CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención pertenece al campo de los métodos para el tratamiento de la infertilidad y la pérdida de embarazo recurrente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En la actualidad se estima que el 15% de las parejas tiene problemas de fertilidad. El origen del problema se atribuye en un 33% de los casos a la mujer, en un 25%, en un 33% de los casos a ambos, pero el origen es desconocido en el 11% de los casos restantes.

Cada vez más evidencias ponen de manifiesto la relevancia de la microbiota del tracto reproductivo de la mujer en la reproducción humana. En condiciones fisiológicas, y en contraste con la microbiota intestinal, la microbiota vaginal humana se caracteriza generalmente por una baja diversidad bacteriana y la abundancia y predominancia de bacterias del género Lactobacillus.

La microbiota vaginal en la mayoría de las mujeres sanas en edad reproductiva se compone principalmente de una o pocas especies de Lactobacillus, que representan el 90% -95% de las bacterias totales.

Varios factores contribuyen a los cambios interindividuales e intraindividuales en la microbiota vaginal y, aunque pueden ocurrir cambios entre los diferentes vaginotipos, el aumento de la diversidad y los anaerobios estrictos y la disminución o el agotamiento de los lactobacilos se consideran factores de riesgo para la vaginosis bacteriana (BV).

La composición de la microbiota vaginal (y, en particular, cualquier desviación del microbioma vaginal de baja diversidad dominado por Lactobacillus) puede desempeñar un papel clave en la fertilidad y en los resultados de los tratamientos de reproducción asistida (TRA). Sin embargo existen probióticos disponibles comercialmente que se prescriben empíricamente para tratar de repoblar el tracto reproductivo femenino con cepas de Lactobacillus (Moreno y Simón, Reprod Med Biol. 2019; 18:40-50), no se ha llevado a cabo una evaluación científica adecuada de su utilidad real. Por tanto, existe la necesidad de proporcionar nuevos tratamientos para la infertilidad, así como para la pérdida recurrente del embarazo, basados en la administración de probióticos de eficacia demostrada. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han descubierto que, sorprendentemente, la administración oral de un probiótico de la cepa CECT 5713 de Lactobacillus salivarius a mujeres con infertilidad o con pérdida de recurrente de embarazo inexplicables permitió conseguir embarazo con una efectividad del 66% (Tabla 4), y un éxito reproductivo del 56% (Tabla 4). Por otra parte, los autores de la presente invención también han descubierto que tanto en las mujeres con infertilidad como en las mujeres con pérdida recurrente de embarazo el tratamiento con el probiótico condujo a una reducción del pH vaginal (Tabla 7) y a un aumento de los niveles vaginales de las citoquinas ΤGFβ1, ΤGFβ2 y VEGF (Tabla 8) en aquellas mujeres que finalmente consiguieron embarazo, pero no en las que no lograron embarazo.

Por lo tanto, en un aspecto, la invención se refiere a una cepa de la especie Lactobacillus salivarius depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso 5713 o un mutante de la misma para su uso en el tratamiento y/o prevención de infertilidad o pérdida recurrente del embarazo en un sujeto femenino.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para monitorizar el efecto de un tratamiento para infertilidad o pérdida recurrente de embarazo en un sujeto femenino con una cepa de la especie Lactobacillus salivarius depositada en la CECT con el número de acceso 5713 o un mutante del mismo que comprende:

(i) determinar el nivel en una muestra de la mucosa de la vagina y/o de la mucosa de la cérvix de dicho sujeto femenino de un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en VEGF, TGF-β1 y ΤGF-β2 y (ii) comparar dicho nivel con un valor de referencia obtenido del mismo sujeto antes de la terapia, en donde un aumento de dicho nivel con respecto al valor de referencia es indicativo de que el tratamiento está siendo eficaz y una disminución o falta de cambio en dicho nivel con respecto al valor de referencia es indicativo de que el tratamiento está siendo ineficaz. BREVE DESRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Especies de lactobacilos dominantes en muestras de lavado cérvico -vaginal de mujeres fértiles (C), mujeres con aborto repetitivo (RA) y mujeres con infertilidad de origen desconocido (INF), en aquellos casos en los que se pudieron aislar.

Figura 2. Comparación de la diversidad bacteriana, evaluada mediante el uso del índice de Shannon (A) o el índice de Simpson (B) entre los grupos control, RA e INF. Las pruebas de suma de rango de Wilcoxon con correción de Bonferroni se utilizaron para las comparaciones por pares entre grupos. Figura 3. Gráficos de PCoA (Análisis de coordenadas principales) de perfiles bacterianos (a nivel de género) basados en el análisis de similitud de Bray-Curtis (abundancia relativa) (A) y el coeficiente de Jaccard para datos binarios (presencia/ausencia) (B), de las muestras de lavado cérvico-vaginal. Control, círculos; RA, cruces; INF, triángulos. Los diagramas de caja en las figuras inferiores presentan la distancia de las muestras al centroide en cada grupo. El valor dado en cada eje representa el porcentaje de la varianza total explicada por ese eje. El valor p se calculó con la prueba de permutación para la homogeneidad de dispersiones multivariadas. Figura 4. Gráficos de PCA (Análisis de componentes principales) de perfiles bacterianos a nivel de género en función de su abundancia relativa en las muestras de lavado cérvico-vaginal (Control, círculos; INF, triángulos; RA, cuadrados).

