L'histamine est un médiateur proinflammatoire libéré par les mastocytes et les basophiles activés. Ce médiateur existe préformé dans des granules présent dans le cytoplasme de ces cellules et est libéré rapidement après activation. L'histamine est libérée en particulier lors de l'activation dépendante de l'IgE des mastocytes et des basophiles au cours des phénomènes allergiques. Elle participe aux manifestations cliniques associées à la réaction d'hypersensibilité immédiate telles que vasodilatation et sécrétion bronchique.

Récemment il a été observé que l'histamine présentait également des propriétés immunorégulatrices. L'histamine augmente la production d'IL-6 et d'IL-8 par les cellules endothéliales ainsi que la production d'IL-1 et d'IL-6 par les monocytes. Il a également été observé que l'histamine réduit la production d'IL-12 par les monocytes de patients atteints d'atopies (van der Pouw Kraan et al, J Clin Invest 1998 Nov 15 ; 102 (10) : 1866-73).

Les cellules dendritiques jouent un rôle dans le développement d'une réponse immune et dans l'initiation d'une réponse Iymphocytaire T spécifique (Steinman RM et al Immuno Rev (1997) 156,25 & Sella M et al Curr Opin Immunol (1997) 9,10).

Les cellules dendritiques immatures sont localisées dans les tissus non lymphoïdes. Au niveau de la peau, dans tous les épidermes hormis l'intestin, elles sont alors appelées cellules de Langerhans ; des cellules dendritiques, en plus faible quantité, sont aussi localisées dans les organes tels que le

poumon, le foie, l'intestin. Ces cellules dendritiques immatures captent et digèrent les antigènes de façon très efficace. Après une stimulation antigénique in vivo ou stimulation par des molécules proinflammatoires, les cellules dendritiques qui ont capté les antigènes migrent dans les organes lymphoïdes secondaires. Durant cette migration, les cellules dendritiques subissent des modifications fonctionnelles et phénotypiques qui sont regroupées sous le terme de maturation. Cette maturation se caractérise par une augmentation à la surface des CD de molécules impliquées dans l'activation des lymphocytes T (telles que CD40, CD54, CD58, CD86 et MHC classe I/II), la production de cytokines proinflammatoires (IL-1 et IL-6) et de chemokines (telles que TNFa, IL-8, MCP-1 et MIP-lalpha) et perdent leur capacité à processer 1antigène. Les chemokines recrutent des cellules inflammatoires et favorisent l'initiation d'une réponse immune. En particulier, l'IL-8, le MCP-1 et le MIP-lalpha attirent non seulement des cellules inflammatoires mais également des lymphocytes T naïfs et mémoires. Ainsi, les CD en sécrétant des chemokines augmentent leurs chances d'entrer en contact avec les lymphocytes T. Les cytokines proinflammatoires et en particulier l'IL-1 vont également agir en activant directement les CD.

La mise en place d'une réponse anticorps dirigée contre un antigène nécessite une série d'événements complexes. Elle met en jeu des cellules présentant l'antigène, des lymphocytes T régulateurs (Th pour T"helper") et des lymphocytes B producteurs d'anticorps. Deux types de lymphocytes Th peuvent tre distingués selon le profil de cytokines produites : lymphocytes Th de type 1 produisant de l'IFN-y et de l'IL-2 et favorisant la formation d'IgG2a chez la souris, et lymphocytes Th de type 2 produisant de l'IL-4, IL-5 et IL-10 avec formation d'IgGl chez la souris (Mosmann, T. R. and Sad S. Immunol. Today 1996,17 : 138). Par ailleurs, il a été montré que, pour un mme antigène donné, c'est l'adjuvant qui oriente vers l'isotype majoritaire lors de la réponse anticorps (Toellner K.-M. et al.

J. Exp. Med. 1998,187 : 1193). Ainsi, il est connu que les sels d'aluminium, comme l'Alhydrogel, induisent chez la souris une réponse essentiellement de type Th2 (Allison A. C. In Vaccine design-The role of cytokine networks Vol. 293,1-9 Plenum Press 1997).

