[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Prophylaxe und Behandlung eines Melanoms und einer Vorstufe hiervon sowie einer Haut- und Schleimhautmetastase und damit zusammenhängende Verwendungen und Verfahren.

[0002] Das maligne Melanom ist ein hochgradig bösartiger Tumor der Pigmentzellen, der sog. Melanozyten. Er neigt dazu, früh Metastasen über Lymph- und Blutbahnen zu streuen und ist die am häufigsten tödlich verlaufende Hautkrankheit mit einer weltweit stark steigenden Anzahl an Neuerkrankungen.

[0003] Das Melanom entwickelt sich meist aus einer Vorstufe. Dieser Zellverband enthält bereits Melanomzellen, die jedoch örtlich auf die oberste Gewebsschicht begrenzt sind. Man spricht auch von einem Melanoma in situ. Eine der Vorstufen des malignen Melanoms wird als Lentigo maligna bezeichnet.

[0004] In der Literatur werden zumindest fünf verschiedene Subtypen des malignen Melanoms unterschieden. Die häufigste Form ist das superfiziell spreitende Melanom (SSM). Die aggressivste Form des malignen Melanoms mit der ungünstigsten Prognose ist das noduläre maligne Melanom (NMM). Weitere Subtypen sind das Lentigo- Maligna-Melanom (LMM), das akrolentiginöse Melanom (ALM) und das amenalotische Melanom (AMM). [0005] Melanome können in unterschiedlichste Organe metastasieren, bevorzugte Zielorgane wie bei anderen Tumoren gibt es nicht. Häufig sind Metastasen in der Leber, in der Haut, in der Lunge, im Skelett und im Gehirn zu finden.

[0006] Unter einer Hautmetastase, die auch als sekundärer Hautkrebs oder metastatischer Hautkrebs bezeichnet wird, versteht man eine lymphogene oder hämato- gene Absiegelung von primären Hautmalignomen oder Tumoren anderer Organe in der Haut. Als verursachende Primärtumoren kommen nach abnehmender Häufigkeit vor allem das maligne Melanom, Mammakarzinom, Magenkarzinom, Uteruskarzinom, Bronchialkarzinom, Rektumkarzinom oder Nierenkarzinom in Frage. Sie können überall auf der Körperoberfläche auftreten, bevorzugt auf der Bauchwand, dem Rumpf und Kapillitium.

[0007] Die wichtigste Form der Therapie des Melanoms ist nach wie vor die chirurgische Entfernung des Primärtumors und Exzision der Metastasen. Nur eine frühzeitige und vollständige Entfernung des Primärtumors kann zur Heilung führen. In späteren Stadien, wenn der Tumor bereits Metastasen in der Haut, Lymphknoten und inneren Organen gebildet hat, ist die Chance auf eine Heilung gering. Hier werden eine ganze Reihe von Therapiealternativen angewendet und erprobt, die in der Regel nur eine zeitweilige Besserung bieten, jedoch meist keine Aussicht auf Heilung haben. Hierzu gehören die Chemotherapie mit DTIC oder Fotemustin, eine Impftherapie mit Antigen präsentierenden Zellen, chirurgische Eingriffe zur Verringerung der Tumormasse oder eine Strahlentherapie. Neuere Therapieansätze beruhen auf der Blockade molekularer Prozesse in der Signaltransduktion der Zelle. Dabei werden beispielsweise Kombinationen eines klassischen Chemotherapeutikums mit b-RAF-Kinase-lnhibitoren wie Sorafenib eingesetzt.

[0008] Eine häufige Behandlungsform von Hautmetastasen ist ferner die in- traläsionale Unterspritzung mit lnterleukin-2 (IL-2).

[0009] Die chirurgische Entfernung des Melanoms, dessen Vorstufen oder Metastasen ist nicht immer durchführbar. Der Eingriff ist außerdem belastend für den Patienten, postoperativ schmerzhaft sowie zeitlich und logistisch aufwändig, besonders bei langen Anfahrtswegen in die Klinik oder kritischem Allgemeinzustand des Patienten. Ferner ist der Eingriff mit Narbenbildungen verbunden und birgt allgemein das Risiko von Wundinfekten.

[0010] Die intraläsionale Unterspritzung von IL-2 weist ebenfalls gravierende Nachteile auf. Sie muss experimentell unter Studienbedingungen über einen längeren Zeitraum dreimal wöchentlich in einem Hautzentrum durchgeführt werden. Neben dem hohen Aufwand und damit verbundenen Kosten ist diese Behandlungsoption oft mit schweren, teilweise systemischen Nebenwirkungen vergesellschaftet. Die Applikation an sich ist schmerzhaft und birgt das Risiko von Hautinfektionen. Darüber hinaus ist die IL-2- Untersprizuung nur für Hautmetastasen von < 5mm Durchmesser geeignet und zeigt nur moderate Ansprechraten.

[0011] Aufgrund der stark ansteigenden Anzahl von Neuerkrankungen und der bislang nicht zufriedenstellenden Therapieansätze besteht ein großer Bedarf an neuen Behandlungsoptionen.

[0012] Vor diesem Hintergrund ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, mit der ein Melanom und eine Melanomvorstufe sowie eine Haut- und Schleimhautmetastase eines beliebigen Primärtumors behandelt bzw. diesen vorgebeugt werden kann.

[0013] Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gelöst, die als Wirkstoff ein Prenylflavonoid, vorzugsweise Prenylnar- ingenin (PN) aufweist.

[0014] Prenylflavonoide gehören zu der Gruppe der Flavonoiden, einer großen Gruppe von niedermolekulargewichtigen polyphenolischen Verbindungen. Flavonoide werden in Pflanzen gefunden und bestehen aus Flavonen, Flavonolen, Flavononen, Flavan-3-olen und Anthocyaninen. Diese sekundären Pflanzenmetabolite spielen eine Rolle in der Abwehr der Pflanze gegen Mikroorganismen oder Pilzen und dem Schutz vor oxidativem Stress. [0015] Ein wichtiger Vertreter der Prenylflavonoide ist das Prenylnaringenin

(PN).

[0016] Es versteht sich, dass die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung eine pharmazeutisch akzeptable Formulierung aufweisen kann. Pharmazeutisch akzeptable Formulierungen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Beispielhaft wird auf die Abhandlung von Kibbe A. (2000), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Auflage, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press, verwiesen. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann ferner Zusätze enthalten. Diese umfassen jedwede Verbindung oder Zusammensetzung, die für die erfindungsgemäße Verwendung vorteilhaft sind, worunter Salze, Bindemittel, Lösungsmittel, Dispersionsmittel und weitere in Zusammenhang mit der Formulierung von Arzneimittel üblicherweise verwendete Stoffe fallen.

[0017] Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.

[0018] Nach einer erfindungsgemäßen Weiterentwicklung weist die pharmazeutische Zusammensetzung 6-Prenylnaringenin (6-PN) und/oder 8-Prenylnaringenin (8-PN) auf.

[0019] 6-PN und 8-PN sind sog. Prenylflavonoide. Diese finden sich in niedrigen Konzentrationen bspw. im Hopfen und in Bier. Die Struktur dieser Klasse von

Flavonoiden leitet sich vom 2-Phenylchrom-4-on ab. 6-PN und 8-PN sind Isomere. Der Unterschied liegt in der Position der aus fünf Kohlenstoffatomen bestehenden Pre- nylgruppe. 6-PN und 8-PN sind Produkte einer Ringschlussreaktion eines gemeinsamen Vorläufermoleküls, Desmethylxanthohumol, einem Polyphenol, das auf der Struktur von 1 ,3-Diphenyl-2-Propen-1 -on basiert. Beide Moleküle existieren als Enantiomere (R, S).

[0020] 8-PN weist eine starke Bindeaffinität zu Östrogenrezeptoren des Rattenuterus auf und ist als potentes Phytoestrogen aufgrund einer charakteristischen Beab- standung der Hydroxylgruppen identifiziert worden, die Beta-Estradiol imitieren; vgl. Milligan et al. (1999), Identification of potent phytoestrogen in hops (Humulus lupulus L.) and beer, J. Clin. Endocrinol. Metab. 84, 2249-2252.

