DESCRIPTION

Domaine Technique

La présente invention se rapporte à de nouvelles compositions proangiogéniques, à leur procédé de préparation et à leurs utilisations notamment en thérapeutique pour la prévention ou le traitement de toute pathologie responsable de complications du type ischémique.

Les compositions proangiogéniques de l'invention ouvrent la voie à de nouvelles stratégies de thérapie cellulaire.

Dans la description ci-dessous, les références entre crochets [ ] renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte.

Etat de la technique

La mise en évidence de l'existence de précurseurs circulants des cellules endothéliales EPC (Endothelial Progenitor Cells en anglais) et de leur potentiel d'utilisation pour stimuler l'angiogenèse et la réparation vasculaire est une avancée importante dans le domaine de la biologie vasculaire.

Ces cellules peuvent être présentes dans la circulation générale soit spontanément soit en réponse à différents stimuli (cytokines proinflammatoires, facteurs de croissance, ischémie, statines, etc). Impliquées dans les mécanismes de réparation vasculaire, ces cellules ouvrent une voie thérapeutique intéressante pour le traitement des maladies cardiovasculaires ischémiques.

Des systèmes proangiogéniques du type marqueur cellulaire/ligand spécifique comprenant un précurseur de cellules endothéliales comportant le marqueur cellulaire Eph, en particulier EphB4 ou EphB1 , ont été décrits [1]. Dans de tels systèmes, pour stimuler l'angiogenèse, les précurseurs des cellules endothéliales comportant le marqueur Eph, sont activés par un ligand spécifique appartenant à la famille des éphrines. Les précurseurs de cellules endothéliales peuvent être obtenus à partir de cellules mononucléées provenant de la moelle osseuse, du sang périphérique ou du sang de cordon ombilical. Après différenciation, les cellules mononucléées de la moelle osseuse ou du cordon ombilical fournissent une quantité relativement importante de précurseurs de cellules endothéliales qui expriment ou comportent le marqueur Eph. Il existe, dans le sang périphérique un très faible pourcentage des cellules mononuclées qui sont des EPC circulants. Cependant, l'obtention des précurseurs de cellules endothéliales via plusieurs étapes (présélection et tri par cytométrie, culture ex vivo, différenciation et maturation des cellules, expansion) nécessite des manipulations complexes et longues, elle est donc coûteuse et son rendement est faible.

Il est, par ailleurs, connu que les facteurs de risques dans les maladies cardiovasculaires peuvent induire des désordres vasculaires et cardiovasculaires à travers le dysfonctionnement endothélial, lequel dysfonctionnement peut entraîner la diminution du nombre et de la fonction des EPC qui interviennent dans la réparation des tissus [2]. Une dysfonction et une quantité d'EPC circulant plus faible que la normale ont été observées chez certains individus ayant des facteurs de risques de maladies cardiovasculaires comme, par exemple, Phypercholestérolémie, le diabète, l'hypertension [3].

Il existe donc un réel besoin de disposer de nouvelles compositions, pouvant stimuler l'angiogenèse au moins avec la même efficacité que les EPC d'origines diverses voire la même intensité que les facteurs angiogènes comme le VEGF, et que ces nouvelles compositions comprennent des cellules facilement accessibles ne nécessitant pas obligatoirement :

d'étape de présélection et de tri par cytométrie, de culture ex vivo, de différenciation et/ou de maturation

ou

d'être en mélange avec d'autres cellules pour stimuler l'angiogenèse. II existe aussi un réel besoin de disposer de nouvelles compositions, capables de stimuler la fonction angiogenèse, comprenant des cellules dont le nombre reste stable. Il existe, en outre, un réel besoin de nouvelles compositions proangiogéniques dont la mise en œuvre est facile, reproductible et de coût réduit.

Description de l'invention

La présente invention a précisément pour but de répondre à ces besoins en fournissant des composition proangiogénique comprenant des cellules mononucléées (MNC) provenant du sang périphérique, et des ligands L aptes à provoquer l'activation desdites cellules mononucléées (MNC) du sang périphérique dans laquelle les cellules mononucléées (MNC) du sang circulant comportent des récepteurs aptes à recevoir les ligands L pour provoquer l'activation desdites cellules.