Du fait de leur capacité à induire la polarisation des lymphocytes T naïfs en cellules effectrices Thl (producteurs d'IFNgamma) ou Th2 (producteurs d'IL4), les CD matures ont été appelées CD1 ou CD2 respectivement (Liu, YJ et al Curr. Top Microbiol Immunol 2000). Les CD myéloïdes peuvent se polariser en CD1 ou CD2 en fonction de la nature des facteurs de polarisation qui vont influencer la production d'IL12 (une cytokine à orientation Thl). Alors que l'IFNgamma induit la polarisation de CD en cours de maturation en CD1 (Hilkens, CM et al Blood 1997 ; Vieira, PL et al J Immunol 2000), la prostaglandine E2 (Kalinski P, et al J Immunol 1997 ; Kalinski P, et al J Immunol 1998), la toxine cholérique (Gagliardi MC, et al European J Immunol 2000), et 1'ATP (La Sala A, et al J Immunol 2001) favorisent le développement de CD2.

Ces cellules dendritiques matures présentent les antigènes aux lymphocytes T et initient les réponses T spécifiques de façon très efficace, les molécules de costimulation étant exprimées en quantité importante sur ces cellules. Les cellules en devenant matures perdent leur capacité à capter et processer, l'antigène. Dans les zones thymo- dépendantes des organes lymphoïdes, les cellules dendritiques qui ont migré ont acquis de puissantes propriétés immunostimulatrices et vont donc activer de façon très efficace les lymphocytes T naïfs circulants.

Les auteurs de la présente invention ont mis en évidence pour la première fois le lien entre l'histamine et la polarisation des cellules dendritiques. Plus particulièrement, ils ont démontré que l'histamine favorisait la polarisation des cellules dendritiques en cellules dendritiques de type CD2.

Cela est d'autant plus surprenant du fait que l'homme du métier ne peut distinguer les molécules favorisant une réponse Th2 agissant directement sur les cellules lymphocytes T naïfs ou agissant par l'intermédiaire des cellules dendritiques.

Dans la suite de la présente description, l'expression « histamine » sera utilisée pour nommer l'histamine, mais aussi les sels d'histamine tels que le dihydrochlorure d'histamine, l'histamine phosphate ou d'autres sels, esters ou précurseurs d'histamine et les agonistes des récepteurs (H1, H2, H3) de l'histamine. Le HTMT, l'Amthamine ou le Dimaprit, tout comme d'autres analogues ou agonistes des récepteurs de l'histamine décrits dans le brevet US 5,728,378 sont aussi compris dans le terme"histamine".

La présente invention concerne ainsi l'utilisation d'histamine et/ou d'agonistes des récepteurs de l'histamine pour induire la polarisation de cellules dendritiques, et plus particulièrement pour polariser les cellules dendritiques en cellules dendritiques de type 2.

La présente invention concerne plus particulièrement l'utilisation d'histamine et/ou d'agonistes des récepteurs de l'histamine pour la fabrication d'un médicament destiné à induire la polarisation des cellules dendritiques, préférentiellement en cellules dendritiques de type 2 (DC2).

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'histamine et/ou les agonistes des récepteurs de l'histamine selon l'invention peuvent servir à favoriser la polarisation des cellules dendritiques in vitro, les cellules matures polarisées pouvant ensuite tre réinjectées in vivo.

Dans un mode de réalisation encore plus préféré de l'invention ce médicament peut servir à favoriser la polarisation des cellules dendritiques in vitro, après mise en contact avec un agent biologique. Ainsi, l'invention concerne l'utilisation selon l'invention d'histamine et/ou d'agonistes des récepteurs de l'histamine et en outre d'au moins un agent

biologique pour la fabrication d'un médicament. Ce dernier pourra par exemple augmenter la réponse immunologique vis-à-vis de cet agent biologique.

Cet agent biologique peut tre choisi parmi les acides nucléiques, les protéines, les lipides, les lipopeptides ou les polysaccharides.

Il peut tre plus particulièrement choisi parmi les antigènes vaccinants et/ou les antigènes de bactéries, de virus, de levures, de parasites, de champignons.

Plus préférentiellement, l'agent biologique est un antigène tumoral. Au sens de la présente invention, un antigène tumoral est défini comme une protéine ou un peptide tumoral, et notamment comme un épitope, notamment un épitope CTL (séquences peptidiques interagissant avec les molécules de classe I et présentés aux lymphocytes T CD8+) ou comme la séquence nucléique codant pour de tels protéines, peptides ou épitopes. On peut citer à titre non limitatif les antigènes tumoraux suivants : MAGE-2, MAGE-3, MUC-1, MUC-2, HER-2, GD2, carcinoembryonic antigen (CEA), TAG-72, ovarian-associated antigens OV-TL3 et MOV18, TUAN, alpha-feto protein (AFP), OFP, CA-125, CA-50, CA- 19-9, renal tumor-associated antigen G250, EGP-40 (ou EpCAM), S100 (malignant melanoma-associated antigen), p53, prostate tumor-associated antigens (e. g., PSA and PSMA) et p21ras.