[0021] Neben den antioxidativen Eigenschaften zeigen einige Flavonoide auch Antikrebseigenschaften; vgl. Hodek et al. (2002) Flavonoids-potent and versatile biologi- cally active Compounds interacting with cytochromes p. 450, Chem. Biol. Interact. 139, 1 - 21 ; Son et al. (2007) Pomiferin, histone deacetylase inhibitor isolated from fruits of Maclu- ra pomifera, Bioorg. Med. Chem. Lett, Vol. 17(17), 4753-4755; Cidade et al. (2001 ) Artelastocarpin and carpelastofuran, two new flavones, and cytotoxicities of prenyl flavo- noids from Artocarpus elasticus against three Cancer cell lines, Planta. Med. Vol. 67(9), 867-870; Kuete et al. (201 1 ), Cytotoxicity and mode of action of four naturally occuring flavonoids from the genus Dorstenia: gancaonin Q, 4-hydroxylonchocarpin, 6- prenylapigenin, and 6,8-diprenyleriodictyol, Planta. Med. Vol. 77(18), 194-1989 (abstract).

[0022] 8-PN inhibiert die Angiogenese, induziert durch den basischen Fib- roblastenwachstumsfaktor und vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor, in einem dreidimensionalen Collagengel in vitro und in Chorioallantoismembran assays in vivo; vgl. Pepper et al. (2004), 8-Prenylnaringenin, A novel phytoestogen, inhibits angiogenesis in vitro and in vivo, J. Cell Physiol. 199, 98-107.

[0023] 8-PN imitiert die Wirkungen von 17ß-Estradiol auf den Brustkrebszellen MCF-7; vgl. Rong et al. (2001 ), 8-Prenylnaringenin, the phytoestrogen in hops and beer, upregulates the function of the e-cadherin-/catenin complex in human mammary Carcinoma cells, Eur. J. Cell Biol. 80, 5 580-585.

[0024] 8-PN induziert ferner die Apoptose in MCF7-Zellen und in einer gegen eine Vielzahl von Wirkstoffen resistenten Leukämieblaste; vgl. Bruneiii et al. (2007), 8- Prenylnaringenin, inhibits estrogen receptor-α mediated cell growth and induces apoptosis in MCF-7 breast Cancer cells, J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 107, 140-148, und Diller et al. (2007), Ability of prenylflavanones present in hops to induce apoptosis in a human Burkitt lymphoma cell line, Planta Med. 73, 755-761. [0025] Vor Kurzem wurde ferner die Inhibition des P-Glycoproteins, dem mit einer Multiresistenz assoziierten Transporterprotein, und die Inhibition von MRP1 durch 8- PN beschrieben; vgl. Wesolowska et al. (2010), 8-Prenylnaringenin is an inhibitor of multidrug resistance-associated transporters, P-glycoprotein and MRP1 , Eur. J. Pharma- col. 644, 32-40.

[0026] Ferner inhibiert 8-PN direkt die Aktivierung des PI (3) K/Akt-Signalweges in MCF-7-Zellen in vitro; Bruneiii et al. (2009), 8-Prenylnaringenin inhibits epidermal growth factor-induced MCF-7 breast cancer cell proliferation by targeting phosphatidylino- sitol-3-ΟΗ kinase activity, J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 1 13, 163-170.

[0027] 6-PN und 8-PN zeigen antiproliferative Wirkungen auf die humanen Prostatakrebszelllinien PC-3 und DU 145 in vitro; Delmulle et al. (2006), Anti-proliferative properties of prenylated flavonoids from hops (Humulus lupulus L.) in human prostate Cancer cell lines, Phytomedicine 13, 732-734. Dies erfolgt in Abwesenheit einer Caspase- 3-Aktivierung und typischen apoptotischen morphologischen Merkmalen; Delmulle et al. (2008), Treatment of PC-3 and DU 145 prostate Cancer cells by prenylflavonoids from hop (Humulus lupulus L.) induces a caspase-independent form of cell death, Phytother. Res. 22, 197-203.

[0028] Die Eignung von 6-PN und 8-PN zur Prophylaxe und Behandlung eines Melanoms oder einer Vorstufe hiervon sowie einer Haut- oder Schleimhautmetastase eines beliebigen Primärtumors ist im Stand der Technik bislang nicht beschrieben oder nahegelegt. Dies liegt auch daran, dass die genauen zellulären Mechanismen von 6-PN und 8-PN bislang nicht bekannt sind.

[0029] Die Erfinder konnten nunmehr erstmals in silico und in vitro demonstrieren, dass 6-PN und 8-PN distinkte potente Inhibitoren von Histondeacetylasen (HDACs) der Klassen I, II und IV sind und eine Hyperacetylierung des Histonproteins H3 induzieren. Dies konnten die Erfinder am Beispiel verschiedener Tumorzelllinien zeigen, insbesondere anhand der beiden Melanomzelllinien SK-MEL-28 und BLM. [0030] Ferner konnten die Erfinder an einer Vielzahl von Tumorzelllinien zeigen, dass 6-PN und 8-PN starke Apoptose-unabhängige antiproliferative Eigenschaften in vitro und niedrige Toxizität in vivo zeigen. In humanen epidermalen Hautrekonstrukten zeigen beide PNs eine stark inhibierte Zellproliferation und Invasion der Tumorzellen.

[0031] Ferner konnten die Erfinder in Tumorzellen nach Behandlung mit 6-PN und 8-PN die Induktion von Autophagie beobachten.

[0032] Zusammengenommen ergeben die von den Erfindern generierten Daten, dass 6-PN und 8-PN potente phytotherapeutische epigenetische Wirkstoffe zur Melanomprävention, Melanomtherapie, Behandlung und Prophylaxe von Haut- und Schleimhautmetastasen eines beliebigen Primärtumors sind.

[0033] Nach einer bevorzugten Weiterbildung ist die pharmazeutische Zusammensetzung zur Prophylaxe und/oder Behandlung eines Melanoms oder einer Melanomvorstufe der Haut ausgebildet.

[0034] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das Arzneimittel zur Behandlung der häufigsten Melanomform, nämlich dem kutanen Melanom und dessen Vorstufen bereitgestellt wird. Zufriedenstellende Therapieansätze gegen diese Krankheitsbilder existieren im Stand der Technik bislang nicht.

[0035] Nach einer erfindungsgemäß bevorzugten Weiterbildung ist die pharmazeutische Zusammensetzung zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Melanomhaut- und/oder Melanomschleimhautmetastasten ausgebildet.

[0036] Auch mit dieser Maßnahme wird auf vorteilhafte Art und Weise die Behandlung solcher Metastasen adressiert, für die bislang keine ausreichenden Behandlungskonzepte vorliegen. [0037] Nach einer bevorzugten Weiterbildung ist die pharmazeutische Zusammensetzung zur topischen Applikation, weiter vorzugsweise zur topischen Applikation auf die Haut ausgebildet.

[0038] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass erstmals eine wirksame topische Therapie des Melanoms, dessen Vorstufen bzw. von Metastasen eines beliebigen Primärtumors möglich ist, die vom Patienten selbst durchgeführt werden kann. Sie ist für den Patienten sowohl physisch als auch psychisch weitaus weniger belastend als die derzeitigen Therapieformen, beispielsweise eine Unterspritzung der Läsionen mit IL-2. Gegenüber operativen Eingriffen und der IL2-Unterspritzung ist auch der Kostenaufwand einer solchen topischen Therapie deutlich reduziert. Auch das Risiko von Infektionen ist stark vermindert. Die erfindungsgemäße topische Ausgestaltung der Zusammensetzung ermöglicht ferner die Behandlung eines größeren Hautareals. Nach Erkenntnissen der Erfinder ist ferner von einer besseren antitumoralen Wirkung bzw. höheren Ansprechrate auszugehen im Vergleich zu der IL2-Unterspritzung. Auch ermöglicht die topische Applikation die Behandlung von okkulten Hautmikrometastasen. Einem Rezidiv kann somit entgegengewirkt werden, was sowohl bei einer chirurgischen Entfernung als auch IL2- Unterspritzung nur bedingt bzw. gar nicht der Fall ist. Auch ermöglicht die topische Applikation eine wirksame Melanomprophylaxe, die Therapie von Melanomvorstufen oder nach Exzision eines Primärmelanoms die Verminderung des Risikos der primären Melanomentstehung bzw. eines Melanomrezidives.

[0039] Erfindungsgemäß ist es deshalb bevorzugt, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung in einer Applikationsform vorliegt, die eine topische Applikation ermöglicht und deshalb vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Salbe, Creme, Lotion, Gel, Paste, transdermales therapeutisches System, Schaum, Puder.

