransfecté avec un virus muté ne produisant aucune protéine Cl (par délétion de l'ORF Cl ou par introduction d'un codon STOP). Si la replication virale est également diminuée, il s'agit alors d'un phénomène de titration des protéines Cl et non d'un effet négatif dominant.

e) Les protéines Cl mutées surexprimées ont un effet négatif dominant: elles sont capables d'inhiber en trans la replication du génome viral sauvage.

Afin de voir si les protéines Cl mutées dans le site de liaison aux NTP exprimées à haut niveau peuvent inhiber la replication du génome viral sauvage, les ORFs correspondantes ont été placées sous contrôle d'un promoteur fort (pClAla, pClHis, pClArg). Les constructions ainsi obtenues ont été testées pour leur effet sur la replication par cotransfection de protoplastes avec un génome viral sauvage. Les plasmides pClAla et pClHis exercent une inhibition prononcée de la replication du virus sauvage (diminution d'un facteur 38,5 et 14,5 respectivement par rapport au témoin utilisé). D'autres expériences ont montré une variation dans le même sens, pClHis ayant cette fois un effet plus fort que pClAla. Quant au plasmide pClArg, son effet n'est pas significatif puisque le facteur de diminution n'est que de 1,4. Ceci tend à faire valoir l'hypothèse de la dilution de molécules dans le cas de la cotransfection de génomes viraux entiers. En effet, avec cette même mutation, on pouvait voir un effet de diminution de la replication virale que, curieusement, on ne retrouve pas dans le cas d'une surexpression. Une cotransfection contrôle a été réalisée avec pTYnéo et une cassette d'expression de la protéine GUS (β-glucuronidase), le promoteur alors utilisé étant le promoteur 35S du CaMV. Cette transfection a été réalisée dans le but d'évaluer les conséquences de la surexpression d'une protéine quelconque. Sur les deux expériences réalisées, les résultats ont été antagonistes puisque dans un cas l'effet semble nul alors que dans l'autre cela a provoqué une chute des formes réplicatives d'un facteur 4 (Fig. 5 et Fig. 7).

Conclusion

L'altération du site potentiel de liaison aux NTP de la protéine Cl du TYLCV résulte en l'obtention de génomes viraux déficients pour leur replication. Ceci démontre l'importance de ce site dans le fonctionnement de la protéine Cl et suggère fortement que la protéine Cl est sans doute capable de se lier à un NTP. De plus, les génomes viraux mutés (pTYAla et pTYArg) peuvent freiner la replication de leur homologue sauvage. Un effet similaire a pu être mis en évidence avec un vecteur d'expression des protéines Cl mutées, pour les mutations Ala et His.

Il semble donc que le phénotype négatif des protéines Cl mutées soit effectivement dominant sur leur homologue sauvage, et conduise ainsi à une inhibition de la replication virale. En effet, l'inhibition de la replication observée dans le cas de la cotransfection de génomes viraux entiers ne peut être expliquée uniquement par un effet de dilution des protéines Cl sauvages puisque le mutant pTYHis n'induit pas de variation très importante. Toutefois, l'effet de la surexpression d'une protéine exogène (GUS) reste à définir.

Plusieurs mécanismes peuvent rendre compte d'un effet négatif dominant des protéines Cl mutées. Il est possible que la protéine Cl soit multimèrique et que les sous-unités mutées s'associent à leur homologue sauvage, rendant non fonctionnels des multimères hétérologues. Une autre possibilité est que les protéines Cl mutées entrent en compétition avec les protéines sauvages pour un substrat limitant. Ce substat pourrait être une protéine cellulaire, ou l'ADN viral lui-même. Le complexe hypothétique ainsi formé serait transitoire et productif quand il contient la protéine Cl sauvage, mais incapable d'évoluer plus loin s'il n'y a pas liaison aux NTP ou hydrolyse de ceux-ci.

L'obtention de phénotypes négatifs dominants dans le cas de la cotransfection de génomes viraux est un fait surprenant. En effet, il est difficile de concevoir un effet d'inhibition si radical avec des protéines Cl non mutées et mutées exprimées à un même niveau. Il pourrait y avoir surexpression spontanée des protéines Cl mutées, ce qui peut avoir lieu si la protéine Cl régule sa propre expression. En effet, il est concevable que la protéine Cl interagisse normalement avec un cofacteur cellullaire pour réaliser un rétro-contrôle négatif sur sa production; on a d'ailleurs pu voir que les transcrits de Cl sont présents en faible quantité par rapport aux transcrits codés par le brin viral. Les protéines

Cl mutées ont peut-être perdu cette capacité d' interagir avec un cofacteur pour former un complexe de régulation négative. Il en résulterait alors une surexpression des protéines mutées, qui s'amplifient peu à peu et acquièrent alors la capacité d'inhiber les protéines sauvages, comme c'est le cas pour les protéines Rep de l'Adeno Associated Virus (AAV) (Chejanovsky et Carter,

1990).

H) MISE EN EVIDENCE D'UNE ACTIVITE ATPase IN VITRO CHEZ LA PROTEINE Cl D'UN GEMINIVIRUS, LE STYLCV. ETUDE DE MUTATIONS DANS SON SITE DE LIAISON AUX NTP

A) MATERIELS ET METHODES

Plusieurs méthodes classiques de biologie moléculaire ont été employées suivant les protocoles indiqués par Sambrook et al.(1989), Ausubel et al.(1989), ou par les fournisseurs; elles ne seront pas détaillées ici.

1. Etude biochimique de l'activité ATPase in vitro de la protéine Cl sauvage ou mutée

1.1 Obtention de la protéine Cl sauvage ou mutée

Une protéine de fusion GST-C1 "sauvage" a été obtenue. La construction exprimée dans E.coli est placée dans le plasmide pGEX3(Amrad), sous le contrôle d'un promoteur lac inductible par l'IPTG (voir figure 8).

Pour obtenir la même construction avec les différentes mutations étudiées, le fragment de 500 pb SalI-SstI du plasmide pGEX-Cl est remplacé par le fragment correspondant des plasmides pTY-Ala, Arg, His et Pml (figure 8). L'obtention de ces plasmides est décrite dans le paragraphe 2 ci-après.

Le vecteur pGEX-Cl, ainsi que les différents inserts, sont purifiés après digestion par les enzymes Sali et SstI sur gel d'agarose 1% à bas point de fusion. La ligation s'effectue grâce à ligase T4 (Ligase: 400 unités; vecteur: 50ng; insert: 150ng) pendant la nuit à 16°C. La souche d' E.coli DH5α est transformée avec les constructions obtenues, puis l'ADN bactérien est extrait par lyse alcaline. Les constructions sont digérées par l'enzyme Pmll, afin de mettre en évidence l'existence du site correspondant chez les mutants.

Après culture des bactéries en présence de l'inducteur (IPTG 0,2mM), les protéines sont extraites par traitement aux ultrasons ("sonication") (VibraCell 3x30", réglage 4,5). Les protéines contenant une partie GST fonctionnelle sont retenues sur des billes d'agarose-glutathion, lavées avec du tampon MTPBS^ (#: voir annexe) pour éliminer les protéines bactériennes contaminantes, puis éluées dans une solution de glutathion 5mM, Tris pH8 15mM.

La présence de la protéine GST-C1 sauvage ou mutée est contrôlée avant et après purification par dépôt d'un aliquot sur gel dénaturant Laemmli 10%^ et coloration au bleu de Coomassie^.

1.2 Etude de l'activité ATPase in vitro de la protéine Cl sauvage ou mutée (d'après Traut, 1990)

Vingt ml de tampon ATPase(x2) (composition: voir ci-après) sont mélangés à 20 ml de fraction protéique purifiée (environ 50ng). Le mélange est mis à incuber à 25 °C. La réaction est arrêtée après le temps voulu par ajout de

200ml de charbon actif (7,5% de charbon actif dans HC1 50mM, H3PO4

5 mM).

Le charbon actif lie l'ATP, mais non le phosphate inorganique libéré par une éventuelle activité ATPase. Le charbon est ensuite éliminé par centrifugation (5' à 13000 rpm en tube

Eppendorf). La radioactivité du surnageant est mesurée au compteur à scintillation (Beckman LS 7500) après ajout de 4 ml de liquide de scintillation. Tampon ATPase x2: Pipes/NaOH pH 7,0 50 mMjNaCl 200 mM;

MgCl2lO mM; NP40 0,02%; ATP 10 mM. A 400μl de cette solution sont ajoutés avant l'emploi 0,37 MBq (lOmCi) de γ- ³² P-ATP

2 Mutagénèse dirigée

2.1 Choix des mutants

L'obtention des plasmides pTYAla, pTYHis et pTYArg, est décrite dans le paragraphe I)A)a) ci-dessus. Deux autres mutants ont été obtenus:

- un mutant "non-sens" dans lequel un codon Ochre (TAA) est introduit 30 nucléotides en aval du codon d'initiation de l'ORF Cl. Ce mutant permet d'étudier l'effet de l'ARN de Cl seul, sans production de la protéine correspondante. Il est appelé mutant Stop.

- un mutant Pml, dans lequel seul le site Pmll, créé dans les mutants Ala, Arg et His pour faciliter leur sélection, est introduit. Cette construction permet de confirmer l'absence d'effet de cette mutation silencieuse pour la protéine Cl.

2.2 Obtention des mutants Pml et Stop

Le principe de la méthode employée est décrite par Kunkel en 1985: la mutation recherchée est obtenue par hybridation d'un oligonucléotide mutagène avec l'ADN viral simple-brin puis synthèse in vitro du brin complémentaire.

L'ADN non muté est ensuite contre-sélectionné (comme décrit ci-dessus).