L'agent biologique peut encore tre choisi parmi un lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues. Au sens de la présente invention on entend par cellules tumorales autologues, des cellules de tumeurs appartenant au sujet qui va recevoir les compositions selon l'invention. Par cellules tumorales hétérologues, il faut comprendre des cellules issues de tumeurs provenant d'un individu différent de celui à qui la composition selon l'invention est destinée. L'utilisation de cellules hétérologues permet d'obtenir des compositions pharmaceutiques permettant notamment de traiter des patients atteints de cancer chez qui un prélèvement de cellules tumorales n'est pas possible. L'utilisation de cellules hétérologues

permet aussi d'obtenir des compositions selon l'invention standardisées comprenant des antigènes retrouvés dans de nombreux types de cancer et ainsi utilisables chez une majorité de patients.

Les cellules tumorales peuvent tre obtenues suite à un prélèvement de tissus cancéreux, par exemple suite à une biopsie ou résection chirurgicale. Ces cellules peuvent ensuite tre utilisées telles qu'elles ou tre mises en culture avant d'tre lysées. Un lysat cellulaire peut tre défini au sens de la présente invention comme un mélange d'antigènes intra- cellulaires et/ou membranaires, préférentiellement intra et membranaires. Ledit lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues selon l'invention peut-tre obtenu par une lyse mécanique, chimique ou enzymatique de cellules tumorales. Pour lyser les cellules de façon mécanique on peut notamment citer les techniques connues de l'homme de métier, à savoir notamment la sonication, l'ultrasonication ou la congélation/décongélation. On préfère tout particulièrement la congélation/décongélation, et tout particulièrement l'utilisation de plusieurs cycles de congélation/décongélation.

On peut aussi lyser les cellules en utilisant des composés chimiques ou des enzymes, comme par exemple un tampon de lyse à digitonine, du triton X-100 ou du Nonidet P40. Toute méthode permettant de rompre la membrane cellulaire des cellules de tumeurs pourra tre utilisée afin d'obtenir un lysat.

Les cellules dendritiques sont ainsi modifiées en utilisant ces antigènes ou lysats cellulaires de sorte qu'elles expriment des antigènes tumoraux. Ainsi, ledit médicament pourra tre injecté en mme temps que les cellules dendritiques ou de façon préférée ledit médicament pourra tre mis en oeuvre in vitro, afin de favoriser la polarisation des cellules dendritiques avant de les réinjecter aux patients.

Ainsi, grâce à leur efficacité à présenter les antigènes et à stimuler le système immunitaire, les cellules dendritiques

en présence d'histamine et/ou d'agonistes des récepteurs de l'histamine pourront tre utilisées pour générer des réponses CTL anticancéreuses (Nestle F. O. et al., 1998, Nat. Med., 4, 328-332). Cette approche, dénommée"ex vivo"consiste donc à charger les cellules dendritiques ex vivo avec l'antigène d'intért (peptides ou lysat cellulaire) en présence d'histamine et/ou d'agonistes des récepteurs de l'histamine et à réimplanter ces cellules chez le patient. Une étape de lavage des cellules dendritiques de manière à supprimer l'histamine et/ou les agonistes des récepteurs de l'histamine du milieu contenant les cellules dendritiques pourra tre effectuée avant de réimplanter ces cellules chez le patient.

Une autre approche selon l'invention consiste à transfecter ex vivo les cellules dendritiques avec le gène codant pour l'antigène d'intért et notamment avec un gène codant pour un antigènes de bactérie, de virus, de levure, de parasite, de champignon, ou pour un antigène tumoral, tels que ceux décrits ci-dessus, et/ou avec un gène codant pour une cytokine ou un facteur de croissance, tels que ceux décrits ci- dessous, et de mettre les cellules dendritiques, avant et/ou pendant et/ou après la transfection, en présence d'histamine et/ou d'agonistes des récepteurs de l'histamine et à réinjecter ces cellules transfectées (Gilboa E. et al., 1998, Cancer Immunol. Immunother., 46,82-87). Une étape de lavage des cellules dendritiques de manière à supprimer l'histamine et/ou les agonistes des récepteurs de l'histamine du milieu contenant les cellules dendritiques pourra tre effectuée avant de réimplanter ces cellules chez le patient. De telles approches ont été utilisées avec succès chez la souris et chez l'homme (Hsu F. J. et al., 1996, Nat. Med., 2,52-58).