Les MNC du sang circulant acquièrent, après activation par les ligands L des propriétés proangiogénique comparables ou supérieures à celles des EPC provenant de la moelle osseuse ou du sang de cordon ombilical.

On entend par « des cellules mononuclées du sang circulant » au sens de la présente invention, des cellules mononucléées qui ont atteint un stade de maturation et sont différenciées en monocytes et lymphocytes.

Le terme « sang périphérique » selon l'invention est équivalent au terme « sang circulant ».

Par rapport aux EPC, les cellules mononucléées sont plus directement et plus facilement accessibles dans la mesure où leur isolement, à partir de sang circulant, ne nécessite pas d'étape de présélection et de tri par cytométrie, de culture ex vivo, de différenciation et/ou de maturation. Cela facilite donc la mise en œuvre des compositions proangiogéniques de l'invention mais aussi peut réduire le coût de fabrication desdites compositions.

Dans le cas d'états pathologiques nécessitant des traitements urgents qui ne peuvent pas être différés dans le temps, la rapidité d'accès aux compositions selon l'invention peut constituer un avantage important.

Les compositions de l'invention évitent les problèmes liés à la transfusion de cellules sanguines hétérologues et constituent une voie prometteuse. En effet, les compositions selon l'invention sont adaptées pour une utilisation en autotransfusion. Jusqu'à présent, il n'avait jamais été imaginé que l'on puisse activer directement les cellules mononucléées (MNC) du sang circulant pour stimuler l'activité proangiogénique. Et d'ailleurs, l'art antérieur n'enseigne que des compositions proangiogeniques à partir de précurseurs de cellules endothéliales lesquelles résultent de différenciation des cellules mononuclées de la moelle osseuse.

Dans les compositions selon l'invention, les cellules mononucléées (MNC) peuvent comporter des récepteurs aptes à recevoir les ligands L pour provoquer l'activation desdites cellules.

Les compositions selon l'invention peuvent être sous la forme d'un mélange brut de cellules et de molécules, de diverses natures et d'origines et dont les propriétés peuvent changer ou le nombre peut augmenter, afin de disposer des (MNC) en quantité suffisante pour l'utilisation à laquelle ladite composition est destinée. La quantité des cellules mononucléées présentes dans la composition et/ou dans le lot (ou mélange) de cellules à utiliser, peut être comprise par exemple entre 10 ⁶ et 10 ¹² .

Les compositions selon l'invention peuvent également être sous une forme « moins brute», débarrassée de certaines cellules et/ou de molécules par des méthodes de purification connues de l'homme du métier. Ces méthodes ne doivent pas détériorer les cellules (MNC). La composition « moins brute», contient, en général, une concentration plus élevée de cellules (MNC) aptes à être stimulées par rapport à la concentration en cellules (MNC) du mélange brut. La quantité des cellules présentes dans la composition et/ou dans le lot (ou mélange) de cellules à utiliser, peut alors être comprise par exemple entre 10 ⁶ et 10 ¹¹ de cellules mononucléées.

La composition selon l'invention peut comprendre en outre le sang de cordon ombilical ou la moelle osseuse, ou d'un mélange des deux.

Plus particulièrement, les cellules mononucléées (MNC) du sang circulant peuvent provenir du sang périphérique d'un mammifère

Le terme « mammifère » désigne tout mammifère. A titre d'exemple, on peut citer les animaux domestiques comme les chiens et les chats ; les animaux de ferme comme les porcs, les bovins, les moutons et les chèvres ; les animaux comme les souris et les rats ; les primates comme les singes, les chimpanzés ; et l'homme.

Dans le cadre de la présente invention, « stimuler » l'activité proangiogénique, signifie entraîner l'accroissement et l'amélioration des propriétés proangiogéniques in vitro et in vivo.

Toujours dans le cadre de l'invention, le terme provoquer « l'activation » des cellules mononucléées ( NC) du sang circulant, désigne provoquer le déclenchement d'une réponse cellulaire de la part des cellules (MNC) différenciées.

Comme déjà indiqué, les compositions selon l'invention comprennent des cellules mononucléées (MNC) du sang circulant comportant des récepteurs aptes à recevoir les ligands L pour provoquer l'activation desdites cellules. Même en présence d'un excès, les ligands L ne se lieront qu'aux récepteurs aptes à les recevoir et non à tous les récepteurs qui peuvent être présents sur les cellules mononucléées (MNC) du sang circulant.