[0040] Die Wirkstoffe 6-PN und/oder 8-PN können auch verkapselt, beispielsweise in Liposomen, vorliegen. [0041] Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann als Monopräparat ausgebildet sein, in dem 6-PN und/oder 8-PN als einzige(r) Wirkstoff(e) vorgesehen ist/sind. Nach einer Weiterbildung weist die pharmazeutische Zusammensetzung jedoch einen weiteren gegen Melanome und/oder Melanomvorstufen und/oder Haut- und/oder

Schleimhautmetastasen eines beliebigen Primärtumors wirksamen Wirkstoff auf.

[0042] Diese Maßnahme kann sich synergistische Effekte nutzbar machen, die durch das Zusammenwirken von 6-PN und/oder 8-PN und dem weiteren Wirkstoff entstehen. Auch kann dadurch die Anwendung durch den Patienten vereinfacht werden, der ggf. anstelle von zwei Präparaten lediglich die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung aufbringen muss.

[0043] Bei dem weiteren Wirkstoff handelt es sich vorzugsweise um einen Nek- roseinhibitor.

[0044] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass nekrotische Prozesse und damit ggf. verbundene Entzündungen inhibiert und etwaige Nebenwirkungen der erfindungsgemäßen Zusammensetzung weiter reduziert werden.

[0045] Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, wenn es sich bei dem Nekrose- inhibitor um IM-54 handelt.

[0046] Mit dieser Maßnahme wird ein solcher Nekroseinhibitor eingesetzt, der sich nach Erkenntnissen der Erfinder besonders eignet.

[0047] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Prenylnaringenin, vorzugsweise 6- und/oder 8-Prenylnaringenin, als epigenetisch aktiver arzneilicher Wirkstoff, weiter vorzugsweise zur Prophylaxe und/oder Behandlung eines Melanoms und/oder einer Melanomvorstufe und/oder einer Haut- und/oder Schleimhautmetastase eines beliebigen Primärtumors. [0048] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Prenylnaringenin, vorzugsweise 6- und/oder 8-Prenylnaringenin, als Histon- deacetylaseinhibitor (HDACi).

[0049] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung eines Melanoms und/oder einer Melanomvorstufe und/oder einer Haut- und/oder Schleimhautmetastase eines beliebigen Primärtumors bei einem Lebewesen, vorzugsweise einem Menschen, das folgende Schritte aufweist: (1 ) Bereitstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung, und (2) Applikation der pharmazeutischen Zusammensetzung auf die Haut des Lebewesens, vorzugsweise das Melanom und/oder die Melanomvorstufe und/oder die Haut- und/oder Schleimhautmetastase.

[0050] Die Eigenschaften, die Merkmale und Vorteile der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung gelten für die erfindungsgemäßen Verwendungen und das erfindungsgemäße Verfahren gleichermaßen.

[0051] Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

[0052] Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Eigenschaften, Merkmale und Vorteile ergeben. Die Ausführungsbeispiele sollen die Erfindung illustrieren, schränken jedoch deren Reichweite nicht ein. Dabei wird Bezug genommen auf die beigefügten Figuren, in denen Folgendes dargestellt ist:

Fig. 1 : Chemische Strukturen von 6-PN und 8-PN. Dargestellt sind die chemischen Strukturen von 6-Prenylnaringenin (5,6-Dihydroxy-2-(4-Hydroxy- Phenyl)-6-(3-Methyl-But-2-enyl)-Chroman-4-on) und 8-Prenylnaringenin (5J-Dihydroxy-2-(4-Hydroxy-Phenyl)-8-(3-Methyl-But-2-enyl)-C hroman- 4-on).

Fig. 2: Eine Dockinganalyse in silico mit 6-PN und 8-PN illustriert das inhibitorisches Potenzial für human abgeleitete HDACs der Klassen I und II. (A) Ergebnisse der Dockinganalyse in silico von 6-PN und 8-PN mit Kristallstrukturen von HDAC2 (Klasse I) und HDAC4 (Klasse II). Die Analyse zeigt den vorhergesagten Bindemodus von 6-PN und 8-PN in der HDAC-Bindetasche. Für beide Moleküle ist vorhergesagt, dass diese mit dem Zink-Ion als auch den anderen Resten des katalytischen Zentrums interagieren. Dockinganalysen von 6-PN und 8-PN in den individuellen HDAC-Bindetaschen wurden unter Verwendung von GOLD (Version 4.1 .2) und MOE (Version 2009.10) durchgeführt. (B) Gesamtinhibition von HDAC in zellulären Extrakten der humanen Zelllinie HeLa durch Erhöhung der Konzentrationen von 6-PN und 8-PN (5 μΜ, 10 μΜ, 20 μΜ, 50 μΜ und 100 μΜ). Als Referenzinhibitor wurden 100 μΜ SAHA verwendet. Jede Konzentration wurde dreimal in Dreifachansätzen getestet. Dargestellt sind die Mittelwerte ± S.A. (C) Spezifischer fluometrischer Profiling-Assay unter Verwendung von rekombinanten humanen HDACs der Klassen I, II und IV. Spezifische Inhibitionswerte wurden generiert für eine Behandlung mit 100 μΜ 6-PN und 8-PN. TSA wurde als Referenzinhibitor verwendet (HDAC1 , 2, 3, 6, 10, 1 1 : 10 nM; HDAC4, 8, 9: 1 μΜ; HDAC5, 7: 10 μΜ). Die Inhibitionswerte für jede HDAC wurden durch ein im Doppelansatz durchgeführtes Experiment erhalten. Dargestellt sind die Mittelwerte ± S.A.

Fig. 3: Dockinganalyse in silico mit 6-PN und 8-PN für HDAC2, HDAC4,

HDAC7 und HDAC8. (A) Ergebnisse der Dockinganalyse in silico von 6- PN und 8-PN mit Kristallstrukturen von HDAC8 (Klasse I) und HDAC 7 (Klasse II). Die Analyse zeigt den vorhergesagten Bindemodus von 6- PN und 8-PN in den unterschiedlichen HDAC-Bindetaschen. Für beide Moleküle ist vorhergesagt, dass sie mit dem Zink-Ion und anderen Resten des katalytischen Zentrums interagieren. (B) Darstellung eines 2D- Liganden-Plots von 6-PN und 8-PN zusammen mit interagierenden Aminosäuren (Kreisen) der korrespondierenden Bindetasche. Dargestellt sind hydrophobe, polare, saure und basische Reste. Halo-artige Scheiben um die Aminosäuren werden basierend auf der Reduzierung der Lösungsmittelexposition durch den Liganden kalkuliert. Die Pfeile repräsentieren Wasserstoffbindungsinteraktionen des Rückgrats oder Wasserstoffbindungsinteraktionen der Seitenkette. Die gestrichelten Linien repräsentieren Metallkontakte. Die Benzolringe mit einem "+" beschreiben eine Aren-Kation-Interaktion, 2-Benzolringe eine Aren-Aren-Inter- aktion. Bereiche mit einem farbigen Hintergrund korrespondieren mit Lösungsmittel-exponierten Teilen der Liganden. Die Dockinganalysen von 6-PN und 8-PN in den individuellen HDAC-Bindetaschen wurden unter Verwendung von GOLD (Version 4.1 .2) und MOE (Version 2009.10) durchgeführt.

Fig. 4: 6-PN und 8-PN induzieren eine Hyperacetylierung in den Melanomzellen

SK-MEL-28. Western-Blot-Analyse des acetylierten Histonkomplex H3 in zellulären Lysaten von BLM und SK-MEL-28-Zellen behandelt mit 100 μΜ 6-PN oder 8-PN für 1 , 2, 4, 12 und 24 Stunden, oder mit 100 μΜ SAHA (als Referenz-HDACi) für 24 Stunden. Die gleiche Proteinbeladung wurde durch Färbung mit Vinculin bestätigt (untere Reihen).

24 Stunden (BLM) und 2 Stunden (SK-MEL-28) nach der PN-Behand- lung ist eine prominente Hochregulation von AC-H3 detektierbar. Die Proteinexpressionsspiegel wurden mittels densitometrischer Analyse abgeschätzt.

