技术领域

本发明属于基因工程制药领域， 具体涉及二聚体化促血小板生成素模拟肽 TMP二联体-人血清白蛋白 融合蛋白及其制备方法及应用。

发明背景

大多数治疗用的蛋白和多肽半衰期一般较短 （金光泽等， 2010)， 需要频繁注射； 而且这类上市药物 价格较高。 这给需要长期应用治疗蛋白和多肽的患者带来 难以承受的身体负担、 心理负担和经济负担。 因 此， 延长这些治疗蛋白与活性多肽半衰期的蛋白质 工程改造己成为研究的热点， 对长效重组蛋白和活性多 肽药物的开发也已成为对第一代基因工程产品 进行二次开发的一个重要方向 （赵洪亮等， 2005 )。

延长治疗用蛋白和多肽的半衰期通常采用的方 法之一是进行突变体的构建。长效 EPO (促红细胞生成 素， Aranesp,安进公司生产）和长效胰岛素（Lantus, Aventis公司生产）就是采用突变体的方法获得� �（戚 楠和马清钧， 2006 )。 可是， 事实上能够采用这种方法达到延长活性多肽和 蛋白在体内半衰期目的的药物 寥寥无几。 多数目标物经过突变后会带来抗原性增强， 这样的药物注射给人体后， 会导致中和性抗体的产 生。 第二种方法是化学修饰法， 这方面， 尽管聚乙二醇修饰的干扰素等长效药物业已上 市， 但是采用这类 大分子化合物进行修饰所带来的目的物不均一 性问题目前尚难以解决 （姜和和龚梦嘉， 2012)。

近年来， 研究人员通过将半衰期短的多肽、 蛋白与载体蛋白相偶联， 结果目的物在体内的半衰期显著 延长。 目前的工作已证明， 抗体的 Fc段和人血清白蛋白可用作这类蛋白载体。 然而， 抗体的 Fc段不是一 个惰性蛋白， 它在体内可介导多种免疫响应， 而且 Amgen公司对 Fc段的变体已在我国申请专利。 因此， 将 Fc用作蛋白载体的应用大大受限。

人血清白蛋白 （HSA)是人体血浆的主要成分， 由 585个氨基酸组成， 相对分子量约 66.5KDa， 为单链 球型蛋白质。 HSA是血液中最主要、 最基本的载体蛋白， 无酶学及免疫学活性， 可携带并传递多肽、 脂肪 酸、 类固醇以及激素 （富岩等， 2011 )。 由于 HSA是一种惰性蛋白， 能够抵御体内的酶解作用， 在体内的 半衰期可长达 14~20天（Chuang and Otagiri, 2002)。 目前， 常将它作为许多内源因子和外源药物的载体， 将这些内源因子或外源药物与 HSA融合后， 可以增加它们的分子量和水化半径， 减少它们被肾小球的滤过 率， 减少它们在体内利用度， 以改善活性肽或蛋白药物的体内半衰期。 1992年， Yeh等人首次提出将 HSA 作为载体蛋白与 CD4偶联， 采用酵母表达融合蛋白， 获得了治疗人类疾病的长效融合蛋白药物。 美国人类 基因组科学公司 （HGSI)研究开发的 HSA-IFNa(Albuferona)将 IFNa的体内半衰期延长至 144小时， 目前已 完成了三期临床试验。该公司开发的白蛋白生 长激素（Albutropm)给予猕猴皮下注射， 结果表明： 与生长 激素相比， 白蛋白生长激素半衰期延长 6倍 （Osb _O m W «/., 2002 ) _; 白蛋白-粒细胞生长因子 （Albugranm) (Halpern e/ a/., 2002 ), 白蛋白 -B型脑利钠肽（Wang W «/.， 2004)、 白蛋白-人胰岛素（Duttaroy 2005 )、 白蛋白 IL-2 (Melder e? «/., 2005 ) 均处于 I /II期临床试验阶段。 近些年来， 我国也有大量研究采用白蛋白 作为载体以获得长效药物（唱韶红等， 2006; 富岩等， 2011 ; 郭泽峰等， 2008; 黄迎春等， 2011 ; 金光泽 等， 2010; 丁月娣等， 2009; 李道远等， 2009; 刘俊丽等 2011 ; 王楠等， 2007; 龙娟等， 2008 ; 张梅等， 2009； 张国新等， 2008; 周利苹等， 2008 )。 采用白蛋白融合方法延长活性肽或蛋白药物体 内的半衰期已 成为一种通行的技术。 促血小板生成素 （thrombopoietin, TPO) 由 332个氨基酸组成， 含有两个功能区域： 153个氨基酸组成 的 N端以及 179个氨基酸组成的 C端。 TPO的生物学作用是促进巨核细胞的增殖、 分化与成熟， 促进血小板 的产生， 是血小板生成的最重要的调节因子。 它还可加速原始造血干细胞进入细胞周期， 促进其增殖， 而 对粒细胞集落和红细胞无明显影响 （陈学良和宋丽， 1998; 隋杰和肖灿鹏， 2002 )。 因此， 促血小板生成 素对于维持机体的正常凝血功能有着重要的意 义， 目前， 重组人血小板生成素 (rhTPO ) 已由沈阳三生开 发生产并已上市，商品名特比澳，用于治疗放 疗和化疗引发的血小板减少症。然而，美国在 完成 rhTPO I /II 临床试验后发现它引起 TPO中和性抗体的产生， 这将导致继续使用无效甚至是进一步的血小板 减少， 因此 中止了后续的临床试验。 事实上， 全球范围内 rhTPO仅在中国上市 （郭涛和刘丹 ,2011 )。

多种治疗肿瘤的化疗药物可引起骨髓抑抑制， 导致病人血小板数量的减少， 产生自发性出血， 危及生 命。 尽管多种重组人细胞因子诸如： IL-1， IL-3 , IL— 6, IL-11均具有一定的促血小板增生作用， 但大多会 引起头痛、 发热以及高血压等副作用 （李越希等， 2002 )。

TPO的生理功能的发挥是通过与靶细胞表面的 TPO受体 （c-mpl) 的结合， 引起了 c-mp啲二聚体化， 进而诱发细胞内一系列的蛋白质磷酸化， 导致细胞内信号级联放大产生效应 （汪治清和杨新科， 1998 )。 对于 TPO晶体结构的研究表明该分子具有两个受体结 合位点， 这使一分子 TPO可以和两分子受体结合， 进 而引起的受体分子双体化 （Feese ei a/., 2004 )。 研究人员采用噬菌体展示库技术筛选与 TPO非同源但高活 性的模拟肽。 这一多肽为 14肽， 它可选择性结合于 TPO受体， 尤其是当它形成二聚体后， 其体外与受体的 亲和活性与天然 TP0相当 （C _W1 rl _e « ., 1997)。 由于 TPO模拟肽分子量小， 易于被肾小球滤除， 因而它同其 它分子量小的肽和蛋白类似， 在体内应用后半衰期短， 仅有几分钟。 安进公司将这一模拟肽与抗体的 Fc片 段融合， 开发的 Nplate产品已于 2008年 8月上市， 用于治疗原发性血小板减少症。 该产品具有 TPO活性， 但 由于同 TPO不同源， 避免了中和性抗体的产生， 但是由于 Fc片段为非惰性蛋白， Nplate因此带来了免疫负 作用。

为克服 Nplate的缺陷， 我国研究者因此将同一模拟肽二聚体与人血清 白蛋白融合， 用于延长 TP0模拟 肽的半衰期 （CN201110420870.0), 该融合蛋白可促进 Mo7e细胞增殖。 但是， 当我们将这一融合蛋白给正 常小鼠皮下注射， 未能检测到它促血小板生成活性， 在原发性血小板减少症模型中也没有效果。综 上所述， 市场上正期待有更好表现的新一代促血小板生 成的药物。

本发明提供二聚体化促血小板生成素模拟肽 TMP二联体-人血清白蛋白融合蛋白的制备方法� �应用。 本发明在人血清白蛋白与促血小板生成素模拟 肽 TMP二联体间加入二聚体化结构域 H， 同时选择性加入 fip结构域， 经过改造的促血小板生成素模拟肽 TMP二联体 -人血清白蛋白融合蛋白将在表达时二聚体化� � 我们克隆了改造后的融合蛋白基因， 并将其连接入酵母或哺乳动物高效表达质粒， 使重组融合蛋白在酵母 或动物细胞中高效表达。 表达产物经纯化后， 正常小鼠皮下注射， 可显著提升血小板数； 皮下注射给予小 鼠原发性和继发性血小板减少症模型， 治疗效果显著。 参考文献 唱韶红,巩新,杨志愉，王同映,马国昌，马清钧 ,吴军.2006.人血清白蛋白和人干扰素 a2b 的融合蛋白在毕赤酵 母中的表达.生物工程学报 11 173-179. 陈学良,宋丽.1998.血小板生成素的研究新进展.� ��外医学 (生理、 病理科学与临床分） 18:99-101.

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本发明的目的在于提供一种二聚体化促血小板 生成素模拟肽 TMP二联体-人血清白蛋白融合蛋白的制 备和应用。

本发明所述的二聚体化融合蛋白包括促血小板 生成素模拟肽 TMP 二联体、 肽接头和人血清白蛋白 HSA组成， 该融合蛋白还含有二聚体化结构域。

本发明所述的二聚体化结构域是通过二硫键的 共价作用使两个促血小板生成素模拟肽 TMP二联体-人 血清白蛋白融合蛋白单体二聚体化， 从而形成二聚体化的血小板生成素模拟肽 TMP二联体-人血清白蛋白 HSA融合蛋白。

本发明所述的二聚体化结构域选自肽段 (H)或选自 f _lp 结构域的肽段 (fip；)。

本发明所述的二聚体化结构域为肽段 (H)和选自 fip结构域的肽段 （f _ip )。

本发明所述的肽段 (H)的基因序列如 Seq ID No: l所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:2所示。

本发明所述的选自 fip结构域的肽段的基因序列如 Seq ID No:3所示，氨基酸序列如 Seq ID No:4所示。 本发明所述的 HSA可以连接于融合蛋白的 N-末端， 结构式表示为 TMP-L-TMP-L5-H-fip-HSA， L和

L5表示肽接头， H表示二聚体化结构域肽段， fip表示选自 fip结构域的肽段。

本发明所述的 HSA可以连接于融合蛋白的 C-末端，结构式表示为 HSA-L6-H-L7-TMP-L-TMP, L、 L6、

L7表示肽接头， H表示二聚体化结构域肽段。

本发明所述的 L的核苷酸序列为 GGTGGCGGCTCCGGA, 氨基酸序列为 GGGSG。

本发明所述的 L的核苷酸序列为 TCCGGA, 氨基酸序列为 SG。

本发明所述的 L的核苷酸序列为 GGTGGCCCCTCCGGA, 氨基酸序列为 GGPSG。

本发明所述的 L 的核苷酸序列为 GGCGGTGGCGGCAGCGGTGGCGGCTCCGGA, 氨基酸序列为

GGGGSGGGSG。

本发明所述的 L5的核苷酸序列为 GGCGGCGGCGGAAGCAGATCT, 氨基酸序列为 GGGGSRS。 本发明所述的 L6的核苷酸序列为 GGCGGCGGCGGTTCCGGACTG, 氨基酸序列为 GGGGSGL。 本发明所述的 L7的核苷酸序列为 GGTGGCGGCTCCGGA, 氨基酸序列为 EFGGGGS。 本发明所述的促血小板生成素模拟肽 TMP的基因序列如 Seq ID No:5所示，氨基酸序列如 Seq ID No:6 所示， 或该氨基酸序列经突变后具有同样功能的序列 。

本发明所述的 HSA如 Seq ID No:7所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:8所示， 或该氨基酸序列经突变后 具有同样功能的序列。

本发明所述的融合蛋白采用哺乳动物细胞表达 制备。

本发明所述的哺乳动物细胞为 CHO细胞。

本发明所述的融合蛋白采用酵母细胞表达制备 。

本发明所述的酵母为嗜甲醇毕赤酵母 Pichia pastoris ,

本发明还提供了一种促血小板生成素模拟肽 TMP二联体-人血清白蛋白的二聚体化融合蛋白� �制备治 疗原发性或继发性血小板减少症的药物中应用 。 附图说明

图 1. 二聚体化促血小板生成素模拟肽 TMP二联体 -人血清白蛋白的基因片段 （N末端） 构建路线图 图 2. 二聚体化促血小板生成素模拟肽 TMP二联体 -人血清白蛋白的基因片段 （C末端） 构建路线图 图 3. 二聚体化促血小板生成素模拟肽 TMP 二联体-人血清白蛋白融合蛋白酵母表达载体 pPinka-TMP-L-TMP-L5-H-fip-HSA的构建