Deux oligonucléotides mutagènes ont été utilisés: Oligonucléotide "Stop":

5' GTATCAAGGCT(AGATCT)IΔΔTTCCTTACATATCCC 3' Oligonucléotide "Pml": 5' CCGGACAGGAAAGAC(CACGTG)GGCC 3'

Le nouveau site de restriction créé lors de la mutagénèse (BglII pour le mutant "Stop", Pmll pour le mutant "Pml"), est indiqué entre parenthèses. Le codon non-sens Ochre (TAA) introduit est souligné.

2.3 Séquençage des mutants obtenus

Le séquençage des mutants a été effectué au moyen du kit Pharmacia (Sequenase), qui utilise la méthode de terminaison de chaîne de Sanger et al (1977).

Les réactions obtenues sont déposées sur un gel d' acrylamide 6% dénaturant d'épaisseur constante 0,4mm. La migration s'effectue en tampon

TBE (Sambrook et al., 1989) à 60W. L'ADN marqué par de l'α3 ³ P-dCTP ou o.35s-dCTP est révélé par autoradiographie.

3. Etude de la replication de l'ADN viral dans des protoplastes de tabac

(Comme décrit ci-dessus)

3.1 Obtention des protoplastes

(Comme décrit ci-dessus)

3.2 Transfection des protoplastes et Southern blot

(Comme décrit ci-dessus)

4 Obtention de plantes transgéniques possédant un gène qui code pour la protéine Cl sauvage ou mutée

4.1 Constructions introduites

L'ORF Cl entier, sauvage ou muté, est clone dans le vecteur binaire pGA492 (An et al., 1987), en aval du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur, ce qui permet une expression constitutive de l'ORF Cl dans les plantes transformées. La construction employée est détaillée sur la figure 9.

La construction 35s-Cl ainsi que le gène NPTII conférant la résistance à la kanamycine, situés entre les bordures du T-DNA d'Agrobacterium

tumefaciens, sont transférés dans le génome des cellules végétales où ils s'intègrent de manière non contrôlée (place et nombre de copies).

4.2 Transformation de disques foliaires de Nicotiana benthamiana et obtention de plantes transgéniques

La figure 10 indique le protocole suivi pour la transformation de N. benthamiana par A. tumefaciens et la régénération de plantes transgéniques. Des plantules peuvent être acclimatées en serre environ deux mois après la transformation des disques foliaires.

4.3 Contrôle de l'expression de l'ORF Cl dans les plantes obtenues

Les plantes obtenues ont été maintenues, pendant toute leur période de culture in vitro, sur un milieu sélectif (Kanamycine 70mg/l), ce qui permet en principe de conserver uniquement celles qui ont intégré la construction recherchée.

Toutefois certains contrôles sont à effectuer pour s'en assurer.

Un "test NPTII" comme décrit ci-dessus a été effectué à partir d'extrait des plantes régénérées acclimatées en serre.

B) RESULTATS

1. Activité ATPase in vitro de la protéine Cl sauvage ou mutée.

1.1 Activité ATPase de la protéine Cl sauvage La protéine Cl utilisée est une protéine de fusion GST-C1.

La méthode utilisée pour mesurer l'activité ATPase de la protéine Cl permet de mettre en évidence la libération de phosphate inorganique à partir d'ATP. Daas le cas de la protéine GST-C1 sauvage, plusieurs expériences ont montré l'existence d'une telle activité: de 20 à 40% de la radioactivité totale introduite se trouvent libérés dans le surnageant à la fin de la réaction décrite précédemment, ce qui indique l'hydrolyse d'un pourcentage avoisinant de l'ATP introduit. Lors d'expériences-témoin avec la GST seule, ou avec le tampon de l'enzyme, 2 à 4% seulement de la radioactivité introduite se retrouvent dans le surnageant lors d'expériences menées en parallèle, dans les mêmes conditions. Ces résultats semblent indiquer une activité ATPase de la protéine Cl elle- même. La technique employée ne permet pas de déterminer si l'activité de la protéine Cl conduit à l'obtention d'ADP ou d'AMP. Le pourcentage limite d'ATP hydrolyse peut être lié soit à une concentration de produit libéré inhibant

le fonctionnement de l'enzyme, soit à la dégradation de celle-ci après 15 à 30 mn de réaction. Pour déterminer la cause de cette limite, des expériences de variation de concentration de l'enzyme ou de l'ATP sont à effectuer. Il reste aussi à déterminer si la protéine Cl est capable d'hydrolyser d'autres nucléotides, en particulier le GTP.

Si l'activité ATPase détectée est effectivement celle de Cl, et non d'un contaminant d'origine bactérienne, la protéine Cl doit lier l'ATP. Le site de liaison aux NTP semble donc fonctionnel, ce qui permet de supposer que des mutations dans ce site peuvent être la cause de phénotypes négatifs dominants, comme c'est le cas dans d'autres modèles (Chejanovsky et Carter, 1990; Han et

Sternberg 1991).

Les protéines mutées Ala, Arg, His et Pml ont donc été construites, exprimées dans E.coli et purifiées.

1.2 Obtention et activité ATPase des protéines Cl mutées

* Obtention des protéines Cl portant les mutations Ala, Arg, His et Pml

Les protéines portant les mutations Ala, Arg, His et Pml ont été obtenues en utilisant le protocole décrit précédemment. Les protéines GST ou GST-C1 obtenues sont extraites des bactéries et purifiées sur billes d'agarose-glutathion. Contrairement au cas de la GST seule, la quantité des protéines GST-C1 obtenue après purification est faible, et les contaminants encore nombreux. Toutefois, le degré de pureté et la concentration protéioue semblent comparables pour les protéines Cl sauvage et mutée Les protéines mutées ne semblent pas affectées dans leur stabilité par rapport à la protéine Cl sauvage.

* Activité ATPase des protéines Cl mutées seules

L'activité ATPase des protéines mutées est mesurée selon le protocole utilisé pour la protéine Cl sauvage. L'activité ATPase des mutants Ala et His est comparable à celle de la GST seule, donc assimilable à un "bruit de fond". Le mutant Arg possède une activité qui atteint presque la moitié de celle de la protéine Cl sauvage. Le mutant Pml, qui est assimilable à la protéine sauvage puisque la mutation introduite est silencieuse, possède effectivement une activité ATPase comparable à celle de la protéine sauvage.

La réduction de l'activité ATPase chez le mutant Arg et sa perte totale chez les mutants Ala et His montrent l'importance d'une mutation ponctuelle dans le site supposé de liaison aux NTP de la protéine Cl du TYLCV. Ce site

semble donc fonctionnel chez la protéine Cl, et la lysine joue un rôle clé dans son fonctionnement.

La purification limitée de la protéine Cl laisse envisager la possibilité d'une activité ATPase liée à la présence de contaminants bactériens. Néanmoins, il semble peu probable que ces contaminants éventuels se trouvent éliminés de façon spécifique chez les protéines mutées.

Pour éliminer totalement l'hypothèse d'une activité liée à des contaminants bactériens, la méthode envisagée est le marquage de l'ATPase avec du γ35s- ATP, capable de se lier aux enzymes mais non d'être hydrolyse. Après migration sur gel et autoradiographie, un marquage devrait apparaître pour une protéine de la taille de la fusion GST-Cl (65 kDa), puis après clivage de la protéine de fusion par une entérokinase, pour une protéine ayant le poids moléculaire apparent de la protéine Cl (42 kDa).

Cette méthode devrait aussi permettre de déterminer si les mutants ayant perdu leur activité ATPase sont toujours capables de lier l'ATP, comme c'est le cas pour la protéine RAD3 de levure (Sung et al., 1988).

* Activité ATPase des protéines Cl sauvage et mutées

L'activité ATPase d'un mélange de protéines Cl sauvage et mutées a été étudiée. Le mélange Cl sauvage et GST est considéré comme un témoin, aucun effet négatif dominant de la GST n'étant attendu.

Les protéines mutées semblent n'avoir aucun effet sur le fonctionnement de la protéine sauvage, l'activité totale obtenue étant à peu près égale à la somme des activités de chacun des composants du mélange. Les résultats obtenus avec les protéines Cl sauvage et mutées semblent indiquer une activité ATPase de la protéine Cl sauvage, en rapport avec la liaison de l'ATP au site défini par Walker (1982).

L'hydrolyse de l'ATP fournit probablement l'énergie nécessaire à une autre activité de Cl, celle-ci restant à déterminer. L'activité ATPase ne semble pas liée au clivage de l'ADN simple-brin, car celui-ci ne nécessite pas l'apport d'ATP. De plus, des protéines ayant perdu leur capacité de clivage en raison d'une mutation située dans un domaine supposé indépendant du site de liaison aux NTP ont conservé leur activité ATPase.

ni) RESISTANCE DERIVEE DU PATHOGENE: UNE PROTEINE NEGATIVE DOMINANTE PROTEGE DES PLANTES DE NICOTIANA BENTHAMIANA CONTRE LE VIRUS STYLC

A) MATERIELS ET METHODES

1. ETUDE DE LA REPLICATION DE L'ADN VIRAL DANS DES PROTOPLASTES

la. Transfection de protoplastes de tomate

Une suspension cellulaire de l'hybride interspécifique Lycopersicon esculentum x L. pennellii, est cultivée pendant quatre jours dans du milieu MSI* (*: voir annexe ci-après) à 25 °C et avec agitation à 100 RPM. Les cellules sont récoltées par centrifugation (200 g, 5 min.) et lavées deux fois avec du milieu CPW*. Les parois cellulaires sont ensuite digérées avec trois volumes de solution enzymatique* pendant 3 heures avec agitation, à 25 °C et à l'obscurité.