Fig. 5: Echtzeitzellmonitoring der Melanomzellen BLM und SK-MEL-28 behandelt mit 6-PN und 8-PN. (A) BML- und SK-MEL-28-Zellen wurden 24 Stunden nach dem Ausplattieren mit unterschiedlichen Konzentrationen von 6-PN und 8-PN (20 μΜ, 50 μΜ und 100 μΜ) über einen Zeitraum von 104 Stunden behandelt. Die zelluläre Impedanz wurde über den gesamten Beobachtungszeitraum unter Verwendung des xCELLi- gence™ SP-Systems gemessen und über den Zellindex (Cl) dargestellt. Sämtliche Cl-Werte wurden kurz vor Beginn der Behandlung normalisiert. Dargestellt sind normalisierte Cl-Werte alle vier Stunden. Als Positivkontrolle wurde 0,1 % Triton X-100 zur Induktion des Zelltods verwendet. Gezeigt sind die Mittelwerte ± S.A. von drei unabhängigen Experimenten, jeweils in Dreifachansätzen durchgeführt (B, C). Der MUH- Proliferations-Assay mit den Melanomzellen BLM und SK-MEL-28, behandelt mit 6-PN und 8-PN (0,1 μΜ bis 100 μΜ), TSA und SAHA (beide bei 100 μΜ), mit und ohne Zugabe des Nekroseinhibitors IM-54 (5 μΜ), zeigte eine konzentrationsabhängige Reduzierung der Zellproliferation > 90 % in beiden Zelllinien durch die PNs, welche teilweise durch IM-54 inhibiert wird. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SD; die Experimente wurden in Vierfachansätzen durchgeführt. (D) Der MUH-Proliferations- Assay wurde unter den gleichen Bedingungen auf humanen Fibroblasten (FF868) und Melanozyten (HEM1 ) wiederholt.

Fig. 6: 6-PN und 8-PN inhibiert das Wachstum von MCF7 und HT29. (A, B)

MUH-Proliferations-Assay von HT29-Kolon-Krebszellen und MCF7- Brustkrebszellen behandelt mit ansteigenden Konzentrationen von 6-PN und 8-PN (0,1 μΜ bis 100 μΜ) ίϋΓ 48 Stunden. Dargestellt sind Mittelwerte ± S.A.; die Experimente wurden in Vierfachansätzen durchgeführt.

Fig. 7: 100 μΜ 6-PN und 100 μΜ 8-PN induziert keine gespaltene Caspase-3 in den Melanomzellen SK-MEL-28. Western-Blot-Analyse der Melanomzellen SK-MEL-28 behandelt mit 100 μΜ 6-PN, 8-PN, SAHA oder TSA. EtOH und DSO wurden als Kontrollen verwendet. Obwohl eine Bande für Caspase-3 (25 kDa) für alle Behandlungen klar erkennbar ist, kann keine zusätzliche Bande für gespaltene Caspase-3 (erwartete Größe 17 kDa) bei den Behandlungen gefunden werden.

Fig. 8: 6-PN und 8-PN erniedrigt die Expression von pS6p über die Runterregulation von pERK/pP90. Western-Blot-Analyse der Melanomzellen SK- MEL-28 1 Stunde, 2 Stunden, 4 Stunden, 12 Stunden und 24 Stunden nach der Behandlung mit 100 μΜ 6-PN oder 8-PN. 6-PN und 8-PN indu- zierten eine Herunterregulation von pS6p begleitet von einer Abnahme von pERK bzw. pP90. 6-PN und 8-PN induzierten eine zeitabhängige Abnahme der p70s6-Kinase.

Fig. 9: 100 μΜ 6-PN und 100 μΜ 8-PN induzieren keine Apoptose in den Mela- nomzellen SK-MEL-28. Apoptose-Assay (35 Proteine) durchgeführt auf Lysaten der Melanomzellen SK-MEL-28 vier Stunden nach Behandlung mit 100 μΜ 6-PN oder 8-PN. Die Proteinexpressionsspiegel wurden unter Verwendung einer densitometrischen Analyse abgeschätzt. Weder 6- PN noch 8-PN führten zu einer signifikanten Veränderung der Expression der analysierten in die Apoptose involvierten Proteine.

Fig. 10: 100 μΜ 6-PN und 100 μΜ 8-PN induzieren keine Apoptose in SK-MEL- 28-Melanomzellen. (A) Zellzyklus-FACS-Analysen von Pl-gefärbten Melanomzellen BLM und SK-MEL-28. 100 μΜ 8-PN-induzierte einen G2- Arrest in beiden Zellen. (B) FACS-Analysen der Melanomzellen BLM und SK-MEL-28 behandelt mit 100 μΜ 6-PN oder 8-PN und gefärbt auf Annexin V/PI; Staurosporin wurde als Kontrolle zur Apoptoseinduktion und DMSO als Vehikelkontrolle verwendet. Die Behandlung mit PN erhöhte nicht die Anzahl von Annexin V-positiven (apoptotischen) Zellen. (C) Die Melanomzellen BLM und SK-MEL-28 wurden mit 100 μΜ der PNs behandelt; TSA, SAHA und EMSO wurden als Kontrollen verwendet. Ein Western Blot wurde unter Verwendung eines Antikörpers gegen LC3 durchgeführt und zeigte einen Shift von LC3-I nach LC3-III (zweite, untere Bande) nach Behandlung mit den PNs nach 12 und 24 Stunden.

Fig. 1 1 : 6-PN und 8-PN reduzieren die Proliferation und Invasion der Melanomzellen BLM und LOXIMVI in humanen epidermalen Hautkonstrukten und induzieren geringe Embryotoxizität. (A) BLM-Melanomzellen und Kerato- nozyten wurden auf die Oberfläche einer Kollagenmatrix ausplattiert, die mit Fibroblasten versehen war. Nach 16 Tagen bildet sich ein keratini- sierendes stratifiziertes Epithel mit einem rudimentären Corium. Unbehandelte MIB1 -positive (proliferierenden) Kontroll-BLM-Zellen bilden ei- nen großen Tumor in dem epidermalen Teil des Rekonstruktes und in- vadieren das Corium (obere Reihe). Für die unbehandelten BLM-Zellen 103 ± 15 MI B-positive und 39 ± 13 invasive Zellen wurden pro Hochleistungsfeld (40-fache Vergrößerung) gezählt. 100 μΜ 6-PN-Behandlung führte zu einer signifikant abgenommenen Menge von MIB1 -positiven BLM-Zellen (27 ± 6) mit geringerer Invasion (9 ± 4; mittlere Reihe; p < 0,01 , Student's t-Test). 100 μΜ 8-PN-reduzierte die Proliferation (16 ± 4) und Invasion (6 ± 2) der BLM-Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen noch weiter (untere Reihe; p < 0,01 , Student's t-Test). Die Experimente wurde in Dreifachansätzen durchgeführt. (B) Ähnliche Ergebnisse wurden für die Melanomzellen LOXIMVI unter den gleichen Behandlungsbedingungen erhalten. Nur Ansammlungen von toten, MIB1 - negativen LOXIMVI-Zellen wurden nach der Behandlung mit den PNs detektiert. (C) Hühnchenembryonen Stadium 13HH (entsprechend 6 humanen Schwangerschaftswochen) wurden an DMSO als Kontrolle exponiert, 100 μΜ 6-PN oder 100 μΜ 8-PN, um die LD50-Werte zu bestimmen. Die Überlebensraten nach 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden, sind in einem Kaplan-Meier-Plot dargestellt.

Ausführungsbeispiele Materialien und Methoden Synthese von 6-Prenylnaringenin und 8-Prenylnaringenin (PN)

8-Prenylnaringenin und 6-Prenylnaringenin wurden gemäß Gester et al. (2001 ), An efficient synthesis of the potent phytoestrogens 8-prenylnaringenin und 6-(1 ,1 - dimethylallyl)naringenin by europium (lll)-catalyzed Claisen rearrangement, Tetrahedron 57, 1015-1018 bzw. Tischer und Metz (2007), Selective C-6 prenylation of flavonoids via europium(lll)-catalyzed Claisen rearrangement and cross- metathesis, Advanced Synthesis & Catalysis 349, 147-151 , synthetisiert. Der Inhalt der beiden vorstehenden Publikationen ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung. Zellkultur

Die Erfinder haben insgesamt 19 verschiedene Tumorzelllinien getestet, darunter fünf Melanomzelllinien, zwei Leberkrebszelllinien, drei Brustkrebszelllinien, drei Darmkrebszelllinien, zwei Prostatakrebszelllinien, zwei Lungenkrebszelllinien und zwei Nierenkrebszelllinien:

