DESCRIPCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención está en el campo técnico de la obtención de proteínas de interés en un huésped, donde dicho huésped es una microalga eucaríota. Dicha microalga puede ser de un género de la división de las clorofitas. En concreto, la presente invención se refiere a un plásmido y la utilización de este plásmido en un procedimiento de expresión de una proteina en microalgas El plásmido comprende una fusión que comprende un gen que codifica para el péptido autohidrolizable FMDV 2A de Foot and mouth disease virus y el gen que codifica para la enzima aminoglicósido 3fosfotransferasa de Streptomyces rimosus (APHVIII).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las microalgas son un grupo heterogéneo de microorganismos, mayoritariamente fotosintéttcos, con gran importancia ecológica y con un enorme potencial biotecnológico, cuyo uso para la producción a gran escala de carotenoides, ácidos grasos poliinsaturados y otros compuestos de alto valor añadido está bien establecido. Más aún, en los últimos años, ha habido un creciente interés en las microalgas como posible materia prima para una tercera generación de biocombustibles de tercera generación con un balance neutro de carbono. Esto ha incrementado el interés sobre la ingeniería genética de microalgas como posible herramienta para conseguir la producción económicamente viable de materias primas y para aumentar la productividad de compuestos de alto valor añadido. Sin embargo la manipulación genética de microalgas ha estado hasta ahora limitada a un bajo número de especies.

Se estima que el número de especies de microalgas oscila entre 300.000 y un millón de especies, de las cuales aproximadamente 30.000 se han clasificado y estudiado y menos de 20 se han transformado genéticamente con éxito. La mayoría del trabajo sobre la manipulación genética se ha centrado en las especies clásicas como Chlamydomonas reinhardtii o Phaeodactyium tricomutum, que no son siempre las de mayor interés aplicado.

La falta de promotores endógenos y otras regiones regulatorias es uno de los principales problemas para la manipulación genética de nuevas especies de microalgas, pero incluso cuando se cuenta con esos elementos, la baja eficiencia y la inestabilidad en la expresión de los transgenes son todavía problemas usuales.

Los genes selectivos más utilizados en la manipulación de microalgas son los que confieren resistencia a antibióticos como bleomicina (BLE), streptomicina (AADA) y paromomicína {APHVIIl), o a herbicidas, como el gen acetoliasa sintasa (ALS), que confiere resistencia al herbicida silfonilurea, o el gen BAR que confiere resitencia al herbicida fosfinotricina (PPT). En cuanto a los promotores, su elección es, como se ha indicado, crítica para el desarrollo de un sistema de transformación eficiente. Promotores como el de la subunidad pequeña de la ribilosa bifosfato carboxilasa de Chlamydomonas (RbcS2) se han utilizado con éxito en Chlamydomonas y otras clorofitas como ChforeUa ellipsoidea o Volvox cateri.

La existencia de péptidos autoprocesables, como el péptido 2A del virus FMDV (foot and mouth desease virus) se conoce desde hace tiempo. El péptido, de tan solo 24 aminoácidos, se hidroliza espontáneamente por el enlace peptídico que une los aminoácidos Gly23 y Pro24. La posibilidad de utilizar este pequeño péptido FMDV 2A como una estrategia para expresar dos genes bajo el mismo promotor y luego gracias a su capacidad de autoprocesamiento obtener los dos productos góntcos independientes se ha utilizado en varios sistemas eucariotas como células de mamífero y plantas o en terapia génica.

Recientemente se ha demostrado su funcionamiento en microalgas (Rásala, B.A. et al. Robust expression and secretion of xylanasael in C. reinhardtii by fusión to a selection gene and processing with the FMDV 2A peptide. PLoS One 2012; 7(8): e43349). Este documento describe la fusión del gen de resistencia a bleomicina (BLE) con el gen de la xilanasa de Trichoderma reesei mediante el pequeño péptido autohidrolizable (FMDV 2A) y demostraron la obtención de las dos proteínas de forma independiente, la proteína de unión a bteomicina (BLE) y la xilanasa. Más aún, concluyen que ésta fusión permite obtener transformantes con altos niveles de xilanasa. Pero el antibiótico de selección que utilizan, bleomicina, tiene como principal inconveniente su alto poder mutagénico y bajas eficiencias de transformación.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