Les protoplastes ainsi obtenus sont ensuite filtrés deux fois sur tamis de 300 μm puis 140 μm, récoltés par centrifugation (90 g, 5 min.) et lavés deux fois avec du milieu TM2*. Les protoplastes sont comptés en cellule de Fuchs- Rosenthal et repris à une concentration de 106 protoplastes/ml.

A 5x105 protoplastes, sont ajoutés 50 μg d'ADN de thymus de veau, 10 μg d'ADN viral double brin linéarisé par SstI et 0.5 ml de solution PEG 1500 (40% dans du milieu F*). La suspension de protoplastes est ensuite diluée à des intervalles de 10 min. avec le milieu F* (volume final 10 ml). Les protoplastes sont récoltés (90 g, 5 min.) et cultivés à une concentration de 105 /ml dans du milieu TM2* à lumière diffuse et à 25 °C. Les cellules sont récoltées sept jours plus tard pour l'extraction de l'ADN total.

lb. Extraction de l'ADN total de protoplastes transfectés (Comme décrit ci-dessus)

le. Analyse de l'ADN par Southern Mot

(Comme décrit ci-dessus)

2. RECHERCHE DE PLANTES TRANSGENIQUES RESISTANTES

AU STYLCV

2a. Agroinoculation de plantes transgéniques (régénérants primaires)

Les plantes transgéniques de N. benthamiana (Ala, His, Arg et Stop) ont été obtenues par transformation avec les différents gènes Cl mutés (Ala, His, Arg et Stop) (Desbiez, DEA 1993). La descendance obtenue après autofécondation (FI) des premiers régénérants (R) a été semée sans sélection et les plantes obtenues (FI), sont testées pour leur sensibilité ou résistance vis à vis du STYLCV sauvage; voir Fig.ll.

Comme le STYLCV ne peut pas être transmis mécaniquement, la technique d' agroinoculation ou agroinfection (Grimsley et al, 1986) a été utilisée pour infecter les plantes FI transgéniques de N. benthamiana. Cette technique permet d'introduire le génome viral dans les plantes grâce au T-DNA d'Agrobacterium tumefaciens.

Le STYLCV sauvage a été clone sous forme de 1.8 mer dans le vecteur binaire pBini9, devenant ainsi le plasmide pBIN19/TYLCV-S 1.8 mer (Kheyr- Pour et al , 1991). Les bactéries transformées ont été sélectionnées sur milieu

YEB* solide additionné de kanamycine (100 μg/ml), de rifampicine (150 μg/ml) et de néomycine (20 μg/ml). Les A. tumefaciens LBA4404/pBinl9/TYLCV-S 1.8 mer ont été cultivés dans 20 ml de YEB* liquide (additionné d'antibiotiques comme indiqué ci-dessus), à 28°C avec agitation (200 RPM) et à l'obscurité. Après 48h d'incubation, les bactéries ont été lavées 2 fois à l'eau stérile puis remises en suspension dans 10 ml d'eau stérile.

Pour l' agroinoculation, des plantes âgées d'environ trois à quatre semaines sont utilisées. La suspension d'A. tumefaciens LBA4404/pBinl9/TYLCV-S 1.8 mer est injectée à l'aide d'une seringue de 1ml au niveau des pétioles de trois feuilles jeunes. Les plantes sont placées dans des enceintes à 24°C, 16h de photopériode et 70% d'hygrométrie (avec une désinfection des eaux de drainage, pour éviter la contamination de l'environnement).

Pour chaque expérience 25 plantes sont agroinoculées. Deux plantes transgéniques et 2 plantes de N. benthamiana normales sont inoculées avec de l'eau stérile (contrôle négatif)- De plus deux plantes de N. benthamiana normales sont inoculées dans les mêmes conditions avec la souche d'A. tumefaciens décrite ci-dessus (contrôle positif)- Les plantes sont suivies régulièrement pour observer l'apparition de symptômes. Un mois après l' agroinoculation, les premiers symptômes caractéristiques (enroulement et jaunissement des feuilles) apparaissent sur les plantes témoins non transgéniques.

2b. Détection des différentes formes d'ADN viral

La présence d'ADN viral simple brin dans les plantes agroinoculées est détectée par la méthode du "squash foliaire" (Navot et al, 1989): une feuille jeune est écrasée sur une membrane de nylon, et l'ADN en est fixé aux UV. Sans dénaturation préalable, la membrane est hybridée avec une sonde correspondant à l'ADN total STYLCV marqué au [α-32p] dCTP.

Pour confirmer la présence des autres formes d'ADN viral, un Southern blot est réalisé. L'ADN total est extrait selon la méthode de Matzeit et al

(1991), suivie d'une série d'extractions phenoliques, et enfin l'ADN est précipité à l'éthanol. Cinq μg d'ADN sont déposés dans un gel d'agarose à 1 %

(TAExl*) à 2V/cm et analysés par Southern Blot (voir ci-dessus § l.c).

2c. Agroinoculation de disques foliaires

Une culture d'A. tumefaciens LBA4404/pBinl9/TYLCV-S 1.8 mer est maintenue pendant 48h (voir ci-dessus agroinoculation de plantes transgéniques). Les agrobactéries sont lavées et remises en suspension dans du milieu MS 30*. Pour chaque plante, deux jeunes feuilles sont décontaminées au Dichloroisocyanuranate de sodium (Bayrochlor, 1 comprimé par litre) pendant 15 min. Des disques foliaires sont découpés et immergés pendant 1 min. dans la suspension d' agrobactéries. Les disques sont alors séchés sur papier stérile, puis déposés sur le milieu A*. Après 48h, les disques sont transférés sur le milieu B*. L'ADN total est extrait sept jours après l 'agroinoculation (voir ci-dessous).

2d. Extraction de l'ADN total de plantes transgéniques ou de disques foliaires agroinoculés avec le STYLCV

Un gramme de feuilles jeunes (ou de disques foliaires) est broyé dans l'azote liquide et remis en suspension dans 5 ml de solution TNES*. Deux extractions phenoliques sont effectuées pour éliminer les débris cellulaires et les protéines. Les acides nucléiques (ADN et ARN) sont précipités en présence d'acétate de sodium 0.3M (pH 5.2) et d'éthanol 70% (% final), séchés et repris dans 200 μl de TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM) stérile. Les ARNS sont éliminés par un traitement à la RNase A (concentration finale 200 μg/ml) pendant lh à 37°C. La densité optique à 260 nm est mesurée. Cinq μg d'ADN sont déposés dans un gel d'agarose à 1% dans du TAExl (migration 2V/cm, 15h) et analysés par Southern Blot.

3. DETERMINATION DU NOMBRE D'INSERTS DANS LES PLANTES FI ALA1

3a. Ségrégation in vitro sur kanamycine

Pour déterminer la concentration en kanamycine nécessaire pour arrêter la croissance des plantes, une gamme de concentration est réalisée pour N. benthamiana non tranformé (70, 100, 150, 200 et 300 μg/ml). Les graines FI sont semées sur le milieu MS30* contenant de la kanamycine à 150 μg/ml et régulièrement observées pour la décoloration des feuilles.

3b. Southern blot

Cinq μg d'ADN génomique extraits de feuilles de plantes transgéniques FI Alal avant agroinoculation sont digérés par HindSI (le choix de cette enzyme repose sur le fait qu'elle coupe une seule fois au niveau de l'insert 35S-C1). Les fragments d'ADN digérés sont séparés en gel d'agarose à 1% dans du TAExl*

(5 V/cm pendant 5h), puis transférés sur membrane de nylon Hybond-N (Amersham) pendant 6h par capillarité avec du SSCx20*. La membrane est ensuite hybridée avec une sonde ADN Cl PflMl-BgHÏ (obtenue par coupure avec PfiMl et Bglϋ. de l'ADN viral clone dans pUC118 au niveau du site SstI et séparation en gel d'agarose à bas point de fusion) marquée par amorçage aléatoire au [α-32p] dCTP et traitée de la même manière que ci-dessus (voir analyse de l'ADN par Southern § l.c).

4. ANALYSE DES PROTEINES PAR WESTERN BLOT

4a. Extraction des protéines totales de plantes

Cinq cent mg de feuilles jeunes sont broyés dans l'azote liquide, et les protéines totales sont précipitées à l'acide trichloroacétique 10% (4 ml/g). Le culot est lavé une fois à l'acétone 100% puis trois fois à l'acétone 90%, avant d'être séché toute la nuit au Speed-Vac (Savant). Le culot est repris dans 400 μl de tampon Tris-Glycine (25mM Tris, 250mM Glycine). La concentration en protéines totales est déterminée à 280 nm. A 20 μl du surnageant (contenant 50 μg de protéines totales) sont ajoutés 4 μl de tampon 6xSDS* et le tout est porté à 100°C pendant 4 min. et immédiatement chargé sur un gel de poly acrylamide (12.5%) en présence de SDS 0.1 %. La migration se poursuit pendant lh à 20

V/cm. Le gel est ensuite transféré sur membrane de nylon Hybond-C extra (Amersham), en présence de tampon Tris-Glycine, pendant 16h à 2 V/cm.

4b. Préadsorption de l'anticorps anti-Cl avec l'extrait protéique de N. benthamiana non transgénique

L'anticorps polyclonal anti-Cl a été préparé au laboratoire par purification sur gel de polyacrylamide de la bande correspondant à la protéine de fusion GST-Cl (produite chez E. coli) et inoculation à un lapin. Dix μl d'anticorps polyclonaux anti-Cl sont incubés avec 50 μl d'extrait protéique total de N. benthamiana non transgénique toute la nuit à température ambiante. La solution est ensuite centrifugée à 17000 g pendant 5 min., à température ambiante et le surnageant récupéré.