图 4. 二聚体化促血小板生成素模拟肽 TMP二联体-人血清白蛋白融合蛋白的基因片段� �N末端）构建路线 图

图 5. 二聚体化促血小板生成素模拟肽 TMP 二联体-人血清白蛋白融合蛋白酵母表达载体 pPinka-HSA-L6-H-L7-TMP-L-TMP的构建

图 6.二聚体化促血小板生成素模拟肽 TMP二联体-人血清白蛋白融合蛋白的基因片段 （C末端） 构建路线 图 具体实施例

实施例一二聚体化促血小板生成素模拟肽 TMP二联体-人血清白蛋白融合蛋白 CHO表达载体的构建与筛 选

一.包含 TMP-Ll-TMP-L5-H-fip-HSA的载体的构建

HSA cDNA的片段的克隆： 用 PCR方法从质粒 pcDNA3.1-fip-HSA (HSA全基因序列由宝生物公司全基因 合成， pcDNA3.1质粒购自 Invitrogen)分两段扩增获得 HSA cDNA, 分别为 fip (Postl ) -HSA (Prel ) (fip 为选自 fip结构域的肽段， HSA为人血清白蛋白， Pre表示前半部分， post表示后半部分， 基因序列如 Seq ID No:9所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:10所示） 和 HSA (Postl ) -His (Post为 HSA后端， His为组氨 酸尾部标记， HSA (Postl ) -His的基因序列如 Seq ID No: 11所示， 氨基酸序列如 Seq ID No: 12所示的）。 用弓 I物 PI ( cgtggccatcatggagaccaaccccagcatcgatgcacacaagagtgaggttgctc ) , P2 ( cacagcacttctctagagtggtttc )扩增 所得产物为 HSA (Prel ), 之后采用 PCR纯化试剂盒 （购自上海生工） 纯化， 再以 HSA (Prel ) 为模板， 用弓 I物 P2 ( cacagcacttctctagagtggtttc ) , P3 ( gaagctgcaggactacatcgacaggatcatcgtggccatcatggagaccaacccc ) 扩增 所得产物为 fip (Postl ) -HSA (Prel ), 然后用限制性内切酶 Pstl和 Xbal (购自上海生工） 进行消化， 用 胶回收试剂盒 （购自上海生工） 进行片段回收； 用引物 P4 ( gaaaccactctagagaagtgctgtg ) , P5 ( gaaactcgagtcagtggtggtggtggtggtgtaagcctaaggcagcttgacttgcagc )扩增所得产物为 HSA (Postl ) -His, 然后用 限制性内切酶 Xbal和 Xhol (购自上海生工） 进行消化， 用胶回收试剂盒进行片段回收。 所述引物由宝生 物工程（大连）有限公司合成。

ss-TMP-Ll-TMP-L5-H-iip (Prel ) 的克隆： 利用基因合成的方法制备用于含有信号序列和 连接子的 TMP 基因 ss-TMP-Ll-TMP ( ss为哺乳动物细胞 CHO的信号肽， TMP为模拟肽， L1为肽接头， 其基因序列为 GGTGGCGGCTCCGGA, 氨基酸序列为 GGGSG, ss-TMP-Ll-TMP的基因序列如 Seq ID No:13所示， 氨基 酸序列如 Seq ID No: 14所示）， 该序列由宝生物工程（大连）有限公司合成， 并连接至 pMD19-T Simple载 体。 用 PCR 方法从质粒 pMD19-T-ss-TMP-Ll-TMP 获得 TMP cDNA 片段。 用弓 I物 P6 ( ctggatggcctccatcagctcgtccctgctcacgcacggtgggcatgtgtgagttttg )， P7 ( gaagaagctttgctatggagacagacacactcct )扩增 所得产物为 ss-TMP-Ll-TMP， 用 PCR纯化试剂盒纯化 （购自上海生工）， 再以 ss- TMP-L1-TMP为模板， 用 弓 I 物 P7 ( gaag aagctttgctatgg ag ac ag acac actcct ) ， P8

( gaagctgcagcctgaagttgatctcctcctgcttctggatggcctccatcagctcgtc ) 扩增所得产物为 ss-TMP-Ll -TMP-L5-H-fip (Prel )， 基因序列如 Seq ID No:15所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:16所示， 然后用限制性内切酶 Hindlll 和 Pstl进行消化， 用胶回收试剂盒进行片段回收， 获得纯化的 ss-TMP-Ll-TMP-L5-H-fip (Prel ) 片段。 包含 ss-TMP-Ll-TMP-L5-H-fip-HSA-His 的载体的构建： 用限制性内切酶 Hindlll和 Xhol 消化质粒 pcDNA3.1-fip-HSA, 用胶回收试剂盒进行片段回收得到载体 pcDNA3.1。 将前述三个回收片段 fip (Postl ) -HSA (Prel ), HSA (Postl ) -His和 ss-TMP-Ll -TMP-L5-H-fip (Prel )与回收载体以摩尔数比用 5 : 5： 5： 1的比例混合， 并加入 5U T4连接酶， 16°C反应 4小时。 反应产物用 CaCl ₂ 热休克转化 DH5a菌 （购自天 根生化科技有限公司）。转化菌涂布于含氨苄 青霉素的 LB固体平板培养基（胰化蛋白胨 10g， 酵母提取物 5g， NaCl 10g, 摇动容器直至溶质溶解， 用 5mol/L NaOH调 pH至 7.0。 用去离子水定容至 1L。 在 15psi 高压下蒸汽灭菌 20mm) 上进行菌落筛选。 从平板上挑取单克隆接入 lmL LB液体培养基， YTC, 220rpm 培养 6-8hr， 进行菌液 PCR筛选， 筛选出的阳性菌落后， 再进一步小量提取质粒， 并进行双酶切鉴定， 酶 切鉴定无误后送往公司测序，测序正确的克隆 即为含 ss-TMP-Ll-TMP-L5-H-fip-HSA-His基因的目标克隆 1。 其序列如 Seq ID No:17所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:18所示。 二聚体化 HSA蛋白载体与二联体 TPO模 拟肽融合蛋白的基因片段（N末端） 构建路线图见图 1。

二.包含 TMP-L2-TMP-L5-H-fip-HSA的载体的构建

HSA cDNA的片段的克隆：用 PCR方法从质粒 pcDNA3.1-fip-HSA (HSA全基因序列由宝生物公司全基因 合成， pcDNA3.1质粒购自 Invitrogen)分两段扩增获得 HSA cDNA, 分别为 fip (Postl ) -HSA (Prel ) (fip 为选自 fip结构域的肽段， HSA为人血清白蛋白， Pre表示前半部分， post表示后半部分， 基因序列如 Seq ID No:9所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:10所示）和 HSA (Postl ) -His (Post为 HSA后端， His为组氨 酸尾部标记， HSA (Postl ) -His的基因序列如 Seq ID No: 11所示， 氨基酸序列如 Seq ID No: 12所示的）。 用弓 I物 PI ( cgtggccatcatggagaccaaccccagcatcgatgcacacaagagtgaggttgctc ) , P2 ( cacagcacttctctagagtggtttc )扩增 所得产物为 HSA (Prel ), 之后采用 PCR纯化试剂盒（购自上海生工） 纯化， 再以 HSA (Prel ) 为模板， 用弓 I物 P2 ( cacagcacttctctagagtggtttc ) , P3 ( gaagctgcaggactacatcgacaggatcatcgtggccatcatggagaccaacccc ) 扩增 所得产物为 fip (Postl ) -HSA (Prel ), 然后用限制性内切酶 Pstl和 Xbal (购自上海生工）进行消化， 用 胶回收试剂盒 （购自上海生工） 进行片段回收； 用引物 P4 ( gaaaccactctagagaagtgctgtg ) , P5 ( gaaactcgagtcagtggtggtggtggtggtgtaagcctaaggcagcttgacttgcagc )扩增所得产物为 HSA (Postl ) -His, 然后用 限制性内切酶 Xbal和 Xhol (购自上海生工） 进行消化， 用胶回收试剂盒进行片段回收。 所述引物由宝生 物工程 （大连）有限公司合成。

ss-TMP-L2-TMP-L5-H-lip (Prel ) 的克隆： 利用基因合成的方法制备用于含有信号序列和 连接子的 TMP 基因 _SS -TMP-L2-TMP ( ss为哺乳动物细胞 CHO的信号肽， TMP为模拟肽， L2为肽接头， 其基因序列为 TCCGGA, 氨基酸序列为 SG)， 该序列由宝生物工程 （大连）有限公司合成， 并连接至 pMD19-T Simple 载体。 用 PCR 方法从质粒 pMD19-T-ss-TMP-L2-TMP 获得 TMP cDNA 片段。 用引物 P6 ( ctggatggcctccatcagctcgtccctgctcacgcacggtgggcatgtgtgagttttg )， P7 ( gaagaagctttgctatggagacagacacactcct )扩增 所得产物为 -TMP-L2-TMP, 用 PCR纯化试剂盒纯化 （购自上海生工）， 再以 ss- TMP-L2-TMP为模板， 用 弓 I 物 P7 ( gaag aagctttgctatgg ag ac ag acac actcct ) ， P8

( gaagctgcagcctgaagttgatctcctcctgcttctggatggcctccatcagctcgtc ) 扩增所得产物为 ss-TMP-L2-TMP-L5-H-fip (Prel ) , 然后用限制性内切酶 Hmdlll和 Pstl进行消化， 用胶回收试剂盒进行片段回收， 获得纯化的 ss-TMP-L2-TMP-L5-H-fip (Prel ) 片段。

包含 ss-TMP-L2-TMP-L5-H-fip-HSA-His 的载体的构建： 用限制性内切酶 Hmdlll和 Xhol 消化质粒 pcDNA3.1-fip-HSA, 用胶回收试剂盒进行片段回收得到载体 pcDNA3.1。 将前述三个回收片段 fip (Postl ) -HSA (Prel ), HSA (Postl ) -His和 ss-TMP-L2-TMP-L5-H-fip (Prel )与回收载体以摩尔数比用 5 : 5： 5： 1的比例混合， 并加入 5U T4连接酶， 16°C反应 4小时。 反应产物用 CaCl ₂ 热休克转化 DH5a菌 （购自天 根生化科技有限公司）。转化菌涂布于含氨苄 青霉素的 LB固体平板培养基（胰化蛋白胨 10g， 酵母提取物 5g， NaCl 10g, 摇动容器直至溶质溶解， 用 5mol/L NaOH调 pH至 7.0。 用去离子水定容至 1L。 在 15psi 高压下蒸汽灭菌 20mm) 上进行菌落筛选。 从平板上挑取单克隆接入 lmL LB液体培养基， 37°C, 220rpm 培养 6-8hr， 进行菌液 PCR筛选， 筛选出的阳性菌落后， 再进一步小量提取质粒， 并进行双酶切鉴定， 酶 切鉴定无误后送往公司测序，测序正确的克隆 即为含 ss-TMP-L2-TMP-L5-H-fip-HSA-His基因的目标克隆 2。 其序列如 Seq ID No:19所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:20所示。 三.包含 TMP-L3-TMP-L5-H-fip-HSA的载体的构建

HSA cDNA的片段的克隆：用 PCR方法从质粒 pcDNA3.1-fip-HSA (HSA全基因序列由宝生物公司全基因 合成， pcDNA3.1质粒购自 Invitrogen)分两段扩增获得 HSA cDNA, 分别为 fip (Postl ) -HSA (Prel ) (fip 为选自 fip结构域的肽段， HSA为人血清白蛋白， Pre表示前半部分， post表示后半部分， 基因序列如 Seq ID No:9所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:10所示）和 HSA (Postl ) -His (Post为 HSA后端， His为组氨 酸尾部标记， HSA (Postl ) -His的基因序列如 Seq ID No: 11所示， 氨基酸序列如 Seq ID No: 12所示的）。 用弓 I物 PI ( cgtggccatcatggagaccaaccccagcatcgatgcacacaagagtgaggttgctc ) , P2 ( cacagcacttctctagagtggtttc )扩增 所得产物为 HSA (Prel ), 之后采用 PCR纯化试剂盒（购自上海生工） 纯化， 再以 HSA (Prel ) 为模板， 用弓 I物 P2 ( cacagcacttctctagagtggtttc ) , P3 ( gaagctgcaggactacatcgacaggatcatcgtggccatcatggagaccaacccc ) 扩增 所得产物为 fip (Postl ) -HSA (Prel ), 然后用限制性内切酶 Pstl和 Xbal (购自上海生工）进行消化， 用 胶回收试剂盒 （购自上海生工） 进行片段回收； 用引物 P4 ( gaaaccactctagagaagtgctgtg ) , P5 ( aaactcgagtcagtggtggtggtggtggtgtaagcctaaggcagcttgacttgcagc )扩增所得产物为 HSA (Postl ) -His, 然后用 限制性内切酶 Xbal和 Xhol (购自上海生工） 进行消化， 用胶回收试剂盒进行片段回收。 所述引物由宝生 物工程（大连）有限公司合成。

ss-TMP-L3-TMP-L5-H-iip (Prel ) 的克隆: 利用基因合成的方法制备用于含有信号序列和 连接子的 TMP 基因 SS-TMP-L3-TMP ( ss为哺乳动物细胞 CHO的信号肽， TMP为模拟肽， L3为肽接头， 其基因序列为 GGTGGCCCCTCCGGA, 氨基酸序列为 GGPSG), 该序列由宝生物工程（大连）有限公司合成， 并连接至 pMD19-T Simple载体。 用 PCR方法从质粒 pMD19-T-ss-TMP-L3-TMP获得 TMP cDNA片段。 用引物 P6 ( ctggatggcctccatcagctcgtccctgctcacgcacggtgggcatgtgtgagttttg )， P7 ( gaagaagctttgctatggagacagacacactcct )扩增 所得产物为 ss-TMP-L3-TMP， 用 PCR纯化试剂盒纯化 （购自上海生工）， 再以 ss- TMP-L3-TMP为模板， 用 弓 I 物 P7 ( gaag aagctttgctatgg ag ac ag acac actcct ) ， P8