Tabelle 1 : Getestete Tumorzelllinien

Beispielhaft werden nachfolgend die metastatischen Melanomzelllinien SK-MEL- 28, LOXIMVI und BLM, die Kolon-Krebszellen HT29 und die Brustkrebszellen MCF7 beschrieben. Diese wurden in RPMI 1640-Medium kultiviert, supplementiert mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 1 % Penicillin und 1 % Streptomycin. Sämtliche Zellkulturen wurden bei 37 °C in einer Atmosphäre aus 95 % Luft und 5 % C0 ₂ bei 100 % Feuchtigkeit gehalten. Dockinganalysen in silico

Die Dockinganalysen wurden mit humanem HDAC2, 4, 7 und 8 mit 6-PN, 8-PN und den beiden HDACi-Referenzverbindungen Suberoylanilid-Hydroxaminsäure (SAHA) und Trichostatin (A (TSA)) durchgeführt. HDAC-Inhibitor Screening Assay

Die Bestimmung der HDACi-Aktivität wurde mittels des HDAC-Assay-Kits durchgeführt, wie von dem Hersteller beschrieben (Active Motif, La Hulpe, Belgien), und zwar unter Verwendung von 6-PN und 8-PN bei steigenden Konzentrationen (5 μΜ, 10 μΜ, 20 μΜ, 50 μΜ und 100 μΜ). HDAC-Inhibitionsprofiling

Der humane HDAC-Profiling-Assay wurde auf Basis der Fluor de Z.ys™-Techno- logie von Scottish Biomedical, Glasgow, Vereinigtes Königreich, durchgeführt. Die prozentualen Inhibitionswerte von 100 μΜ 6-PN und 100 μΜ 8-PN gegen die humanen HDAC-Enzyme HDAC1 , HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10 und HDAC1 1 wurden bestimmt. Sämtliche Assays wurden in 1 % DMSO (Endkonzentration) durchgeführt. Immunblotting

Die folgenden Antikörper wurden verwendet: Anti-Vinculin und Anti-Actin (1 :5000, Sigma-Aldrich), Anti-Acetyl-Histon H3 (1 :5000, Millipore, Billerica, USA), Anti- Caspase-3 (1 :1000), Anti-AKT, Anti-pAKT, Anti-ERK, Anti-pERK, Anti-pE90, Anti- p70S6-Kinase und Ant.i-pS6-Prot.ein (1 :1000), alle von Cell Signaling, Frankfurt, Deutschland), Anti-LC3 (1 :5000, Sigma-Aldrich). Proliferations-Assay

Die Zellen wurden als Dreifachansätze in Platten mit 96 Vertiefungen bei einer Dichte von 2500 Zellen pro Vertiefung in 50 μΙ Medium (5 x 10 ⁴ Zellen pro Milliliter) ausplattiert. Nach 24 Stunden wurde das Medium durch ein solches ersetzt, das 6- PN, 8-PN (gelöst in DMSO), TSA (gelöst in EtOH) oder SAHA (gelöst in DMSO) bei den zu testenden Konzentrationen mit oder ohne Zugabe des Nekroseinhibi- tors IM-54 bei 5 μΜ (Calbiochem, Darmstadt, Deutschland), enthielt. Zellen behandelt mit Kulturmedium, ohne oder mit DMSO, dienten als Kontrollen. Der Assay wurde nach einer Inkubation von 24 Stunden gestartet. Das Medium wurde verworfen, jede Vertiefung wurde zweimal mit PBS (ohne Ca ⁺⁺ und Mg ⁺⁺ ) gewaschen und 100 μΙ einer Lösung enthaltend 100 mg 4-Methyl Umbellipherylheptanoat pro Milliliter PBS wurden hinzugegeben. Die Platten wurden bei 37 °C für 1 Stunde inkubiert und in einem Fluoroskan II (Lab Systems, Helsinki, Finnland) mit einem λβΓΠ von 355 nm und λβχ von 460 nm gemessen. Die Intensität der Fluoreszenz indiziert die Anzahl von lebenden Zellen in den Vertiefungen. Echtzeitzellmonitoring-Assay

Die humanen Melanomzelllinien BLM und SK-MEL-28 (2,5 x 10 ³ ZellenA ertiefung) wurden in Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert. Die Zellen wurden nach 24 Stunden mit verschiedenen Konzentrationen von 6-PN oder 8-PN (20 μΜ, 50 μΜ und 100 μΜ) behandelt und durch Messungen der elektrischen Impedanz in Intervallen von 15 Minuten für eine Zeitspanne von insgesamt 104 Stunden und unter Verwendung des xCELLigencer® SP Systems (Roche Applied Science) überwacht. Die Zellindexwerte wurden unter Verwendung der RTCA-Software

(1 .0.0.0805) kalkuliert. Sämtliche Kurven wurden am Beginn des Behandlungszeitraums normalisiert. Apoptose-Assay

Der Test der Apoptose-Induktion erfolgte mit dem human Proteom-Profiler-Apop- tose-Antikörper-Array-Kit (R & D Systems, Wiesbaden, Deutschland), wie vom Hersteller beschrieben, und zwar nach Behandlung der Melanomzellen SK-MEL- 28 mit 100 μΜ 6-PN oder 100 μΜ 8-PN für 4 Stunden. Organtypische epidermale Hautrekonstrukte

Organtypische Kulturen von humaner Haut und Melanoma (unter Verwendung von BLM und LOXIMVI-Melanomzellen) wurden hergestellt, wie zuvor beschrieben von Meier et al. (2000), Human melanoma progression in skin reconstructs: biological significance of bFGF, Am. J. Pathol. 156, 193-200. Embryotoxizitätstest (Bestimmung von LD ₅₀ )

Befruchtete Eier von Leghorn-Hühnern (Gallus gallus domesticus) wurden bei 38 °C in einem temperaturkontrollierten, befeuchteten Brüter inkubiert. Der oberste Punkt der Eischale und damit indirekt das Blastoderm, das stets in Richtung des oberen Teils des Eis orientiert ist, wurde mit einem Stift markiert. Für den Embryotoxizitätstest wurden die Eier nach ungefähr 48 bis 52 Stunden der Inkubation (entsprechend des Stadiums 12 bis 13) präpariert, was in etwa 6 humanen Schwangerschaftswochen entspricht. Vor der Fenestration wurde ein kleines Loch in die laterale Seite der Eier gestochen und 2 ml Eiweiß wurden mit einer Kanüle aus dem unteren Spiegel des Blastoderms entnommen. Anschließend wurde das Ei für die Fenestration unter Verwendung einer Bügelsäge präpariert, um eine rechteckige Bruchgrenze auf der Schale um den zuvor markierten Punkt zu generieren (etwa 15 x 25 mm Größe). Das zuvor festgelegte "Fenster" wurde durch Entfernung der Eischale mit einer gebogenen Pinzette geöffnet. Zu diesem Stadium ist der Embryo bereits auf der Oberseite des Blastoderms sichtbar. 100 μΜ 6- PN oder 8-PN (gelöst in 50 % Ethanol und 50 % PBS, Gesamtvolumen: 500 μΙ) wurden auf den oberen Teil des Blastoderms gegeben (2 Embryos pro Behand- lungsgruppe; das Experiment wurde in Dreifachansätzen durchgeführt; insgesamt n = 6 pro Gruppe). Als Kontrolle wurde die gleiche Anzahl von Embryonen mit den gleichen Volumina von Ethanol und PBS ohne Zugabe von 6-PN oder 8-PN behandelt, um mögliche toxische Effekte des Ethanols auszuschließen. Die Eier wurden dann mit Klebeband verschlossen und in den Inkubator zurückgestellt. Die Lebensfähigkeit der Embryos wurde verifiziert und 24, 48 und 72 Stunden nach der Verabreichung der Substanzen dokumentiert. Statistische Analysen

Statistische Analysen für die verschiedenen Assays wurden mit dem One-Way ANOVA Dunnett's Multiple Comparison Test unter Verwendung von GraphPad Prism Version 4.00 (GraphPad Software, San Diego, Kalifornien, USA) durchgeführt. Gemäß dieser Analyse wurde ein Wert von p < 0,01 als statistisch signifikant definiert. Ergebnisse In s/7/co-Dockinganalysen sagen eine Bindung von 6-PN und 8-PN in humanen HDAC-Enzymen voraus.