4c. Incubation de la membrane avec l'anticorps anti-Cl préadsorbé

La membrane est incubée pendant une heure avec une solution de PBS*, Tween20 0.1%, Lait écrémé Gloria 5% (pour saturer les sites de fixation non spécifiques de la membrane à l'anticorps). Les anticorps anti-Cl préalablement préadsorbés sont ajoutés à la membrane pendant 2h à température ambiante

(dilution l/10000).Puis trois lavages dans du PBS, Tween20 0.1 % sont effectués. La membrane est alors incubée dans du sérum de chèvre anti-IgG- lapin conjugué à la phosphatase alcaline (Sigma) (dilution 1/9500) pendant 2h à température ambiante. La membrane est ensuite lavée dans du PBS, Tween20 0.1%. La révélation du complexe antigène-anticorps se fait dans 15 ml de tampon substrat* en présence de 100 μl de Nitro Blue Tetrazolium (NBT: solution mère à 50 mg/ml, Sigma) et de 50 μl de 5-Bromo-4-Chloro-3-Indoyl Phosphate (BCIP: solution mère à 50 mg/ml, Sigma). Un précipité de couleur brune apparaît et la réaction est arrêtée dans l'eau bidistillée, le tout à température ambiante et à la lumière.

B) RESULTATS

a) REPLICATION DES GENOMES VIRAUX SAUVAGE ET MUTES DANS DES PROTOPLASTES DE TOMATE

Pour examiner un éventuel effet négatif dominant in vivo de la protéine Cl mutée au niveau de la P-loop sur la replication de l'ADN viral sauvage, les génomes viraux (sauvage et muté) sont cotransfectes dans des protoplastes de tomate. L'intérêt d'un tel système est qu'il permet d'étudier la replication de l'ADN viral indépendamment des phénomènes de mouvement systémique du virus.

Le plasmide pTY renferme le génome, double brin viral sauvage entier du STYLCV clone dans le site SstI du vecteur pUC118. Les plasmides pTYAla,

pTYHis et pTYArg sont identiques à pTY, sauf qu'ils portent respectivement une mutation ponctuelle remplaçant la Lys227 en alanine, histidine et arginine. Le plasmide pTYStop contient une mutation "non sens" 30 nt en aval du codon d'initiation de la traduction de l'ORF Cl. Grâce aux ligases cellulaires, les monomères de génomes viraux introduits linéarisés par 55/1 sont recircularisés et servent ainsi de formes réplicatives intermédiaires dans le cycle viral.

Quand les protoplastes de tomate sont transfectés avec de l'ADN viral sauvage seul, les différentes formes de l'ADN viral simple brin (ss) et double brin superenroulé (ds), s'accumulent et sont détectées. Ceci témoigne d'une replication de novo du génome viral sauvage dans les protoplastes (voir

Fig. 12). Le mutant pTYStop, comme attendu ne se réplique pas (car il n'y a pas traduction de TARN). Le mutant pTYArg se réplique mais moins bien que le sauvage. En revanche, les mutants pTYAla et pTYHis (qui sont déficients pour leur activité ATPase in vitro) ne se répliquent pas (ou se répliquent à un niveau non détectable) (Fig.11). Ces résultats suggèrent que la P-loop (et probablement l'activité ATPase) est nécessaire à la replication de l'ADN viral et confirment les résultats présentés sur la figure 4 susmentionnée.

Quand l'ADN viral sauvage est cotransfecté avec les ADNs viraux mutés des résultats intéressants sont obtenus. En présence de pTYArg ou pTYHis, la replication de l'ADN viral sauvage n'est apparemment pas altérée (présence des formes ss et ds). En revanche, pTYAla affecte considérablement la replication de l'ADN viral sauvage puisque la forme ss est absente (ou non détectable) et la forme ds est présente en quantité plus faible (Fig.12); Cette forme ds est probablement générée par la circularisation de l'ADN- viral linéaire introduit grâce aux ligases cellulaires. Ces résultats montrent clairement un effet négatif dominant du génome viral muté pTYAla sur la replication de l'ADN viral sauvage, ce qui confirme les résultats présentés sur la figure 6 susmentionnée.

b) AGROINOCULATION DE PLANTES FI PAR LE STYLCV SAUVAGE

Afin de voir si les plantes transformées par les différents gènes Cl mutés sont résistantes au STYLCV sauvage, des expériences d' agroinoculation sont réalisées (Grimsley et al, 1986). Des plantes de N. benthamiana ont été transformées par les différents gènes Cl mutés (Cl-Ala, Cl-His, Cl-Arg et Cl- Stop) placés sous le contrôle du promoteur 35S du Cauliflower Mosaic Virus

(CaMV). Les régénérants correspondants ont été respectivement obtenus (Ala, His, Arg et Stop) (Desbiez, DEA 1993). La première descendance FI de ces plantes obtenue par autofécondation est semée et les plantes âgées d'environ un

mois sont agroinculées avec le STYLCV. A la suite de l' agroinoculation, des monomères de virus sont libérés du 1.8-mer probablement par recombinaison homologue. Les monomères viraux libérés se répliquent et infectent la plante de manière systémique. Trois à quatre semaines après l 'agroinoculation, les premiers symptômes (enroulement des feuilles) apparaissent. La présence de l'ADN viral ss est détectée par la technique du squash foliaire (Navot et al, 1989), et confirmée par analyse de l'ADN total de ces plantes par Southern blot. Les N. benthamiana non transgéniques (témoin positif) sont malades et présentent en squash foliaire un fort signal d'hybridation avec une sonde ADN total de STYLCV. Toutes les plantes Argl, His21 et Stop6 sont malades et présentent toutes un fort signal d'hybridation avec la même sonde. Par contre, parmi 14 plantes Alal agroinoculées dans les mêmes conditions, sept ne présentent ni symptômes ni hybridation avec la sonde. L'analyse de l'ADN total par Southern blot montre pour ces plantes une absence totale des différentes formes de l'ADN viral, alors que les plantes sensibles présentent bien les différentes formes de l'ADN viral (ss, ds et forme circulaire relâchée (oc)).

Pour confirmer ces résultats, des disques foliaires de plantes potentiellement résistantes sont agroinoculées avec le STYLCV. Sept jours après l' agroinoculation, les différentes formes de l'ADN viral (ss et ds) sont détectées dans les disques foliaires de N. benthamiana non transgénique. Ceci témoigne d'une bonne infectivité du clone utilisé pour inoculer les disques foliaires. Trois plantes montrent une replication très réduite par à rapport au témoin positif: ce sont des plantes résistantes (absence de symptômes, mais replication résiduelle de l'ADN viral). Deux plantes ne présentent aucune forme d'ADN viral: ce sont des plantes totalement résistantes. Curieusement deux plantes présentent les différentes formes de l'ADN viral, alors qu'aucun signal n'était visible ni en squash ni en Southern blot. Ceci pourrait s'expliquer par la "pression en inoculum" utilisée dans les expériences d' agroinoculation de disques foliaires. Cette "pression en inoculum" est plus élevée par rapport à celle utilisée dans l' agroinoculation de plantes entières, et donc conduirait à une modification du rapport protéines Cl mutée: sauvage en faveur de la protéine sauvage, et par conséquent à la replication de l'ADN viral. D'un autre côté, ce comportement (ambigu) pourrait correspondre à une inhibition du mouvement (à longue distance?) du virus in planta, puisque l' agroinoculation de disques foliaires permet de s'affranchir des phénomènes de mouvement à longue distance.

Par ailleurs, trois autres descendances FI de plantes Ala issues de régénérants indépendants (Alal 4, Ala30 et Ala44) sont disponibles. L' agroinoculation de 35 plantes FI Ala30 avec le STYLCV a révélé l'existence

de 29 plantes potentiellement résistantes. Ce résultat conforte celui obtenu avec la descendance FI de Alal.

c) CARACTERISATION MOLECULAIRE DES PLANTES ALA1 RESISTANTES AU TYLCV

La présence et le nombre de copies du gène Cl-Ala présentes dans le génome des plantes Alal est déterminée par deux approches complémentaires. La première, génétique, repose sur l'étude de la ségrégation du phénotype résistance à la kanamycine (kanR). Ce phénotype est conféré par le gène néomycine phosphotransférase (NPTII du transposon Tn5) introduit avec le gène

Cl muté pour faciliter la sélection des transformants. La deuxième, moléculaire, consiste à digérer l'ADN génomique et à effectuer un Southern.

L'expression du gène Cl-Ala est analysée au niveau protéique par Western blot.

1. Détermination du nombre de copies du gène Cl-Ala

* approche génétique Une gamme de concentration en kanamycine est réalisée pour N. bentfiamiana afin de déterminer la concentration nécessaire pour arrêter la croissance des plantes (décoloration des feuilles). Les résultats ont montré que pour obtenir des effets visibles, il fallait utiliser une concentration en kanamycine supérieure à 100 mg/1. Une concentration de 150 mg/l est donc utilisée.

Une ségrégation de type 3 kanR:l kanS correspondrait théoriquement à l'insertion d'une copie unique de T-DNA dans le génome de plante, alors qu'une ségrégation de type 15 kanR:l kanS correspondrait à l'insertion de deux copies de T-DNA. Parmi 89 plantes Alal semées, 7 sont kanS et 82 sont kanR. Le test χ2 montre que ces valeurs sont en accord avec une ségrégation de type 15:1 (χ2 =0.45 et a < 0.001, donc l'écart est non significatif et il y a moins d'une chance sur mille pour que notre hypothèse ne soit pas valable). Ces résultats suggèrent que le régénérant primaire Alal renfermait au moins deux copies de T-DNA dont les gènes NPTII sont exprimés.

Cette méthode est néanmoins criticable pour deux raisons:

- Le phénotype kanR est conféré par le gène NPTII, or il se pourrait qu'un remaniement ou une perte de ce gène se soit produit: on aurait alors un

phénotype kanS bien que le gène Cl soit présent. La situation inverse pourrait également se produire, avec perte du gène Cl et présence du gène NPTII (kanR).