Les cellules mononucléées (MNC) du sang circulant comportent donc des récepteurs aptes à être stimulés par des ligands membranaires non circulants, comme les éphrines.

Ces récepteurs peuvent être par exemple des récepteurs transmembranaires à activité tyrosine kinase, choisis dans le groupe comprenant les EphA, les Eph B.

Les ligands L peuvent être des ligands de la famille des éphrines. Les éphrines peuvent être divisées en deux sous-familles, les ligands de type A étant simplement liés aux membranes plasmiques par un glycosylphosphatidilinositol (GPI) et les ligands B étant transmembranaires avec un domaine intracytoplasmique.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le ligand L est une molécule à activité éphrine-B, plus particulièrement une molécule à activité éphrine-B2. Le ligand L peut être l'éphrine-B2.

Les ligands L peuvent être éventuellement associés à une molécule de stabilisation et/ou de liaison. Dans le cadre de la présente invention, le terme « associé » couvre tout type de liaison d'intensité et de propriété différente : à savoir, covalente, ionique, polaire, de Van der Waals et hydrophobe. Les molécules de stabilisation et/ou de liaison peuvent stabiliser et/ou protéger le ligand. Elles peuvent fixer le ligand mais ne peuvent pas se fixer sur les récepteurs.

Dans les compositions selon l'invention, la molécule de stabilisation et/ou de liaison peut être, par exemple, un fragment Fc d'une immunoglobuline. Le fragment Fc, qui résulte de la fragmentation des liaisons peptidiques d'une molécule d'immonuglobuline, ne possède pas de site de fixation des antigènes. Il ne possède donc pas d'activité anticorps. Pour le fragment Fc (ou domaine Fc), il s'agit de la partie de la molécule d'immunoglobuline formée par les régions constantes des 2 chaînes lourdes. C'est ce domaine Fc qui donne ses propriétés à l'immunoglobuline. Le fragment Fc peut être obtenu à partir des immunoglobulines, par exemple, par une action protéolytique de la papaïne, de la pepsine ou toute autre enzyme adaptée.

Un autre objet de l'invention est un matériau proangiogénique comprenant des cellules mononucléées (MNC) du sang circulant activées par des ligands L pour stimuler l'angiogénèse, lesdits ligands L étant éventuellement associés à une molécule de stabilisation et/ou de liaison.

Dans un mode de réalisation de l'invention, le matériau proangiogénique comprend des cellules mononucléées (MNC) du sang circulant stimulées par des molécules d'éphrine-B2 comme ligands, lesdits ligands L étant éventuellement associés à une molécule de stabilisation et/ou de liaison. Dans ce mode de réalisation, lesdites cellules mononucléées (MNC) du sang circulant comportent des récepteurs choisis parmi les Eph A et les EphB, aptes à être stimulés par des molécules d'éphrine-B2.

L'invention concerne également le procédé de préparation d'une composition proangiogénique selon l'invention, comprenant les étapes suivantes :

(i) on se procure des cellules mononucléées (MNC) du sang périphérique que l'on place dans un milieu adapté ;

(ii) on met en contact les cellules mononucléées de l'étape (i), avec les ligands L.

Lesdits ligands étant éventuellement associés à une molécule de stabilisation et/ou de liaison. Le terme « sang périphérique » selon l'invention est équivalent au terme « sang circulant ». Les cellules mononucléées proviennent du sang périphérique (PBMNC).

En outre, le sang de cordon ombilical ou la moelle osseuse, ou d'un mélange des deux peut être ajouté(e) au sang périphérique comprenant les cellules mononucléées de l'étape.

Les NC peuvent être isolées à partir du sang périphérique par toute méthode adaptée connue de l'homme du métier, comme par exemple la centrifugation différentielle, le tri par la cytométrie de flux.

Le milieu adapté de l'étape (i) peut être un liquide physiologique comprenant principalement de l'eau. Le milieu adapté peut comprendre au moins 80%, avantageusement au moins 85% et encore plus avantageusement au moins 90% d'eau.