El problema en vista del estado de la técnica más cercano puede definirse como la aportación de un plásmido y procedimiento para transformar microalgas con alta eficiencia de transformación y expresar proteínas de interés en dichas microalgas. La solución a este problema consiste en proporcionar un plásmido y procedimiento definido por las reivindicaciones de la presente solicitud. En un primer aspecto, la presente invención proporciona un plásmido para expresar una protelna, que comprende un gen que codifica para dicha proteina y el cásete pHSP70A- RbcS2-6xHis-PLK-FMDV2A-APHVIII-3'UTR identificado por la secuencia SEQ ID NO: 1 , donde dicho cásete comprende:

- el promotor híbrido pHSP70A/RbcS2 de Chlamydomonas,

- la fusión del gen que codifica para el péptido autohidrolizable FMDV 2A de Foot and mouth disease virus y el gen que codifica para la enzima aminoglicósido 3fosfotransferasa de Streptomyces rimosus (APHVIII).

Un segundo aspecto es el primer aspecto de la presente invención, donde dicho plásmido está identificado por la secuencia SEQ ID NO: 2.

El plásmido del primer o segundo aspecto de la invención soluciona los problemas planteados en el estado de la técnica porque ofrece un procedimiento para la expresión de altas cantidades de la proteina de interés y mejor eficiencia de transformación.

El plásmido del primer o segundo aspecto de la invención contiene la fusión traduccional del gen de interés con el gen de resistencia a paromomicina, que carece de los efectos mutagénicos de otras antibióticos y permite, gracias al péptido autohidrolizable FMDV 2A, la obtención independiente de la proteina de interés y la proteína de resistencia a antibiótico.

Además, el plásmido del primer o segundo aspecto de la invención permite la fusión del péptido FMDV2A por el extremo amino de la aminoglicósido 3 ^' fosfotransferasa, con lo que se evitan las interferencias del pequeño fragmento resultante de la autolisis del péptido FMDV2A ejerce sobre la actividad antibiótica de la aminoglicósido 3 ^' fosfotransferasa.

El péptido FMDV 2A permite la autohidrólisis de las dos proteínas una vez formadas, a partir del mismo transcrito común, pero utiliza como gen seleccionable el gen APHVIII, que codifica la enzima aminoglicósido 3 ^' fosfotransferasa de Streptomyces rimosus y confiere resistencia al antibiótico paromomicina. Intentos previos para fusionar proteínas con gen APHVIII no han tenido éxito, ya que este gen parece perder su funcionalidad cuando se le adicionan póptidos al extremo carboxilo final. El plásmido del primer o segundo aspecto de la invención contiene el gen que codifica la enzima aminoglicósido 3'fosfotransferasa de Streptomyces rimosus (APHVIII), que confiere resistencia al antibiótico paromomicina, unido por su extremo amino terminal con una región de policlonaje a través de un péptido autohidrolizable, como el péptido FMDV 2A del foot and mouth desease virus.

Esto permite la inserción y expresión de forma coordinada con el gen de resistencia al antibiótico de cualquier gen de interés. Además precediendo a la región de poBclonaje hemos introducido un epitopo, fácilmente detectable mediante técnicas inmunoqufmicas, y todo el cassette está bajo el control del promotor híbrido el RbcS2/HSP70A de Chlamydomonas (Fig. 1 ; Fig. 2). La posición relativa de los promotores respecto al polilinker y todos los elementos del plásmido han sido optimizados, eliminando nucleótidos no necesarios, para mejorar la expresión y conseguir asi incrementar la eficiencia de la transformación hasta 3 veces con respecto a otros plásmidos que tienen el mismo promotor.

Como el gen de resistencia a antibiótico {APHVIII) y el gen de interés se expresan bajo el control del mismo promotor, el cribado con cantidades crecientes del antibiótico paromomicina proporciona un método sencillo para seleccionar los transformantes con más alto nivel de expresión del gen APHVIII y consecuentemente del gen de nuestro interés.