- Si la plante renferme plus de deux copies du gène Cl, les résultats de la ségrégation deviennent difficiles à interpréter. Il faut soit augmenter la taille de l'échantillonnage, soit étudier la ségrégation kanR/kanS de la descendance F2.

* approche moléculaire Afin de déterminer le nombre exact de copies du gène Cl-Ala présentes dans les plantes transformées Alal, l'ADN de ces plantes est digéré par HwdlII. Comme cette enzyme ne coupe qu'une fois au niveau du gène Cl, le nombre de bandes qui sera révélé correspond au nombre d'inserts Cl-Ala. La taille minimale attendue est de 1530 pb. Pour avoir une digestion enzymatique complète, l'enzyme utilisée est largement en excès (10 fois celle recommandée par le fournisseur) et le temps de digestion est de cinq heures au lieu d'une heure. La digestion est ensuite vérifiée sur gel.

Trois bandes sont révélées: 1600 pb, 1800 pb et 2200 pb. Ces résultats montrent que les plantes analysées sont bien transgéniques, puisqu'elles renferment une ou deux copies du gène Cl-Ala. Ils suggèrent aussi que le régénérant primaire (Alal) renfermait au moins trois copies du gène Cl.

2. Détection de la protéine Cl-Ala dans les plantes transgéniques

La protéine Cl-Ala dans les plantes transgéniQ'jeε Alal est analysée par Western blot. Une expérience préliminaire a révélé de nombreuses bandes non spécifiques même dans un extrait protéique de N. benthamiana non transgénique. Par conséquent, une étape de préadsorption de l'anticorps anti-Cl avec un extrait protéique total de N. benthamiana non transgénique est réalisée avant incubation de l'anticorps anti-Cl avec la membrane. Cette étape est rendue nécessaire pour épuiser la solution d'anticorps anti-Cl en anticorps qui reconnaissent de manière aspécifique les antigènes de N. benthamiana.

L'anticorps dirigé contre la protéine Cl reconnaît une bande d'environ 40 kDa, taille attendue pour cette protéine. Cette bande est présente chez les plantes transgéniques Alal, D, S, U, et V, mais est absente chez N. benthamiana non transgénique et chez la plante Alal B sensible au STYLCV.

Rappelons que la plante Alal serait "résistante" d'après le squash mais "sensible" d'après les résultats d' agroinoculation de disques foliaires. Ce comportement "ambigu" pourrait correspondre à la production de cette bande de

40 kDa.

Ces résultats démontrent que la protéine Cl-Ala est exprimée dans les plantes transgéniques Alal. Us montrent une corrélation entre l'expression de la protéine mutée Cl-Ala et la résistance au STYLCV.

Conclusion

a) La P-loop de la protéine Cl est essentielle à la replication

Les protoplastes offrent un moyen puissant et rapide pour l'étude de la replication de l'ADN viral, indépendamment des processus de mouvement systémique du virus. A la suite de transfection de protoplastes par le génome viral sauvage, les différentes formes de l'ADN viral simple brin (ss) et double brin superenroulé (ds) s'accumulent et sont détectées. La forme ds correspond à une synthèse de novo, plutôt qu'à une ligation de l'ADN viral linéaire introduit. Ceci a été montré pour le WDV (Matzeit et al, 1991). Les auteurs ont utilisé une enzyme de restriction (Dpnl) qui reconnaît et coupe seulement la séquence GAmTC dont l'adénine est méthylée en position N6. L'ADN viral amplifié chez E. coli est digéré par Dpnl, alors que la forme ds de cellules de blé transfectées est résistante à la digestion. Ceci montre que la forme ds est néosynthétisée dans les cellules transfectées. Toutefois, une déméthylation de l'ADN introduit dans les cellules transfectées n'est pas à exclure. L'utilisation de plasmide contenant un dimère en tandem (au lieu d'un ADN linéarisé) aboutit à la formation des mêmes formes (ss et ds) qui correspondent donc à une synthèse de novo.

Une activité ATPase in vitro a été mise en évidence chez la protéine Cl du STYLCV sauvage (Desbiez, DEA 1993). Cette activité est absente chez les protéines mutées Cl-Ala et Cl -His, et réduite chez la protéine mutée Cl-Arg. Ici, nous montrons une nette corrélation entre l'activité ATPase et la replication de ces mutants dans les protoplastes de tomate. En effet, les deux mutants pTYAla et pTYHis ne se répliquent pas dans les protoplastes de tomate transfectés. Ces résultats montrent que le site de liaison au NTP (P-loop) est impliqué, directement ou indirectement, dans la replication de l'ADN viral. En revanche, le mutant pTYArg (qui porte une substitution de la lysine 227 en arginine) se réplique mais moins bien que le sauvage. Le remplacement du résidu lysine 227 par l'arginine, acide aminé proche par sa structure et sa charge (positive à pH physiologique) du résidu lysine, semble affecter légèrement l'activité de le protéine Cl. Ceci n'est pas le cas pour les résidus alanine et histidine. Ces résultats suggèrent un rôle essentiel de la lysine 227 de la P-loop dans la replication de l'ADN viral.

De nombreux exemples, dans d'autres systèmes animaux et viraux, ont souligné l'importance de cette P-loop et particulièrement du résidu conservé lysine. La protéine RAD3 de Saccharomyces cerevisiae est impliquée dans la réparation des lésions de l'ADN. Une substimtion de la lysine 48 de la P-loop par un résidu arginine entraîne une perte des activités ATPase et ADN hélicase de cette protéine (Sung et a , 1988). La protéine Rep de l'AAV est impliquée dans la replication de l'ADN viral. Une substitution de la lysine 340 par une histidine produit un virus mutant incapable de se répliquer (Chejanovsky et al. , 1990).

b) La protéine Cl du TYLCV: quels rôles dans la replication de l'ADN viral?

La protéine Cl (ou son homolgue ALI chez les géminivirus à génome bipartite) est essentielle à la replication de l'ADN viral. Parmi les différents géminivirus, c'est la protéine ALI du TGMV qui est la plus étudiée. Cependant, les rôles de cette protéine dans la replication ne sont pas bien élucidés. Il a été montré que la protéine ALI du TGMV reconnaît spécifiquement une séquence d'environ 50 nt au niveau de la région commune, et préférentiellement l'ADN simple brin (Lazarowitz et al , 1992b; Thômmes et al, 1993). Cette interaction spécifique est nécessaire à l'initiation de la replication. Pour la protéine Cl du

TYLCV, il a été montré qu'elle possédait une activité endonucléase site spécifique au niveau du nonanucléotide très conservé dans la structure potentielle en tige-boucle de tous les géminivirus connus. La protéine ALI du TGMV possède également une activité d' autorégulation négative sur sa propre transcription (Sunter et a , 1993). Le domaine protéique responsable de l'activité de répression a été identifié pour la protéine ALI du TGMV. La signification de cette rétrorégulation demeure inconnue. L'hypothèse que nous avançons est que la protéine Cl serait suffisante pour le cycle viral en très faible quantité, d'où le phénomène de rétrorégulation observé. Il se pourrait que la surexpression de la protéine Cl soit préjudiciable à la cellule hôte et par conséquent au virus lui-même qui ne fait qu'utiliser la machinerie cellulaire.

La présence chez la protéine Cl (et ALI) d'un motif conservé GxxxxGKT/S, correspondant au site de liaison aux NTP (P-loop), a conduit à attribuer à cette protéine un rôle potentiel d'ADN hélicase (Gorbalenya et Koonin, 1993). Cette activité d'ADN hélicase pourrait, par exemple, faciliter la fixation du complexe cellulaire d'ADN polymérase comme c'est le cas pour l'antigène T de SV40 (Dodson et al , 1987). La mise en évidence d'une activité ATPase in vitro chez la protéine Cl du TYLCV a renforcé cette hypothèse.

Cependant, toutes les ADN hélicases connues, à l'exception de celle du virus de la vaccine (Traktman et al , 1993), possèdent une activité ATPase ADN- dépendante. Des essais in vitro de l'activité ATPase de la protéine Cl de TYLCV ont montré qu'elle était ADN (simple et double brin) indépendante. Il est possible que les conditions utilisées ne soient pas optimales pour mettre en évidence cette dépendance. D'autre part, la protéine Cl utilisée est sous forme de fusion GST-Cl exprimée dans un procaryote E. coli. Par conséquent, des modifications post-traductionnelles (phosphorylation, glycosylation, myristylation etc.) et/ou des oligomérisations pourraient être nécessaires à l'expression de cette activité ADN hélicase potentielle (ou topoisomérase ou autre(s) inconnue(s)), et ces modifications ne se produisent pas chez E. coli. Enfin, il est possible également que la fusion avec la GST influence le fonctionnement normal de la protéine Cl. Il est intéressant de noter qu'au moins deux sites potentiellement phosphory labiés existent au niveau de la P-loop: RXXl (site consensus des protéines kinases calmoduline-dependante et RIKG site consensus reconnu par les protéines kinases de type C (Hofer et al , 1992).

L'activité ATPase déterminée in vitro possède une activité spécifique (a.s.) de l'ordre de 3x10-2 mol d'ATP hydrolyse/ min mol de protéine, qui est très faible comparée aux ATPases adénylate kinases par exemple, qui ont une a.s. de l'ordre de 2x106 (Hampton et Slotin, 1975). Si une activité ATPase existe bien in vivo et avec la valeur d'a.s. comparable à celle déterminée in vitro, elle ne servirait sans doute pas à fournir l'énergie nécessaire à une fonction, par exemple hélicase ou topoisomérase, mais permettrait vraisemblablement un changement de conformation de la protéine Cl elle-même, induisant soit la formation d'un multimère de Cl, soit l'interaction avec des facteurs de l'hôte.