Outre l'eau, le milieu adapté peut comprendre un ou plusieurs éléments choisis parmi :

les solutés minéraux comme des oligo-éléments et des ions notamment Na ⁺ , CI ^" , K ⁺ , PO ₄ ^3" , Ca ²⁺ , SO ₄ ^2_ ;

les solutés organiques comme des lipides, des glucides, des acides aminés, de l'urée, de l'acide urique, de la bilirubine, des hormones ;

les protéines plasmatiques comme l'albumine, des immunoglobulines, du fibrinogène, des lipoprotéines etc.

Le milieu adapté est plus particulièrement un plasma.

Dans certains cas, le plasma peut être du plasma autologue.

Les cellules mononucléées (MNC) du sang circulant sont mises en contact avec des ligands de la famille des éphrines.

Le ligand L est avantageusement une molécule à activité éphrine-B, plus avantageusement une molécule à activité éphrine-B2. Le ligand L dans l'étape (ii) peut être l'éphrine-B2.

Le ligand L peut éventuellement être associé à une molécule de stabilisation/liaison telle que décrite précédemment.

Les cellules mononucléées (MNC) utilisées comportent des récepteurs aptes à être stimulés par des ligands de la famille des éphrines. Ces récepteurs peuvent être par exemple des récepteurs transmembranaires à activité tyrosine kinase, choisis dans le groupe comprenant les EphA, les Eph B.

Le ligand L peut éventuellement être associé à une molécule de stabilisation/liaison telle que décrite précédemment. La molécule de stabilisation/liaison est avantageusement un fragment Fc d'une immunoglobuline.

Dans l'étape (ii), la durée de mise en contact entre les cellules mononucléées (MNC) du sang circulant et les ligands L peut être comprise entre 5 minutes et 6 heures, par exemple entre 20 minutes et 4 heures, par exemple entre 30 minutes et 1 heure.

La mise en contact de l'étape (ii) peut s'effectuer à une température allant de 20 à 50°C, par exemple entre 25 et 40°C, par exemple 37°C.

La mise en contact de l'étape (ii) peut se faire dans une atmosphère favorisant la liaison des ligands L aux récepteurs des cellules (MNC) du sang circulant, par exemple avec des pourcentages en C0 ₂ et en oxygène variant respectivement entre 2% et 10%, et entre 98% et 90%, la somme des pourcentages de C0 ₂ et d'oxygène étant égale dans tous les cas à 100%. Plus particulièrement, l'atmosphère choisie est composée de 5% de C0 ₂ et de 95% d'oxygène.

Dans le procédé de l'invention, on peut, en outre, effectuer une étape de lavage après l'étape (ii). Le lavage peut être effectué avec un milieu adapté tel que décrit précédemment.

L'invention s'étend également aux compositions proangiogéniques susceptibles d'être obtenues selon le procédé de l'invention, ladite composition comprenant des cellules mononucléées (MNC) du sang circulant et des ligands

L aptes à activer lesdites cellules mononucléées (MNC) du sang circulant pour stimuler l'activité proangiogénique ;

lesdits ligands L étant éventuellement associés à une molécule de stabilisation et/ou de liaison.

Les compositions proangiogéniques selon l'invention, peuvent être utilisées directement ou sous forme d'une composition pharmaceutique, pour une utilisation comme médicament. Le matériau proangiogénique selon l'invention, peut également être utilisé directement ou sous forme d'une composition pharmaceutique le contenant, pour une utilisation comme médicament.

Ainsi, l'un des aspects de l'invention peut être la composition proangiogénique ou le matériau proangiogénique, selon l'invention, pour son utilisation comme médicament, en particulier pour le traitement et la régénération des tissus vasculaires qui ont été endommagés notamment au niveau cardiaque, cérébral ou encore périphérique ; ou encore en thérapeutique, notamment pour la prévention ou le traitement de toute pathologie donnant des complications ischémiques comme le diabète, la neuropathie diabétique, l'athérosclérose, l'infarctus de myocarde, les accidents vasculaires cérébraux, l'artériopathie des membres inférieurs, le vieillissement, l'hyperlipidémie, Phypercholestérolémie, l'obésité, l'hypertension.

Selon un autre de ses aspects, la présente invention concerne des compositions pharmaceutiques comprenant une composition proangiogénique ou un matériau proangiogénique, selon l'invention, et éventuellement un ou plusieurs excipient(s) pharmaceutiquement acceptable(s).

Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être préparées par des procédés connus.