La presente invención evita el uso del gen BLE, de resistencia a bleomicina, que ha demostrado ser altamente mutagénico e introduce alteraciones no deseables a los transformantes aislados. Además la colocación de la región de policlonaje en el extremo amino soluciona los problemas para fusionar secuencias proteicas al extremo carboxilo de la proteina aminoglicósido 3'fosfotransferasa. Hemos podido comprobar que induso pequeños péptidos como el péptido autoprocesable FMDV 2A interfieren con la funcionalidad de la aminoglicósido 3'fosfotransferasa si estos son unidos a su extremo carboxilo terminal. En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de expresión de una proteina en microalgas, que comprende:

(a) transformar dicha microalga con un plásmido según la reivindicación 1 ó 2,

(b) expresar dicha proteina y la fusión del gen que codifica para el péptido autohidrolizable FMDV 2A de Foot and mouth disease virus y el gen que codifica para la enzima aminoglicósido 3'fosfotransferasa de Streptomyces rimosus (APHVIII), donde dicha proteina se separa de la enzima APHVIII tras autohidólisis del péptido autohidrolizable FMDV 2A. Un cuarto aspecto es el procedimiento del tercer aspecto de la invención, donde dicha microalga es es una microalga de un género de la división de las clorofitas.

Preferiblemente, dicha microalga es del género Chtamydomonas o Phaeodactytum.

Más preferiblemente, dicha microalga es Chtamydomonas reinhardtíi.

TEXTO LIBRE DE LA LISTA DE SECUENCIAS A continuación se aporta una traducción del texto libre en inglés que aparece en la lista de secuencias.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fioura 1. Representación esquemática del plásmido Phyco69 con indicación de los principales sitios de restricción

Figura 2. Detalle de los componentes principales del plásmido Phyco69 Figura 3. Comparación de la eficiencia del plásmido pSI103 (A) y Phyco69 (B). Primera fila, resultados utilizando 200 ng de cada plásmido. Segunda fila, resultados utilizando 500 ng de cada plásmido. Tercera fila, resultados utilizando 1 μg de cada plásmido. Figura 4. Representación esquemática del plásmido Phyco69-ARS, con indicación de los principales sitios de restricción.

Figura 5. Resultados de RT-PCR mediante inmunodetecáón con anticuerpos monodonales comerciales anti-poli Histidina-fosfatasa alcalina (SIGMA), que se unen a la protelna ARS2, con un peso molecular de 77425 daltons, y a la protetna fusión ARS2-APHVIII, con un peso molecular de 106,000 daltons.

MODOS DE REALIZACIÓN PREFERENTE EJEMPLO 1. Transformación de la mieroalga aucariota C. reinhardtii con el plásmido Phyco69

El plásmido para la expresión de proteínas exógenas en microalgas eucaríotas mediante fusión traduccional con el gen marcador seleccionable APHVIII se ha denonimado Phyco69.

En este ejemplo se describe la transformación de la mieroalga modelo Chlamyóomonas reinhardtii con el plásmido Phyco69 y la frecuencia de transformación observada para este plásmido en comparación con otros plásmidos que contienen el mismo gen marcador selectivo, como el pSI103

La estirpe 704 de Chlamyóomonas reinhardtii, que carece de pared celular, fue adquirida en el Culture Collection of Algae at the University of Texas (UTEX, Austin, TEX, USA) y mantenida en medio Tris-Acetato-Fosfato (TAP), preparado según descrito en Harris (2009). El plásmido Phyco69 y el plásmido pSI103 se conservaron en E. cotí con glicerol 15% a - 80"C para su mantenimiento y propagación. El plásmido pSI103 ha sido descrito en el documento Sizova, I. et al. A Streptomyces rimosus aphVIII gene coding for a new type phosphotransferase provides stable antibiotic resistance to Chlamydomonas reinhardtii. Gene 2001; 277: 221-229. Los plásmidos se obtuvieron a partir de las correspondientes bacterias por los clásicos métodos de aislamiento de ADN plasmldicos basados en separación con columnas de sílice.

Las células de C. remharütii se dejaron crecer hasta la mitad de la fase exponencial de crecimiento (alrededor de 1.6x10 ^a células mL ¹ ), fueron recogidas por centrifugación y resuspendidas en medio TAP fresco para obtener una suspensión celular 100 veces concentrada.

Cantidades crecientes, comprendidas entre 0,2 y 2 μς, de cada plásmido se añadieron a diferentes tubos de 15 mL con 0.6 mL de la suspensión celular concentrada 100 veces, 0.1 mL de PEG 8000 al 20% y 0,3 gr de perlas de vidrio. Cada tubo se agitó enérgicamente durante 8 segundos (el tiempo de agitación puede variar según la especies a transformar). Las células transformadas se resuspendieron en 50 mL de medio Tris Acetato fosfato (TAP) estéril y se incubaron toda la noche en la cámara de cultivo. Todo el proceso se llevó a cabo en esterilidad. Después de esta incubación en ausencia de antibiótico, el cultivo se recogió por centrifugación y las células precipitadas se resuspendieron en 0.8 mL de medio de cultivo y se inocularon en placas con medio TAP sólido y el correspondiente antibiótico, en este caso paromomicina (30 ml ^-1 ) Las colonias de microatgas transformadas son visibles tras 5-7 días de cultivo (Fig. 3).