La protéine Hsp70 d'E. coli possède une activité du type "chaperon", c'est-à- dire capable de se lier à d'autres protéines (Buchberger et al., 1994). Cette fonction est couplée à une activité ATPase avec une a.s. de l'ordre de 3.5x10-2. La fixation, et probablement l'hydrolyse de l'ATP, induiraient un changement de conformation de la protéine Hsp70 nécessaire à son activité de "chaperon" . Il est possible qu'un changement de conformation ait lieu également chez la protéine Cl et qu'il soit nécessaire à son activité.

c) Effet négatif dominant sur la replication de l'ADN viral sauvage Quand les protoplastes de tomate sont cotransfectes avec pTY et pTYArg, la replication de l'ADN viral n'est pas altérée: l'ADN de pTY se réplique et celui de pTYArg se réplique également seul, à un niveau moindre que le génome sauvage. Le même résultat est observé avec pTY et pTYHis, bien que

ce dernier ne se réplique pas seul dans les protoplastes de tomate. La protéine Cl -His n'a donc pas d'effet dominant détectable sur la replication du sauvage. Il est possible que la substitution du résidu lysine par l'acide aminé histidine ait un effet sur lOligomérisation ou son interaction potentielles avec d'autres facteurs (voir plus loin). D'un autre côté, on peut penser que la protéine Cl sauvage

"complémenterait" la déficience en replication du mutant pTYHis. Pour montrer cela, il faudrait cotransfecter des protoplastes de tomate avec d'une part pTYHis et d'autre part une construction plasmidique renfermant l'ORF Cl sauvage sous contrôle de promoteur fort (35S du CaMV par exemple). Si notre hypothèse est vraie, on devrait observer une replication de l'ADN viral muté pTYHis.

La cotransfection des protoplastes de tomate avec pTY et pTYAla, dont le génome ne se réplique pas seul, provoque une réduction notable de la replication du sauvage. Ce résultat correspond à un effet négatif dominant en trans du mutant pTYAla sur la replication du sauvage, et rejoint des résultats préliminaires et similaires obtenus avec des protoplastes de tabac (Meltouchi,

DE A 1992). Récemment, un exemple de mutation négative dominante a été obtenu pour un virus à ARN, le Potato Virus X (PVX) (Longstaff et al , 1993). La protéine de 188 K du PVX contient un motif GDD conservé parmi les ARN polymérases. L'expression de cette protéine modifiée au niveau du motif GDD dans des plantes transgéniques de N. tabacum (cv. Samsun NN) entraîne une résistance au PVX (absence d'accumulation de TARN viral).

Deux modèles peuvent rendre compte de l'effet négatif dominant observé (Herskowitz, 1987). Soit la protéine mutée Cl-Ala entre en compétition avec la protéine sauvage correspondante pour un substrat ou un facteur (activateur? répresseur?) se trouvant en quantité limitante, soit elle s'associe avec la protéine correspondante sauvage (ou un facteur hôte) pour former un hétéromultimère non fonctionnel (c'est-à-dire inactif ou très vite dégradable).

L'effet négatif dominant de la protéine mutée sur la protéine sauvage a été recherché in vitro pour l'activité ATPase. Les résultats obtenus n'ont montré aucun effet négatif concernant l'utilisation de l'ATP. Toutefois, aucune conclusion relative à un effet in vivo ne peut être avancée car, la protéine Cl est sous forme de fusion GST-Cl exprimée chez E. coli. Si ce modèle de titration d'un facteur limitant (par exemple un activateur ou un répresseur), par la protéine mutée, a effectivement lieu in vivo, il suffirait de surexprimer la protéine sauvage sous promoteur fort pour contrebalancer l'effet négatif dominant (à condition, bien sûr, que la protéine mutée n'ait pas une très grande affinité pour le facteur limitant).

Le deuxième modèle propose la formation d'un hétéromultimère non fonctionnel entre la protéine sauvage et mutée (et/ou un autre facteur de l'hôte). On peut penser que l' hétéromultimère ne reconnaît plus la séquence spécifique de la région intergénique, qu'il aurait perdu la capacité d'autoregulation négative, qu'il serait instable ou très vite dégradable. Pour vérifier ce deuxième modèle, il faudrait d'abord mettre en évidence dans un système eucaryote l'existence de tels oligomères ou hétéromultimères de la protéine Cl.

En l'absence de fonctions biochimiques clairement attribuées à la protéine Cl, il est difficile de choisir entre les deux modèles. L'identification de facteur(s) de l'hôte interagissant avec la protéine Cl ainsi que la détermination des structures tertiaires et quaternaires de celle-ci permettraient de mieux choisir le modèle approprié pour rendre compte de l'effet négatif dominant observé et par conséquent, élucider les rôles de la protéine Cl dans la replication de l'ADN viral.

d) Des plantes transgéniques exprimant Cl-Ala sont résistantes au TYLCV

Deux types de résultats ont été obtenus lorsqu'à été analysée la résistance au TYLCV de la descendance FI des plantes transformées avec les différents gènes Cl mutés. Les plantes FI His21, Argl et Stopό sont toutes sensibles au

STYLCV. La descendance FI Alal montre, pour cinq plantes sur 14 analysées, une résistance à ce virus. Ces résultats confortent ceux obtenus avec les expériences de cotransfection, dans lesquelles seul le mutant pTYAla inhibe la replication du génome sauvage. Nous avons utilisé trois méthodes expérimentales pour tester la résistance de ces plantes vis-à-vis du TYLCV. Le premier niveau repose sur la détection de la forme virale simple brin (ss) par la méthode du squash foliaire. Le deuxième niveau consiste à extraire l'ADN total de la plante et à analyser les différentes formes de l'ADN viral par Southern blot. Enfin, le troisième niveau fait appel à la méthode d' agroinoculation de disques foliaires de ces plantes par le STYLCV. Cette dernière méthode est beaucoup utilisée dans les programmes de sélection de résistance au TYLCV (et aux géminivirus en général).

Utilisant ces trois approches, nous avons pu obtenir deux types de réponse. Trois plantes Alal présentent une résistance incomplète au STYLCV, puisque l' agroinoculation de disques foliaires de ces plantes conduit à un faible niveau de replication par rapport aux plantes sensibles. Deux plantes Alal montrent une résistance totale (aucune replication n'est observée avec les trois expériences).

Curieusement, deux plantes Alal, qui, si l'on s'en tient aux résultats du squash et du Southern, seraient résistantes, se comportent comme les plantes sensibles (avec un niveau élevé de replication) après agroinoculation de disques foliaires. Nous avons interprété ce phénotype comme correspondant soit a une "pression en inoculum" élevée modifiant le rapport protéine Cl mutée: protéine

Cl sauvage, soit probablement à une inhibition de mouvement viral in planta.

Notons que les sept plantes Alal précitées ne présentent aucun symptôme caractéristique du TYLCV même trois mois après leur agroinoculation.

Ces résultats suggèrent un effet négatif dominant in planta et en trans de la protéine Cl-Ala mutée surexprimée sur la replication de l'ADN viral sauvage. Le mécanisme rendant compte de cet effet in planta est probablement le même que celui ayant lieu dans les protoplastes.

Nous avons analysé la présence et l'expression du gène Cl-Ala introduit dans ces plantes résistantes. Le gène est effectivement présent en une ou deux copies chez les plantes résistantes mais aussi chez certaines plantes sensibles analysées. Une corrélation entre d'une part la présence et le nombre de copies du gène Cl-Ala et d'autre part la résistance ne peut pas être établie. Ceci peut être dû soit à un effet de position (insertion dans une région "silencieuse" du génome), soit à un remaniement du gène entraînant une sensibilité au TYLCV. Les plantes Alal résistantes au TYLCV expriment toutes la protéine Cl-

Ala, alors qu'une plante sensible, à l'exception de l'une d'elles, ne l'exprime pas. En attendant d'analyser davantage de plantes Alal (et d'autres plantes FI Ala disponibles), on peut dire qu'il y a une corrélation entre l'expression de la protéine et la résistance.

ANNEXE

milieux pour protoplastes de tomate

milieu MSI milieu CPW

Sels MS (Sigma) 4.6 g mannitol 440 mM vitamines Morel 1 ml MES 100 mM saccharose 20 g CaCl2 10 mM myoinositol 100 mg KH2PO4 0.19 mM

2,4 D l mg KNO3 I mM

CaCl2, 2 H2O 7 mM MgS04 l mM

H2O (q.s.p.) 1 1 H2O (q.s.p.) 1 1 pH 5.7 pH 5.7

solution enzvmatiquç DOUΓ Drotonlastes de tahar.

