本发明涉及一种植物耐逆性相关蛋白 TaDREB4B及其编码基因和应用。

背景技术

干旱、 高盐及低温等逆境胁迫是影响小麦生长、 发育的障碍因子。 因此， 了解 小麦对逆境条件的应答与信号传导机制， 提高小麦品种的抗逆性， 成为小麦遗传研 究及小麦品种改良的重要任务之一。在逆境胁 迫下植物体内会产生一系列应答反应， 伴随着许多生理生化及发育上的变化。 明确植物对逆境的反应机制， 将为抗逆基因 工程研究和应用提供科学论据。 目前， 植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、 分子水 平， 并与遗传学和遗传工程研究相结合， 探索用生物技术来改进植物生长特性， 其 目的是提高植物对逆境的适应能力。

在干旱、 高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下， 植物能够在分子、 细胞和整体 水平上做出相应的调整， 以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生 存。 许多基 因受胁迫诱导表达， 这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫 应答， 而且能够 调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径 ， 从而使植物避免或减少伤害， 增强 对胁迫环境的抗性。 与胁迫相关的基因产物可以分为两大类： 第一类基因编码的产 物包括离子通道蛋白、 水通道蛋白、 渗透调节因子 （蔗糖、 脯氨酸和甜菜碱等） 合 成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物； 第二类基因编码的产物包括参与胁迫相 关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子， 如蛋白激酶、 转录因子等。 其中， 转录 因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重 要作用。

转录因子也称为反式作用因子， 是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件 发生特异性作用的 DNA结合蛋白， 通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互 作 用， 激活或抑制转录。 转录因子的 DNA结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异 性， 而转录调控区决定了它对基因表达起激活或是 抑制作用。 此外， 其自身活性还 受到核定位及寡聚化等作用的影响。

目前已知在植物中与胁迫相关的转录因子主要 有： 具有 AP2 结构域的 AP2 (APETALA2) /EREBP (乙烯应答元件结合蛋白， ethylene responsive element binding protein)转录因子家族、含有碱性区域和亮氨酸� ��链的 bZIP ( basic region/leucine zipper motif transcription factors ) 类转录因子、 含有保守的 WRKY氨基酸序列 的 WRKY转录因子家族、 含有碱性螺旋-环 -螺旋 （bHLH)和亮氨酸拉链的 MYC家族和 具有色氨酸簇 （Trp cluster) 的 MYB家族。 这五个转录因子家族， 除 WRKY家族不 参与植物的水胁迫反应外， 其它四个家族均参与调节植物对干旱、 高盐和低温等的 逆境胁迫反应。其中， AP2/EREBP类转录因子在高等植物中广泛存在， 它是植物所特 有的一类转录因子， 近年来， 在拟南芥、 烟草、 玉米、 水稻、 大豆和油菜中均有报 道， 这表明 AP2/EREBP类转录因子在高等植物中普遍存在并具 有重要作用。 DREB (脱水应答元件结合蛋白， DRE-binding protein)类转录因子是 AP2家族中 EREBP-l ike亚家族中的一个成员。 DREB和 EREBP类转录因子在氨基酸序列上没有显 著的相同性， 但都含有一段非常保守的由 58 个左右氨基酸组成的 DNA 结合区域 ( EREBP/AP2结构域） 。 蛋白质三维分析表明， 该区域含有 3个 β -折叠， 对识别各 类顺式作用元件起关键作用。 其中位于第二个 β _折叠中的第 14、 19位的两个氨基 酸残基的差异， 决定这类转录因子与不同顺式作用元件的特异 结合。 DREB类转录因 子第 14位氨基酸是缬氨酸 （V14 ) ， 第 19位氨基酸是谷氨酸 （E19 ) ， 其中第 19位 的氨基酸并不保守， 例如水稻的 OsDREB l 转录因子的第 19 位氨基酸就是缬氨酸 ( D i bonze J G , Sakuma Y, I o Y, Kasu a M， Dubou zet EG, Miura S , Seki M, Shinozaki K , Yamaguchi --Shinozaki K , 2003 ) 。 在 DREB相关蛋白中决定 DNA结合 的特异性方面， V14的作用明显要比 E19重要 ( Sakuma Y, Liu Q, Dubouzet JG, Abe H， Shinozaki K and Yamaguchi-Shinozaki K， 2002 ) ； 而 ERF类转录因子第 14位 氨基酸是甘氨酸， 第 19位是天冬氨酸， 因而 DREB特异结合 DRE/CRT顺式元件， ERF 特异结合 GCC-盒。 AP2/EREBP结构域的 C-端区还包含 1个由 18个氨基酸残基组成的 核心序列，该序列形成双亲性的 α -螺旋，该 α -螺旋可能参与同其它转录因子及 DNA 间的相互作用。

目前， 在许多植物中都发现含有 EREBP/AP2结构域的转录因子， 并分别与抗病、 抗逆等信号传递有关（刘强，赵南明， Yamaguchi-Shinozaki K， Shinozaki K， 2000 )。 刘强等认为， 一个 DREB基因可以调控多个与植物干旱、 高盐及低温耐性有关的功能 基因的表达（刘强， 赵南明， Yamaguchi-Shinozaki K， Shinozaki Κ， 2000 )。 Kasuga 等的研究证实， 导入到拟南芥的 DREB1A基因可以同时促进与逆境胁迫耐性有关的 基 因 rd29、 rdl7、 kinl、 cor6. 6、 corl5a以及 erdlO的表达， 转基因植株的抗逆性大 大增强 ( Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K.， 1999 )。 同样， 低温耐性转录因子 CBF1 的转基因植株的耐低温能力有显著提高 ( Jaglo-Ottosen KR， Gi lmour SJ， Zarka DG， Schabenberger 0， Thomashow MF.， 1998 ) 。 由于植物的逆境耐性是由多基因调控的复杂性 状， 依靠导入单个功能性蛋 白基因很难实现植物抗逆性的综合提高。 因此， 利用一个关键性转录因子促进多个 功能基因的表达， 从而增强植物的抗逆性， 已经成为植物抗逆基因工程的研究热点。