Les excipients sont habituellement des éléments sans activité thérapeutique qui entrent dans la composition d'un médicament ou qui sont utilisés pour sa fabrication. L'excipient a pour fonction d'améliorer l'aspect, d'assurer la conservation, de faciliter la mise en forme et l'administration du médicament. Il sert aussi à acheminer le principe actif vers son site d'action et à contrôler son absorption par l'organisme. Selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaités, différents excipients peuvent être utilisés. L'homme du métier est en mesure de choisir les excipients appropriés selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration désirés [6].

La quantité de composition proangiogénique ou de matériau proangiogénique directement administrée ou comprise dans les compositions pharmaceutiques est une quantité thérapeutiquement effective. Par quantité effective ou quantité thérapeutiquement effective, on entend une quantité de composition proangiogénique, de matériau proangiogénique, ou de composition pharmaceutique qui conduit à l'effet prophylactique ou thérapeutique désiré. Ladite quantité effective peut être déterminée de manière expérimentale par des procédures pharmaceutiques standard.

Afin d'obtenir l'effet thérapeutique désiré, la dose de principe actif (par exemple l'éphrine B2-Fc) nécessaire pour activer les cellules peut varier entre 10 et 200 microgrammes par ml et le nombre de cellules activées dans le lot à utiliser est de 10 ⁸ à 10 ¹¹ cellules par traitement. Bien que ces dosages soient des exemples de situation moyenne, il peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus faibles soient appropriés. De tels dosages font partie de l'invention. Selon la pratique habituelle, le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le médecin selon le mode d'administration, le poids et la réponse dudit patient.

Le mode d'administration peut être avantageusement parentérale. L'administration parentérale peut comprendre par exemple l'administration intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intrapéritonéale, intra-artérielle, intra-articulaire, intra-cisternale, intradermique, intralésionelle, intraoculaire, intrapleurale, intrathécale, intra-utérine, et intraventriculaire. L'indication thérapeutique à traiter ainsi que les propriétés physicochimiques et biologiques de la composition permet de déterminer la voie d'administration et la formulation les plus appropriées. Différentes formulations et systèmes d'administration sont décrits dans l'état de la technique [5].

Les compositions proangiogéniques ou les matériaux proangiogéniques, de l'invention, peuvent être utilisées pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement et à la régénération des tissus vasculaires qui ont été endommagés notamment au niveau cardiaque, cérébral ou encore périphérique. Ils peuvent aussi être utilisées pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de toute pathologie donnant des complications ischémiques comme le diabète, la neuropathie diabétique, l'athérosclérose, l'infarctus du myocarde, les accidents vasculaires cérébraux, l'artériopathie des membres inférieurs, le vieillissement, l'hyperlipidémie, l'hypercholestérolémie, l'obésité, l'hypertension. Selon un de ses aspects, la présente invention concerne une composition proangiogénique ou un matériau proangiogénique, selon l'invention, pour le traitement et la régénération des tissus vasculaires qui ont été endommagés notamment au niveau cardiaque, cérébral ou encore périphérique.

Selon un autre de ses aspects, la présente invention concerne une composition proangiogénique ou un matériau proangiogénique, selon l'invention, pour la prévention ou le traitement de toute pathologie donnant des complications ischémîques comme le diabète, la neuropathie diabétique, l'athérosclérose, l'infarctus du myocarde, les accidents vasculaires cérébraux, l'artériopathie des membres inférieurs, le vieillissement, l'hyperlipidémie, l'hypercholestérolémie, l'obésité, l'hypertension.

L'invention est, en outre, relative à l'utilisation d'une molécule à activité éphrine-B2 comme ligand apte à se lier aux récepteurs des cellules mononucléées (MNC) pour déclencher leur activation.

Les compositions proangiogéniques de l'invention peuvent être utilisées en thérapie cellulaire chez le mammifère et en particulier chez l'homme.

La présente invention, selon un autre de ses aspects, concerne également une méthode de prévention ou de traitement des pathologies ci- dessus indiquées qui comprend l'administration d'une composition proangiogénique ou d'une composition pharmaceutique la comprenant, d'un matériau proangiogénique ou d'une composition pharmaceutique le comprenant.