Um eine potenzielle HDACi-Aktivität von 6-PN und 8-PN (Fig. 1 ) zu identifizieren, wurden zunächst in s/7/co-Dockinganalysen mit den humanen HDAC-Klasse I Mitgliedern HDAC2 und HDAC8 als auch den Klasse II Mitgliedern HDAC4 und HDAC7 (Fig. 2, 3) durchgeführt. Wichtige Merkmale für ein HDACi sind die strukturelle Eigenschaft, in die Bindetasche der HDAC-Enzyme zu passen, und die Kapazität, mit Schlüsselresten wie dem Zink-Ion im katalytischen Zentrum zu interagie- ren. Gemäß den vorhergesagten Interaktionen der Dockinganalysen erfüllen sowohl 6-PN als auch 8-PN theoretisch beide Erfordernisse betreffend HDAC2, HDAC4 (Fig. 2A) oder HDAC7 bzw. HDAC8 (Fig. 3). Es wurde jedoch beobachtet, dass kein konsistenter Bindemodus für 6-PN und 8-PN über die verschiedenen HDAC-Enzyme erhalten wurde, d.h. es interagieren unterschiedliche Teile von 6- PN und 8-PN mit dem Zink-Ion. Dies macht die Dockinganalyse von 6-PN und 8- PN schwierig zu interpretieren. Das etablierte HDACi-Tricholstatin A (TSA; nicht klinisch zugelassen aufgrund von Toxizität) und Suberoylanilid-Hydroxaminsäure (SAHA; klinisch zugelassen für die Krebstherapie) wurden ebenfalls als Referenzinhibitoren analysiert. Zum Vergleich der Dockingergebnisse wurde die Scoring- Funktion GoldScore verwendet. Interessanterweise ergaben 6-PN und 8-PN höhere GoldScores als TSA oder SAHA für HDAC4, HDAC7 und HDAC8, und Gold- Scores vergleichbar mit (6-PN) oder niedriger (8-PN) als TSA oder SAHA für HDAC2 mit den oben erwähnten Restriktionen.

HDAC2 HDAC4 HDAC7 HDAC8

6-PN 62.8 66.5 56.9 59.5

8-PN 37 57.6 56.7 64.8

Tabelle 2: GoldScores für 6-PN und 8-PN. Kalkulierte GoldScores für 6-PN und 8-PN auf der Basis der korrespondierenden Dockinganalyse mit HDAC2, 4, 7 und 8. Die Docking- und folgenden Analysen erfolgten unter Verwendung von GOLD (Version 4.1.2).

Basierend auf den in s/7/co-Daten scheinen 6-PN und 8-PN inhibitorische Aktivität gegen HDAC-Enzyme der Klassen I und II im Vergleich zu Standard HDACi wie TSA und SAHA aufzuweisen. In v/ ^' iro-Screening bestätigt die vermutete pan-HDACi-Aktivität von 6-PN und 8-PN.

Um die vorhergesagte HDACi-Aktivität in vitro weiter zu untersuchen, wurden 6-PN und 8-PN in einem HDACi-Assay gescreent. Unter Verwendung von standardisiertem Kernextrakt von HeLa-Zellen als humane HDAC-Enzymquelle zeigten 6-PN und 8-PN eine dosisabhängige HDAC-inhibitorische Aktivität (Fig. 2B). Bereits niedrige Konzentrationen von 6-PN (5 μΜ) und 8-PN (10 μΜ) zeigten inhibitorische Wirkungen, und 100 μΜ resultierte in einer Inhibitionsrate > 50 % (Fig. 2B).

100 μΜ SAHA wurde als Kontroll-HDACi verwendet. Schließlich zeigten 6-PN und 8-PN eine substanzielle HDACi-Aktivität auf humanen HDAC-Enzymen in vitro. Um die in silico- und in v/ ^' iro-Ergebnisse zu überprüfen und um die Inhibitoraktivität von 6-PN und 8-PN aufzuschlüsseln, wurde eine Profilinganalyse mit allen bekannten humanen HDAC-Enzymen der Klassen I, II und IV durchgeführt (Fig. 2C). Auf der Basis des HDACi-Screening-Assays und der resultierenden Inhibitionswerte wurden 100 μΜ 6-PN, 8-PN und TSA (als Referenz-HDACi; in den optimierten Konzentrationen 0,01 μΜ, 1 μΜ und 10 μΜ) verwendet, um alle konservierten elf HDAC-Enzyme zu testen und um adäquate Inhibitorkonzentrationen sicherzustellen. In Übereinstimmung mit den Dockingergebnissen und dem Screening-Assay inhibierten 6-PN als auch 8-PN stark die HDAC-Aktivität aller getesteter HDACs (Fig. 2C). Gemäß den spezifischen HDAC-Inhibitionswerten für HDAC1 -HDAC1 1 können beide Prenylflavonoide als pan-HDACi betrachtet werden. Hyperacetylierung von H3 nach einer Behandlung mit 6-PN und 8-PN in BLM und SK-MEL-8-Melanomzellen

Eine Inkubation von Zellen mit HDACi induziert im Allgemeinen eine Hyperacetylierung von Histonproteinen. Deshalb wurde der Acetylierungsstatus des Histon- proteins H3 nach Behandlung mit 6-PN oder 8-PN untersucht. Entsprechend den HDAC-Screening-Ergebnissen wurde ein direkter Effekt beobachtet. Western Blot- Analysen zeigten im Vergleich zu DMSO-behandelten Kontrollzellen einen massiven Anstieg der Acetylierung des Histonkomplexes H3 in BLM-Melanomzellen 24 Stunden nach Behandlung mit 100 μΜ 6-PN oder 8-PN, und in SK-MEL-28 Melanomzellen bereits 2 Stunden nach Behandlung mit 100 μΜ 6-PN oder 8-PN (Fig. 4). SAHA wurde als Kontroll-HDACi verwendet (bei 100 μΜ, 24 Stunden Behandlung). Apoptose-unabhängige antiproliferative Effekte von 6-PN und 8-PN auf humanen Melanom-, Kolon- und Brustkrebszellen

Aufgrund der neu gefundenen HDACi-Aktivität von 6-PN als auch 8-PN und der beobachteten Hyperacetylierung von Histonprotein H3 in humanen Melanomzellen wurden die antiproliferativen Effekte auf Krebszellen getestet. Die humanen me- tastasierenden Melanomzelllinien BLM und SK-MEL-28 wurden einmal mit steigenden Konzentrationen von 6-PN oder 8-PN (20 μΜ, 50 μΜ und 100 μΜ) behandelt und kontinuierlich für eine gesamte Zeitspanne von 104 Stunden unter Verwendung eines Echtzeitzellmonitor-Assays beobachtet (Fig. 5A). Die Zellimpedanz, dargestellt als Zellindex (Ci), wurde gemessen, was Veränderungen im zellulären Status reflektiert. Demnach zeigt ein Anstieg des Ci im Allgemeinen zelluläres Wachstum an, während eine Abnahme Störungen des Zellwachstums oder der Lebensfähigkeit indiziert. Der normalisierte Ci von BLM- und SK-MEL-28-Zellen behandelt mit 6-PN und 8-PN nahm über die Zeit im Vergleich zur Kontrolle für jede getestete Konzentration ab. Insbesondere eine Inkubation mit 60 μΜ und 100 μΜ 6-PN als auch 8-PN zeigte eine verstärkte und schnelle Veränderung des gemessenen Ci. Die frühe HDACi-vermittelte Hyperacetylierung von Histon H3, die in der Western Blot-Analyse bei 100 μΜ für beide PNS in SK-MEL-28-Zellen de- tektiert wurde, stand im Einklang mit der raschen Abnahme des normalisierten Ci bereits 4 Stunden nach Behandlung im Vergleich zur Kontrolle. Gleichermaßen korrespondierte in den BLM-Zellen die Hyperacetylierung von Histon H3 nach einer Behandlung mit den PNs mit einer verzögerten Abnahme des Ci.