Le médicament selon l'invention peut comprendre, dans un mode de réalisation préféré de l'invention, en outre un facteur de maturation des cellules dendritiques. Ce dernier pourra notamment tre choisi parmi les LPS, le TNFa, et tout composés

bactériens ou viraux induisant la maturation des cellules dendritiques immatures, tels que par exemple des LPS (lipopolysaccharides), des OmpA, des oligonucléotides ou du monophosphoril A.

On pourra notamment utilisé ce facteur de maturation préalablement à l'histamine, de manière à maturer les cellules dendritiques immatures. On pourra également, de façon préféré, utiliser simultanément l'histamine et le facteur de maturation pour maturer et polariser les cellules dendritiques.

Le médicament selon l'invention peut aussi comprendre en outre une cytokine ou un facteur de croissance, notamment l'interféron alpha ou gamma, le GM-CSF, l'IL-2, l'IL-12, l'IL-4, l'IL-6 et IL-18, une HSP (Heat Shock Protein) telle que par exemple l'hsp70, l'hsp90, l'hsp96, qui permet de potentialiser la réponse immunitaire ; et/ou des fibroblastes modifiés génétiquement de façon à relarguer une cytokine ou un facteur de croissance. On peut citer les fibroblastes exprimant du GM-CSF commercialisés par la société Immune Response Corporation.

L'histamine et/ou les agonistes des récepteurs de l'histamine avec au moins un agent biologique associé au TNF alpha peut tre utilisé pour la fabrication d'un médicament destiné à augmenter la prolifération des lymphocytes T.

Le médicament selon l'invention peut comprendre en outre un adjuvant permettant d'augmenter la réponse immunitaire, notamment choisi dans le groupe d'adjuvant comprenant le MPL-A, le Quil-A, l'ISCOM, les CpG, Leif, la CT (toxine cholérique) ou la LT (LT pour « Heat labile enterotoxin » entérotoxine labile à la chaleur), tout comme les versions détoxifiées de la CT ou la LT, ou des protéines membranaires bactériennes telles que les OMPC de Neisseria meningitidis (Vella et al., Infect. Immun. 60, 1992,4977-4983), TraT d'Escherichia coli (Croft et al., J.

Immunol. 146,1991,793-798) ou PorB de Neisseria meningitidis (Fusco et al., J. Infect. Dis. 175,1997,364-372), et préférentiellement une OmpA d'une bactérie du genre Klebsiella,

protéine majeure de la membrane externe baptisée P40, présentant une activité adjuvante pour des antigènes sous-unitaires peptidiques (WO 95/27787 et WO 96/14415 ; Haeuw et al., Eur. J.

Biochem. 255, 1998,446-454 ; Plotnicky-Gilquin et al., J.

Virol. 73, 1999,5637-5645).

Le médicament selon l'invention peut encore comprendre un milieu pharmaceutiquement acceptable. Au sens de la présente invention, le milieu pharmaceutiquement acceptable est le milieu dans lequel les composés de l'invention sont administrés, préférentiellement un milieu injectable chez l'homme. Il peut tre constitué d'eau, d'une solution aqueuse saline ou d'une solution aqueuse à base de dextrose et/ou de glycérol.

Le médicament selon l'invention peut en outre tre véhiculé sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité ; ainsi, il peut tre véhiculé sous forme de liposomes, virosomes, nanosphères, microsphères ou microcapsules. Le médicament ou l'association d'histamine et/ou d'agonistes des récepteurs de l'histamine-agent biologique pourra aussi se présenter sous une forme facilement administrable telle qu'une pommade, une lotion, une solution ou encore sous forme d'une composition adhésive : emplâtre ou « patch ».