根据含 DNA结合区的数目， AP2/EREBP转录因子分为 AP2 (APETALA2)和乙烯应答 元件结合蛋白 EREBP ( ethylene-responsive element binding protein ) 以及 RAV 三个大类型。 AP2型转录因子包括拟南芥的 AP2、 ANT, 玉米的 Glossy、 idsl等。 这 种类型的转录因子含有两个 AP2/EREBP结构域， 调节细胞的生长发育， 在拟南芥中 已发现 14个 AP2型转录因子基因； EREBP型转录因子仅含 1个 AP2/EREBP结构域， 调节植物对激素 （乙烯） 、 病原、 低温、 干旱及高盐等地分子应答反应。 EREBP型转 录因子中， 已发现有烟草 EREBPl-4、番茄 Pti4_6、拟南芥 RAV1_2、 AtEBP、 AtERFl_5、 DREB1A-C ( CBF1-3 ) 和 DREB2A-B等许多成员， 分别与细胞发育、 激素、 抗病、 低温 及干旱、 高盐等信号传递有关。 这些 EREBP 型转录因子又可以再分为： EREBP ( ethylene-responsive element binding protein , 即 ERF ) 亚组， 包括烟草 EREBP 1-4 , 番茄 Pti4-6、 拟南芥 AtEBP、 AtERFl_5、 这类转录因子与含核心序列 AGCCGCC的 GCC-盒特异结合， 因此， 它的 DNA结合区又称为 GCC-盒结合域（GCC-box binding domain, GBD ) ， 其中第 2个 G、 第 5个 G、 第 7个 C对 ERF蛋白的识别有 重要作用 （Hao D， Ohme-Takagi M， Sarai A, 1998 ) 。 用核磁共振对其三维空间结 构的研究表明， AtERFl的 GBD通过形成 3个反向的 β _片层与其靶序列 GCC-盒的大 沟相结合； DREBP亚组， 包括拟南芥 DREB1A-C ( CBF1-3 ) 和 DREB2A-B, 这类转录因 子在干旱、 高盐、 低温下特异结合干旱应答元件 DRE/CRT, 在拟南芥基因组中发现 124个 DREBP型转录因子基因； RAV型转录因子包括拟南芥 RAV1、 RAV2、含有两个不 同的 DNA结合区一 ERF/AP2和 B3， 在拟南芥中已发现 6个 RAV型转录因子基因。 还 有一类特殊的转录因子 AL079349 , 它与以上的转录因子都不同， 自成一类。

最近发现 EREBPs蛋白参与了干旱、高盐和低温胁迫的信号 传导和基因表达调控。 Mine等人从低温储藏的土豆块茎中分离到了 EREBP转录因子 CIP353 , 受低温胁迫诱 导强烈表达 ( Mine T, Hiyoshi T, Kasaoka K， Ohyama A, 2003 ) ， 说明可能有 EREBP 蛋白参与了受低温胁迫的基因表达调控。 Park等利用西红柿为材料，得到了受高盐、 乙烯或茉莉酸诱导表达的 EREBP转录因子 7¾i基因， EMSA( Electrophoretic mobi l ity shift assays ) 试验分析发现， Tsi 蛋白与 GCC-box和 DRE/CRT顺式元件都能结合 ( Park JM， Park CJ， Lee SB , Ham BK， Shin R， Paek KH， 2001 ) ， 尽管前者结合 能力大于后者， 但说明， 某些 EREBP蛋白能激活受渗透胁迫诱导表达的基因。 在正 常生长条件下， 7¾i基因的超量表达提高了转基因植株 35S TsU、 的耐盐性、 增 强了抗病性 （Park JM， Park CJ， Lee SB, Ham BK， Shin R， Paek KH， 2001 ) ， 以 上说明了 7¾i基因可能参与了生物胁迫和非生物胁迫两� �信号传导途径。 由高盐胁 迫激活的一条类 MAPK信号传递模式（包括 SIMKK和 SMK)，将胁迫信号传递给 EIN2 (在乙烯信号传递途径的 CTR1下游） （Guo HW and Ecker J， 2004 ) ， 最后激活某 些 EREBPs转录因子， 调控渗透胁迫相关基因的表达， 提高植物的耐盐性。 对于是否 存在含 GCC-box元件， 且表达产物直接参与非生物胁迫响应的基因， 还有待作进一 步的证实。

综合目前的研究结果， 植物在逆境胁迫条件下的信号传递途径至少有 以下六条 途径： （1 ) 依赖于 ABA的信号传递途径有三条： 受干旱、 高盐诱导， 激活 MYB、 MYC 类转录因子基因， 调控具有 MYBR或 MYCR顺式作用元件的靶基因； 受干旱、 高盐诱 导， 激活 ABF/AREB类转录因子基因， 调控具有 ABRE顺式作用元件的靶基因； 受干 旱、 高盐诱导， 激活 CBF4， DREB1类转录因子基因， 调控具有 DRE/CRT顺式作用元 件的靶基因。 （2 ) 不依赖于 ABA的信号传递途径有三条： 受干旱、 高盐诱导， 激活 DREB2类转录因子基因， 调控具有 DRE/CRT顺式作用元件的靶基因； 受低温诱导， 激 活 CBF1-3/DREB1A-C类转录因子基因， 调控具有 DRE/CRT顺式作用元件的靶基因； 受干旱、 高盐或乙烯诱导， 激活 ERF类转录因子基因， 调控具有 DRE/CRT或 GCC顺 式作用元件的靶基因。

发明公开

本发明的目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白 TaDREB4B及其编码基因和应用。 本发明提供的蛋白质， 为一种脱水应答元件结合蛋白， 来源于小麦属小麦 ( Triticum aestivum L. ) ， 是如下 (a) 或 (b) ：

(a) 由序列表中序列 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列 1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的� �代和 /或缺失和 /或 添加且与植物耐逆性相关的由序列 1衍生的蛋白质。

序列 1所示蛋白质由 346个氨基酸残基组成， 自氨基端第 26位 -33位氨基酸残 基序列和第 63位 -67位氨基酸残基序列为两个可能的核定位信号 区， 自氨基端第 89 位 -147位氨基酸残基序列为保守的 AP2/EREBP结构域。

为了使 （a) 中的 TaDREB4B便于纯化， 可在由序列表中序列 1 所示的氨基 酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连 接上如表 1所示的标签。

表 1 标签的序列

上述 （b) 中的 TaDREB4B可人工合成， 也可先合成其编码基因， 再进行生物表 达得到。 上述 （b) 中的 TaDREB4B的编码基因可通过将序列表中序列 2所示的 DNA 序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子， 和 /或进行一个或几个碱基对的错义突 变， 和 /或在其 5'端和 /或 3'端连上表 1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围 。

所述基因可为如下 1) 或 2) 或 3) 或 4) 或 5) 的 DNA分子：

1) 序列表中序列 2 自 5' 端第 128至 1168位核苷酸所示的 DNA分子；

2) 序列表中序列 2 自 5' 端第 128至 1193位核苷酸所示的 DNA分子；

3) 序列表中序列 2所示的 DNA分子；

4)在严格条件下与 1)或 2)或 3) 限定的 DNA序列杂交且编码耐逆性相关蛋白 的 DNA分子；

5) 与 1) 或 2) 或 3) 限定的 DNA序列具有 90%以上同源性， 且编码耐逆性相关 蛋白的 DNA分子。

所述严格条件为在 0.1XSSPE (或 0.1XSSC) 、 0.1% SDS 的溶液中， 65°C条 件下杂交并洗膜。 序列 2所示 cDNA序列由 1494个核苷酸组成， 该基因的开放阅读框架为自 5 ' 端第 128位 -1168位核苷酸。