( gaagctgcagcctgaagttgatctcctcctgcttctggatggcctccatcagctcgtc ) 扩增所得产物为 ss-TMP-L3-TMP-L5-H-fip (Prel ) , 然后用限制性内切酶 Hmdlll和 Pstl进行消化， 用胶回收试剂盒进行片段回收， 获得纯化的 ss-TMP-L3 -TMP-L5 -H-fip (Prel ) 片段。

包含 ss-TMP-L3-TMP-L5-H-fip-HSA-His 的载体的构建： 用限制性内切酶 Hindlll和 Xhol 消化质粒 pcDNA3.1-fip-HSA, 用胶回收试剂盒进行片段回收得到载体 pcDNA3.1。 将前述三个回收片段 fip (Postl ) -HSA (Prel ), HSA (Postl ) -His和 ss-TMP-L3-TMP-L5-H-fip (Prel )与回收载体以摩尔数比用 5 : 5： 5： 1的比例混合， 并加入 5U T4连接酶， 16°C反应 4小时。 反应产物用 CaCl ₂ 热休克转化 DH5a菌 （购自天 根生化科技有限公司）。转化菌涂布于含氨苄 青霉素的 LB固体平板培养基（胰化蛋白胨 10g， 酵母提取物 5g， NaCl 10g, 摇动容器直至溶质溶解， 用 5mol/L NaOH调 pH至 7.0。 用去离子水定容至 1L。 在 15psi 高压下蒸汽灭菌 20mm) 上进行菌落筛选。 从平板上挑取单克隆接入 lmL LB液体培养基， YTC, 220rpm 培养 6-8hr， 进行菌液 PCR筛选， 筛选出的阳性菌落后， 再进一步小量提取质粒， 并进行双酶切鉴定， 酶 切鉴定无误后送往公司测序，测序正确的克隆 即为含 ss-TMP-L3-TMP-L5-H-fip-HSA-His基因的目标克隆 3。 其序列如 Seq ID No :21所示， 氨基酸序列如 Seq ID No :22所示。 四.包含 TMP-L4-TMP-L5-H-fip-HSA的载体的构建

HSA cDNA的片段的克隆：用 PCR方法从质粒 pcDNA3.1-fip-HSA (HSA全基因序列由宝生物公司全基因 合成， pcDNA3.1质粒购自 Invitrogen)分两段扩增获得 HSA cDNA, 分别为 fip (Postl ) -HSA (Prel ) (fip 为选自 fip结构域的肽段， HSA为人血清白蛋白， Pre表示前半部分， post表示后半部分， 基因序列如 Seq ID No:9所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:10所示）和 HSA (Postl ) -His (Post为 HSA后端， His为组氨 酸尾部标记， HSA (Postl ) -His的基因序列如 Seq ID No: 11所示， 氨基酸序列如 Seq ID No: 12所示的）。 用弓 I物 PI ( cgtggccatcatggagaccaaccccagcatcgatgcacacaagagtgaggttgctc ) , P2 ( cacagcacttctctagagtggtttc )扩增 所得产物为 HSA (Prel ), 之后采用 PCR纯化试剂盒（购自上海生工） 纯化， 再以 HSA (Prel ) 为模板， 用弓 I物 P2 ( cacagcacttctctagagtggtttc ) , P3 ( gaagctgcaggactacatcgacaggatcatcgtggccatcatggagaccaacccc ) 扩增 所得产物为 fip (Postl ) -HSA (Prel ), 然后用限制性内切酶 Pstl和 Xbal (购自上海生工）进行消化， 用 胶回收试剂盒 （购自上海生工） 进行片段回收； 用引物 P4 ( gaaaccactctagagaagtgctgtg ) , P5 ( gaaactcgagtcagtggtggtggtggtggtgtaagcctaaggcagcttgacttgcagc )扩增所得产物为 HSA ( Postl ) -His, 然后用 限制性内切酶 Xbal和 Xhol (购自上海生工） 进行消化， 用胶回收试剂盒进行片段回收。 所述引物由宝生 物工程（大连）有限公司合成。

ss-TMP-L4-TMP-L5-H-iip (Prel ) 的克隆： 利用基因合成的方法制备用于含有信号序列和 连接子的 TMP 基因 SS-TMP-L4-TMP ( ss为哺乳动物细胞 CHO的信号肽， TMP为模拟肽， L4为肽接头， 其基因序列为 GGCGGTGGCGGCAGCGGTGGCGGCTCCGGA , 氨基酸序列为 GGGGSGGGSG ) , 该序列由宝生物工程

(大连） 有限公司合成， 并连接至 pMD19-T Simple载体。 用 PCR方法从质粒 pMD19-T-ss-TMP-L4-TMP 获得 TMP cDNA 片段。 用引物 P6 ( ctggatggcctccatcagctcgtccctgctcacgcacggtgggcatgtgtgagttttg ) , P7

( gaagaagctttgctatggagacagacacactcct )扩增所得产物为 ss-TMP-L4-TMP， 用 PCR纯化试剂盒纯化（购自上 海生工）， 再以 ss- TMP-L4-TMP 为模板， 用引物 P7 ( gaagaagctttgctatggagacagacacactcct ) , P8

( gaagctgcagcctgaagttgatctcctcctgcttctggatggcctccatcagctcgtc ) 扩增所得产物为 ss-TMP-L4-TMP-L5-H-fip

(Prel ) , 然后用限制性内切酶 Hmdlll和 Pstl进行消化， 用胶回收试剂盒进行片段回收， 获得纯化的 ss-TMP-L4-TMP-L5-H-fip (Prel ) 片段。

包含 ss-TMP-L4-TMP-L5-H-fip-HSA-His 的载体的构建： 用限制性内切酶 Hindlll和 Xhol 消化质粒 pcDNA3.1-fip-HSA, 用胶回收试剂盒进行片段回收得到载体 pcDNA3.1。 将前述三个回收片段 fip (Postl ) -HSA (Prel ) , HSA ( Postl ) -His和 ss-TMP-L4-TMP-L5-H-fip ( Prel )与回收载体以摩尔数比用 5 : 5： 5： 1的比例混合， 并加入 5U T4连接酶， 16°C反应 4小时。 反应产物用 CaCl ₂ 热休克转化 DH5a菌 （购自天 根生化科技有限公司）。转化菌涂布于含氨苄 青霉素的 LB固体平板培养基（胰化蛋白胨 10g， 酵母提取物 5g， NaCl 10g, 摇动容器直至溶质溶解， 用 5mol/L NaOH调 pH至 7.0。 用去离子水定容至 1L。 在 15psi 高压下蒸汽灭菌 20mm ) 上进行菌落筛选。 从平板上挑取单克隆接入 lmL LB液体培养基， 37°C , 220rpm 培养 6-8hr， 进行菌液 PCR筛选， 筛选出的阳性菌落后， 再进一步小量提取质粒， 并进行双酶切鉴定， 酶 切鉴定无误后送往公司测序，测序正确的克隆 即为含 ss-TMP-L4-TMP-L5-H-fip-HSA-His基因的目标克隆 4。 其序列如 Seq ID No :23所示， 氨基酸序列如 Seq ID No :24所示。 五. 包含 HSA-L6-H-L7-TMP-L1-TMP载体的构建

SS-HSA-L6-H-L7 的 克 隆 ： 用 弓 I 物 P4 ( gaaaccactctagagaagtgctgtg ) ， P5 ( gaaactcgagtcagtggtggtggtggtggtgtaagcctaaggcagcttgacttgcagc )扩增所得产物为 HSA ( Post2 ) -His, 基因序 列如 Seq ID No:25所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:26所示， 然后用限制性内切酶 Xbal和 Xhol (购自上海 生工） 进行消化， 用胶回收试剂盒进行片段回收。 所述引物由宝生物工程（大连） 有限公司合成。

用 弓 I 物 PI ( gaagctgcaggactacatcgacaggatcatcgtggccatcatggagaccaacccc ) ， P2 ( cgtggccatcatggagaccaaccccagcatcgatgcacacaagagtgaggttgctc )扩增所得产物为 HSA (Mid ) , 基因序列如 Seq ID No:27所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:28所示， 之后采用 PCR纯化试剂盒（购自上海生工） 纯化。

利用基因合成的方法制备含有用于在 CHO 细胞中表达的信号序列和 HSA基因前端序列 ss-HSA (Pre2)， 该序列由宝生物工程 （大连）有限公司合成， 连接至 pMD19-T Simple载体。 用限制性内切酶 Hindlll和 Msel (购自 NEB公司） 消化质粒 pMD19-T-ss-HSA (Pre2 ) 获得 ss-HSA (Pre2) 片段， 基因序 列如 Seq ID No:29所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:30所示， 用胶回收试剂盒进行片段回收。

用限制性内切酶 Hindlll和 Xhol消化质粒 pcDNA3.1-fip-HSA， 用胶回收试剂盒进行片段回收得到载 体 pcDNA3.1。 将前述三个回收片段 ss-HSA (Pre2)， HSA ( Mid) 禾卩 HSA (Post2 ) -His与回收载体以摩 尔数比用 5 : 5： 5： 1的比例混合， 加入 5U T4连接酶， 16°C反应 4小时。 反应产物用 CaCl ₂ 热休克转化 DH5(x菌（购自天根生化科技有限公司）。 转化菌涂布于含氨苄青霉素的 LB固体平板培养基上进行菌落筛 选。 挑取含有重组子的菌落， 命名为 pcDNA3.1-ss-HSA。

用 PCR 方 法 从 质 粒 pcDNA3.1 -ss-HSA 分 两 段 获 得 HSA cDNA 。 用 弓 I 物 P7

( aagaagctttgctatggagacagacacactcct ) , P2 ( cgtggccatcatggagaccaaccccagcatcgatgcacacaagagtgaggttgctc )扩增 所得产物为 ss-HSA (pre3 )， 基因序列如 Seq ID No:31所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:32所示， 然后用限 制性内切酶 Hmdlll 和 Xbal 进行消化， 用胶回收试剂盒进行片段回收； 用引物 P4

( gaaaccactcta a aagtgctgtg , )， P9 ( gaaggaattccttgccgggggacaggctca)扩增所得产物为 HSA (post3 ) -L6-H-L7, 基因序列如 Seq ID No:33所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:34所示， 然后用限制性内切酶 Xbal和 EcoRI进 行消化， 用胶回收试剂盒进行片段回收。

TMP-L1-TMP 序列的合成： 利用基因合成的方法制备 TMP 基因 TMP-L1 -TMP ( L1 基因序列为 GGTGGCGGCTCCGGA, 氨基酸序列为 GGGSG, 全序列由宝生物工程 （大连） 有限公司合成， 连接至 pMD19-T Simple载体）。用限制性内切酶 EcoRI和 Xhol消化质粒 pMD19-T-TMP-Ll-TMP获得 TMP-L1-TMP 片段， 用胶回收试剂盒进行片段回收。

包含 -HSA-L6-H-L7-TMP-L1-TMP 载体的构建： 用限制性内切酶 Hindlll 禾卩 Xhol 消化质粒 pcDNA3.1-fip-HSA , 用胶回收试剂盒进行片段回收得到载体 pcDNA3.1。 将前述三个回收片段 ss-HSA (pre3 ), HSA (post3 ) -L6-H-L7和 TMP-L1 -TMP与回收载体以摩尔数比用 5 : 5： 5： 1的比例混合， 加 入 5U T4连接酶， 16 反应 4小时。反应产物用 CaCl ₂ 热休克转化 DH5a菌（购自天根生化科技有限公司）。 转化菌涂布于含氨苄青霉素的 LB固体平板培养基上进行菌落筛选。 从平板上挑取单克隆接入 lmL LB液 体培养基， 37°C, 220rpm培养 6-8hr， 进行菌液 PCR筛选， 筛选出的阳性菌落后， 再进一步小量提取质粒， 并进行双酶切鉴定，酶切鉴定无误后送往公司 测序，测序正确的克隆即为含 SS-HSA-L6-H-L7-TMP-L1-TMP 基因的目标克隆 5。其序列如 Seq ID No:35所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:36所示。二聚体化 HSA蛋白载 体与二联体 TPO模拟肽融合蛋白的基因片段 （C末端） 构建路线图见图 2。 六. 包含 HSA-L6-H-L7-TMP-L2-TMP载体的构建

SS-HSA-L6-H-L7 的 克 隆 ： 用 弓 I 物 P4 ( gaaaccactctagagaagtgctgtg ) , P5 ( aaactcgagtcagtggtggtggtggtggtgtaagcctaaggcagcttgacttgcagc ) 扩增所得产物为 HSA ( Post2 ) -His, 基因序 列如 Seq ID No:25所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:26所示， 然后用限制性内切酶 Xbal和 Xhol (购自上海 生工） 进行消化， 用胶回收试剂盒进行片段回收。 所述引物由宝生物工程 （大连） 有限公司合成。

用 弓 I 物 PI ( gaagctgcaggactacatcgacaggatcatcgtggccatcatggagaccaacccc ) ， P2 ( cgtggccatcatggagaccaaccccagcatcgatgcacacaagagtgaggttgctc )扩增所得产物为 HSA (Mid ) , 基因序歹 ll如 Seq ID No:27所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:28所示， 之后采用 PCR纯化试剂盒 （购自上海生工） 纯化。