Le médicament selon l'invention pourra tre utilisé notamment pour le traitement : - des infections microbiennes, en particulier les infections de type chronique associées au développement d'une réponse immune spécifique inefficace (virus : par exemple le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), les virus hépatiques, en particulier les virus hépatiques A, B, C et D et le parainfluenza virus, bactéries, parasites et levures), - des cancers, en particulier chez les sujets porteurs du VIH et/ou atteints de myélomes, lymphomes, leucémies, mélanomes, carcinomes, du rein, du cerveau, de la prostate, du

rectum, du pancréas, des ovaires, du poumon, de la remise, par exemple.

Comme décrit ci dessus, l'invention concerne particulièrement l'immunothérapie cellulaire utilisant des vaccins anti-cancéreux et anti-infectieux en particulier, en générant in vitro des cellules dendritiques autologues polarisées, en y introduisant un antigène tumoral et en les réinjectant après une étape de lavage facultative. L'exposition des cellules dendritiques in vitro à l'histamine et/ou aux agonistes des récepteurs de l'histamine et facultativement à un facteur de maturation, permettra d'augmenter la polarisation des cellules dendritiques et donc d'augmenter l'efficacité du vaccin.

Aussi, la présente invention concerne particulièrement l'utilisation selon l'invention d'histamine et/ou d'agonistes des récepteurs de l'histamine pour la préparation d'un médicament pour augmenter la réponse immunologique vis-à-vis d'un agent biologique tel que défini ci dessus. Ce médicament peut tre un vaccin pour le traitement ou la prévention des maladies infectieuses d'origine virale-comme notamment le VIH, les virus hépatiques et le parainfluenza virus-, bactérienne, fongique, ou provoquées par une levure ou un parasite.

La présente invention concerne encore l'utilisation selon l'invention d'histamine et/ou d'agonistes des récepteurs de l'histamine avec au moins un agent biologique pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention des cancers et particulièrement des cancers parmi les myélomes, lymphomes, leucémies, carcinomes du rein, du cerveau, de la prostate, du rectum, du pancréas, des ovaires, du poumon, et pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention des cancers cutanés choisi parmi les kératinomes et les carcinomes.

Comme décrit ci dessus le traitement de ces cancers peut aussi tre envisagé en injectant des cellules dendritiques

autologues, et notamment des cellules dendritiques autologues qui ont été modifiées afin d'exprimer des antigènes tumoraux. La polarisation des cellules dendritiques sera assurée par l'histamine et/ou les agonistes des récepteurs de l'histamine.

Si l'on utilise des cellules dendritiques immatures, on pourra utiliser en outre un facteur de maturation.

L'invention a encore pour objet l'utilisation d'histamine et/ou d'agonistes des récepteurs de l'histamine pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre des pathologies associées à une réponse Thl excessive.

Comme exemples de telles pathologies, on peut particulièrement citer la thyroïdite d'Hashimoto, la sclérose en plaques, le diabète de type I, le rejet de greffe, la maladie de Crohn, l'arthrite rhumatoïde, la sarcoïdose et les maladies auto-immunes. Certaines immunothérapies à base de DC2 sont plus particulièrement envisagées dans l'article de Yong-Jun et al, Blood, 15 avril 2000, volume 95, number 8,2482-2483.

L'invention concerne encore l'utilisation d'histamine et/ou d'agonistes des récepteurs de l'histamine pour induire in vitro la polarisation de cellules dendritiques, et plus particulièrement pour polariser les cellules dendritiques en cellules dendritiques de type 2.

Dans un mode de réalisation de l'invention particulièrement préféré, on utilise en outre de l'histamine et/ou d'agonistes des récepteurs de l'histamine un facteur de maturation, pour induire in vitro la polarisation de cellules dendritiques, et plus particulièrement pour polariser les cellules dendritiques en cellules dendritiques de type 2.

L'invention a encore pour objet un dispositif pour la polarisation des cellules dendritiques,'tel que par exemple un kit, comprenant au moins de l'histamine et/ou des agonistes des récepteurs de l'histamine.

Dans un mode de réalisation de l'invention particulièrement préféré, le dispositif pour la polarisation des cellules dendritiques, tel que par exemple un kit, comprend en outre un facteur de maturation.