Um die antiproliferativen Effekte von 6-PN und 8-PN auf BLM und SK-MEL-28- Melanomzellen zu konkretisieren, wurden Proliferations-Assays durchgeführt (Fig. 5B, C). Gemäß dem Echtzeitzellmonitoring-Assay induzieren bereits 20 μΜ 6- PN oder 8-PN eine distinkte Abnahme innerhalb von 48 Stunden (Fig. 5A). Deshalb wurden auf der einen Seite auch niedrige Konzentrationen in diesen Assay eingeschlossen, und auf der anderen Seite wurden die Zelllinien für 48 Stunden behandelt. In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen zeigten Konzentrationen von 50 μΜ und 100 μΜ 6-PN als auch 8-PN einen starken antiproliferativen Effekt. In BLM- und SK-MEL-28-Zellen reduzierte 6-PN die Zellproliferation bis zu 95 % und 8-PN bis zu 90 % (Fig. 5B, C). Ferner induzierten auch Behandlungen von anderen Tumorentitäten, wie HT-20-Kolon-Krebs- und MCF-7-Brustkrebszellen, mit steigenden Konzentrationen von 6-PN oder 8-PN eine starke Reduzierung der Zellproliferation (Fig. 6). Um die Antikrebseigenschaften von 6-PN und 8-PN auf metastatische Melanom- zellen weiter zu evaluieren, wurden die Proliferations-Assays unter Zugabe des Nekroseinhibitors IM-54 wiederholt, um die Rolle der Nekroseinduktion nach Behandlung mit PN zu analysieren. Die Zugabe von 5 μΜ IM-54 reduzierte die Zelltodraten bei höheren PN-Konzentrationen sowohl in BLM als auch SK-MEL-28- Zelllinien um bis zu 35 % (Fig. 5B, C). Höhere Dosen von IM-54 (10 μΜ) zeigten keinen zusätzlichen Effekt (nicht gezeigt).

Als Nächstes wurde getestet, ob PNs auch die Proliferation von gutartigen Zellen beeinflusst. Dazu wurden humane Fibroblasten (FF) und Vorhautmelanozyten (HEM1 ) mit den gleichen Konzentrationen von 6-PN und 8-PN behandelt, und die Proliferation wurde unter Verwendung des oben beschriebenen Proliferations- Assays getestet. Die Fibroblastenproliferation wurde durch die PN-Behandlung kaum beeinflusst (Fig. 5D), wohingegen die Proliferation der Melanozyten bei höheren Konzentrationen der PNs deutlich abnahm (Fig. 5E). Für TSA und SAHA konnte keine reduzierte Proliferation der Fibroblasten oder Melanozyten detektiert werden.

Zusammengenommen reduzieren 6-PN und 8-PN effektiv die Zellproliferation in allen getesteten Krebszellen (vgl. Tab. 1 ); insbesondere Melanomzellen waren höchst zugänglich für eine Behandlung mit den beiden Prenylflavonoiden. IM-54 war in der Lage, PN-induzierten Zelltod in BLM und SK-MEL-28-Zellen teilweise zu blockieren, was darauf hinweist, dass die antiproliferative und zytotoxische Kaskade, die durch PN initiiert wird, eventuell in einem Teil der Melanomzellen Nekrose induziert.

Um den Typus des Zelltods weiter zu analysieren, der durch 6-PN und 8-PN induziert wird, wurden Western Blot-Analysen von SK-MEL-28 Melanomzellen 1 , 2, 4, 12 und 24 Stunden nach Behandlung mit 100 μΜ 6-PN und 8-PN durchgeführt. Für beide PNs wurden reduzierte Proteinspiegel von Caspase-3 (pro-apop- totisch) und Bcl-xl (anti-apoptotisch) detektiert (nicht gezeigt). Allerdings wurde für 6-PN, 8-PN oder jeden anderen verwendeten Referenz-HDACi (TSA, SAHA) oder Vehikelkontrolle (DMSO) keine zusätzliche Bande für gespaltene Caspase-3 in SK-MEL-28-Zellen detektiert (Fig. 7). Nach PN-Behandlung wurde eine inkonsistente Expression von onkogenem AKT und Phospho-AKT (pAKT) detektiert. Auf der anderen Seite wurde Phospho-S6-Protein (pS6P, ein stromabwärts gelegenes Target von mTOR) stark durch 6-PN oder 8-PN nach 4, 12 und 24 Stunden herunterreguliert (Fig. 8). Es gab deshalb eine offensichtliche Diskrepanz zwischen der Expression von pAKT und pS6P. Deshalb wurde zuerst nach der Expression der P70S6-Kinase und dessen phosphorylierter Form geschaut. 6-PN und 8-PN regulierten die Banden für die P70S6-Kinase in einer zeitabhängigen Art und Weise herunter (Fig. 8). Interessanterweise war dessen phosphorylierte Form (pP70S6- Kinase) nicht detektierbar, selbst nicht in der Kontrollgruppe (nicht gezeigt). Deshalb wurde als Nächstes gefragt, ob S6P durch einen anderen Mechanismus phosphoryliert werden könnte. In dieser Hinsicht kann aktiviertes ERK die p90 ri- bosomale S6-Kinase (pP90) phosphorylieren. pP90 phosphoryliert ebenfalls S6P (zusätzlich zu der P70S6-Kinase). Da die pP70S6-Kinase in den verwendeten Zellen nicht vorhanden war (SK-MEL-28 und BLM), wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Phosphorylierung von S6P über den pERK/pP90-Signalweg erfolgt, unabhängig von der P70S6-Signalgebung. Diese Hypothese wurde gestützt durch die parallele Herunterregulation der Banden für pP90 (Thr359/Ser363) und pS6P 12 Stunden nach Behandlung mit 6-PN, und die Wiedererscheinung von beiden Banden nach 24 Stunden (Fig. 8). In der 8-PN-Behandlungsgruppe wurde nach 12 Stunden und 24 Stunden eine starke Herunterregulation von pERK und ein zusätzlicher Anstieg des pP80-Proteins detektiert, die begleitet wurde von der parallelen Herunterregulation von pS6P. Die Western-Blot-Experimente wurden mit BLM- Zellen unter den gleichen Behandlungsbedingungen wiederholt und erzielten vergleichbare Ergebnisse (nicht gezeigt). Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass die Phosphorylierung von S6P über die Herunterregulation des pERK/pP90- Signalwegs durch die PNs erfolgt, unabhängig von der PI3K/AKT/P70S6- Signalgebung.

Um die Möglichkeit der Apoptoseinduktion weiter zu analysieren, wurde 4 Stunden nach Behandlung mit 100 μΜ 6-PN oder 8-PN ein umfangreicher Apoptose-Assay auf SK-MEL-28-Melanomzellen durchgeführt (Fig. 9). Die Proteinexpressionsspiegel wurden abgeschätzt, indem eine densitometrische Analyse durchgeführt wurde und bestätigte, dass die Abnahme der Proliferation der Melanomtumorzellen, die durch 6-PN oder 8-PN induziert wurde, nicht Apoptose-assoziiert erfolgte (Fig. 9). Dies wurde durch FACS-Zellzyklusanalysen bestätigt, um auf eine mögliche Zunahme der Sub-G1 -Fraktion der Zellen (Apoptosezellen) oder nach der Induktion eines G2-Arrest (Inhibition der Proliferation) zu screenen. Tatsächlich zeigte die FACS-Analyse eine Induktion des G2-Arrests in BLM und SK-MEL-28-Zellen 48 Stunden nach Behandlung mit 100μΜ 8-PN im Vergleich zu DMSO-behandelten Kontrollzellen (BLM: 99,6% vs.30,4%; SK-MEL-28: 49,8% vs. 20,1 % der Zellen in der G2-Phase); die Sub-G1 -Fraktion (apoptotische Zellen) blieb unbeeinflusst von 8-PN (Fig. 10A). Um weiter zwischen der Induktion der Apoptose und/oder Nekrose zu differenzieren, wurde 4 Stunden und 24 Stunden nach Behandlung mit 6-PN oder 8-PN eine Pl/Annexin-V-Färbung von SK-MEL-28- und BLM-Zellen durchgeführt; 10μΜ Staurosporin (6 Stunden Behandlung) wurde als Positivkontrolle für die Induktion der Apoptose verwendet; eine DMSO-Behandlung wurde als Vehikelkontrolle verwendet. Die Zellen wurden dann durch FACS analysiert. In Übereinstimmung mit den obigen Ergebnissen, erhöhte 4 oder 24 Stunden nach Behandlung weder 6-PN noch 8-PN die Anzahl der Annexin-V-positiven (apoptoti- schen) Zellen; Staurosporin erhöhte die Anzahl der Annexin-V-positiven Zellen (BLM: DMSO-Kontrolle: 4,1 %; Staurosporin: 17,4%; 6-PN 4 Stunden und 24 Stunden: 0,2% und 0,2%; 8-PN 4 Stunden und 24 Stunden: 1 ,2% und 5,9%; SK-MEL- 28: DMSO-Kontrolle: 2,5%; Staurosporin: 13,9%; 6-PN 4 Stunden und 24 Stunden: 0,5% und 0,6%; 8-PN 4 Stunden und 24 Stunden: 0,2% und 0,5%; (Fig. 10B). Im Gegensatz hierzu nahm die Anzahl von Pl-positiven (nekrotischen) Zellen nur nach Behandlung mit den PNs stark ab (BLM: DMSO-Kontrolle: 9,1 %; Staurosporin: 16,6%; 6-PN 4 Stunden und 24 Stunden: 30,8% und 92,1 %; 8-PN 4 Stunden und 24 Stunden: 27% und 22,4%; SK-MEL-28: DMSO-Kontrolle: 7,9%; Staurosporin: 9,3%; 6-PN 4 Stunden und 24 Stunden: 31 ,1 % und 65%; 8-PN 4 Stunden und 24 Stunden: 29,9% und 58,2% (Fig. 10B). Zusammen genommen, der Western- Blot und die FACS-Ergebnisse demonstrieren eindeutig, dass die 6-PN- und 8-PN- induzierte Zytotoxizität auf Melanomzellen nicht durch Apoptose-Induktion erfolgt, sondern eher durch Nekrose. 6-PN und 8-PN induziert Autophagie in BLM und SK-MEL-28-Melanomzellen