利用基因合成的方法制备含有用于在 CHO 细胞中表达的信号序列和 HSA 基因前端序列 ss-HSA (Pre2)， 该序列由宝生物工程 （大连） 有限公司合成， 连接至 pMD19-T Simple 载体。 用限制性内切酶 Hindlll和 Msel (购自 NEB公司） 消化质粒 pMD19-T-ss-HSA (Pre2) 获得 ss-HSA (Pre2) 片段， 基因序 列如 Seq ID No:29所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:30所示， 用胶回收试剂盒进行片段回收。

用限制性内切酶 Hmdlll和 Xhol消化质粒 pcDNA3.1-fip-HSA， 用胶回收试剂盒进行片段回收得到载 体 pcDNA3.1。 将前述三个回收片段 ss-HSA (Pre2), HSA (Mid) 禾 Π HSA (Post2 ) -His与回收载体以摩 尔数比用 5 : 5： 5： 1的比例混合， 加入 5U T4连接酶， 16°C反应 4小时。 反应产物用 CaCl ₂ 热休克转化 DH5( 菌（购自天根生化科技有限公司）。 转化菌涂布于含氨苄青霉素的 LB固体平板培养基上进行菌落篩 选。 挑取含有重组子的菌落， 命名为 pcDNA3.1-ss-HSA。

用 PCR 方 法 从 质 粒 pcDNA3.1 -ss-HSA 分 两 段 获 得 HSA cDNA 。 用 弓 I 物 P7

( gaagaagctttgctatggagacagacacactcct )， P2 ( cgtggccatcatggagaccaaccccagcatcgatgcacacaagagtgaggttgctc )扩增 所得产物为 ss-HSA (pre3 ), 基因序列如 Seq ID No:31所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:32所示， 然后用限 制性内切酶 Hmdlll和 Xbal进行消化，用胶回收试剂盒进行片段回收� �用引物 P4( gaaaccactctagagaagtgctgtg ) , Ρ9 ( gaaggaattccttgccgggggacaggctca ) 扩增所得产物为 HSA (post3 ) -L6-H-L7, 基因序列如 Seq ID No :33 所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:34所示， 然后用限制性内切酶 Xbal和 EcoRJ进行消化， 用胶回收试剂盒 进行片段回收。

TMP-L2-TMP序列的合成：利用基因合成的方法制� � TMP基因 TMP-L2-TMP (L2基因序列为 TCCGGA, 氨基酸序列为 SG， 全序列由宝生物工程 （大连） 有限公司合成， 连接至 pMD19-T Simple载体）。 用限制 性内切酶 EcofU和 Xhol消化质粒 pMD19-T-TMP-L2-TMP获得 TMP-L2-TMP片段， 用胶回收试剂盒进行 片段回收。

包含 SS-HSA-L6-H-L7-TMP-L2-TMP 载体的构建： 用限制性内切酶 Hindlll 禾卩 Xhol 消化质粒 pcDNA3.1-fip-HSA, 用胶回收试剂盒进行片段回收得到载体 pcDNA3.1。 将前述三个回收片段 ss-HSA (pre3 ), HSA (post3 ) -L6-H-L7和 TMP-L2-TMP与回收载体以摩尔数比用 5 : 5： 5： 1的比例混合， 加 入 5U T4连接酶， 16Ό反应 4小时。反应产物用 CaCl ₂ 热休克转化 DH5a菌（购自天根生化科技有限公司）。 转化菌涂布于含氨苄青霉素的 LB固体平板培养基上进行菌落筛选。 从平板上挑取单克隆接入 lmL LB液 体培养基， 37°C, 220rpm培养 6-8hr， 进行菌液 PCR筛选， 筛选出的阳性菌落后， 再进一步小量提取质粒， 并进行双酶切鉴定，酶切鉴定无误后送往公司 测序，测序正确的克隆即为含 SS-HSA-L6-H-L7-TMP-L2-TMP 基因的目标克隆 6。 其序列如 Seq ID No:37所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:38所示。 七. 包含 HSA-L6-H-L7-TMP-L3-TMP载体的构建

SS-HSA-L6-H-L7 的 克 隆 ： 用 弓 I 物 P4 ( gaaaccactctagagaagtgctgtg ) ， P5 ( aaactcgagtcagtggtggtggtggtggtgtaagcctaaggcagcttgacttgcagc ) 扩增所得产物为 HSA (Post2 ) -His, 基因序 列如 Seq ID No:25所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:26所示， 然后用限制性内切酶 Xbal和 Xhol (购自上海 生工） 进行消化， 用胶回收试剂盒进行片段回收。 所述引物由宝生物工程 （大连） 有限公司合成。

用 弓 I 物 PI ( gaagctgcaggactacatcgacaggatcatcgtggccatcatggagaccaacccc ) ， P2 ( cgtggccatcatggagaccaaccccagcatcgatgcacacaagagtgaggttgctc )扩增所得产物为 HSA (Mid), 基因序列如 Seq ID No:27所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:28所示， 之后采用 PCR纯化试剂盒 （购自上海生工） 纯化。 利用基因合成的方法制备含有用于在 CHO 细胞中表达的信号序列和 HSA 基因前端序列 ss-HSA (Pre2)， 该序列由宝生物工程 （大连） 有限公司合成， 连接至 pMD19-T Simple 载体。 用限制性内切酶 Hindlll和 Msel (购自 NEB公司） 消化质粒 pMD19-T-ss-HSA (Pre2) 获得 ss-HSA (Pre2) 片段， 基因序 列如 Seq ID No:29所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:30所示， 用胶回收试剂盒进行片段回收。

用限制性内切酶 Hindlll和 Xhol消化质粒 pcDNA3.1-fip-HSA， 用胶回收试剂盒进行片段回收得到载 体 pcDNA3.1。 将前述三个回收片段 ss-HSA (Pre2), HSA (Mid) 禾 B HSA (Post2 ) -His与回收载体以摩 尔数比用 5 : 5： 5： 1的比例混合， 加入 5U T4连接酶， 16°C反应 4小时。 反应产物用 CaCl ₂ 热休克转化 DH5a菌（购自天根生化科技有限公司）。 转化菌涂布于含氨苄青霉素的 LB固体平板培养基上进行菌落筛 选。 挑取含有重组子的菌落， 命名为 pcDNA3.1-ss-HSA。

用 PCR 方 法 从 质 粒 pcDNA3.1 -ss-HSA 分 两 段 获 得 HSA cDNA 。 用 弓 I 物 P7 ( gaagaagctttgctatggagacagacacactcct )， P2 ( cgtggccatcatggagaccaaccccagcatcgatgcacacaagagtgaggttgctc )扩增 所得产物为 ss-HSA (pre3 ), 基因序列如 Seq ID No:31所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:32所示， 然后用限 制性内切酶 Hmdlll和 Xbal进行消化，用胶回收试剂盒进行片段回收� �用引物 P4( gaaaccactctagagaagtgctgtg ) , Ρ9 ( gaaggaattccttgccgggggacaggctca ) 扩增所得产物为 HSA (post3 ) -L6-H-L7, 基因序列如 Seq ID No :33 所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:34所示， 然后用限制性内切酶 Xbal和 EcoRI进行消化， 用胶回收试剂盒 进行片段回收。

TMP-L3-TMP 序列的合成： 利用基因合成的方法制备 TMP 基因 TMP-L3-TMP ( L3 基因序列为 GGTGGCCCCTCCGGA, 氨基酸序列为 GGPSG, 全序列由宝生物工程 （大连） 有限公司合成， 连接至 pMD19-T Simple载体）。用限制性内切酶 EcoRI和 Xhol消化质粒 pMD19-T-TMP-L3-TMP获得 TMP-L3-TMP 片段， 用胶回收试剂盒进行片段回收。

包含 SS-HSA-L6-H-L7-TMP-L3-TMP 载体的构建： 用限制性内切酶 Hindlll 禾卩 Xhol 消化质粒 pcDNA3.1-fip-HSA, 用胶回收试剂盒进行片段回收得到载体 pcDNA3.1。 将前述三个回收片段 ss-HSA (pre3 ), HSA (post3 ) -L6-H-L7和 TMP-L3-TMP与回收载体以摩尔数比用 5 : 5： 5： 1的比例混合， 加 入 5U T4连接酶， 16°C反应 4小时。反应产物用 CaCl ₂ 热休克转化 DH5a菌（购自天根生化科技有限公司）。 转化菌涂布于含氨苄青霉素的 LB固体平板培养基上进行菌落筛选。 从平板上挑取单克隆接入 lmL LB液 体培养基， 37°C, 220rpm培养 6-8hr， 进行菌液 PCR筛选， 筛选出的阳性菌落后， 再进一步小量提取质粒， 并进行双酶切鉴定，酶切鉴定无误后送往公司 测序，测序正确的克隆即为含 SS-HSA-L6-H-L7-TMP-L3-TMP 基因的目标克隆 7。 其序列如 Seq ID No:39所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:40所示。 八. 包含 HSA-L6-H-L7-TMP-L4-TMP载体的构建

SS-HSA-L6-H-L7 的 克 隆 ： 用 弓 I 物 P4 ( gaaaccactctagagaagtgctgtg ) ， P5 ( gaaactcgagtcagtggtggtggtggtggtgtaagcctaaggcagcttgacttgcagc ) 扩增所得产物为 HSA (Post2 ) -His, 基因序 列如 Seq ID No:25所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:26所示， 然后用限制性内切酶 Xbal和 Xhol (购自上海 生工） 进行消化， 用胶回收试剂盒进行片段回收。 所述引物由宝生物工程 （大连） 有限公司合成。

用 弓 I 物 PI ( gaagctgcaggactacatcgacaggatcatcgtggccatcatggagaccaacccc ) ， P2 ( cgtggccatcatggagaccaaccccagcatcgatgcacacaagagtgaggttgctc )扩增所得产物为 HSA (Mid), 基因序列如 Seq ID No:27所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:28所示， 之后采用 PCR纯化试剂盒 （购自上海生工） 纯化。 利用基因合成的方法制备含有用于在 CHO 细胞中表达的信号序列和 HSA 基因前端序列 ss-HSA (Pre2), 该序列由宝生物工程 （大连） 有限公司合成， 连接至 pMD19-T Simple 载体。 用限制性内切酶 Hindlll和 Msel (购自 NEB公司） 消化质粒 pMD19-T-ss-HSA (Pre2) 获得 ss-HSA (Pre2) 片段， 基因序 列如 Seq ID No:29所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:30所示， 用胶回收试剂盒进行片段回收。

用限制性内切酶 Hindlll和 Xhol消化质粒 pcDNA3.1-fip-HSA， 用胶回收试剂盒进行片段回收得到载 体 pcDNA3.1。 将前述三个回收片段 ss-HSA (Pre2), HSA (Mid) 禾卩 HSA (Post2 ) -His与回收载体以摩 尔数比用 5 : 5： 5： 1的比例混合， 加入 5U T4连接酶， 16°C反应 4小时。 反应产物用 CaCl ₂ 热休克转化 DH5a菌（购自天根生化科技有限公司）。 转化菌涂布于含氨苄青霉素的 LB固体平板培养基上进行菌落筛 选。 挑取含有重组子的菌落， 命名为 pcDNA3.1-ss-HSA。

用 PCR 方 法 从 质 粒 pcDNA3.1 -ss-HSA 分 两 段 获 得 HSA cDNA 。 用 弓 I 物 P7 ( gaagaagctttgctatggagacagacacactcct ), P2 ( cgtggccatcatggagaccaaccccagcatcgatgcacacaagagtgaggttgctc )扩增 所得产物为 ss-HSA (pre3 ), 基因序列如 Seq ID No:31所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:32所示， 然后用限 制性内切酶 Hmdlll和 Xbal进行消化，用胶回收试剂盒进行片段回收� �用引物 P4( gaaaccactctagagaagtgctgtg), P9 ( gaaggaattccttgccgggggacaggctc ) 扩增所得产物为 HSA (post3 ) -L6-H-L7, 基因序列如 Seq ID No :33 所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:34所示， 然后用限制性内切酶 Xbal和 EcoRI进行消化， 用胶回收试剂盒 进行片段回收。

TMP-L4-TMP 序列的合成： 利用基因合成的方法制备 TMP 基因 TMP-L4-TMP ( L4 基因序列为 GGCGGTGGCGGCAGCGGTGGCGGCTCCGGA ,氨基酸序列为 GGGGSGGGSG,全序列由宝生物工程（大 连） 有限公司合成， 连接至 pMD19-T Simple 载体）。 用限制性内切酶 EcoRI 和 Xhol 消化质粒 PMD19-T-TMP-L4-TMP获得 TMP-L4-TMP片段， 用胶回收试剂盒进行片段回收。

包含 -HSA-L6-H-L7-TMP-L4-TMP 载体的构建： 用限制性内切酶 Hindlll 禾卩 Xhol 消化质粒 pcDNA3.1-fip-HSA, 用胶回收试剂盒进行片段回收得到载体 pcDNA3.1。 将前述三个回收片段 ss-HSA (pre3 ), HSA (post3 ) -L6-H-L7和 TMP-L4-TMP与回收载体以摩尔数比用 5 : 5： 5： 1的比例混合， 加 入 5U T4连接酶， 16Ό反应 4小时。反应产物用 CaCl ₂ 热休克转化 DH5a菌（购自天根生化科技有限公司）。 转化菌涂布于含氨苄青霉素的 LB固体平板培养基上进行菌落筛选。 从平板上挑取单克隆接入 lmL LB液 体培养基， 37°C, 220rpm培养 6-8hr， 进行菌液 PCR筛选， 筛选出的阳性菌落后， 再进一步小量提取质粒， 并进行双酶切鉴定，酶切鉴定无误后送往公司 测序，测序正确的克隆即为含 -HSA-L6-H-L7-TMP-L4-TMP 基因的目标克隆 8。 其序列如 Seq ID No:41所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:42所示。 实施例二 二聚体化促血小板生成素模拟肽 TMP二联体 -人血清白蛋白融合蛋白在哺乳动物细胞 CHO的表 达