Ce kit pourra tre adapté pour la polarisation des cellules dendritiques in vitro et pourra tre utilisé par exemple dans les laboratoires de recherche. Ce kit peut contenir en outre de l'histamine et/ou des agonistes des récepteurs de l'histamine un facteur de maturation, des cellules dendritiques immatures et/ou les moyens nécessaires à isoler des cellules dendritiques immatures, tels que par exemple des moyens de purification de cellules mononucléaires sanguines. Il pourra ainsi comprendre par exemple de l'histamine et/ou des agonistes des récepteurs de l'histamine, un facteur de maturation, différents milieux de culture, des solutions de lavage, des plaques de culture, des réactifs, des contrôles tels que par exemple des anticorps, et une notice explicative pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention de maturation des cellules dendritiques.

Un kit selon l'invention pourra aussi tre adapté à la mise en oeuvre de la méthode thérapeutique ci-dessus mentionnée.

Ce kit peut contenir en outre de l'histamine et/ou des agonistes des récepteurs de l'histamine, un facteur de maturation, des cellules dendritiques immatures et/ou les moyens nécessaires à isoler des cellules dendritiques immatures, tels que par exemple des moyens de purification de cellules mononucléaires sanguines.

Il pourra ainsi comprendre par exemple de l'histamine et/ou des agonistes des récepteurs de l'histamine, un facteur de maturation, différents milieux de culture, des solutions de lavage, des plaques de culture, des réactifs, des contrôles, et une notice explicative pour la mise en oeuvre de la méthode thérapeutique ci-dessus mentionnée. Le cas échéant il pourra encore contenir des antigènes hétérologues ou des moyens pour obtenir un lysat de cellules autologues.

Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Ces exemples démontrent l'action de l'histamine sur les cellules dendritiques : l'histamine induit la maturation des cellules dendritiques humaines immatures et leur confère de puissantes propriétés stimulatrices et présentatrice d'antigène.

Dans ces exemples, on se référera aux figures suivantes : Figure 1 : L'histamine prévient la production d'IL12 par les CD matures.

A&B : la maturation des CD est induite par 10 ng/ml de LPS, en l'absence ou présence de doses croissantes d'IFNg et/ou histamine. Après 48 heures les CD matures sont stimulées avec du CD40 ligand soluble (A) ou LPS + IFNg (B). La concentration d'IL12 p70 dans les surnageants a été mesurée par ELISA après 24 heures. Les résultats sont représentatifs d'une expérience parmi 3.

C : des CD immatures ont été incubées du LPS (10 ng/ml) + de l'IFNg (100 ng/ml) et traitées ou non avec de l'histamine (10-5 M), des antagonistes des récepteurs H1, H2 ou H3 (Mepyramine, cimetidine, et thioperamide, respectivement) (tous à 5x10-5 M) 1 heure avant l'addition d'histamine (10-5 M), ou ont été traitées avec des agonistes des récepteurs H1 et H2 (HTMT et Amthamine, respectivement) (10-5 M). Après 2 jours les CD matures ont été restimulés par du LPS + de l'IFNg et la production d'IL12 p70 a été dosée. Les résultats sont exprimés en pg/ml comme la moyenne SD de quatre expériences.

Figure 2 : l'histamine est un facteur de polarisation des CD vers les CD2.

Les lymphocytes T naïfs (CD4+ CD45Ra+) ont été cultivées pendant 5 jours avec les CD allogéniques matures. La maturation de ces CD a été induite par un traitement de 2 jours avec du LPS (10 ng/ml), LPS (10 ng/ml) + INFg (100 ng/ml), LPS (10 ng/ml) +

histamine (10-5 M), ou LPS (10 ng/ml) + INFg (100 ng/ml) + histamine (10-5 M). Après une expansion induite par l'IL2, les lymphocytes T ont été stimulées avec PMA + ionomycine pendant 5 heures et la production d'IL4 et d'IFNg a été évaluée par FACS, après marquage intracellulaire. Le pourcentage de cellules positives est indiqué dans chaque cadran. Les données sont représentatives parmi 3.

Exemple 1 L'histamine diminue la capacité des cellules dendritiques en cours de maturation à produire de l'IL12 après restimulation et ceci mme en présence d'IFNy.