El numero de transformantes obtenido para las distintas concentraciones de plásmido fue el indicado en la Tabla I

Tabla I. Frecuencia de la transformación de C. reinhardtii para distintas cantidades de plásmidos

Cada transformación se hizo por triplicado, siendo los valores indicados la media de tres repeticiones.

El número de transformantes obtenido para ambos plásmidos es mayor con mayores cantidades de ADN. En todos los casos el número de transformantes fue mucho mayor para el plásmido Phyco69, objeto de esta patente, obteniéndose frecuencias de transformación 3 veces superiores a las obtenidas con el plásmido estándar pSI103.

EJEMPLO 2. Clonación y expresión del gen ARS de Chlamydomonas nihmrdtii en la microalga eucaríota C. nmhardtii con el plásmido Phyco69

En este ejemplo se describe la clonación del gen ARS, que codifica la enzima arílsulfatasa, cuya actividad enzimática puede ser fácilmente ensayada con un substrato cromogénico en el plásmido Phyco69, objeto de esta patente y su expresión en la microalga modelo Chlamydomonas reinhardtü.

Se obtuvo un fragmento de ADN correspondiente al ARN mensajero del gen ARS de Chlamydomonas reinhardtü. El fragmento se diseñó para contener sitios de corte para las enzimas Xhol y Ndel y carecer de codón de parada. Además se diseñó para que al introducirlo entre los sitios de corte Xhol y Ndel del polilinker del plásmido Phyco69 quedara en la misma fase de lectura que el gen APHVIII.

El plásmido Phyco69-ARS se utilizó para transformar la microalga Chlamydomonas remhardtii estirpe 704, mediante el método de agitación con perlas de vidrio tal como se describe en el ejemplo anterior.

La estirpe 704 de Chlamydomonas remhardtii, que carece de pared celular, fue adquirida en el Culture Collection of Algae at the University of Texas (UTEX, Austin, TEX, USA) y mantenida en medio TAP.

Las células de C. reinhardtü se dejaron crecer hasta la mitad de la fase exponencial de crecimiento (alrededor de 1.6x106 células mL ^-1 ), fueron recogidas por centrifugación y resuspendidas en medio TAP fresco para obtener una suspensión celular 100 veces concentrada.

Aproximadamente 1 μg del plámido Phyco69-ARS se añadió a un tubo eppendorf que contenia 0 6mL de la suspensión celular concentrada, 0.1 mL de PEG 8000 y una pequeña cantidad de perlas de vidrio. El tubo se agitó enérgicamente durante 8 segundos. Las células transformadas se resuspendieron en 50 mL de medio Tris Acetato fosfato (TAP) estéril y se incubaron toda la noche en la cámara de cultivo. Después de esta incubación en ausencia de antibiótico, el cultivo se recogió por centrifugación y las células precipitadas se resuspendieron en 0.8 ml_ de medio de cultivo y se inocularon en placas con medio TAP sólido y el correspondiente antibiótico, en este se hicieron 4 reacciones de transformación que se plaquearon sobre placas con concentraciones de paromomtcina de 50, 100, 150 y 200 mL ¹ . Las colonias de microalgas transformadas son visibles tras 5-7 días de cultivo. El número de transformantes disminuía a medida que las concentraciones de antibiótico eran más restrictivas, se eligieron los dos transformantes que fueron aparecieron a mayor concentración de antibiótico. La correcta inserción tanto del gen selectivo, APHVIH, como del gen de nuestro interés ARS en el genoma se chequeó mediante PCR y su correcta transcripción y traducción se comprobó mediante RT-PCR a partir de RNA mensajero y mediante inmunodetección con anticuerpos monodonales comerciales anti-poli Histidia-fosfatasa alcalina (SIGMA), que se unen a la proteína ARS2, con un peso molecular de 77,425 daltons, y a la proteina fusión ARS2-APHVIII, con un peso molecular de 106,000 daltons (Fig. 4).