Une première méthode peut consister à :

isoler les cellules mononucléées (MNC) à partir du sang circulant et/ou de la moelle osseuse ;

activer les (MNC) in vitro par la liaison des ligands L à leurs récepteurs spécifiques présents sur les (MNC), pour améliorer leur propriété proangiogénique ; et

introduire les cellules (MNC) ainsi activées dans le sang ou directement dans les tissus ischémiques.

Cette méthode permet d'augmenter de manière significative le nombre de cellules (MNC) activées. L'activation in vitro des (MNC) peut être, en outre, utile pour ensemencer des prothèses vasculaires par exemple. Une deuxième méthode peut consister à :

utiliser directement un échantillon de sang et/ou de moelle osseuse dans son intégralité, contenant des cellules (MNC) éventuellement avec d'autres cellules et des cytokines ;

ajouter des ligands L audit échantillon ;

introduire directement le tout sans fractionnement cellulaire.

Chez l'homme, cette méthode peut être qualifiée d'autologue et permet de procéder à des autotransfusions, ce qui permet d'éliminer par exemple tous les problèmes de compatibilité immunologique et de sécurité virale.

Brève description des figures

La figure 1 représente les résultats de perfusion cutanée des pattes ischémique et non ischémique de la souris, évalués par vélocimétrie laser-Doppler à imagerie de perfusion ( LDI 5078, commercialisé par la société Moon Instruments).

La figure 2 représente les résultats de score angiographique des pattes ischémique et non ischémique de la souris, évalués par microangiographie de haute définition (2200, commercialisé par Kodak Dental Systems, France).

La figure 3 représente les résultats de densité capillaire dans les muscles des pattes ischémique et non ischémique de la souris, évalués par immuno-histomorphométrie quantitative (microscope à fluorescence Leitz et logiciel Histolab commercialisé par Microvision (Evry)).

EXEMPLES

Méthodes et Matériels

Les expériences sont effectuées conformément à la législation protégeant les animaux dans le cadre d'expérimentation animale et toute autre loi ou régulation en vigueur en France et en accord avec les Directives de la Communauté Européenne No. 07430 concernant le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire). Les protocoles d'étude sont approuvés par le Service de la Protection et la Santé des Animaux et de la Protection de l'Environnement, Ministère de l'agriculture, France.

Exemple 1 : Préparation d'une composition proangiogénique selon l'invention

Isolement des MNC

30 à 40 ml de sang périphérique humain ont été fraîchement recueillis dans des tubes revêtus d'héparine (Vacuette 455051 , commercialisé par la société Greiner Bio-One GmbH). Les cellules mononucléées (MNC) ont été isolées du sang périphérique par centrifugation de gradient de densité au moyen de Ficoll. Deux heures avant l'injection intraveineuse (iv) des cellules (MNC) dans les animaux, les échantillons de sang ont été dilués 2 fois avec du tampon phosphate salin ou PBS venant de l'anglais phosphate buffered saline (14040 commercialisé par la société Gibco). 30 à 35 ml de l'échantillon dilué du sang ont été placés en couche sur 10ml d'une bande de Ficoll préalablement préparée (1 ,077g/ml ; P04-60500 commercialisé par la société Pan Biotech). La centrifugation a été réalisée à température ambiante (environ 20°C) pendant 30 minutes à 700 x g (ou 700 fois l'accélération de la pesanteur. La couche blanche des cellules (MNC) a été enlevée de l'interface plasma-Ficoll. Après 2 lavages avec 50 ml de M199 (31153 commercialisé par la société Gibco) , les cellules mononucléées ont été comptées et remises en suspension dans un milieu M199 contenant 2% de sérum bovin fœtal ou FBS venant de l'anglais Fetal Bovine Sérum à une concentration de 3x10 ⁶ cellules/ml.

Stimulation des (MNC)

Pour la stimulation, 3x10 ⁶ cellules mononucléées (MNC) dans 1 ml de milieu M 199 contenant 2% de sérum bovin f tal ou FBS ont été incubées avec 15 μg éphrine-B2 (496-EB, R&D Systems) à 37°C pendant 30 minutes sous une atmosphère contenant 5% de CO2 et 95% d'oxygène. Les cellules (MNC) stimulées ont ensuite été lavées 2 fois avec 10 ml de milieu M199 contenant 2% de FBS afin d'éliminer de l'éphrin-B2 libre. Injection des (MNC1

Les (MNC) lavées ont été remises en suspension à une concentration de 10 ³ , 10 ⁴ , et 10 ⁵ cellules par 100 μΙ de PBS et ensuite injectées dans la veine de la queue des souris opérées, 5 heures après la ligature de l'artère fémorale dans des conditions stériles.