含有所述基因的重组表达载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌均属于本发明 的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的 重组表达载体。 所述植物表达载 体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击 的载体等。 所述植物表达载体还可包 含外源基因的 3 ' 端非翻译区域， 即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与 mRNA加工或 基因表达的 DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加 入到 mRNA前体的 3 '端， 如农杆菌冠瘿瘤诱导（Ti)质粒基因（如胭脂合 成酶 Nos基因）、 植物基因 （如大豆贮 存蛋白基因） 3 ' 端转录的非翻译区均具有类似功能。 使用所述基因构建重组植物表 达载体时， 在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型 启动子或组成型启动子， 如花椰菜花叶病毒 （CAMV ) 35S启动子、 玉米的泛素启动子 （Ub i qui t in ) ， 它们可 单独使用或与其它的植物启动子结合使用； 此外， 使用本发明的基因构建植物表达 载体时， 还可使用增强子， 包括翻译增强子或转录增强子， 这些增强子区域可以是 ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必 需与编码序列的阅读框相同， 以保证 整个序列的正确翻译。 所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛 的， 可以是天 然的， 也可以是合成的。 翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基 因。 为了便 于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选， 可对所用植物表达载体进行加工， 如 加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的 酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤 光素酶基因等） 、 具有抗性的抗生素标记物 （庆大霉素标记物、 卡那霉素标记物等） 或是抗化学试剂标记基因 （如抗除莠剂基因） 等。 从转基因植物的安全性考虑， 可 不加任何选择性标记基因， 直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为 ?-Gk?- TaDREB4B、 ^I U I- TaDREB4B 或 pAHC25- 7¾層 ；

所述 YEP-GAP- 7¾ZWM 为将所述基因插入 YEP-GAP的多克隆位点得到的重组质 粒。 所述 YEP-GAP- 7¾ZWM 优选为将序列表的序列 2 自 5'端第 128至 1 193位核苷 酸所示的 DNA片段插入 YEP-GAP的 EcoRl和 ol酶切识别位点之间得到的重组质粒。

所述 pBI 121- 7¾ZWM 为将所述基因插入 pBI 121 的多克隆位点得到的重组质 粒。所述 pBI 121- 7¾ZWM 优选为将序列表的序列 2 自 5'端第 128至 1 193位核苷酸 所示的 DNA片段插入 PBI 121的 BamHI和 Xho l酶切识别位点之间得到的重组质粒。

所述 pAHC25- 7¾ZWM 为将所述基因插入 pAHC25 的多克隆位点得到的重组质 粒。所述 pBI 121- 7¾ZWM 优选为将序列表的序列 2 自 5'端第 128至 1 193位核苷酸 所示的 DNA片段插入 pAHC25的 Smal和 Spe l酶切识别位点之间得到的重组质粒。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法， 是将所述基因导入目的植物中， 得 到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。 所述基因具体可通过所述重组表达载体 导入所述目的植物中。 携带有所述基因的表达载体可通过使用 Ti质粒、 Ri质粒、植 物病毒载体、 直接 DNA转化、 显微注射、 电导、 农杆菌介导等常规生物学方法转化 植物细胞或组织， 并将转化的植物组织培育成植株。

所述耐逆性可为耐非生物胁迫或抗病。

所述耐非生物胁迫具体可为耐旱和 /或耐盐和 /或耐高温 （如 43 °C ) 。

所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双 子叶植物， 如拟南芥 （如哥伦比 亚生态型拟南芥） 、 小麦 （如济麦 19 ) 等。

所述耐旱可体现为如下 （ I ) 和 /或 （Π ) _:

( I ) 所述转基因植物的脯氨酸含量和 /或可溶性总糖含量和 /或过氧化物酶活 性和 /或光合速率高于所述目的植物；

( II ) 干旱条件下， 所述转基因植物的株粒重和 /或千粒重高于所述目的植物； 所述抗病可为抗白粉病， 具体可为抗由白粉病病原菌 E09引起的白粉病。

本发明还保护所述蛋白作为转录因子的应用。

附图说明

图 1为 TaDREB4B与小麦 TaDREB氨基酸序列的同源性比对结果。

图 2为 7¾ZWM 受胁迫诱导表达的实时荧光定量 PCR图谱； A: 脱落酸处理； B : 乙烯处理； C: 高温处理； D : 茉莉酸甲酯处理； E : 冷害处理； F: 盐渍处理； G: 干 旱处理； H: 水杨酸处理； I： 白粉病病原菌处理。

图 3为酵母单杂交系统证明转录因子体内结合特� �性和激活特性的原理示意图。 图 4为野生型和转基因拟南芥的抗旱性比较。

图 5为野生型和转基因拟南芥的耐盐性比较。

图 6为野生型和转基因拟南芥的耐高温性比较。

图 7 为野生型和转基因小麦的抗旱指标比较； A: 脯氨酸含量； B : 可溶性总糖 含量； C: POD酶活性； D : SPAD值。

图 8为野生型和转基因小麦对白粉病病原菌的耐� �比较。

实施发明的最佳方式

以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。 下述实施例中的实 验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊 说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。 下述实施例中的％， 如无特殊说明， 均 为质量百分含量。 实施例 1、 TaDREB4B的克隆

一、 mRNA的分离

将水培的生长 10天左右的小白麦 （国家种质资源库， 编号 ZM242 )三叶期幼苗干 旱处理 2小时，用液氮速冻， -80 °C保存备用。采用 Quikprep Mi cro mRNA Puri fi cat ion Ki t ( Pharmac ia ) 进行 mRNA的分离。

二、 cDNA文库的构建及滴度测定 1 cDNA文库的构建

采用 Timesaver™ cDNA Synthesis Kit (Pharmacia) 将步骤一得到的 mRNA合成 cDNA双链， 并力口 fc。RI/〃。iI adaptor; 采用 ZAP Express® Predigested Gigapack® III Gold Cloning Kit (Stratagene)进行 cDNA文库的构建， 共得到 500ul库液。

2、 滴度的测定

(1) 取 lul库液用 SM Buffer稀释 1000倍；

(2) 分别取 lul 10ul lOOul稀释液至三个 10ml离心管中， 分别加 lOOul感 受态宿主菌 XLl-Blue MRF' (0D ₆ 。。为 1.0) ， 于 37°C温浴 20min;

(3)分别加入 3ml顶胶（50°C)混匀， 立即铺于固体 NZY平板上， 凝固后倒置， 37°C培养过夜；

(4) 根据平板噬菌斑数， 求平均值， 即为库容量。

计算公式： 噬菌斑数 （Pfu) X稀释因子

X 1000ul/ml

噬菌体稀释液的体积 （ul)

经计算， 该 cDNA文库的滴度为 3.0X10 ⁶ 个噬菌斑。

三、 cDNA文库的筛选

1、 探针的准备

根据已克隆的 DREB基因的 AP2保守区序列设计引物 WAPF和 WAPR, 以普通小麦 的 cDNA为模板进行 PCR扩增。

WAPF: 5' -ACC GCG GTG TGA GGC AGA GGA - 3'

WAPR: 5' -TGA GAA GTT GAC ACG TGC TTT GGC - 3'

PCR扩增产物进行 1.2 %琼脂糖凝胶电泳。

2、 探针的回收

采用 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (TaKaRa公司， Code No. DV805A) 回收纯化 180bp位置的条带 （探针） 。

3、 转膜

(1) 取 lul步骤二的 1的库液， 在培养皿中培养噬菌体， 大概 6.0X10 ³ pfu;