大量提取质粒试剂盒 （凯杰公司， 上海）

L-谷氨酰胺、 次黄嘌呤钠和胸腺嘧啶增补试剂 （HT) 购自美国 Im trogen公司；

T75细胞培养瓶购自丹麦 NUNC公司；

2-L WAVE细胞培养袋购自美国通用电气公司医疗集� �部； 中华仓鼠卵巢悬浮细胞 （CHO-S ) 购自美国 Invitogen公司， 该细胞是一种从中华仓鼠卵巢亚系克隆 细胞 （CHO-K1 ) 分离出的克隆。 选择 CHO-S亲代细胞系用于细胞培养和转染。 CHO-S细胞适于无血清 悬浮培养， 使用添加有 8mM L-谷氨酰胺和 2mM胸腺嘧啶增补试剂（HT ) 的 FreeStyle™ CHO无血清表达 培养基 （Invitrogen), 可使 CHO-S细胞获得良好的生长状态以及较高的瞬时� ��达产物。

25-kDa线性 PE1转染试剂购自美国 PolySciences公司； 使用双蒸水将 PE1转染试剂制成 lmg/ml的母 液后， 用 1M HC1调节 pH值至 7.0， 经 0.22μιη无菌滤膜过滤分装， 置于 4'C保存；

1. 在 WAVE生物反应器中大规模瞬时转染悬浮 CHO-S细胞

取两支冻存的 CHO细胞 (冻存密度大于 5χ 10 ⁶ 活细胞 /毫升)， 分别以 15ml新鲜 FreeStyle™ CHO无血 清表达培养基复苏至两个 T75细胞培养瓶中，于 37°C、 5% v/v C0 ₂ 培养箱中静置培养。 待培养瓶中细胞密 度达到 2-3 x l0 ⁶ 活细胞 /毫升 (vc/ml ) 后， 连同 470ml新鲜 FreeStyle™ CHO无血清表达培养基一并转入 WAVE细胞袋，使用 WAVE生物反应器继续培养。 WAVE反应器摇摆角度和转速分别设置为 7.5°和 13.5rpm、 温度设定为 37°C， C0 ₂ 通气量设定为 10Lpm。 待细胞袋中细胞密度达到 l x lO ⁶ vc/ml、 细胞活力>95%时， 补加 500ml新鲜完全培养基， 并于次日进行转染。 每 1L细胞培养液转染使用 lmg质粒 DNA{ 1号克隆， 采用大量提取质粒试剂盒（凯杰公司， 上海） 提取， 操作步骤参见实验手册}和 3mgPEI。 转染当天， 使用 最终培养体积 5% v/v ( 50ml ) 的无菌 PBS混合质粒 DNA、 PEL 配制成转染复合物， 室温温育 10mm后 泵入 WAVE细胞袋， 继续培养细胞； 每日取样检测细胞活力， 当细胞活力降至 50%或转染至第七天时， 收 集 WAVE细胞袋中的培养物， 4°C下 lOOOOrpm离心十分钟， 获得含目标产物的细胞瞬时表达上清。

实施例 1中得到的 2-8号克隆也采用相同的方法瞬时转染至 CHO-S细胞株中， 分别得到含有 TMP-L2-TMP-L5 -H-fip-HSA序列、 TMP-L2-TMP-L5-H-fip-HSA序列、 TMP-L2-TMP-L5-H-fip-HSA序列、 HSA-L6-H-L7-TMP-L1 -TMP序列、 HSA-L6-H-L7-TMP-L2-TMP序列、 HSA-L6-H-L7-TMP-L3-TMP序列、 HSA-L6-H-L7-TMP-L4-TMP序列编码目标产物的细胞瞬� �表达上清。 实施例三哺乳动物细胞 CHO表达的二聚体化促血小板生成素模拟肽 TMP二联体-人血清白蛋白融合蛋白 的纯化

对于带 His标签的 1-4号 CHO细胞株的细胞瞬时表达上清， 过 Ni Sepharose FF柱进行亲和层析， 收 集目标组分， 再过 Sephacjyl S-200分子筛术进行层析， 收集二聚体化融合蛋白和融合蛋白单体。 对于不带 ffis标签的 5-8号 CHO细胞株的细胞瞬时表达上清， 过 Capto blue柱进行亲和层析， 收集含 HSA载体蛋 白的目的融合蛋白组分，再上 Sephacjyl S-200分子筛术进行层析，收集二聚体化融合蛋� ��和融合蛋白单体。 经过上述纯化步骤， 分别得到纯化的 1-8号 CHO细胞株培养目标融合蛋白， 经非还原型 SDS-PAGE检査， 二聚体化融合蛋白在 SDS-PAGE 电泳图谱上显示为分子量大小为 150kDa 的条带， 单体融合蛋白在 SDS-PAGE电泳图谱上显示为分子量大小为 75kDa的条带， 其中单体比例 <10%。 实施例四 二聚体化促血小板生成素模拟肽 TMP二联体-人血清白蛋白融合蛋白酵母表达载� �的构建与筛 选

一. 包含 TMP-Ll-TMP-L5-H-fip-HSA载体的构建 以酵母表达载体 pPinka-HC ( invitrogen , USA ) 为模板， 利用引物 P12 ( cccgctttttggatgatt ) , P13 (gacttccggagccgccaccggccctagcagccagccactgccgcagtgtggggccttcg at ccttttctcgagagatacc ) , 通过 PCR扩增获得 α-factor-TMP-Ll， 基因序列如 Seq ID No:43所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:44所示。

提 取 克 隆 1 中 的 质 粒 pcDNA3.1-TMP-Ll-TMP-L5-H-fip-HSA 。 以 pcDNA3.1-TMP-Ll-TMP-L5-H-fip-HSA质粒载体为模板， 采用引物 14 ( gaaaccactctagagaagtgctgtg ) , 引物 15 ( cggggtacctcagtggtggtggtggtggtgtaagcctaaggcagcttgacttgcagc ) , 通过 PCR扩增获得 HSA (post4 ) -His, 基因序列如 Seq ID No:45所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:46所示。

上述 PCR扩增反应中模板 DNA用量为 250 ng,引物为 ΙΟΟρΜ,多聚酶是 EasyA PolymeraseC Stratagene, USA ) , 采用 50μ1体系， 30循环反应（94°C预变性 3min; 94°CV |430 sec， 55 °〇退火30 56 72°C延伸 2 min)。

分别将 5μ _β 的 pcDNA3.1-TMP-Ll-TMP-L5-H-fip-HSA质粒 DNA， 用 Β·ψΜ和 w I (大连宝生物公 司）在 37°C条件下过夜处理， 经双酶切反应获得 TMP-L5-H-fip-HSA (pre4 ), 基因序列如 Seq ID No:47所 示， 氨基酸序列如 Seq ID No:48所示。

同样条件下利用 Sacl及 Κριύ双酶切 5μ¾的 pPinka-HC载体（invitrogen, USA )，并回收获得 pPinka-HC 载体片断（6902bp)。取 5 α-factor-TMP-Ll ,分别用限制性内切酶 BspEl和 S«cl处理并回收，取 5μ _δ HSA (post4 ) 片段， 分别用限制性内切酶 Κρ«Ι， ΧδαΙ处理并回收 （图 3 )。

将限制性内切酶处理过的三个片段连接得到人 血清白蛋白 -血小板生成素融合基因片段， 通过分子克 隆手段将其连接于酵母表达载体 pPinka-HC 上， 最终构建出 毕赤酵母重组质粒 pPinka-TMP-Ll -TMP-L5-H-fip-HSA (图 3, 4 )。 方法如下：

pPinka-HC Sac I / Kpn I 1.5μ1

TMP-L5-H-fip-HSA (pre4 ) 6 μ1

a-factor-TMP-Ll 7μ1

10χΤ4 ligase buffer 2.5μ1

T4 DNA ligase Ι μΐ

16°C， 过夜连接反应后进行转化反应： 取连接产物 4 μΐ 与 50 μ1 大肠杆菌 TOP10感受态细胞 （天根 生化科技 (北京)有限公司） 混合后装入 0.1cm电击杯中， 在电转仪对应程序下电击一次 （1.8KV, 3.4ms ), 迅速加入 lml LB培养基， 混合后转移至 1.5ml离心管中， 于 37°C， 150rpm培养 lhr， 取适量菌液涂布于 LB(Amp+)平板。 置于 37°C培养箱， 培养过夜。

从转化平板上挑取单克隆接入 lmL LB液体培养基， 37°C， 220rpm培养 6-8hr， 进行菌液 PCR筛选， 筛选出的阳性接种后进一步小量提取质粒， 并进行双酶切鉴定， 酶切鉴定无误后送往公司测序， 测序正确 的 pPinka-TMP-Ll-TMP-L5-H-fip-HSA质粒即为克隆 9号。 二. 包含 TMP-L2-TMP-L5-H-fip-HSA载体的构建 以酵母表达载体 pPinka-HC ( invitrogen, USA) 为模板， 利用引物 P12 ( cccgctttttggatgatt), P16 ( gacttccggaggccctagcagccagccactgccgcagtgtggggccttcgatccttttct cgagagatacc )， 通过 PCR扩增获得 a-factor-TMP-L2 o

提 取 克 隆 1 中 的 质 粒 pcDNA3.1-TMP-Ll-TMP-L5-H-fip-HSA 。 以 pcDNA3.1-TMP-Ll-TMP-L5-H-fip-HSA质粒载体为模板， 采用引物 14 ( gaaaccactctagagaagtgctgtg ) , 引物 15 ( cggggtacctcagtggtggtggtggtggtgtaagcctaaggcagcttgacttgcagc ) , 通过 PCR扩增获得 HSA (post4 ) -His, 基因序列如 Seq ID No:45所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:46所示。

上述 PCR扩增反应中模板 DNA用量为 250 ng，引物为 ΙΟΟρΜ，多聚酶是 EasyA Polymerase( Stratagene, USA ) , 采用 50μ1体系， 30循环反应（94°C预变性 3min; 94°CV |430 sec， 55 °〇退火30 56 72°C延伸 2 min)。

分别将 5μ _β 的 pcDNA3.1-TMP-Ll-TMP-L5-H-fip-HSA质粒 DNA， 用 Β·ψΜ和 Kp>2 1 ( Ta aRa, Japan ) 在 37°C条件下过夜处理， 经双酶切反应获得 TMP-L5-H-fip-HSA (pre4 ), 基因序列如 Seq ID No:47所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:48所示。

同样条件下利用 Sacl及 Κριύ双酶切 5μ¾的 pPinka-HC载体（invitrogen, USA )，并回收获得 pPinka-HC 载体片断（6902bp)。取 5 a-factor-TMP-L2,分别用限制性内切酶 BspEl和 S«cl处理并回收，取 5μ _δ HSA (post4 ) 片段， 分别用限制性内切酶 Κρ«Ι， ΧδαΙ处理并回收 （图 3 )。

将限制性内切酶处理过的三个片段连接得到人 血清白蛋白 -血小板生成素融合基因片段， 通过分子克 隆手段将其连接于酵母表达载体 pPinka-HC 上， 最终构建出 毕赤酵母重组质粒 pPinka-TMP-L2-TMP-L5-H-fip-HSA (图 3, 4 )。 方法如下：

pPinka-HC Sac 11 Kpn I 1.5 μΐ

TMP-L5-H-fip-HSA (pre4 ) 6 μΐ

a-factor-TMP-L2 7μ1

10χΤ4 ligase buffer 2.5μ1

T4 DNA ligase Ι μΐ

16°C， 过夜连接反应后进行转化反应： 取连接产物 4 μΐ 与 50 μ1 大肠杆菌 TOP10感受态细胞 （天根 生化科技 (北京)有限公司） 混合后装入 0.1cm电击杯中， 在电转仪对应程序下电击一次 （1.8KV, 3.4ms ), 迅速加入 lml LB培养基， 混合后转移至 1.5ml离心管中， 于 37°C， 150rpm培养 lhr， 取适量菌液涂布于 LB(Amp+)平板。 置于 37°C培养箱， 培养过夜。

从转化平板上挑取单克隆接入 lmL LB液体培养基， 37°C， 220rpm培养 6-8hr， 进行菌液 PCR筛选， 筛选出的阳性接种后进一步小量提取质粒， 并进行双酶切鉴定， 酶切鉴定无误后送往公司测序， 测序正确 的 pPinka-TMP-L2-TMP-L5-H-fip-HSA质粒即为克隆 10号。 三. 包含 TMP-L3-TMP-L5-H-fip-HSA载体的构建 以酵母表达载体 pPinka-HC ( invitrogen , USA ) 为模板， 利用引物 P12 ( cccgctttttggatgatt ) , P17 (gacttccggaggggccaccggccctagcagccagccactgccgcagtgtggggccttcg at ccttttctcgagagatacc ) , 通过 PCR扩增获得 a-factor-TMP-L3„ 提 取 克 隆 1 中 的 质 粒 pcDNA3.1-TMP-Ll-TMP-L5-H-fip-HSA 。 以 pcDNA3.1-TMP-Ll-TMP-L5-H-fip-HSA质粒载体为模板， 采用引物 14 ( gaaaccactctagagaagtgctgtg ) , 引物 15 ( cggggtacctcagtggtggtggtggtggtgtaagcctaaggcagcttgacttgcagc ) , 通过 PCR扩增获得 HSA (post4 ) -His, 基因序列如 Seq ID No:45所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:46所示。