Exemple 2 : Activité proangiogénique des compositions selon l'invention

Préparation des souris nudes athvmiques

Des souris adultes nudes athymiques maies (6 à 7 semaines d'âge,

Harlan) ont été hébergées avec libre accès à la nourriture et à l'eau, au moins 7 jours avant la ligature de l'artère fémorale de droite. Les souris ont été maintenues sur un cycle inversé de nuit/jour de 12h : les souris sont maintenues dans l'obscurité de 7h à 19h puis à la lumière de 19h à 7h, à température ambiante (22°C). Toutes les manipulations sont réalisées dans des conditions exemptes de germes de pathogènes. Les souris ont été gardées dans des cages jetables en plastique comportant des filtres dans leur partie supérieure. La cage, la partie supérieure en filtre, la bouteille d'eau, le plateau de nourriture (Innovive) et la nourriture chow (Harlan) ont été préalablement irradiés aux UV. L'eau potable a été, préalablement à son utilisation, traitée à l'autoclave.

Ligature de l'artère fémorale droite

Une intervention chirurgicale a été réalisée afin de créer une ischémie unilatérale de la patte postérieure dans des conditions stériles. Les souris ont été anesthésiées par inhalation d'isofurane (1 ,5 à 2,0%). Les réflexes de retrait de patte et de clignement d'œil ont été complètement supprimés avant l'intervention. L'exposition de l'artère fémorale a été obtenue en réalisant une incision dans la partie centrale de la peau sus-jacente de la patte droite. En utilisant un microscope, l'artère fémorale a été disséquée et séparée de la veine, juste au-dessus du point de départ de la circomflexa femoris lateralis. La peau sus-jacente a été ensuite fermée au moyen d'une agrafeuse chirurgicale. Evaluation de la perfusion cutanée de la patte

L'évaluation du flux sanguin cutanée de la patte par des cellules (MNC) stimulées par éphrine-B2 permet d'évaluer la capacité des cellules (MNC) stimulées à améliorer la perfusion du membre ischémié.

Au I4 ^ème jour de post-ligature, les animaux ont été anesthésiés par injection intra-péritonéale (ip) de pentobarbital (10 mg/kg). Les souris ont été ensuite placées sur une couverture chauffante et la température rectale a été maintenue entre 36,5 et 37°C afin de minimiser l'influence de la température du corps sur la perfusion cutanée de la patte. L'évaluation a été ensuite réalisée au moyen d'un Doppler Laser à imagerie de perfusion (MLDI 5078, commercialisé par la société Moon Instruments). Les résultats de perfusion cutanée pour chaque animal ont été exprimés en rapport de la patte droite ischémiée versus la patte gauche non ischémiée. Détermination de la densité artérielle

La détermination de la densité vasculaire par des cellules (MNC) stimulées par éphrine-B2 permet d'évaluer la capacité desdites cellules stimulées à induire le remodelage du réseau vasculaire pré-existant (remodelage vasculaire).

A la suite de l'évaluation de la perfusion cutanée de la patte, la densité vasculaire a été déterminée par de la microangiographie haute définition (2200, commercialisé par Kodak Dental Systems, France). Une laparotomie longitudinale a été réalisée et un cathéter en polyéthylène (PE-10) a été inséré dans l'aorte abdominale à travers laquelle environ 150 μΙ de produit de contraste (1 ,67g/ml de sulfate de barium salin) (Fluka-11845, commercialisé par la société Sigma, France), a été injecté. La microangiographie de la patte arrière a ensuite été établie et les images (2 à 3 images par animal) ont été acquises par un transducteur digital aux rayons X. La densité artérielle de chaque patte arrière a été estimée en un pourcentage de pixels par image dans la région de quantification occupée par des artères utilisant par analyse quantitative classique d'images. Les résultats de la densité vasculaire pour chaque animal ont été exprimés en rapport de la patte droite (ischémiée) versus la patte gauche (non ischémiée). Pour l'analyse immuno-histochimique, les muscles jumeaux du triceps de tous les animaux ont été recueillis inclus dans une matrice Tissue-Tek O C. T. (commercialisé par la société Finetek Europe) et rapidement congelés au moyen de l'isopentyl prérefroidi dans de l'azote liquide.