(2) 噬菌斑培养好后放在 4°C冷却， 临用时取出置于超净台吹干， 防止转膜时 顶胶被膜粘起；

(3)将 Hybrond-N ⁺ 膜剪成圆形， 比直径为 150 的培养皿稍小， 用铅笔在膜上 表明编号及日期 （与培养皿对应） ；

(4)用镊子夹住膜两边， 有字面朝上， 中间先接触平板， 慢慢松开， 不要移动， 不要有气泡， 使膜自然摊平， 完全摊平后， 计时；

(5)用注射器针头在膜上扎三个不对称的孔， 在培养皿背面对应的位置用记号 笔做好标记；

(6) 3min后， 用镊子从一边开始轻轻揭起膜， 不要带起顶胶；

(7) 将膜迅速放入盛有变性液的培养皿中 （放一层滤纸及 15ml变性液） 变性 7min, 有字面朝下， 注意避免溶液到达膜的上表面；

(8) 将膜转移至盛有中和液的培养皿中 （放一层滤纸及 15ml中和液） 中和两 次， 每次 3min;

(9) 然后将膜转入漂洗液中洗 30min， 可轻轻摇动；

(10) 取出膜， 在干净的滤纸上吸干， 有字面朝下；

(11) 用保鲜膜将膜包好， 在紫外交联仪上交联 lmin， 4°C存放备用；

4、 预杂交和杂交反应

65°C预杂交 5-6h (新膜） ； 探针标记完后， 加入 NaOH溶液， 混匀后于室温静置 lOmin使探针变性， 然后 65°C杂交过夜。

5、 洗脱

在 55°C-65°C条件下洗膜。 用滤纸吸干洗好的膜， 保鲜膜包好， 压 X—光片。 6、 阳性克隆的二轮筛选

(1) 将 X光片与膜对齐， 确定位置， 描下膜上的三个不对称点的位置；

(2) 在读片机上放上 X光片及相应的培养皿， 根据不对称点使培养皿定位； (3) 用去头的 lml枪头取出确定的阳性杂交斑， 放在 lml SM 缓冲溶液中， 加 入 50ul氯仿；

(4) 振荡 30秒， 室温放置 1小时， 离心， 取上清；

(5) 取 10-50ul上清再次铺板， 培养噬菌体进行二次筛选；

(6) 二次筛选的步骤同上： 转膜、 预杂交和杂交反应、 洗脱、 压 X—光片， 得 到单个阳性噬菌斑。

四、 得到 TaDREB4B

1、 集群内删除（Mass excision)

(1) 制备 XLl-Blue MRF'和 XL0LR菌； 用液体 LB培养基培养 XLl-Blue MRF'和 XL0LR 菌， 30°C过夜， 培养基中添加 0.2%麦芽糖、 10mM MgS0 ₄ 和抗生素， 分别为 12.5μ g/ml四环素和 50μ g/ml卡那霉素； 第二天， 1000 X g离心 lOmin收集菌体， 用 10mM MgS0 ₄ 重悬， 使 0D ₆ 。。达到 1.0;

(2) 在一个 10ml的无菌离心管中加入：

Ιμ ΐ库液 （约含 6.0 X10 ³ 噬菌体颗粒）

XLl-Blue MRF' 200 μ 1 (0D ₆ 。。为 1·0) ExAssist 助手噬菌体 2μ l lXliTpfu/ml)

(3) 37°C温育 15min;

(4) 加入 20ml液体 NZY培养基， 37 °C振荡培养 2.5_3h;

(5) 65- 70°C加热 20min;

(6) 1000Xg离心 10min， 上清移至一个新管中；

(7) 在一个 1.5ml的离心管中混合 200 μ 1 XL0LR菌和 1 μ 1上清；

(8) 37°C温育 15min; (9) 取 10μ 1、 100 μ 1菌液分别涂于 LB固体培养基（含氨苄 50 μ g/ml)上， °C培养过夜。

2、 cDNA文库插入片段的检查

(1) 随机挑取步骤 1中集群内删除的单菌落， 提取它们的质粒 DNA;

(2) 用限制内切酶 fcoRl (Takara)消化， 反应体系 ΙΟμ Ι:

0.5μ 1

2μ 1

6.5μ 1

(3) 37°C消化 2h， 0.8%琼脂糖凝胶电泳， 发现 95%以上的载体有插入片段， 说明

95%以上的噬菌体含有重组子， 因此文库实际含有的重组子为 2.85X 10 ⁶ (cDNA文库的 滴度为 3.0X10 ⁶ ) 。 50%以上的重组子的插入片段在 800bp— 4Kb之间， 说明构建的文 库较完整。

3、 单克隆内删除（Single-clone excision)

(1)将得到单个阳性噬菌斑从平板上抠下， 放入到一个无菌的、 已加有 500 μ 1

SM缓冲液和 20 μ 1氯仿的离心管中， 漩涡振荡 10sec， 4°C储存；

(2)用液体 LB培养基培养 XLl-BlueMRF'和 XL0LR菌， 30°C过夜， 培养基中添 力口 0.2%(w/v)麦芽糖、 10mM MgS0 ₄ 和抗生素， 分别为 12.5 μ g/ml四环素和 50 μ g/ml 卡那霉素；

(3) 第二天， 1000Xg离心 lOmin收集菌体， 用 10mM MgS0 ₄ 重悬， 使 0D ₆ 。。达到

1.0；

(4) 在一个 10ml的无菌离心管中加入：

XLl-Blue MRF' 200 μ 1 (0D ₆ 。。为 1·0)

噬菌体贮存液 250 μ 1 (至少含 1 X 10 ⁵ 噬菌体颗粒） ExAssist助手噬菌体 Ιμ ΐ (>1 X 10 ¹⁰ pfu/ml)

(5) 37°C温育 15min;

(6) 加入 3ml液体 NZY培养基， 37°C振荡培养 2.5_3h;

(7) 于 65-70°C水浴离心管 20min， 然后 1000 X g离心 15min;

(8) 将上清移至一个新的离心管中， 即为噬菌粒悬浮液；

(9)在一个 1.5ml的离心管中加入 200 μ 1步骤 （3) 制备好的 XL0LR菌和步骤

(8) 制备好的噬菌粒悬浮液 100μ 1， 再加入 300μ 1 液体 ΝΖΥ 培养基， 37°C温育 45-60min;

(10) 取 50 μ ΐ菌液涂于 LB固体培养基（含氨苄 50 μ g/ml)上， 37°C培养过夜；

(11) 第二天挑取阳性克隆， 用液体 LB培养基培养过夜， 提取质粒， 用 ¾oRI 酶切， 电泳检测插入片段长度。

( 12)选取插入片段大于 800bp的克隆进行测序， 在 ABI733测序仪（Genecore Biological Company) 上， 采用双脱氧核苷酸链终止法测定序列， 将得到的全序列 与 EMBL Bank以及 GENEBANK等核苷酸数据库比较， 用 DNASIS软件进行分析。 发现 18号克隆有一个保守的 AP2/EREBP结构域。 且基因结构完整。