(dans du CPW)

cellulase 2% macérozyme 0.1% pectolyase 0.019?

milieu TM2 milieu F

macroéléments 100 m 1 NaCl 140 mM microéléments 1 ml KC1 5 mM vitamine 1 ml Na2HP04 0.75 mM saccharose 68.4 g glucose 54 mM mannitol 4.6 g CaCl2 150 mM xylitol 3.8 g MES I mM sorbitol 4.6 g pH 5.5

tampons d'extraction

Tampon TE: TRIS 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5 - 8

Tampon TNES Tampon X

(extraction d'ADN de plantes) (extraction d'ADN de protoplastes de tabac et de tomate)

Tris-HCl (pH8) 100 mM Tris-HCl (pH8) 100 mM

NaCl 100 mM NaCl 100 mM

EDTA 10 mM EDTA 50 mM

SDS 1% SDS 0.5%

milieux de culture

milieu YEB (pour les agrobactérie. milieu MS30

Bacto-beef extract 5 g sels MS (macro et micro éléments) (Sigma) 4.6 g

Bacto-yeast extract ig saccharose 30 g peptone 6g H2O (q.s.p.) 11 saccharose 5g pH5.8

MgSO4 0.5 g

H2O (q.s.p.) 11 (MS = Murashige et pH7.2 Skoog)

milisjΛ milieiLB

MS30 + ANA 0.1 g/1 milieu A + BAP 1 g/1 kanamycine 70 mg/1 Vitamines de Morel céfotaxime 500 mg/1

solutions pour Southern

TAExl SSCώû

Tris-acétate 0.04 M NaCl 175 g EDTA 0.001 M Na-citrate 88 g H2O (q.s.p.) 11

TBExl

Tris-borate 0,09 M

EDTA 0,002 M

solution d' hybridation

NaH2P04 0.5 M

SDS 7%

EDTA ImM

BSA 10 g/1

PBS Tampon substrat

(Phosphate-Buffered Saline) (pour phosphatase alcaline)

NaCl 140 mM NaCl 100 mM

KC1 2.7 mM MgC12 5 mM

Na2HP04 10 mM Tris-HCl (pH 9.5) 100 mM

KH2PO4 1.8 mM pH 7.3

Tampon 6xSDS

Tris-HCl (pH 6.8) 350mM

SDS 0.3% glycérol 36%

DTT 9%

Bleu de bromophénol 0.012%

Milieux et gels utilisés pour l'étude de la protéine Rep in vitro

Milieu MTPBS

* NaCl 100 mM

* Na ₂ HPO ₄ 16 mM

* NaH ₂ Po ₄ 4 mM pH 7,3

Composition des gels utilisés: Gel Laemmli 10%

Gel de tassement (2,5 ml) Gel résolutif (5 ml)

H2O 1,9 ml H2O 1,67 ml

Tris 1 M pH 6,8 0,31 ml Tris 1 M pH 8,8 1,63 ml

SDS 20% 30 μl SDS 30 μl

Acrylamide- Acrylamide- bisacrylamide 30% 0,32 ml bisacrylamide 30% 1,65 ml

APS 10% 25 μl APS 25 μl

TEMED 4 μl TEMED μl

Solution de Bleu de Coomassie:

* 2,5 mg/1 de Bleu de Coomassie Brillant R250 * 20% Ethanol

* 10% Acide acétique

Les gels sont mis à colorer la nuit dans cette solution, puis l'excès de coloration est éliminé par rinçage dans un mélange d'éthanol 20% - acide acétique 10% pendant au moins une heure.

Milieu I: MS30 + ANA 0,1 mg/1

BAP 1 mg/1

Vitamines de Morel: Panthoténate de Ca 1 mg/1 Méso-Inositol 100 mg/1

Biotine 0,01 mg/1

Acide nicotinique 1 mg/1 Pyridoxine (Vit. B6) 1 mg/1

Thiamine (Vit. Bl) 1 mg/1

Milieu II: Milieu I + Kanamycine 70 mg/1 Céfotaxime 500 mg/1

Milieu HI: Milieu II sans ANA et BA

Les trois milieux sont utilisés solides (agar 9 g/1).

IV) CONSTRUCTION DE TOMATES TRANSGENIQUES (L. esculentum) EXPRIMANT LES PROTEINES REP MUTEES ET PROTEGEES CONTRE LES PATHOLOGIES PROVOQUEES PAR LES STYLCV

1) Protocole utilisé pour la transformation génétique de la tomate (Lycopersicon esculentum)

Le protocole suivi s'inspire de deux publications.

D'une part celle de S. McCormick et al. (1986): leaf disk transformation of cultivated tomato (Lycopersicon esculentum) using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Reports 5_:81-84, d'autre part, celle de J.J. Fillati et al.

(1987): Efficient transfert of a glyphosate tolérance gène into tomato using a binary Agrobacterium tumefaciens.vector. Bio/technology 5_:726-730.

Les explants utilisés sont les jeunes cotylédons encore en croissance, avant l'émergence des premières feuilles.

Ils proviennent de germinations stériles in vitro.

Les souches d'Agrobacterium contenant les plasmides qui renferment le gène d'intérêt (à savoir les séquences nucléotidiques mutées Cl* telles que représentées sur la figure 13) sont cultivées en milieu liquide pendant deux jours à 28 °C, à l'obscurité et avec agitation.

La succession des opérations est la suivante :

Jour 1 : mise en culture des bactéries en milieu minimum avec antibiotiques. Préparation de boîtes de Pétri (milieu solide) contenant une suspension cellulaire de tabac en pleine croissance: il s'agit des couches- nourrices.

Jour 2 : découpage minutieux des fragments de cotylédons (deux fragments par cotylédon), en évitant toute oxydation des tissus (sous l'eau). Mise en culture de ces fragments, face supérieure dirigée vers le bas, sur les couches-nourrices recouvertes au préalable d'un papier filtre Whatman n° 1. Cette incubation doit se poursuivre pendant une durée minimale de 8 heures, à

25 °C, en lumière atténuée.

Jour 3 : centrifugation des agrobactéries et reprise de celles-ci dans un milieu adapté aux tissus végétaux en prenant le soin d'ajuster la DO (à 590 nm) de la suspension entre 0,4 et 0,5. Immersion rapide des explants de tomate dans cette suspension et mise en culture de ceux-ci sur les mêmes couches-nourrices : il s'agit de la co-culture plantes-bactéries, qui se poursuit pendant 40 heures, à 25 °C, en lumière atténuée.

Jour 5 : transfert des explants sur un milieu permettant la régénération de bourgeons (régulateurs de croissance) et la sélection des cellules transformées

(antibiotiques appropriés). Les fragments de cotylédons sont alors déposés selon une polarité normale. Us sont transférés sur de nouveaux milieux toutes les deux à trois semaines, jusqu'à l'apparition de bourgeons.

Lorsque les bourgeons sont bien développés, ils sont mis sur un milieu permettant l'enracinement. Bien enracinées, les plantes sont acclimatées en serre.

Milieux utilisés pour la transformation de la tomate : Milieux pour bactéries :

Milieu minimal pour la culture des Agrobacterium, pour 1 litre :

K ₂ HPO 10,5 g K2HPO4 4,5 g

(NH4) ₂ SO ₄ 1,0 g

Citrate de sodium, 2H2O 0,5 g

Autoclaver à 120°C, 30 mn, dans un volume total de 990 ml. Avant emploi, ajouter les composés suivants, stériles: stérilisés également à l'autoclave MgSO , H ₂ O 1M 1 ml (120°C, 30 mn)

Glucose 20% 10 ml (110°C, 30 mn)

Stérilisé par filtration (0,45 μm).

Tétracycline à une concentration finale de 5 mg/1 pour le vecteur utilisé. Milieu liquide pour remettre en suspension les agrobactéries : Eléments minéraux de Murashige et Skoog, déjà décrits ci-dessus pour la transformation de Nicotiana benthamiana: Saccharose 30 g pH 5,8

Autoclaver à 110°C, pendant 20 mn. Milieux pour plantes :

Milieu pour la germination des graines de tomate : Pour 1 litre : Elément minéraux de Murashige et Skoog Saccharose 30 g Agarose 6 g pH 5,8

Autoclaver à 110°C, pendant 20 mn. Verser dans des tubes de culture stériles.

Milieu pour la suspension BY2 :

Déjà décrit ci-dessus pour l'entretien de cette suspension cellulaire utilisée également pour la transfection de protoplastes de tabac.

Ce milieu est simplement solidifié avec 0,6% d'agarose et coulé en boîtes de Pétri. Un ml de suspension est étalé sur sa surface.

Milieu permettant la sélection des cellules transformées et la régénération de bourgeons :

Pour 1 litre : Eléments minéraux de Murashige et Skoog Myo Inositol 100 mg

Saccharose 20 g

Gelrite (Serva) 2 g pH 6,0

Autoclaver à 110°C, pendant 20 mn. Avant emploi, ajouter les composés suivants, stérilisés par filtration :

Riboside de zéatine 2 mg

Vitamines de Nitsch :

Thiamine 0,5 mg

Glycine 2,0 mg Acide nicotinique 5,0 mg

Pyridoxine 0,5 mg

Acide folique 0,5 mg

Biotine 0,05 mg

Une solution concentrée 1000 fois de ce mélange est préparée, fractionnée en volumes de 1 ml et stockée à -20°C.

Pour 1 1 de milieu, ajouter 1 ml de solution-stock. Antibiotiques :

Céfotaxime 500 mg (pour éliminer les agrobactéries)

Kanamycine 100 mg (sélection des cellules transformées) Milieu d'enracinement :

Pour 1 litre : Eléments minéraux de Murashige et Skoog dilués de moitié Saccharose 5 g

Gelrite 2 g pH 6,0

Autoclaver à 110°C, pendant 20 mn.

Avant emploi, ajouter les composés suivants, stérilisés par filtration : Céfotaxime 200 mg

Kanamycine 50 mg.

2) Agroinoculation de tomates (Lycopersicon esculentum) avec le STYLCV

Les expériences d' agroinoculation ont été réalisées suivant le procédé décrit ci-dessus pour N. benthamiana.

Plantes inoculées : régénérants primaires T0 parfaitement enracinés in vitro sur le milieu de culture in vitro sélectif contenant de la kanamycine (50 mg/1).

Résultats obtenus après hybridation moléculaire selon la technique de squash blot en utilisant comme sonde l'ADN total du STYLCV, marqué au 32p.

Conclusion générale :sur un ensemble de 11 régénérants primaires T0 indépendants, 4 obtenus avec la construction Ala et 7 avec la construction His, 4

(2 avec l'une des constructions et 2 avec l'autre) sont dépourvus d'ADN viral après agroinoculation et sont donc de bons candidats pour une résistance au virus STYLCV (voir le Tableau 1 ci-joint).