1/Matériels et Méthodes Les cellules dendritiques humaines sont générées à partir de monocytes isolés du sang périphérique. Le sang est prélevé par leucophérèse en présence d'anticoagulant comme par exemple l'héparinate de lithium. Les cellules mononucléées (CMN) sont isolées de sujets sains par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque (densité=1, 077) (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suède). Brièvement, les cellules du sang sont centrifugées à 1500 rpm pendant 30 minutes à température ambiante. Les CMN, localisées à l'interface Ficoll-plasma, sont récupérées et lavées deux fois en présence de milieu RPMI 1640 (Life technologies, Cergy Pontoise, France). Les monocytes sont purifiés par sélection positive en utilisant un séparateur magnétique de cellules (MACS ; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne) en accord avec les instructions du fabriquant. Brièvement, les CMN sont incubées pendant 20 minutes à 4°C avec des billes magnétiques sur lesquelles sont fixées un anticorps monoclonal anti-CD14 humain. Après lavage, la suspension cellulaire plus billes est déposée sur une colonne et soumise à un champ magnétique. Après trois lavages, la colonne n'est plus soumise au champ magnétique et les monocytes sont

collectés par gravitation. La pureté des monocytes est évaluée par cytofluorométrie (cytofluoromètre FACScan ; Becton Dickinson, Erembodegem, Belgique) sur la base des paramètres taille-granulosité des cellules. La pureté est supérieure à 98%.

Les monocytes sont ensuite mis en culture à la concentration de 106 cellules/ml dans le milieu suivant (dénommé par la suite milieu de culture complet) : milieu RPMI 1640 supplémenté de 10% de sérum de veau foetal (chauffage à 56°C pendant 30 minutes), 2 mM de L-glutamine, 50 U/ml de pénicilline et 50 ug/ml de streptomycine (Life technologies) dans des plaques de culture 6 puits (Nunc, Roskilde, Danemark) à raison de 5 ml de milieu par puits. Les cellules sont activées avec 20 ng/ml d'IL-4 humaine recombinante et 20 ng/ml de GM-CSF humaine recombinante (R&D Systems, Abingdon, Royaume Uni). Après 5 à 7 jours de culture (37°C, 5% CO2 en atmosphère humide), le phénotype des cellules est défini par cytofluorométrie. Brièvement, un aliquot de la suspension cellulaire est prélevé. Les cellules sont lavées dans du tampon FACS (tampon phosphate 10 mM pH 7,4 contenant 1 % de sérum albumine bovine et 0,01% d'azide de sodium) puis réparties dans des puits d'une plaque de culture 96 puits à fond conique (Nunc) à raison de 2x104 cellules dans un volume de 50 ul de tampon FACS. Dans chaque puit est ajouté soit un anticorps anti- CDla humain marqué à la fluorescéine (Becton Dickinson) soit un anticorps anti-CD83 humain non marqué révélé par un anticorps anti-immunoglobuline de souris marqué à la fluorescéine (Becton Dickinson). Après 20 minutes d'incubation à 4°C, les cellules sont lavées trois fois avec 200 ul de tampon FACS puis sont remises en suspension dans 200 pl de ce mme tampon. L'analyse de l'expression de CDla versus CD83 est évaluée par FACS. Seules les cellules dendritiques immatures caractérisées par une expression de la molécules CDla (intensité moyenne de fluorescence (IMF) >100) et l'absence d'expression de la molécule CD83 ont été utilisées.

Après 7 jours, les CD immatures ont été stimulées avec du LPS (de Escherichia coli isotype OUI : B4, Sigma, Saint Louis, MO) seul, ou en combinaison avec de l'IFNg (R&D Systems, Abingdon, UK) et ou histamine (Sigma). Après 2 jours, les CD matures ont été lavées et recultivées à 105 cellules/200 ul/puits dans des plaques de cultures 96 puits et ont été ou non stimulées avec 5 ug/ml de CD40 ligand soluble recombinant (Peprotech, Rocky Hill, NJ) ou avec du LPS (10 ng/ml) + IFNg (100 ng/ml). Après 24 heures, l'IL12 a été dosée dans les surnageants par ELISA (R&D Systems ; sensibilité 0.5 pg/ml) les résultats sont exprimés en pg/ml comme la moyenne SD de quatre expériences 2/Résultats La maturation des cellules dendritiques est induite par une incubation de 2 jours avec du LPS en présence ou en l'absence d'IFNg et ou d'histamine.

Comme décrit précédemment (Vieira et al JI 2000) les CD maturées avec le LPS produisent de faibles taux d'IL12 après stimulation avec du CD40 ligand ou avec LPS +IFNg.

Comme décrit précédemment (Vieira et al JI 2000) l'ajout d'IFNg génère des CD matures produisant de forts taux d'IL12 après restimulation.