上述 PCR扩增反应中模板 DNA用量为 250 ng,引物为 ΙΟΟρΜ,多聚酶是 EasyA PolymeraseC Stratagene, USA ) , 采用 50μ1体系， 30循环反应（94°C预变性 3mm; 94i ^ft 30 sec， 55 °。退火30 36 72°C延伸 2 min ) o

分别将 5μ _β 的 pcDNA3.1-TMP-Ll-TMP-L5-H-fip-HSA质粒 DNA, 用 ΒφΕΙ和 Kpn I ( TaKaRa, Japan ) 在 37°C条件下过夜处理， 经双酶切反应获得 TMP-L5-H-fip-HSA (pre4)， 基因序列如 Seq ID No:47所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:48所示。

同样条件下利用 Sacl及 双酶切 5μ¾的 pPinka-HC载体 (invitrogen，USA )，并回收获得 pPinka-HC 载体片断（6902bp)。取 5 a-factor-TMP-L2,分别用限制性内切酶 BspEl和 S«cl处理并回收，取 5μ _β HSA (post4 ) 片段， 分别用限制性内切酶 ¾wl， X^d处理并回收 （图 3 )。

将限制性内切酶处理过的三个片段连接得到人 血清白蛋白-血小板生成素融合基因片段， 通过分子克 隆手段将其连接于酵母表达载体 pPinka-HC 上， 最终构建出 毕赤酵母重组质粒 pPinka-TMP-L3-TMP-L5-H-fip-HSA (图 3, 4)。 方法如下：

pPinka-HC Sac 11 Kpn I 1.5 μΐ

TMP-L5-H-fip-HSA (pre4 ) 6 μΐ

a-factor-TMP-L3 7μ1

HSA (Post4 ) -His 7 μΐ

10xT4 1igase buffer 2.5μ1

T4 DNA ligase Ι μΐ

16°C， 过夜连接反应后进行转化反应： 取连接产物 4 μΐ 与 50 μΐ 大肠杆菌 TOP10 感受态细胞 （天 根生化科技 (北京)有限公司） 混合后装入 0.1cm电击杯中， 在电转仪对应程序下电击一次（L8KV, 3.4ms)， 迅速加入 1ml LB培养基， 混合后转移至 1.5ml离心管中， 于 37°C,150rpm培养 lhr， 取适量菌液涂布于 LB(Amp+)平板。 置于 37°C培养箱， 培养过夜。

从转化平板上挑取单克隆接入 lmL LB液体培养基， 37°C， 220rpm培养 6-8hr， 进行菌液 PCR筛选， 筛选出的阳性接种后进一步小量提取质粒， 并进行双酶切鉴定， 酶切鉴定无误后送往公司测序， 测序正确 的 pPinka-TMP-L3-TMP-L5-H-fip-HSA质粒即为克隆 11号 四. 包含 TMP-L4-TMP-L5-H-fip-HSA载体的构建

以酵母表达载体 pPinka-HC ( invitrogen , USA ) 为模板， 利用引物 P12 ( cccgctttttggatgatt ) , P18 ( gacttccggagccgccaccgctgccgccaccgccggccctagcagccagccactgccgca gtgtggggccttcgatccttttctcgagagatacc )， 通过 PCR扩增获得 a-factor-TMP-L4。

提 取 克 隆 1 中 的 质 粒 pcDNA3.1-TMP-Ll-TMP-L5-H-fip-HSA 。 以 pcDNA3.1-TMP-Ll-TMP-L5-H-fip-HSA质粒载体为模板， 采用引物 14 ( gaaaccactctagagaagtgctgtg ) , 引物 15 ( cggggtacctcagtggtggtggtggtggtgtaagcctaaggcagcttgacttgcagc ) , 通过 PCR扩增获得 HSA (post4 ) -His, 基因序列如 Seq ID No:45所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:46所示。 上述 PCR扩增反应中模板 DNA用量为 250 ng,引物为 ΙΟΟρΜ,多聚酶是 EasyA PolymeraseC Stratagene, USA ) , 采用 50μ1体系， 30循环反应（94°C预变性 3min; 94°C^ |i 30 sec， 55 °。退火30 86 72°C延伸 2 min ) o

分别将 5μ _β 的 pcDNA3.1-TMP-Ll-TMP-L5-H-fip-HSA质粒 DNA， 用 Β·ψ£Ι和 Kpn I ( TaKaRa, Japan ) 在 37°C条件下过夜处理， 经双酶切反应获得 TMP-L5-H-fip-HSA (pre4)， 基因序列如 Seq ID No:47所示， 氨基酸序列如 Seq ID No:48所示。

同样条件下利用 S«cl及 ¾wl双酶切 5 的 pPinka-HC载体（invitrogen，USA )，并回收获得 pPinka-HC 载体片断（6902bp)。取 5 a-factor-TMP-L4,分别用限制性内切酶 ΒφΕΙ和 Sad处理并回收，取 5μ ₈ HSA (post4 ) 片段， 分别用限制性内切酶 /wl, Χδαΐ处理并回收 （图 3 )。

将限制性内切酶处理过的三个片段连接得到人 血清白蛋白-血小板生成素融合基因片段， 通过分子克 隆手段将其连接于酵母表达载体 pPmkcx-HC 上， 最终构建出 毕赤酵母重组质粒 pPinka-TMP-L4-TMP-L5-H-fip-HSA (图 3 , 4)。 方法如下：

pPinka-HC Sa l / Kpn l 1.5μ1

TMP-L5-H-fip-HSA (pre4 ) 6 μΐ

a-factor-TMP-L4 7μ1

HSA (Post4 ) -His 7 μΐ

10xT4 ligase buffer 2.5μ1

T4 DNA ligase Ι μΐ

16°C， 过夜连接反应后进行转化反应： 取连接产物 4 μΐ 与 50 μΐ 大肠杆菌 TOP10 感受态细胞 （天 根生化科技 (北京)有限公司） 混合后装入 0.1cm电击杯中， 在电转仪对应程序下电击一次（1.8KV, 3.4ms)， 迅速加入 lml LB培养基， 混合后转移至 1.5ml离心管中， 于 37°C， 150rpm培养 lhr， 取适量菌液涂布于 LB(Amp+)平板。 置于 37°C培养箱， 培养过夜。

从转化平板上挑取单克隆接入 lmL LB液体培养基， 37°C， 220rpm培养 6-8hr， 进行菌液 PCR筛选， 筛选出的阳性接种后进一步小量提取质粒， 并进行双酶切鉴定， 酶切鉴定无误后送往公司测序， 测序正确 的 pPinka-TMP-L4-TMP-L5-H-fip-HSA质粒即为克隆 12号。 五. 包含 HSA-L6-H-L7-TMP-L1-TMP载体的构建

TMP-L1-TMP 片段的合成 委托大连宝生物公司全基因合成 TMP-L1-TMP 片段， 合成好的片段连接于 pMD19-T simple载体中。 将该质粒转化入大肠杆菌 TOP10感受态中， 并筛选出阳性克隆。 摇菌培养该菌 株， 抽提质粒得到 pMD19-T simple-TMP-Ll -TMPo 所得的质粒用 Κρηί 和 Eco (大连宝生物公司） 在 37°C条件下过夜处理， 经双酶切反应获得 TMP-L1-TMP。

HSA-L6-H-L7片段的合成 以 pcDNA3.1-HSA-L6-H-L7-TMP-Ll -TMP质粒载体为模板， 采用引物 10 ( GAAGGATATCGATGCACACAAGAGTGAGGT )， 引物 11 得 HSA-L6-H-L7。 PCR扩增反应中模板 DNA用量为 250 ng， 引物为 ΙΟΟρΜ, 多聚酶是 EasyA Polymerase ( Stratagene, USA ), 采用 50μ1体系， 30循环反应（94°C预变性 3 min; 94°C变性 30 sec, 55 退火30 ₈ 6(， 72°〇延伸2 111111)。

PC 扩增得到的 HSA-H用 Ecom和 EcoWV (大连宝生物公司）在 37Ό条件下过夜处理， 经双酶切反 应获得 HSA-L6-H-L7 ( EcoRVEcoRV) .

同样条件下利用 Sftd及 (大连宝生物公司） 双酶切 5ng的 pPinka-HC载体 （invitrogen, USA ) , 并回收获得 pPmka-HC ( SM/Kpnl ) 载体片断 （7890bp)。

将限制性内切酶处理过的两个片段连接得到血 小板生成素-人血清白蛋白融合基因片段， 通过分子克 隆手段将其连接于酵母表达载体 pPinka-HC 上， 最终构建出 毕赤酵母重组质粒 pPmka-HSA-L6-H-L7-TMP-Ll -TMP (图 5， 图 6)。 方法如下：

pPinka-HC St l / Kpnl 2μΙ

TMP-L1-TMP (. Kpnl/EcoR 5μ1

HSA-L6-H-L7 ( EcoRI/EcoRV )

10χΤ4 ligase buffer 1.5μ1

T4 DNA ligase Ιμΐ

ddH ₂ 0 2.5μ1

16°C， 过夜连接反应后进行转化反应： 取连接产物 4 μΐ 与 50 μ1 大肠杆菌 TOP10 感受态 （天根生化 科技 (北京)有限公司） 混合后装入 0.1cm电击杯中， 在电转仪对应程序下电击一次 （1.8KV, 3.4ms ) , 迅速 加入 1ml LB培养基，混合后转移至 1.5ml离心管中，于 37°C ,150rpm培养 lhr，取适量菌液涂布于 LB(Amp+) 平板。 置于 37Ό培养箱， 培养过夜。

从转化平板上挑取单克隆接入 lmL LB液体培养基， YTC , 220rpm培养 6-8hr ， 进行菌液 PCR筛选， 筛选出的阳性菌落， 接种后进一步小量提取质粒， 并进行双酶切鉴定， 酶切鉴定无误后送往公司测序， 测 序正确的 pPinka-HSA-L6-H-L7-TMP-Ll-TMP质粒即为克隆 13号。 六. 包含 HSA-L6-H-L7-TMP-L2-TMP载体的构建

TMP-L2-TMP 片段的合成 委托大连宝生物公司全基因合成 TMP-L2-TMP 片段,合成好的片段连接于 PMD19-T simple载体中。 将该质粒转化入 TOP10感受态中， 并筛选出阳性克隆。 摇菌培养该菌株， 抽提 质粒得到 pMD19-T simple-TMP-L2-TMP„

所得的质粒用 Κρηί 和 Ecom (大连宝生物公司） 在 37°C条件下过夜处理， 经双酶切反应获得 TMP-L2-TMP。 HSA-L6-H-L7片段的合成 以 pcDNA3.1-HSA-L6-H-L7-TMP-Ll -TMP质粒载体为模板， 采用引物 10 ( GAAGGATATCGATGCACACAAGAGTGAGGT )， 引物 11 得 HSA-L6-H-L7。 PCR扩增反应中模板 DNA用量为 250 ng， 引物为 ΙΟΟρΜ, 多聚酶是 EasyA Polymerase ( Stratagene, USA ), 采用 50μ1体系， 30循环反应（94°C预变性 3 min; 94°C变性 30 see, 55 °( 退火30 86(：， 72°( 延伸2 111111)。

PCR扩增得到的 HSA-H用 Ec。 和 coRN (大连宝生物公司）在 37Ό条件下过夜处理， 经双酶切反 应获得 HSA-L6-H-L7 ( EcoRl/EcoRV ) ( 1824bp )。

同样条件下利用 SftJ及 ¾wl ( TaKaRa, Japan)双酶切 5 g的 pPinka-HC载体（invitrogen, USA), 并 回收获得 pPinka-HC ( SM/ΚρηΌ 载体片断 （7890bp)。

将限制性内切酶处理过的两个片段连接得到血 小板生成素-人血清白蛋白融合基因片段， 通过分子克 隆手段将其连接于酵母表达载体 pPmka-HC 上， 最终构建出 毕赤酵母重组质粒 pPinka-HSA-L6-H-L7-TMP-L2-TMP (图 5， 图 6)。 方法如下：

pPinka-HC Stul / Kpnl 2μ1

TMP-L2-TMP (. Kpnl/EcoRl ) 5μ1

HSA-L6-H-L7 ( EcoRI/EcoRV )

10χΤ4 ligase buffer 1.5μ1

T4 DNA ligase Ιμΐ

dd¾0 2.5μ1

16°C , 过夜连接反应后进行转化反应： 取连接产物 4 μΐ 与 50 μ1大肠杆菌 TOP10 感受态 （天根生化 科技 (北京)有限公司） 混合后装入 0.1cm电击杯中， 在电转仪对应程序下电击一次 （1.8KV, 3.4ms ) , 迅速 加入 1ml LB培养基，混合后转移至 1.5ml离心管中，于 37°C ,150rpm培养 lhr，取适量菌液涂布于 LB(Amp+) 平板。 置于 37°C培养箱， 培养过夜。

从转化平板上挑取单克隆接入 lmL LB液体培养基， 37°C， 220rpm培养 6-8hr， 进行菌液 PCR筛选， 筛选出的阳性菌落， 接种后进一步小量提取质粒， 并进行双酶切鉴定， 酶切鉴定无误后送往公司测序， 测 序正确的 pPinka-HSA-L6-H-L7-TMP-L2-TMP质粒即为克隆 14号。。 七. 包含 HSA-L6-H-L7-TMP-L3-TMP载体的构建