(13) 分析 18号克隆的核苷酸序列及对应的氨基酸序列， 得到序列表中序列 2 所示的核苷酸序列。

将序列表的序列 1所示的蛋白命名为 TaDREB4B蛋白，由 346个氨基酸残基组成。 序列 1中的自氨基端第 26位 -33位氨基酸残基和第 63位 -67位氨基酸残基为两个可 能的核定位信号区， 自氨基端第 89-147位氨基酸残基为保守的 AP2/EREBP结构域。 TaDREB4B 蛋白的同源序列比对结果如图 1 所示 （黑框表示一致的氨基酸部分） ， TaDREB4B与已报道的小麦 TaDREB (AAL01124)只有 34.97%的同源性， 说明 TaDREB4B 是一个新发现的小麦蛋白。 将 TaDREB4B蛋白的编码基因命名为 TaDREB4B繊, 其 开放阅读框架为自序列表的序列 2的 5' 端第 128位 -1168位核苷酸。 实施例 2、 实时荧光定量 PCR分析 TaDREB4B的表达特性

一、 进行各种胁迫处理

苗龄为 10天的小白麦幼苗， 进行以下处理

(1) 干旱处理： 将水培的小麦幼苗取出吸干根上的水分， 置于干燥的滤纸上， 干旱培养 30分钟、 1小时、 2小时、 4小时、 8小时、 12小时、 24小时后取出材料， 用 液氮速冻， -80°C保存备用。

(2) 盐渍处理： 将小麦幼苗置于 2%的由 NaCl和 Na ₂ S0 ₄ 组成的钠盐溶液中 （NaCl 与 Na ₂ SC 质量百分比为 3: 2) 中， 光照培养 30分钟、 1小时、 2小时、 4小时、 8小时、 12小时、 24小时后分别取出材料， 用液氮速冻， -80°C保存备用。

(3) 脱落酸处理： 将小麦幼苗置于 200 μ Μ的脱落酸 （ABA) 水溶液中， 光照培 养 30分钟、 1小时、 2小时、 4小时、 8小时、 12小时、 24小时后分别取出并用液氮速 冻， -80°C保存备用。

(4) 白粉病病原菌处理： 将小麦幼苗接种白粉病菌株， 光照培养 3小时、 6小时、 12小时、 2天、 3天、 4天、 5天后， 取出并用液氮速冻， -80°C保存备用。

(5) 冷害处理： 将小麦幼苗置于 4°C培养箱， 光照培养 30分钟、 1小时、 2小时、 4小时、 8小时、 12小时、 24小时后取出并用液氮速冻， -80°C保存备用。

(6) 茉莉酸甲酯处理： 将小麦幼苗置于 50μ Μ的茉莉酸甲酯（JA)溶液中， 光照 培养 30分钟、 1小时、 2小时、 4小时、 8小时、 12小时、 24小时后分别取出并用液氮 速冻， -80°C保存备用。

(7) 乙烯处理： 小麦幼苗置于含有乙烯的塑料袋中， 光照培养 30分钟、 1小时、

2小时、 4小时、 8小时、 12小时、 24小时后分别取出并用液氮速冻， -80°C保存备用。

(8) 水杨酸处理： 将小麦幼苗置于 50μ Μ的水杨酸（SA)溶液中， 光照培养 30分 钟、 1小时、 2小时、 4小时、 8小时、 12小时、 24小时后分别取出并用液氮速冻， -80 °c保存备用。

( 9 ) 高温处理： 将小麦幼苗置于 42 °C下， 光照培养 30分钟、 1小时、 2小时、 4 小时、 8小时、 12小时、 24小时后分别取出并用液氮速冻， -80°C保存备用。

( 10 ) 对照的处理： 直接取未经任何处理的小麦幼苗 -80°C冻存作为对照 （0小 时） 。

二、 mRNA的分离

采用 Quikprep Micro mRNA Purification Kit ( Pharmacia) 进行 mRNA的分离。 三、反转录为 cDNA

¾ffi R103-Quant_Reverse_Transcriptase ( TIANGEN ) 将纯化的 mRNA反转录为 cDNA。

四、 实时荧光定量 PCR

根据 7¾ZWM^9序列， 在其可变区设计特异引物 TaDREB4BRTF和 TaDREB4BRTR。 以 actin为内参基因， 弓 I物为 actin_2F禾口 actin_2R。

TaDREB4BRTF _: 5， - GATGTGTTCGAGCCATTGGAG- 3，；

TaDREB4BRTR _: 5， - TGGTCCAAGCCATCCAGGTAG- 3， 。

actin-2F : 5， -CTCCCTCACAACAACCGC- 3，；

actin-2R: 5' -TACCAGGAACTTCCATACCAAC-3' 。

7¾ZWM 对各个胁迫及激素表现出响应， 见图 2。 实施例 3、 TaDREB4B的激活特性

用酵母单杂交系统证明转录因子的激活特性的 主要原理如图 3所示， 将 DRE顺式 作用元件和突变体 DRE顺式作用元件分别构建到 pHISi-1载体和 pLacZi载体的基本启 动子 Pmin ( minimal promoter) 上游， Pmin启动子下游连接报道基因 （His3、 LacZ 和 URA3 ) 。 当连接有编码转录因子的目的基因的表达载体 YEP-GAP (不含激活功能） 分别转化到连有 DRE顺式作用元件和突变体 DRE顺式作用元件的酵母细胞后， 如果连 有突变体 DRE顺式作用元件的酵母细胞中的报道基因不能 表达， 而连有特定的 DRE顺 式作用元件的酵母细胞中的报道基因能够表达 ， 说明该转录因子能与 DRE顺式作用元 件结合， 且具有激活功能， 激活了 Pmin启动子， 促使报道基因表达。 从而证明目的 转录因子的体内结合特异性和激活功能。

YEP-GAP : 中国农业科学院作物科学研究保证向公众提供 ； 参考文献 Liu Q， Kasuga

M， Sakuma Y, Abe H， Miura S， Yamaguchi-Shinozaki K， Shinozaki K. Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought- and

low-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis, Plant Cell 1998 Aug ; 10 (8) : 1391-1406。

YPD液体培养基： 细菌培养用酵母抽提物 （Bacto-Yeast Extract ) 10g/L, 细菌 培养用胰化蛋白胨 （Bacto-Peptone) 20g/L， 调节 pH至 5.8， 12rC/15min灭菌， 降 至 60°C以后加入 40%的 Glucose, 使其终浓度为 20g/L。

SD/His—/Ura—/Trp—选择性培养基：不含氨基酸� ��酵母氮源（Yeast nitrogen base) 6· 7g/L， 营养缺陷型混合物 （drop-out media without His/Ura/Trp) 100ml, 琼脂 粉 (Bacteriological agar) 20g/L， 调节 pH至 5· 8， 121°C/15min灭菌， 降至 60°C后 加入 40%Glucose， 使其终浓度为 20g/L。