Da spekuliert wurde, dass die Bildung von intrazytoplasmatischen Vakuolen in pankreatischen oder Brustkrebszellen durch 6-PN und 8-PN, die in früheren Studien beobachtet wurde, eine Induktion der Autophagie darstellen könnte, wurde dieser Aspekt auf einer molekularen Ebene weiter untersucht. BLM und SK-MEL- 28-Melanomzellen wurden mit "Ι ΟΟμΜ 6-PN, 8-PN, SAHA oder TSA (und mit DMSO als Kontrolle) behandelt, und die behandelten Zellen wurden lysiert, um die Proteine 1 Stunde, 2 Stunden, 4 Stunden, 12 Stunden und 24 Stunden zu extrahieren. Als Indikator für die Induktion von Autophagie wurde der Shift von LC3-I nach LC3-II (Konversion der löslichen Form von LC3 (LC3-I) zur autophagisch- vesikel-assoziierten Form (LC3-II), verwendet. In beiden Melanomzellen induzierten nach 12-24 Stunden nur 6-PN und 8-PN einen klaren Shift von LC3-I nach LC3-II (Fig. 10C). 6-PN und 8-PN inhibieren die Proliferation und Invasion von BLM und LOXIMVI- Melanomzellen in organotypischen humanen epidermalen Hautrekonstrukten

Da 6-PN und 8-PN nachweislich antiproliferative Effekte auf Melanomzellen in vitro ausüben, wurde gefragt, ob solche Effekte auch in einem komplexeren humanen epidermalen Hautrekonstrukt visualisiert werden können. In diesem Assay werden Keratinozyten und Melanomzellen auf die Oberfläche einer Kollagenmatrix ausplattiert, die mit Fibroblasten besiedelt war. Nach 16 Tagen bildete sich ein kerati- nisierendes stratifiziertes Epithel mit einem rudimentären Corium. Unbehandelte Kontroll-BLM-Zellen (die 70-80% Proliferation zeigten, bestimmte durch MIB1 - Immunhistochemie) haben einen großen Tumor im epidermalen Teil des Rekon- struktes gebildet und das Corium invadiert (Fig. 1 1A, obere Reihe). Um die Menge von proliferierenden Zellen zu bestimmen, wurde die Anzahl von MIB1 -positiven Melanomzellen pro Hochleistungsfeld im epidermalen Teil des Rekonstruktes an der epidermalen-dermalen Grenze gezählt (40-fache Vergrößerung, n=5 angrenzende Felder untersucht). Ferner wurde die Anzahl von Melanomzellen in den gleichen Hochleistungsfeldern gezählt, die den dermalen Teil des Rekonstruktes invadiert haben. In den Rekonstrukten mit unbehandelten BLM-Zellen wurden 103±15 MI B1 -positive Zellen und 39±13 invasive Zellen gezählt (Fig. 1 1A, obere Reihe). Eine Behandlung mit 100μΜ 6-PN reduzierte signifikant die Anzahl von proliferierenden BLM-Zellen und verringerte die Invasion: 27±6 MI B1 -positive Zellen und 9±4 invasive Zellen (p<0,01 , Student's t-test; Fig. 1 1A, mittlere Reihe). Fü 8-PN waren die Effekte im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen sogar noch deutlicher: 16±4 MIB1 -positive Zellen und 6±2 invasive Zellen (p<0,01 , Student's t Test; Fig. 1 1A, untere Reihe). Das Experiment mit den epidermalen Hautrekon- strukten wurde mit einer zweiten metastatischen humanen Melanomzelllinie (LOXIMVI) wiederholt, um die Zelllinien-Phänomenologie in der besonderen Hautrekonstruktumgebung auszuschließen. In der unbehandelten Gruppe waren die LOXIMVI-Zellen (ausgerichtet entlang der dermalen-epidermalen Grenze und in prominenten Tumorzellnestern im dermalen Teil der Aggregate) 100% MIB1 - positiv (Fig. 1 1 B). Die Behandlungen mit 6-PN und 8-PN führten jeweils zur vollständig inhibierten Zellproliferation der LOXIMVI-Zellen: Es konnten lediglich Nester von toten LOXIMVI-Zellen im dermalen Teil der Hautrekonstrukte detektiert werden (Fig. 1 1 B).

Zusammenfassend konnten die antiproliferativen Effekte, die in vitro beobachtet wurden, reproduziert werden und auf eine zusätzliche Inhibition der BLM- und LOXIMVI-Melanomzellinvasion in epidermalen Hautrekonstrukten erweitert werden.

In vivo Toxizitätsstudien mit 6-PN und 8-PN

Aufgrund der detektierten zytotoxischen Effekte auf Krebszellen und Melanozyten in vitro war die Bestimmung der Embryotoxizität in vivo von großem Interesse. Da zu wurden 2 Tage alte Hühnchenembryos für 24, 48 und 72 Stunden mit 10ΟμΜ 6 PN oder 100μΜ 8-PN behandelt, um das Überleben als Messgröße für letale Emb ryotoxizität zu beobachten (Fig. 1 1 C). Da das PN-Lösungsmittel, das für die Experimente in vitro verwendet wurde (DMSO), den Embryotoxizitätsassay und damit die Bestimmung der LD ₅₀ -Werte negativ beeinflusst (7/7 Embryos waren 24 Stunden nach der Zugabe der entsprechenden Menge von DMSO tot; Fig. 1 1 C), wur- den die PNs nun in einer Mischung aus weniger toxischem Ethanol und PBS anstelle von DMSO gelöst, um artifizielle Nebenwirkungen des Lösungsmittels für dieses Experiment in vivo zu minimieren. Ferner wurde ein Vortest des neuen Lösungsmittels allein durchgeführt. Bei einer Konzentration von 500μΜ von Ethanol- lösungsmittel starben 6/7 Embryos innerhalb der ersten 24 Stunden und das verbliebene Embryo nach 48 Stunden. Es stellte sich heraus, dass 200μΜ Ethanol und PBS als Lösungsmittelmischung die LD ₅₀ -Konzentration darstellt, wohingegen niedrigere Konzentrationen des Lösungsmittels (100μΜ und darunter) gut vertragen werden. 6-PN und 8-PN wurden deshalb bei 100μΜ getestet, die Konzentration, für die in den früheren Assays eine zytotoxische Wirksamkeit gezeigt werden konnte. 72 Stunden nach der Behandlung mit den PNs zeigten sich geringe embryotoxische Effekte: 6/10 Embryos überlebten nach 72 Stunden nach Behandlung mit 6-PN, und 8/10 Embryos nach Behandlung mit 8-PN (Fig. 1 1 C). Gemäß dem sehr sensitiven Embryotoxizitatsassay in vivo werden Konzentrationen von 100 μΜ 6-PN und 100μΜ 8-PN sehr gut toleriert. Schlussfolgerung

Die Erfinder konnten anhand von 19 verschiedenen Tumorzelllinien auf eindrucksvolle Art und Weise zeigen, dass ein Prenylflavonoid bzw. Prenylnaringenin (PN), insbesondere 6- und/oder 8-Prenylnaringenin (6-PN, 8-PN), zur Prophylaxe und/oder Behandlung eines Melanoms und/oder einer Melanomvorstufe und/oder einer Haut- und/oder Schleimhautmetastase geeignet sind.