TMP-L3-TMP 片段的合成 委托大连宝生物公司全基因合成 TMP-L3-TMP 片段,合成好的片段连接于 PMD19-T simple载体中。 将该质粒转化入 TOP10感受态中， 并筛选出阳性克隆。 摇菌培养该菌株， 抽提 质粒得到 pMD19-T simple-TMP-L3-TMPo

所得的质粒用 Kpnl 和 EcoRl (大连宝生物公司） 在 37°C条件下过夜处理， 经双酶切反应获得 TMP-L3-TMP。

HSA-L6-H-L7片段的合成 以 pcDNA3.1-HSA-L6-H-L7-TMP-Ll -TMP质粒载体为模板， 采用引物 10 ( GAAGGATATCGATGCACACAAGAGTGAGGT )， 引物 11 得 HSA-L6-H-L7。 PCR扩增反应中模板 DNA用量为 250 ng， 引物为 ΙΟΟρΜ, 多聚酶是 EasyA Polymerase ( Stratagene, USA ), 采用 50μ1体系， 30循环反应（94°C预变性 3 min; 94°C变性 30 sec, 55 退火30 36(；， 72°〇延伸2 111 ）。

PCR扩增得到的 HSA-H用 Ecom和 EcoRN (大连宝生物公司 )在 37Ό条件下过夜处理， 经双酶切反 应获得 HSA-L6-H-L7 ( EcoRl/EcoRY) ( 1824bp )。

同样条件下利用 Sftd及 ^7l (大连宝生物公司） 双酶切 5ng的 pPinka-HC载体 （invitrogen, USA ) , 并回收获得 pPinka-HC ( Stul/Kpnl ) 载体片断 （7890bp)。

将限制性内切酶处理过的两个片段连接得到血 小板生成素-人血清白蛋白融合基因片段， 通过分子克 隆手段将其连接于酵母表达载体 pPmka-HC 上， 最终构建出 毕赤酵母重组质粒 pPinka-HSA-L6-H-L7-TMP-L3 -TMP (图 5， 图 6)。 方法如下：

pPinka-HC Stul / Kpnl 2μ1

TMP-L3-TMP (. Kpnl/EcoRl ) 5μ1

HSA-L6-H-L7 ( EcoRl/EcoR ) 3μ1

10χΤ4 ligase buffer 1.5μ1

T4 DNA ligase Ιμΐ

dd¾0 2.5μ1

16°C， 过夜连接反应后进行转化反应： 取连接产物 4 μΐ 与 50 μ1大肠杆菌 TOP10 感受态 （天根生化 科技 (北京)有限公司） 混合后装入 0.1cm电击杯中， 在电转仪对应程序下电击一次 （1.8KV, 3.4ms ) , 迅速 加入 1ml LB培养基，混合后转移至 1.5ml离心管中，于 37°C， 150rpm培养 lhr，取适量菌液涂布于 LB(Amp+) 平板。 置于 37°C培养箱， 培养过夜。

从转化平板上挑取单克隆接入 lmL LB液体培养基， 37°C， 220rpm培养 6-8hr ， 进行菌液 PCR筛选， 筛选出的阳性菌落， 接种后进一步小量提取质粒， 并进行双酶切鉴定， 酶切鉴定无误后送往公司测序， 测 序正确的 pPinka-HSA-L6-H-L7-TMP-L3-TMP质粒即为克隆 15号。 八. 包含 HSA-L6-H-L7-TMP-L4-TMP载体的构建

TMP-L4-TMP 片段的合成 委托大连宝生物公司全基因合成 TMP-L4-TMP 片段,合成好的片段连接于 PMD19-T simple载体中。 将该质粒转化入 TOP10感受态中， 并筛选出阳性克隆。 摇菌培养该菌株， 抽提 质粒得到 pMD19-T simple-TMP-L4-TMP„

所得的质粒用 Κρηί 和 Ecom (大连宝生物公司） 在 37°C条件下过夜处理， 经双酶切反应获得 TMP-L4-TMP。

HSA-L6-H-L7片段的合成 以 pcDNA3.1-HSA-L6-H-L7-TMP-Ll -TMP质粒载体为模板， 采用引物 10 ( GAAGGATATCGATGCACACAAGAGTGAGGT )， 引物 11 得 HSA-L6-H-L7。 PCR扩增反应中模板 DNA用量为 250 ng， 引物为 ΙΟΟρΜ, 多聚酶是 EasyA Polymerase ( Stratagene, USA ), 采用 50μ1体系， 30循环反应（94°C预变性 3 min; 94°C变性 30 sec, 55 °〇退火30 86。， 72°(延伸2 111111)。

PCR扩增得到的 HSA-H用 EcoRI和 EcoRV (大连宝生物公司）在 37Ό条件下过夜处理， 经双酶切反 应获得 HSA-L6-H-L7 ( EcoRl/EcoRV )„

同样条件下利用 Sftd及 (大连宝生物公司） 双酶切 5 的 pPmkot-HC载体 （mvitrogen, USA ) , 并回收获得 pPmka-HC ( Stul/Kpnl ) 载体片断。

将限制性内切酶处理过的两个片段连接得到血 小板生成素-人血清白蛋白融合基因片段， 通过分子克 隆手段将其连接于酵母表达载体 pPinka-HC 上， 最终构建出 毕赤酵母重组质粒 pPinka-HSA-L6-H-L7-TMP-L4-TMP (图 5， 图 6)。 方法如下：

pPinka-HC Stul / Kpnl 2μ1

TMP-L4-TMP (. Kpnl/EcoRi ) 5μ1

HSA-L6-H-L7 ( EcoRI EcoRV)

10χΤ4 ligase buffer 1.5μ1

T4 DNA ligase Ιμΐ

dd¾0 2.5μ1

16°C，过夜连接反应后进行转化反应：取连接� ��物 4 μΐ 与 50 μ1 大肠杆菌 TOP10 感受态 ( mvitrogen, USA )混合后装入 0.1cm电击杯中， 在电转仪对应程序下电击一次（1.8KV, 3.4ms )，迅速加入 1ml LB培养 基， 混合后转移至 1.5ml离心管中， 于 37°C， 150rpm培养 lhr， 取适量菌液涂布于 LB(Amp+)平板。 置于 37Ό培养箱， 培养过夜。

从转化平板上挑取单克隆接入 lmL LB液体培养基， TTC , 220rpm培养 6-8hr ， 进行菌液 PCR筛选， 筛选出的阳性菌落， 接种后进一步小量提取质粒， 并进行双酶切鉴定， 酶切鉴定无误后送往公司测序， 测 序正确的 pPinka-HSA-L6-H-L7-TMP-L4-TMP质粒即为克隆 16号。 实施例 5； 在毕赤酵母中表达二聚体化促血小板生成素模 拟肽 TMP二联体-人血清白蛋白融合蛋白工程菌 株的转化， 筛选

一. 二聚体化促血小板生成素模拟肽 TMP二联体 -人血清白蛋白融合蛋白工程菌株的转化 表达载 体 的 筛选鉴 定通 常 采用 以 下 的 方法 ： 首先 将 实施例 5 得 到 的 含 pPinka-TMP-Ll -TMP-L5-H-fip-HSA重组质粒大肠杆菌 TOP10, 接入 LB液体培养基， 37°C , 220rpm培养 16hr， 采用大提质粒试剂盒提取 pPinka-TMP-Ll-TMP- -H-fip-HSA重组质粒， 然后用限制性内切酶线性 化， 通过电转化法将其转入毕赤酵母中， 涂板培养 3-7天， 选取 3-8个白色克隆接种到液体 BMGY培养基 中 （配方参照 《PichiaPmk ^TM Expression System》）， 更换 BMMY 液体培养基 （配方参照 《PichiaPink ^TM Expression System}) ) 继续摇瓶培养 3-4天， 获得少量的表达产物， 此时可以通过 PCR, SDS-PAGE对表达 产物进行筛选和鉴定。 详细操作步骤可以参见 PichiaPink™ Expression System (Invitrogen, USA)操作指南， 表达载体的电转化具体方法如下：

1 ) 大量提取构建好的重组质粒 pPinka-TMP-Ll-TMP-L5-H-fip-HSA质粒 DNA， 然后选取限制性内切 酶 Λ/7Π (NEB, USA) 对质粒进行线性化， 纯化定量后备用。

2 ) 制备酵母感受态： 将 PichiaPink ^TM Expression Strains (invitrogen, USA) 划线于 YPD平板， 28°C 培养 3-5天。 待长出克隆后挑取单克隆入 10ml YPD培养基 28°C， 300rpm培养 1-2天， 取 1ml培养物接入 lOOml YPD培养基， 相同条件培养至 OD ₆ 。。=1.3-1.5。 将培养物转移至 250ml离心管中， 4°C， 1500xg离心 5min， 弃上清， 沉淀重悬于 250ml冰水中。 重复前一步骤再次离心， 弃上清， 沉淀重悬于 50ml冰水中。 重复前一步骤条件继续离心， 弃上清， 沉淀重悬于 10ml 1M的冰山梨醇中。 重复前一步骤条件继续离心， 弃上清， 沉淀重悬于 300μ1 1Μ的冰山梨醇中。 将制备好的酵母感受态置于冰上， 当天使用。

3)取 10 g线性化后的 pPinka-TMP-Ll-TMP-L5-H-fip-HSA质粒 DNA与制备好的酵母菌株感受态细 胞混合， 转移至 0.2cm的电击杯中。 置冰上 5min， 在电转仪对应的程序下电击一次。 立即加入 lml冰浴的 YPDS, 混合后放入 28°C培养箱静置培养 6hr。 去适量菌悬液涂布于 PAD平板， 28°C培养 3-10天。 待长出 明显克隆后， 挑取白色克隆再次划线于 PAD平板。

2-8号克隆也采用相同的方法处理。

二. 目的蛋白的摇瓶表达

1 ) 挑取二次划线后的白色含有 TMP-Ll-TMP-L5-H-fip-HSA序列的 1号 pPinka酵母菌株的单克隆接 种于 50ml BMGY培养基中， 28°C， 300rpm, 培养 3天。

2 ) 将菌液离心后弃上清， 用 10ml BMMY培养基重悬菌体， 28°C , 300rpm, 培养 72-96hr。

3 ) 每隔 12hr取样 500μ1， 并补加 500μ1 40%甲醇。 取样后， 剩余细胞继续培养， 样品于 1500xg离心 10mm, 上清、 沉淀分别存于 -80°C， 以备后续检测。

4 ) 诱导结束时， 收集所有细胞， 1500xg离心 lOmin, 上清、 沉淀分别存于 -80°C。

选择目的物表达量高的克隆获得带有 TMP-Ll-TMP-L5-H-fip-HSA序列的 1号酵母菌株。 2-8号克隆也 采用相同方法处理， 分别得到含有 TMP-L2-TMP-L5-H-fip-HSA序列的 1号 pPinka酵母菌株， 含有 TMP-L3-TMP-L5-H-fip-HSA序列的 3号 pPmka酵母菌株， 含有 TMP-L4-TMP-L5-H-fip-HSA序列的 4号 pPinka酵母菌株， 含有 HSA-L6-H-L7-TMP-L1-TMP序列的 5号 pPinka酵母菌株， 含有

HSA-L6-H-L7-TMP-L2-TMP序列的 6号 pPinka酵母菌株， 含有 HSA-L6-H-L7-TMP-L3-TMP序列的 7号 pPinka酵母菌株， 含有 HSA-L6-H-L7-TMP-L4-TMP序列的 8号 pPinka酵母菌株。 实施例 ό工程毕赤酵母培养上清中目的产物的纯化

选择实施例 5中筛选得到表达目的物含量高的各工程菌株� � 按同样的方法进行 lOOOmL的摇瓶表达。 甲醇诱导 96小时样品经 7500rpm离心 5mm， 收集上清。 对于带 His标签的 1-4号酵母株的培养上清， 过 Ni Sepharose FF柱进行亲和层析， 收集目标组分， 再过 Sephacryl S-200分子筛术进行层析， 收集二聚体化 融合蛋白和融合蛋白单体。 对于不带 ffis标签的 5-8号酵母株的培养上清， 过 Capto blue柱进行亲和层析， 收集含 HSA载体蛋白的目的融合蛋白组分， 再上 Sephacryl S-200分子筛术进行层析， 收集二聚体化融合 蛋白和融合蛋白单体。经过上述纯化步骤，分 别得到 1-8号酵母株纯化的培养产物，经非还原型 SDS-PAGE 检查， 二聚体化融合蛋白在 SDS-PAGE电泳图谱上显示为分子量大小为 150kDa的条带， 单体融合蛋白在 SDS-PAGE电泳图谱上显示为分子量大小为 75kDa的条带， 其中单体比例 <10%。 实施例 7 二聚体化 HSA蛋白载体与二联体 TPO模拟肽融合蛋白 mpl受体依赖的细胞水平生物活性检测 Lipofectamine2000 (美国， Invitrogen)

Opti-MEM减血清培养基 （美国， Invitrogen)

双亮荧光素酶检测试剂盒 （美国， Promega)