营养缺陷型混合物 （Drop-out mix) ： (10X ) ： L-Isoleucine (异亮氨酸） 300mg/L, L-Valine (缬氨酸） 1500mg/L, L-Adenine (腺嘌吟） 200mg/L, L-Arginine (精氨酸） 200mg/L, L_Histidine Hcl monohydrate (组氨酸） 200mg/L， L-Leucine (亮氨酸) 1000mg/L, L-Lysine Hcl (赖氨酸） 300mg/L， L-Methionine (甲硫氨酸) 200mg/L, L-Phenylalanine (苯丙氨酸） 500mg/L, L-Threonine (苏氨酸） 2000mg/L, L-Tyrosine (酪氨酸） 300mg/l。

lXPEG/LiAc: 50%PEG3350 8ml， 10XTE buffer 1ml， lOXLiAc 1ml。

10 XTE Buffer: lOOmM Tr is-He 1， lOmM EDTA、 pH=7.5, 121°C高压灭菌， 室温 保存。

ΙΧΤΕ/LiAc: 10 XTE buffer 1ml， lOXLiAc 1ml， dd¾0 8ml。

Z Buffer: N¾HP0 ₄ · 7H ₂ 016. lg/L, NaH ₂ P0 ₄ · H ₂ 05.5g/L， KC10.75g/L， MgS0 ₄ · 7H ₂ 0 0.246g/L， 调节 pH至 7.0， 121°C/15min灭菌， 4°C保存。

X_gal储存液 (X-gal Stock Solution) ： 用 N， N_dimethyl_formamide (DMF) 溶解 X-gal， 使其终浓度为 20mg/ml， _20°C贮存。

含有 X-gal的 Z buffer缓冲液 100ml (Z buffer with X-gal)，现用现配： Z buffer 98ml, β -巯基乙醇 ( β -mercaptoethanol) 0.27ml, X_gal储存液 (X-gal stock solution) 1.67ml。

lOXLiAc: Clontech公司。

一、 重组表达载体的构建

1、 获得 7¾ZWM 基因的获得

根据 TaDREB4B基因的序列设计引物 TaDREB4B_EI和 TaDREB4B_XI， 引物末端分 别引入 EcoRV和 ¾oI酶切位点， 以小白麦的 cDNA为模板， PCR扩增获得 TaDREB4B 基因。

TaDREB4B-EI _: 5， - GGGGAATTCATGACGGTAGATCGGAAGGAC- 3，；

TaDREB4B-XI _: 5， -GGGCTCGAGATGGTTTGGCCGCCGCAAAG- 3，。

PCR扩增产物进行 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

采用 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (TaKaRa公司， Code No.： DV807A) 回收纯化 1.1Kb左右的 PCR产物。

2、 重组表达载体的构建

①用限制性内切酶^ 和 X oI酶切步骤 1回收纯化的 PCR产物， 回收酶切产物； ②用限制性内切酶^ 和 X oI酶切表达载体 YEP-GAP, 回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架 连接；

④将步骤③的连接产物电击转化 JM109菌株 （Clontech公司购买） ， 37°C过夜培 养， 挑取阳性克隆进行测序； 测序结果表明， 得到了重组质粒 YEP-GAP-7¾ZWM (在 YEP-GAP的 EcoRl和 ol酶切位点之间插入了序列表的序列 2自 5'端第 128- 1193位核 苷酸所示的 DNA片段） 。

二、 TaDREB4B的体内结合特异性和激活特性的验证

1、 酵母报道子的构建

(1) 正常双重酵母报道子的构建

DNA片段 A (含 4个 DRE元件）： 5， - GAATTC- DRE- DRE- DRE- DRE- GTCGAC- 3， （DRE的核 心序列： TACCGACAT) 。 DNA片段 A的核苷酸序列见序列表的序列 3。

将 DNA片段 A构建到 pHis-1载体（MATCHMAKER One-Hybrid System, Clontech公司） 的 Pmin _HIS3 启动子上游， 得到重组载体 pHis-1-DRE， 用 ¾o I 和 Nco I 内切酶将 pHis-1-DRE载体切成线状。

将 DNA片段 A构建到 pLacZi载体（MATCHMAKER One-Hybrid System, Clontech公司）

PCYCI启动子上游， 得到重组载体 pLacZi-DRE， 用 ¾o I 和 Nco I 内切酶分别将 pLacZi-DRE载体切成线状。

先将线状 pHis-1-DRE载体转化到酵母细胞（YM4271株系， MATCHMAKER One-Hybrid

System, Clontech公司）内，获得能在 SD/His—培养基上正常生长的酵母转化子（Yeast transformant) 。 接着以这种酵母转化子为寄主细胞， 继续转化含线状 pLacZi-DRE 载体。 这样在同时缺乏组氨酸和尿嘧啶的 SD/His7Ur _a —培养基上， 选择获得含有 pHis-1-DRE和 pLacZi-DRE的正常双重酵母报道子。

(2) 突变体双重酵母报道子的构建

醒片段 B (含 4个 MDRE元件）： 5， -GAATTC-MDRE-MDRE-MDRE-MDRE- GTCGAC- 3， (MDRE: 将 4个 DRE元件的核心序列 CCGAC突变成 TTTTT ) 。 DNA片段 Β的核苷酸序列见 序列表的序列 4。

用 DNA片段 B代替 DNA片段 A，方法同步骤（1)，得到突变体双重酵母报道 子。

2、 PEG/LiAc法转化酵母及结果分析

(1)接种酵母菌株 （YM4271株系） 到 lml YPD液体培养基中， 剧烈震荡 2分钟， 分 散团块后将悬浮液转至含有 50ml YPD液体培养基的三角瓶中， 30°C/250rpm摇过夜， 测 0D600=1.7-1· 8 (计数约 4X 10 ⁷ 个 /mL) ；

(2)取 30ml步骤 （1) 过夜培养物接到 300ml新鲜的 YPD培养基中， 30°C/250rpm培 养， 约 3小时 (至 0D600=0.5±0.1) ， 室温 1000g离心 5min， 收集菌体，弃上清， 用 1/2 体积 IX TE悬浮， 1000g/5min离心；

(3)吸弃上清，用 1.5ml新鲜配制的 ΙΧΤΕ/LiAc溶液悬浮， 振荡混匀备用；

(4)取出 0. lml酵母感受态进行转化，依次加下列溶液： 0. ΐμ _δ YEP ~G ΑΡ - TaDREB4B, 0· lmg ssDNA (鲑鱼精 DNA， Sigma) 、 0.6mlPEG/LiAc， 高速振荡 1分钟， 30°C/200rpm 振荡培养 30分钟；

(5)加入 70ul DMSO (sigma#D8779) ， 轻轻倒置混匀， 42°C热激 30分钟， 其间轻 轻振荡， 冰浴 2分钟， 室温 1000g离心 5min;

(6)吸弃上清， 加入 0.5ml 1XTE buffer悬浮细胞；

(7)用接种环蘸取悬浮液， 分别在含有 0、 15mmol/L 3-AT的 SD/His—/Ura7Trp—选 择性培养基上画线培养。

(8)平板的一半培养正常双重酵母报道子， 另一半培养突变体双重酵母报道子， 以便做对照分析。

(9)颠倒放置于培养箱中， 30°C培养 3— 4天。

(10)结果发现在 Ommol/L 3-AT的 SD/ His—/Ura7Trp—的培养基平板上正常的酵母报 道子和突变的酵母报道子都有生长， 但突变的酵母报道子的直径明显小； 而在 15mmol/L 3-AT的 SD/ His—/Ura7Trp—的培养基平板上正常的酵母报道� ��能正常生长， 但突变的酵母报道子被抑止没有生长。