Tableau 1

Régérants primaires Effectif total Essai du 21/07/95 Effectif total Essai du 11/08/95 TO inoculés inoculé inoculé

Cultivar I Ala a 25 16 b c 1 1 0 3 1 2

Cultivar II a non testé 1 1 0

Cultivar I ^His a 1 0 1 2 2 0

Cultivar II a b c

Cultivar III. a 1 1 0 2 2 0

Cultivar IV a 2 1 1 5 3 2 b 1 1 0 1 1 0

S : plante sensible, présence d'ADN viral sur le squash blot

R : plante résistante, absence d'ADN.

Les effectifs sont faibles car il s'agit des premières plantes de tomates transgéniques obtenues, acclimatées peu à peu en serre.

V) AGROINOCULATION DE NICOTIANA BENTHAMIANA AVEC L'ISOLAT JORDANIEN DU ITYLCV (TTYLCV-Jo):

Les expériences d' agroinoculation ont été effectuées selon le protocole décrit ci-dessus.

Plantes inoculées descendance T2, ou deuxième génération obtenue après autofécondation de plantes Tl comportant les mutations Ala et His qui sont résistantes au STYLCV, et qui produisent en quantité importante la protéine Rep mutée.

Résultats obtenus après hybridation moléculaire selon la technique de squash blot en utilisant comme sonde l'ADN total du ITYLCV-Jo, marqué au 32 _P .

Conclusions générales : dans un ensemble de plantes T2 issues de quatre plantes Tl sélectionnées pour la présence de Rep et la résistance au STYLCV et lors de deux répétitions de la même expérience, certaines d'entre elles montrent une résistance face à un autre virus, le ITYLCV-Jo, dont la séquence nucléotidique ne présente que 75% d'homologie avec celle du STYLCV.

La résistance conférée par la production d'une protéine Rep altérée codée par une séquence Cl mutée du STYLCV semble donc induire une résistance vis- à-vis d'un autre gérninivirus, le ITYLCV-Jo (voir le Tableau 2 joint). De plus, ces virus sont suffisamment éloignés pourqu'il ne puisse pas y avoir complémentation croisée pour les fonctions de la protéine Rep (Jupin I., Héricourt F., Benz B.-et Gronenbom-B. (1995), DNA replication specificity of TYLCV géminivirus is mediated by the aminoterminal 116 amino acids of the

Rep protein, FEBS Letters, 362: 116-120.

Tableau 2

Plantes Tl Nombre de T2 Essai du 23/06/95 Nombre de T2 Essai du 03/08/95 inoculées inoculées

S R S R

His a 11(10) 1(6) 10(4) 12 11 1 b 10(12) 5(10) 5(2) 23 21 2

Ala a 11(8] 6(4) 5(4) 22 18 b 10(9) 7(2) 4(7) 23 23

S : plante sensible, présence d'ADN viral sur le squash blot

R : plante résistante, absence d'/iDN.

(x) : résultats obtenus en parallèle après inoculation duSTYLCV

Légendes des figures:

- figure 1: organisation génomique du STYLCV. Les flèches noires représentent les ORFs des brins viraux (VI et V2) et complémentaires (Cl, C2,

C3, C4). La position de la structure en épingle à cheveux est notée par (;). L'ORF VI semble coder pour une protéine impliquée dans le mouvement systémique, l'ORF V2 code pour la protéine de capside, l'ORF Cl code pour la seule protéine indispensable à la replication, l'ORF C2 code pour un activateur de transcription des ORFs du brin viral, les ORF C3 et C4 n'ont pas de fonctions connues;

- figure 2: représentation schématique des plasmides pTY Ala, His, Arg, du plasmide pBMC-S et des plasmides pCl Ala, His, Arg; les principaux sites de restriction de ces différents plasmides sont indiqués;

- figure 3: les mutations touchent le codon de la lysine en position 227 (codée par AAG) et résultent en sa substimtion par Ala (codée par GCG), His (codée par CAT) et Arg (codée par AGG);

- figure 4: replication des mutants dans le site de liaison aux NTP du STYLCV; l' autoradiogramme résultant de l'analyse selon Southern est quantifié à l'aide d'un analyseur d'images (Bio-Images, Millipore), qui attribue aux taches une valeur de densité optique. Le graphe représente le pourcentage de formes réplicatives après trois (en noir) et cinq (en blanc) jours de culmre des cellules transfectées. pTYLCV: génome viral sauvage; pTYAla, pTYArg: génomes viraux mutés correspondant au changement de K en A et R respectivement;

- figure 5: graphe issu de la quantification de l' autoradiogramme obtenu lors de l'étude d'un effet tra/w-dominant de la mutation K en R, par un test d'activité NPT II. Les constructions indiquées sur le document ont été cotransfectées avec le génome viral recombinant codant pour la néomycine phosphotransférase (pTYNéo). L'activité NPT π est recherchée après 3 et 5 jours de culmre des cellules transfectées. Les intensités ont été normalisées par rapport au signal correspondant à la cotransfection du génome recombinant avec le vecteur pUC.

- figure 6: graphe issu de la quantification de l' autoradiogramme obtenu lors de l'étude de l'effet de la transfection des génomes viraux mutés (pTYAla, pTYHis, pTYArg) sur la replication du génome viral (pTYLCV). le pourcentage de formes réplicatives est représenté pour les différents échantillons après 3 et 5 jours de culmre des cellules transfectées. Le témoin correspond à la cotransfection du virus sauvage avec du vecteur pUC de façon à transfecter la même quantité d'ADN;

- figure 7: graphe issu de la quantification de l' autoradiogramme obtenu lors de l'étude de l'effet de la cotransfection de constructions permettant l'expression à haut niveau des protéines Cl mutées (pClAla, pClHis, pClArg) sur la replication du génome viral (ici pTYNéo);

- figure 8: les plasmides pTYLCV et pTY-Ala, Arg, His, Pml, Stop sont composés du plasmide pUCllδ dans lequel est clone au site unique SstI le génome entier du TYLCV sauvage ou muté. Le plasmide pGEXCl est constitué du plasmide pGEX3 (Amrad) dans lequel est clone au site BamHI le gène Cl. Le répresseur lac, produit du gène lad, se lie au promoteur Ptac et réprime l'expression de la protéine de fusion GST-Cl. En présence d'IPTG, l'expression de la protéine de fusion est déréprimée;

- figure 9: clonage de l'ORF Cl en aval du promoteur 35S dans le plasmide pGA492. Ce plasmide binaire possède les éléments (bordures du T- DNA d'A. tumefaciens) nécessaires en cis au transfert d'ADN ans les plantes. Les autres éléments sont fournis par un plasmide auxiliaire présent dans la souche d'A. tumefaciens LBA4404. Les plasmides contenant les mutations introduites ont été obtenus en remplaçant un fragment Sstl-BglII (Sstl-Pflml pour le mutant Stop) du gène Cl sauvage par un gène muté. La construction est ensuite clonée au site unique EcoRI du plasmide pGA492;

- figure 10: transformation de disques foliaires de N. benthamiana et obtention de plantes transgéniques exprimant l'ORF Cl sauvage ou muté. Partant d'un jeune plant de N. benthamiana âgé d'environ trois semaines, on effectue un prélèvement de jeunes feuilles et une stérilisation. Les disques foliaires sont découpés à l' emporte-pièce, puis immergés 30 secondes dans une culmre d'A. tumefaciens contenant la construction à introduire. Puis les disques sont mis en culture 2 jours sur milieu de bourgeonnement (milieu I) sans antibiotiques. On effectue un repiquage sur milieu II (avec Kanamycine +

Céfotaxime) tous les dix jours jusqu'à l'apparition de bourgeons. Les plantules obtenues sont repiquées sur milieu m (sans hormones) d'enracinement, puis en serre sur vermiculite avec arrosage à la solution nutritive. La composition des milieux I, II et m est fournie en annexe.

- figure 11: schéma simplifié d'explication de l'obtention des plantes de la première génération FI;

- figure 12: replication de l'ADN viral dans des protoplastes de tomate. Les protoplastes sont soit transfectés (puits 1 à 4 et 8), soit cotransfectes (puits 5 à 7 et 9) avec le génome viral sauvage ou muté. Sept jours après, l'ADN total est extrait, séparé dans un gel d'agarose et transféré sur membrane nylon. L'hybridation se fait avec une sonde correspondant à l'ADN total de TYLCV- Sar marquée au ³² P. Exposition de 15 h à -70°C. ss: forme simple brin; ds: forme superenroulée double brin; lin: forme linéaire.

- figure 13: séquences en acides nucléiques et en acides aminés des ORF Cl mutés (Cl*) du STYLCV et des protéines Rep altérées correspondantes. La séquence nucléotidique commence à l'ATG initiateur. La protéine Rep comprend 359 acides aminés. Les acides nucléiques et les acides aminés sauvages sont indiqués par des majuscules. Les acides nucléiques mutés sont indiqués par des minuscules et les acides aminés mutés sont indiqués en majuscules et en italique. Le codon n° 227 (AAG) codant pour la lysine (K) de la protéine Rep sauvage a été remplacé par le codon gcG pour obtenir la protéine Rep K227A, où l'alanine remplace la lysine. Ce même codon a été remplacé par le codon cAt pour obtenir la protéine Rep K227H, dans laquelle l'histidine remplace la lysine. Enfin, le remplacement de ce codon par le codon AgG permet d'obtenir la protéine Rep K227R, où l'arginine remplace la lysine. (Pmll) indique le site de restriction cACGTG introduit pour la sélection des mutants. Il s'agit d'une mutation silencieuse qui n'altère pas la séquence protéique.

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