细胞被动裂解液 （美国， Promega)

pAdVAntage (美国， Promega)

mpl-pcDNA3.1质粒 （中山大学徐培林教授惠赠）

c-fos-pGL3质粒 （日本东京大学 Toshiio lshikawa教授惠赠）， renilla质粒 （美国， Promega) DMEM培养基 （美国， Invitrogen)

胰酶 （中国， 上海生工）

胎牛血清 （美国， Hycl _0ne )。

小鼠胚胎成纤维细胞株 NIH-3T3购自甘肃省动物细胞工程技术研究中心� �

一. 细胞培养

小鼠胚胎成纤维细胞株 NIH-3T3于高糖 DMEM, 10 % v/v胎牛血清中， 5 % v/v C0 ₂ ， 37 °C培养。 二. 转染复合物的制备

Lipofectamine2000与四种质粒 mpl-pcDNA3.1 (阴性对照组为 pcDNA3.1 )、 c-fos-pGL3、 pAdVAntage, Remlla共转染 NIH-3T3细胞， 四种质粒的比例为 5 : 2： 2： 0.1。 将四种质粒 DNA总量 0.8 ， 按比例加 入 50 μΐ Opti-MEM减血清培养基中， 轻轻混匀， 室温孵育 5分钟。 另准备 1 μΐ Lipofectamin2000加入到另 一 50 μΐ Opti-MEM减血清培养基中， 轻轻混匀， 室温孵育 5分钟。 然后将质粒 DNA与 Lipofectamin2000 混合， 室温孵育 20分钟， 制成转染复合物。

三. 二聚体化的血小板生成素模拟肽 TMP二联体-人血清白蛋白 HSA融合蛋白的活性检测方法

将细胞以 3χ 10 ⁴ 个细胞 /孔的密度接种至 24孔板， 培养 24小时后进行转染， 转染前移去培养板中培养 基， 使用无血清培养基润洗一遍后， 每孔加入 400μ1 Ορΐι-ΜΕΜ减血清培养基。 将转染复合物滴加至 24孔 细胞培养板内， 轻轻混合均匀， 置于 37'C、 5% Wv C0 ₂ 培养箱中培养。

转染 6小时后， 将培养基更换为含 10% v/v胎牛血清的 DMEM完全培养基。 转染后 24小时后， 将培 养基更换为无血清 DMEM培养基， 饥饿培养 24小时。 然后， 加入特比澳或待测样品等作用 6小时。 弃去 培养基， PBS将细胞润洗 2遍后， 每孔加入 150 μΐ被动裂解液， 30Ό轻微振荡作用 15分钟。 将细胞吹打 均匀后，每孔取 30 μΐ 转入％孔荧光检测板。首先检测萤火虫荧光素 酶活力： 96孔检测板中每孔加入 40 μΐ Dual-Glo Luciferase Reagent, 混合均匀， 避免产生气泡。 室温孵育 10分钟后， 使用荧光检测仪检测萤火虫 荧光素酶活力。 然后检测海肾荧光素酶活力： 96孔检测板中每孔加入 75μ1 Dual-Glo Stop&Glo Reagent, 混 合均匀， 避免产生气泡。 孵育 10 分钟后， 使用荧光检测仪检测海肾荧光素酶活力。 最后， 计算两种荧光 素酶发光比率： 荧光比率=萤火虫荧光值 /海肾荧光值。

结果表明， 所有转染不含 mpl 受体的 pcDNA3.1 空载体各处理组， 相对荧光比率均为 1。 所有转染 mpl-pcDNA3.1载体的各处理组数据见表 1。 由表 1可知所检测各克隆 CHO表达样品及酵母表达样品中的 二聚体化融合蛋白均具有显著的 mpl受体依赖的细胞水平生物活性，而单体融合 蛋白几乎无 mpl受体依赖 的细胞水平生物活性。 本实验证明， TPO阳性药物及各克隆 CHO表达样品及酵母表达样品二聚体融合蛋 白均具有受体依赖的细胞水平的生物活性。

表 1 二聚体 促血小板生成素模拟肽 TMP二联体-人血清白蛋白融合蛋白 c-mpl受体依赖的细胞水平 生物活性

实验组 相对荧光比率

空白对照组 1.00±0.04

TPO阳性组 1.65±0.08

单体融合蛋白 1.0 0.07

1号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 1.68±0.06

单体融合蛋白 1.05±0.09

2号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 1.65±0.03

单体融合蛋白 1.0 0.05

3号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 1.67±0.05

单体融合蛋白 1.12±0.07

4号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 1.69±0.08

单体融合蛋白 1.04±0.09

5号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 1.60±0.11

单体融合蛋白 1.03±0.06

6号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 1.66±0.03

单体融合蛋白 1.10±0.17

7号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 1.78±0.12

单体融合蛋白 1.04±0.03

8号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 1.72±0.09

单体融合蛋白 1.05±0.04

1号酵母株

二聚体融合蛋白 1.66±0.08

单体融合蛋白 1.05±0.06

2号酵母株

二聚体融合蛋白 1.71土 0.11

单体融合蛋白 1.02±0.05

3号酵母株

二聚体融合蛋白 1.62±0.07

单体融合蛋白 1.10±0.03

4号酵母株

二聚体融合蛋白 1.65±0.08

单体融合蛋白 1.07±0.08

5号酵母株

二聚体融合蛋白 1.62±0.06

6号酵母株 单体融合蛋白 1.08±0.06 二聚体融合蛋白 1.59±0.04

单体融合蛋白 1.04±0.03

7号酵母株

二聚体融合蛋白 1.61±0.05

单体融合蛋白 1.08±0.04

8号酵母株

二聚体融合蛋白 1.62±0.09 实施例八二聚体化促血小板生成素模拟肽 TMP二联体-人血澝白蛋白融合蛋白正常小鼠体� �促血小板生 成活性检测

每组 10只昆明小鼠， 雌雄各半， 体重 20±lg。 头颈部皮下注射待检样品， 连续给药 4天， 给药后第 3 天开始， 隔日鼠尾静脉采血并按常规方法进行血小板计 数， 表 2为 4天血小板计数的平均值。 结果表明， 所检测各克隆 CHO表达样品及酵母表达样品中的二聚体化融合 蛋白均显著提升受试小鼠血小板的数量， 而单体融合蛋白对受试小鼠血小板的数量几乎 无影响。

表 2二聚体化促血小板生成素模拟肽 TMP二联体-人血清白蛋白融合蛋白在小鼠体内� �血小板生成 活性检测

实验组 血小板数量 （x l0 ⁹ /mL ) 生理盐水组 1.32

TPO阳性组 1.89

单体融合蛋白 1.32

1号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 1.80

单体融合蛋白 1.31

2号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 1 + 81

单体融合蛋白 1.33

3号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 2 21

单体融合蛋白 1.32

4号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 2.50

单体融合蛋白 1.34

5号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 1.94

单体融合蛋白 1.32

6号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 1.80

单体融合蛋白 1.33

7号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 2.10

单体融合蛋白 1.37

8号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 1.80

单体融合蛋白 1.31

1号酵母株

二聚体融合蛋白 1.89 单体融合蛋白 1.35

2号酵母株

二聚体融合蛋白 2.77

单体融合蛋白 1.32

3号酵母株

二聚体融合蛋白 1.89

单体融合蛋白 1.36

4号酵母株

二聚体融合蛋白 1.85

单体融合蛋白 1.30

5号酵母株

二聚体融合蛋白 2.45

单体融合蛋白 1+31

6号酵母株

二聚体融合蛋白 2.20

单体融合蛋白 1.32

7号酵母株

二聚体融合蛋白 2.56

单体融合蛋白 1.35

8号酵母株

二聚体融合蛋白 2.38 实施例九二聚体化促血小板生成素模拟肽 TMP二联体-人血清白蛋白融合蛋白对小鼠原发� �血小板减少 症模型的治疗作用

昆明小鼠，摘眼球或眶静脉采血， EDTA-Na ₂ 抗凝； 1500rpm离心 10mm,收集上清， 4000rpm离心 15min 沉淀血小板，调整血小板浓度为 l-2x l0 ⁹ /L。取以上血小板悬液分别与等量的完全� ��氏佐剂和不完全弗氏佐 剂（购自 Sigma公司） 混匀成乳白色油包水状做好抗原。 第 1周取含完全弗氏佐剂的抗原分别注射于家兔 的后足掌、 背部皮下及腹股沟； 第 2、 3、 4周取含不完全弗氏佐剂的抗原分别注射于家� �后足掌、 背部皮 下及腹股沟,前后共 4次注射， 每次注射至少 8点， 每点 200μ1; 第 6周取家兔不抗凝全血， 4000rpm/min 离心 15min后取上清，即为家兔抗小鼠血小板抗血清 (APS), -20°C冰箱储存备用。

从 -20°C取出， 待完全融化后置于 56°C水浴 30min。 按照每 20g ΙΟΟμΙ 1： 4稀释的 APS抗血清给予小 鼠腹腔注射。 隔日注射， 以维持血小板的持续降低。 所有模型组于第 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13天注射 APS; 对照组按每 20g ΙΟΟμΙ生理盐水给予小鼠腹腔注射， 隔日重复注射。 给药组在注射 APS次日头颈部皮下注 射各克隆表达样品， 连续进行 4天。 每组 10只小鼠， 雌雄各半。 于注射次日开始， 隔日从小鼠尾静脉取 血， 采用血球计数板按常规方法进行血小板计数， 表 3为 5天血小板计数的平均值。 结果表明， 所检测各 克隆 CHO表达样品及酵母表达样品中的二聚体化融合 蛋白均显著抑制了受试小鼠原发性血小板减少 症模 型血小板数量的下降， 而单体融合蛋白对受试小鼠原发性血小板减少 症模型血小板数量几乎无影响。 表 3二聚体化促血小板生成素模拟肽 ΤΜΡ二联体-人血清白蛋白融合蛋白对小鼠原� �性血小板减少 症模型的治疗作用

实验组 血小板数量 （x l0 ⁷ /mL ) 生理盐水组 134.0 模型组 27.8

TPO阳性组 45.7 单体融合蛋白 23.2 号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 60.8 单体融合蛋白 31.1 号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 56.8 单体融合蛋白 32.7 号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 61.5 单体融合蛋白 34.1 号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 59.7 单体融合蛋白 28.9 号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 61.8 单体融合蛋白 30.5 号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 55.9 单体融合蛋白 29.7 号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 59.6 单体融合蛋白 31.8 号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 58.6 单体融合蛋白 25.8

1号酵母株

二聚体融合蛋白 53.2 单体融合蛋白 27.3

2号酵母株

二聚体融合蛋白 53.6 单体融合蛋白 25.3

3号酵母株

二聚体融合蛋白 51.9 单体融合蛋白 28.7

4号酵母株

二聚体融合蛋白 50.6 单体融合蛋白 30.1

5号酵母株

二聚体融合蛋白 53.6 单体融合蛋白 27.4

6号酵母株

二聚体融合蛋白 55.3 单体融合蛋白 29.1

7号酵母株

二聚体融合蛋白 53.9 单体融合蛋白 28.2

8号酵母株

二聚体融合蛋白 57.6 实施例十二聚体化促血小板生成素模拟肽 TMP二联体-人血清白蛋白融合蛋白对小鼠继发� �血小板减少 症模型的治疗作用

昆明小鼠，所有模型组按 80mg kg体重给小鼠单次腹腔注射化疗药卡铂（齐鲁� ��药，批号： 1110112ES), 对照组按 10(^L/20g体重头颈部皮下注射生理盐水， 连续注射 4天， 给药组在注射完卡铂后次日头颈部皮 下注射各克隆表达样品， 连续注射 4天， 每组 10只小鼠， 于注射次日开始， 隔日从小鼠尾静脉取血， 采 用血球计数板按常规方法进行血小板计数， 表 4 为 5 天血小板计数的平均值。 结果表明， 所检测各克隆 CHO 表达样品及酵母表达样品中的二聚体化融合蛋 白均显著抑制了受试小鼠继发性血小板减少症 模型血 小板数量的下降， 而单体融合蛋白对受试小鼠继发性血小板减少 症模型血小板数量几乎无影响。 表 4二聚体化促血小板生成素模拟肽 ΤΜΡ二联体-人血清白蛋白融合蛋白对小鼠原� �性血小板减少 症模型的治疗作用

实验组 血小板数量 10 ⁷ 个 /ml) 生理盐水组 143.0

模型组 49.2

ΤΡΟ阳性组 89.7

单体融合蛋白 50.1

1号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 80.2

单体融合蛋白 48.9

2号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 90.1

单体融合蛋白 50.3

3号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 82.5

单体融合蛋白 51.5

4号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 76.4

单体融合蛋白 50.9

5号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 78.1

单体融合蛋白 47.2

6号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 83.1

单体融合蛋白 48.0

7号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 93.2

单体融合蛋白 48.6

8号 CHO细胞株

二聚体融合蛋白 85.7

单体融合蛋白 47.1

1号酵母株

二聚体融合蛋白 88.6

单体融合蛋白 48.8

2号酵母株

二聚体融合蛋白 90.1 单体融合蛋白 46.9 号酵母株

二聚体融合蛋白 89.4 单体融合蛋白 48.4 号酵母株

二聚体融合蛋白 87.7 单体融合蛋白 50.6 号酵母株

二聚体融合蛋白 85.8 单体融合蛋白 50.2 号酵母株

二聚体融合蛋白 80.4 单体融合蛋白 45.5 号酵母株

二聚体融合蛋白 86.9 单体融合蛋白 48.2 号酵母株

二聚体融合蛋白 89.6