3、 半乳糖苷酶活性检测

(1)从 Ommol/L 3-AT的 SD/ His—/Ura7Trp—的培养基平板上分别挑取正常的� ��母报 道子和突变的酵母报道子菌落。 转至 YPD液体培养基中， 于 30°C振荡培养， 待长至对 数生长后期， 取 1.5ml菌液， 3000rpm离心 30s;

(2)弃上清， 控干管中液体， 将离心管置于液氮中速冻 10min， 取出使其自然融 解， 加 50ul Z/X-gal溶液， 30°C温育， 结果发现正常的酵母报道子在 6_8h内变蓝， 而突变的酵母报道子在 12h内没有变化， 仍为白色。 说明转录因子 TaDREB4B能与 DRE 顺式作用元件结合， 且具有激活功能， 激活了 Pmin启动子， 促使报道基因表达。 从 而证明了 TaDREB4B的体内结合特异性和激活功能。 实施例 4、 TaDREB4B提高了拟南芥的抗旱、 耐盐、 耐高温性

一、 重组表达载体的构建

1、 raZWM 基因的克隆

根据 raZWM 基因的序列设计引物对 （TaDREB4B-121F和 TaDREB4B- 121R) ， 引物末端分别引入 BamHI和 Xhol酶切识别位点， 以小白麦的 cDNA为模板， PCR扩增 TaDREB4B。

TaDREB4B-121F _: 5' - GGGGGATCCATGACGGTAGATCGGAAGGAC- 3，；

TaDREB4B-121R _: 5， -GGGCTCGAGATGGTTTGGCCGCCGCAAAG- 3，。

PCR扩增产物进行 1.2%琼脂糖凝胶电泳， 采用 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司， Code No.： DV807A)回收纯化 1.1Kb左右的条带。

2、 重组表达载体的构建

①用限制性内切酶 BamHI和 Xhol酶切步骤 1回收纯化的 PCR产物， 回收酶切产物； ②用限制性内切酶 BamHI和 Xhol酶切 pBI121 ( Clontech公司购买） ， 回收载体骨 架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连 接；

④将步骤③的连接产物电击转化 T0P10菌株 （天根生化科技 （北京）有限公司购 买） ， 37°C过夜培养， 挑取阳性克隆进行测序； 测序结果表明， 得到了重组质粒 p B 1121 - TaDREB4B (在 p B 1121的 B amH I和 Xh o I酶切位点之间插入了序列表的序列 2自 5 ' 端第 128-1193位核苷酸所示的 DNA片段） 。

二、 转基因植物的获得

1、 用重组质粒 ρΒΙ121-7¾Ζν?Μ 化农杆菌 C58 (Clontech公司购买） ， 得到重 组农杆菌。

2、 将重组农杆菌接种于 YEP液体培养基中， 28°C、 3000rpm培养约 30小时；

3、 将步骤 2的菌液转至 YEP液体培养基（含 50 μ g/L卡那霉素和 50 μ g/L利福 平） 中， 28°C、 300rpm培养约 14小时 （菌液 0D600达到 1· 5-3· 0) ；

4、收集菌体， 4°C、4000g离心 lOmin,用 10%蔗糖（含 0.02%silwet)稀释至 0D600 约为 0.8-1.0;

5、 将拟南芥 （哥伦比亚生态型 Col-0, SALK公司购买） 整株与花盆一起倒扣在 盛有步骤 4的菌液的容器中， 使花浸泡 50s左右， 浸泡完毕后， 取出花盆， 侧放于 托盘中， 盖上黑色塑料布， 24hr后揭开塑料布， 直立放置花盆， 进行正常的光照培 养， 收获 1\代种子， 卡那霉素筛选 （浓度为 50 μ g/L卡那霉素） 阳性植株。 将阳性 植株进行 PCR鉴定， 鉴定结果表明， 得到的转基因植株 （转 7¾ZWM 基因植株） 。

τ ₂ 代表示 1\代自交产生的种子及由它所长成的植株， Τ ₃ 代表示 1~ ₂ 代自交产生的种 子及由它所长成的植株。

三、 转空载体对照植物的获得

用质粒 PBI121转化农杆菌， 得到重组农杆菌， 用重组农杆菌转化拟南芥 Col-0, 得到转空载体对照植株， 方法同步骤二。

四、 转基因植物的耐逆性鉴定

分别将 1~ ₃ 代转基因植株、 1~ ₃ 代转空载体对照植株和拟南芥 Col-0 (各 60株） 进行 耐旱性鉴定、 耐盐性鉴定和耐高温鉴定。 均设置三次重复实验， 结果取平均值。

1、 耐旱性

将正常生长 3周的幼苗， 连续 27不浇水， 第 28天统计成活率。 拟南芥 Col-0全部 死亡， 但 90%转基因植株存活且能正常生长 （见图 4， A: 拟南芥 Col-0; B: 转基因植 株） 。 转空载体对照植株的表型与拟南芥 Col-0—致， 存活率与拟南芥 Col-0没有显 著差异。

2、 耐盐性

将正常生长 3周的幼苗， 用 400mMNaCl浇灌， 然后转移到正常花盆中进行正常管 理， 2周后统计成活率。 拟南芥 Col-0几乎全部死亡， 但 55%转基因植株仍然能存活且 正常生长 （见图 5， A: 转基因植株； B: 拟南芥 Col-0) 。 转空载体对照植株的表型 与拟南芥 Col-0—致， 存活率与拟南芥 Col-0没有显著差异。

3、 耐高温

将正常生长 2周的幼苗， 进行高温处理（43°C)， 分别处理 2小时、 4小时、 8小时， 然后常温恢复生长 1周， 计算成活率。 高温处理 2小时， 拟南芥 Col-0和转基因植株的 存活率都为 100%; 高温处理 4小时， 拟南芥 Col-0的存活率为 50%， 100%转基因植株存 活且能正常生长； 高温处理 8小时， 拟南芥 Col-0的存活率为 30%， 55%转基因植株存 活且能正常生长 （见图 6) 。 转空载体对照植株的表型与拟南芥 Col-0—致， 存活率 与拟南芥 Col-0没有显著差异。 实施例 5、 TaDREB4B提高了小麦的抗旱性和对病原菌的耐逆� ��

一、 重组表达载体的构建

1、 raZW 基因的获得

根据 raZWM 基因的序列设计引物对 （TaDREB4B-121F和 TaDREB4B- 121R) ， 引物末端分别引入 Smal 和 e>I 酶切位点， 以小白麦的 cDNA 为模板， PCR 扩增 7¾層 基因。

TaDREB4B-121F _: 5' - TTTCCCGGGATGACGGTAGATCGGAAGGAC- 3，；

TaDREB4B- 121R: 5， - GGGACTAGTATGGTTTGGCCGCCGCAAAG- 3，。

PCR扩增产物进行 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

采用 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (TaKaRa公司， Code No.： DV807A) 回收纯化 1.1Kb左右的 PCR产物。

2、 重组表达载体的构建

①用限制性内切酶 和 e>I酶切步骤 1回收纯化的 PCR产物， 回收酶切产物；

②用限制性内切酶 5¾al和 5^e>I酶切 pAHC25 (购自北京拜尔迪生物技术公司） ， 回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连 接；