Nos résultats montrent que quelque soit la concentration d'IFNg utilisée, l'histamine prévient la capacité des CD restimulées (par CD40 ligand ou par IFNg + LPS) à produire de l'IL12.

Exemple 2 L'effet inhibiteur de 1'histamine sur la production d'IL12 par les CD est médiée par les récepteurs H1 et H2.

1/Matériel et Méthodes Les CD ont été générées et stimulées comme précédemment avec la modification suivante :

- dans certaines expériences les CD ont été préincubées pendant 1 heure avec des antagonistes des récepteurs H1, H2 et H3 (mepyramine, cimetidine et thioperamide, respectivement) utilisés à 10-5 M avant ajout de l'histamine - dans d'autres expériences les CD ont été incubées non avec de l'histamine ou des agonistes des récepteurs H1 et H2 (HTMT dimaléate et amthamine dihydrobromide, respectivement) (les 2 commercialisés par Biomol, Plymouth Meeting, PA).

2/Résultats Les résultats montrent que l'effet inhibiteur de l'histamine sur la production d'IL12 est médiée par les récepteurs H1 et H2 mais pas H3.

En effet les antagonistes H1 et H2 inhibent l'effet de l'histamine : de plus ces résultats sont confirmés par le fait que les agonistes des récepteurs H1 et H2 miment l'effet inhibiteur de l'histamine sur la production d'IL12.

Exemple 3 L'histamine polarise les CD en cours de maturation vers les CD2 et ceci mme en présence d'IFNy.

1/Matériel et Méthodes Les CD ont été générées et stimulées comme précédemment.

Les lymphocytes T ont été préparés et stimulés de la façon suivante. Après rosetting et déplétion des lymphocytes T CD8+, les lymphocytes T naifs CD4+ CD45RA+ ont été purifiés par MACS (Miltenyi biotec, Bergisch Gladbach, Germany) par sélection positive.

Les lymphocytes T naifs purifiés (5x104) ont été cultivées des CD allogéniques irradiées (2x104) dont la maturation a été induite par du LPS (10 ng/ml), LPS (10 ng/ml) plus IFNg (100 ng/ml), LPS (10 ng/ml) + histamine (10-5 M) ou LPS (10 ng/ml) + IFNg (100 ng/ml) + histamine (10-5 M).

Après 5 jours, 50 U/ml d'IL2 humaine recombinante (R&D systems) ont été ajoutés et les cultures ont été maintenues pendant 7 jours. Puis les lymphocytes T ont été lavés et restimulés avec 10 ng/ml de PMA (Sigma) + 1 pg/ml d'ionomycine (Calbiochem, San Diego, CA) pendant 5 heures.

De la brefeldine A (10 ug/ml, Sigma) a été ajoutée pendant les 2 dernières heures de culture.

Les cellules ont ensuite été fixées, permabilisées et marquées avec un mAb anti-IFNg couplé FITC (Pharmingen, San Diego, CA) et avec un mAb anti-IL4 couplé PE (BD biosciences, Franklin Lakes, NJ), puis analysées avec un FACScan (Beckton Dickinson) 2/Résultats Comme attendu (Vieira et al JI 2000), les lymphocytes T naïfs stimulées avec des CD maturées en présence de LPS se différencient en ThO, caractérisés un faible pourcentage de cellules produisant de l'IL4 et de l'IFNg.

Les résultats montrent que l'addition d'histamine durant la maturation des CD génère des CD2 qui favorisent le développement de lymphocytes de type Th2, caractérisés par une augmentation du pourcentage de cellules productrices d'IL4 et une diminution du pourcentage de cellules productrices d'IFNg.

Comme attendu (Vieira et al JI 2000), les lymphocytes T stimulées par les CD maturées en présence de LPS et d'IFNg se différencient en Thl, caractérisés par un important pourcentage de cellules produisant de l'IFNg et un très faible pourcentage de cellules produisant de l'IL4.

Les résultats montrent que l'ajout d'histamine en plus du LPS et de l'IFNg à des CD immatures conduit à la génération de CD matures de type CD2 : en effet, après addition d'histamine, on observe une diminution du pourcentage de cellules produisant de l'IFNg.

Ainsi l'ajout d'histamine au cours de la maturation des CD conduit à des CD2 qui induisent la différenciation de lymphocytes T naïfs en lymphocytes effecteurs de type Th2. Ceci est observé mme en présence d'IFNg, un puissant facteur de polarisation Thl.