Quantification de la densité capillaire

La quantification de la densité capillaire par des cellules ( NC) stimulées par éphrine-B2 permet d'évaluer la capacité desdites cellules stimulées à induire le développement du système vasculaire à partir d'un réseau capillaire (vasculogenèse et/ou angiogenèse).

Pour l'évaluation de la densité capillaire, chaque échantillon de muscle congelé est sectionné au moyen d'un cryostat (commercialisé par la société Leica). Les sections ont une épaisseur de 7 μητι. Le sectionnement a été réalisé à 3 niveaux différents de l'échantillon, séparés par une distance d'environ 300 μ ^η ι. Les sections ont été incubées pendant 1 heure à température ambiante (20°C), avec de l'isocyanate de fluorescéine ou FITC (fluorescein isocyanate en anglais) conjugué à l'isolectine B4 (100 μΙ par lame, 10 μg/ml ; L2895 commercialisé par la société Sigma).

Au moyen d'un microscope à fluorescence équipé de filtres appropriés

(Observer ZI, commercialisé par la société Zeiss), 6 images (2 images par niveau x 3 niveaux) ont été acquises pour chaque échantillon de muscle ischémique ou non ischémique. Le logiciel HistoLab (Version 7.0, commercialisé par la société Microvision Instrument a été utilisé afin de quantifier la densité capillaire. Les résultats pour chaque animal ont été exprimés en un rapport de densité capillaire dans la patte arrière ischémiée versus la patte arrière non ischémiée.

Analyses statistiques

Les résultats de la perfusion cutanée de la patte, de la densité artérielle et de la densité capillaire sont exprimés comme une moyenne de pourcentage du groupe témoin traité par PBS (phosphate buffer saline en anglais) + SEM (erreur sur la moyenne). Les comparaisons entre les différents groupes expérimentaux ont été réalisées au moyen d'une analyse de variance unidirectionnelle (1-way ANOVA en anglais) suivie d'une analyse complémentaire par la méthode PLSD de Fischer (Fischer's Protected Least Significant Différence Method). Les valeurs de P inférieures au seuil de 5 signification 0,05 (P<0,05), ont été considérées significatives.

Effets de cellules (MNC) du sang circulant stimulées par éphrine-B2 (EFNB2 sur la revascularisation post-ischémique î o Perfusion cutanée de la patte

Les cellules (MNC) provenant du sang veineux de patients diabétiques stimulées par EFNB2 à des concentrations de cellules 10 ³ , 10 ⁴ et 10 ⁵ , ont modifié significativement la perfusion cutanée des pattes en comparaison avec PBS au 14 ^ème jour post-ischémie (97+7%, 132+14% et 163+10% du groupe

15 PBS pour des MNC stimulées par EFNB2 à 10 ³ , 10 ⁴ et 10 ⁵ cellules respectivement, figure 1).

Résultat angiographique

Le score angiographique est significativement augmenté par les MNC 0 provenant de patients diabétiques stimulées avec EFNB2 à des concentrations de cellules de 10 ³ ' 0 ⁴ et 10 ⁵ comparé à PBS au 14 ^ème jour post-ischémie. (142+19%, 157+19% et 189+17% du groupe PBS pour des MNC stimulées par EFNB2 à 10 ³ , 10 ⁴ et 10 ⁵ cellules respectivement, figure 2). 5 Densité capillaire

Au 14 ^ème jour post-ligature, la délivrance intraveineuse des cellules MNC stimulées par EFNB2 à des concentrations de cellules 10 ³ , 10 ⁴ et 10 ⁵ , a significativement augmenté la densité capillaire (163+14%, 156+11% et 171+23% du groupe PBS pour des MNC stimulées par EFNB2 à 10 ³ , 10 ⁴ et 10 ⁵ 0 cellules respectivement, figure 3).

En conclusion, les cellules mononucléées du sang périphérique de patient diabétique, activées par ephrinB2-Fc, ont un effet proangiogénique bénéfique très marqué du point de vue fonctionnel (mesure du flux sanguin cutané) et du point de vue structurel (mesures de microangiographies artérielles et de densités capillaires).

Listes des références

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