④将步骤③的连接产物电击转化 T0P10菌株 （购自天根生化科技 （北京）有限公 司） ， 37°C过夜培养， 挑取阳性克隆进行测序； 测序结果表明， 得到了重组质粒 PAHC25- TaDREB4B (在 pAHC25的 Smal和 ¾?e>I酶切位点之间插入了序列表的序列 2自 5 ' 端第 128-1193位核苷酸所示的 DNA片段） 。

二、 转基因植物的获得

1、 基因枪法转化转化小麦愈伤组织

取大田小麦（济麦 19; 购自山东农业科学院）授粉后 14天的未成熟胚， 接种于 SD2培养基上， 26°C黑暗条件下诱导愈伤组织， 7-10d后准备基因枪轰击。

取适量金粉 （ 1.0 μ m) 悬浮液（60 μ g/枪）， 将金粉和 TaDREB4B的混合 液在 4°C振荡 10min， OOOrpm离心 5min去上清， 加入无水乙醇（ 10 μ 1/枪加乙醇） 准备用于基因枪轰击。

采用 PDS-1000/He 基因枪（Bia-Rod 公司生产）轰击小麦幼胚诱导的愈伤组织。 选择 1100 Psi的可裂膜， 对材料进行轰击。 轰击后的愈伤组织继续在原渗透压培养 基上培养 16-18h， 然后转入不加筛选剂的 SD2培养基 （MM培养基也可） 中暗条件下 ( 26°C )恢复培养 2周。 2周后， 将愈伤组织转入第一次筛选培养基上（1/2MS+玉 米 素 0. 5mg/L+2%蔗糖 +双丙氨膦钠 3mg/L; 或 1/2 MS+ a_萘乙酸 lmg/L+ 6-糠氨基嘌吟 0. 5mg/L+2%蔗糖 +双丙氨膦钠 3mg/L也可） 在 24°C (每天光照 10h) 条件下筛选分化 培养 4周。待到愈伤组织分化出绿芽以后， 将分化的绿芽转入无激素培养基（1/2MS+ 双丙氨膦钠 4mg/L)上直到小苗伸长（光照与温度同前）， 待到小苗伸长到 l-2cm 时 (大概需要 4 周） ， 将抗双丙氨膦钠的再生植株移入壮苗培养基 （1/2MS+生长素 0. 5mg/L+多效唑 0. 5mg/L) 上壮苗， 再生植株生长到适宜大小 （苗高 6-8cm，根系较 好） 时移入营养钵中， 在 15°C左右光照培养， 待苗壮后置于温室。

将得到的阳性苗进行分子鉴定， 结果表明得到了转基因植株 （T。代） 。 1\代表示 T。代自交产生的种子及由它所长成的植株， T ₂ 代表示 1\代自交产生的种子及由它所长 成的植株， Τ ₃ 代表示 Τ ₂ 代自交产生的种子及由它所长成的植株， Τ ₄ 代表示 1~ ₃ 代自交产 生的种子及由它所长成的植株， Τ ₅ 代表示 Τ ₄ 代自交产生的种子及由它所长成的植株， Τ ₆ 代表示 Τ ₅ 代自交产生的种子及由它所长成的植株。

三、 转空载体对照植物的获得

用 PAHC25代替 pAHC25- 7¾ZWM ， 制备转空载体对照植株， 方法同步骤二。

四、 转基因植物的抗旱性

2008年 10月将转基因植株中的五个株系（08X10、 08X11、 08X24、 08X27、 08X51 ) 的 T ₆ 代植株、 转空载体对照植株的 Τ ₆ 代植株和济麦 19 (各 30株） 种植于大田， 2009年 测定抗旱指标。 脯氨酸含量的测定方法见文献： 张殿忠 汪沛洪 赵会贤， 测定小麦 叶片游离脯氨酸含量的方法 1990 (4) : 62〜65。 可溶性总糖含量的测定方法见文献： 邹 琦. 植物生理生化实验指导. 北京： 中国农业出版社， 1995。 过氧化物酶活性 ( POD酶活性）的测定方法见文献： 徐朗莱， 叶茂炳过氧化物酶活力连续记录测定法. 南京农业大学学报， 1989， 12 (3) : 82— 83. Chedf M, Aseel in A, Belenger R R. Defense response induced by soluble si l icon in cucumber roots infected by Pyshium spp. phytopathology， 1994， 84 : 236— 275。 光合速率 （SPAD值） 用 LI-6400便携式 光合作用测定仪测定。 设置三次重复实验， 结果取平均值。

结果见图 7。结果表明： 转基因植株的脯氨酸含量（图 7A)、可溶性总糖含量（图 7B) 、 过氧化物酶活性 （图 7C) 和光合速率 （图 7D) 均比济麦 19明显提高。 转空载 体对照植株的脯氨酸含量、 可溶性总糖含量、 过氧化物酶活性和光合速率与济麦 19 没有显著差异。

2008年 10月将转基因植株中的八个株系（08X6、 08X10、 08X11、 08X18、 08X24、

08X27、 08X28、 08X36 ) 的 ^代植株、 转空载体对照植株的 T ₆ 代植株和济麦 19 (各 30株） 种植于旱地。 2009年测定株高、 穗数、 株粒数、 株粒重、 千粒重等指标。 设 置三次重复实验， 结果取平均值。 结果见表 2。 结果表明： 与济麦 19相比， 转基因 植株的株粒重和千粒重明显提高； 转空载体对照植株的各个指标与济麦 19没有显著 差异。

表 2 转 DREB4基因小麦各品系主要性状值

五、 转基因小麦的耐病实例

2008年 10月将转基因植株株系 08X18的 代植株、 转空载体对照植株的 T ₆ 代植株 和济麦 19 (各 30株） 种植于大田， 2009年 2月移栽于温室、 3月底接种白粉病病原菌 Ε09 (北京地区流行的 15号小种， 其毒性谱： Virl, 3a, 3b, 3c, 3e, 5, 6, 7, 8, 17, 19； 购 自中国农业科学院植物保护研究所） 。 两周后观察并拍照， 同时进行抗病鉴定， 鉴 定方法见文献： 谢皓，陈孝，盛宝钦，辛志勇，孔凡晶，林志 珊，马有志，小麦新种质 YW243白粉病抗性鉴定和遗传分析，作物学报， 2001 27 (6)， 715-721。

结果见图 8。抗病性鉴定结果表明， 转基因植株叶片中， 单位面积的发病病斑数 明显小于济麦 19和转空载体对照植株，即转基因植株对白粉� ��病原菌的耐性增强了； 空载体对照植株的表型与野生型植株一致， 对白粉病病原菌的耐性没有显著差异。 工业应用

本发明的 7¾ZWM 在干旱、 高盐、 高温、 低温、 病原菌、 ABA、 乙烯、 JA、 SA 的诱导下表达， 并且可以特异的调控含有 DRE/CRT顺式元件 （核心序列： CCGAC) 的 基因的转录表达； 提高植物的抗旱性、 耐盐性、 耐高温性， 以及对白粉病病原菌的 抗性。 本发明的 7¾ZWM 为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了 基础， 将在 培育抗逆性和耐逆性增强的植物中发挥重要的 作用。