Figura 5. Comparación entre los grupos RA (mujeres con antecedentes de aborto espontáneo recurrente) e INF (mujeres con antecedentes de infertilidad) de diversas características en el momento del reclutamiento: (A) edad, peso y altura; (B) ph, puntuación Nugent y concentración vaginal de ΤGFβ1, ΤGFβ2 y VEGF y (C) recuento de lactobacilos.

Figura 6. Cambios en las características del grupo RA (mujeres con antecedentes de aborto espontáneo recurrente) después del tratamiento probiótico, dependiendo del resultado (embarazo versus no embarazo): (A) cambio en el pH y en la puntuación Nugent; (B) cambio en la concentración vaginal de ΤGFβ1, ΤGFβ2 y VEGF y (C) cambio en el recuento de lactobacilos.

Figura 7. Características del grupo RA (mujeres con antecedentes de aborto espontáneo recurrente) antes (I) y después (F) del tratamiento probiótico, dependiendo del resultado (embarazo versus no embarazo). (A) pH y puntuación de Nugent; (B) concentración vaginal de ΤGFβ1 , ΤGFβ2 y VEGF. Figura 8. Cambios en el perfil de especies dominantes del género Lactobacillus en el grupo RA (mujeres con antecedentes de aborto espontáneo recurrente) antes (I) y después (F) del tratamiento probiótico, dependiendo del resultado (embarazo versus no embarazo). Figura 9. Características del grupo INF (mujeres con antecedentes de infertilidad) antes (I) y después (F) del tratamiento probiótico, dependiendo del resultado (embarazo versus no embarazo).

Figura 10. Cambios en las características del grupo INF (mujeres con antecedentes de infertilidad) después del tratamiento probiótico, dependiendo del resultado (embarazo versus no embarazo): (A) cambio en el pH y en la puntuación Nugent; (B) cambio en la concentración vaginal de ΤGFβ1, ΤGFβ2 y VEGF y (C) cambio en el recuento de lactobacilos.

Figura 11. Cambios en el perfil de especies dominantes del género Lactobacillus en el grupo INF (mujeres con antecedentes de infertilidad) antes (I) y después (F) del tratamiento probiótico, dependiendo del resultado (embarazo versus no embarazo). Figura 12. Comparación de parámetros vaginales entre las mujeres de los grupos RA e INF (considerados conjuntamente) que tuvieron un embarazo y aquellas que no lo consiguieron: (A) cambio en el pH y en la puntuación Nugent; (B) cambio en la concentración vaginal de ΤGFβ1, ΤGFβ2 y VEGF y (C) cambio en el recuento de lactobacilos.

Figura 13. Comparación de parámetros vaginales entre las mujeres de los grupos RA e INF (considerados conjuntamente) que tuvieron un embarazo y aquellas que no lo consiguieron, antes (I) y después (F) del tratamiento probiótico, dependiendo del resultado (embarazo versus no embarazo): (A) pH y puntuación de Nugent; (B) concentración vaginal de ΤGFβ1 , ΤGFβ2 y VEGF.

Figura 14. Cambios en los recuentos de lactobacilos (logio ufc/ml) (A) y en el número de copias de ADN específico de L. salivarius (copias/ml) (B) en las muestras de lavado cérvico-vaginal de las mujeres de los grupos RA e INF (considerados conjuntamente) que tuvieron un embarazo y aquellas que no lo consiguieron, antes (I) y después (F) del tratamiento probiótico, dependiendo del resultado (embarazo versus no embarazo). Figura 15. Comparación de diversas características del grupo control con respecto a las de las mujeres de los grupos RA e INF que tuvieron un embarazo (P) y las de las que no lo tuvieron (NP) tras el tratamiento probiótico: (A) ph y puntuación Nugent (B) concentración vaginal de ΤGFβ1 , ΤGFβ2 y VEGF y (C) recuento de lactobacilos. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Usos médicos de la invención

En un aspecto, la invención se refiere a una cepa de la especie Lactobacillus salivarius depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso 5713 o un mutante de la misma para su uso en el tratamiento y/o prevención de infertilidad o pérdida recurrente del embarazo en un sujeto femenino.

Alternativamente, la invención se refiere al uso de una cepa de la especie Lactobacillus salivarius depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso 5713 o un mutante de la misma para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de infertilidad o pérdida recurrente del embarazo en un sujeto femenino.

Alternativamente, la invención se refiere a un método de tratamiento y/o prevención de infertilidad o pérdida recurrente del embarazo en un sujeto femenino que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una cepa de la especie Lactobacillus salivarius depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso 5713 o un mutante de la misma.

El término "cepa", como se usa en el presente documento, se refiere a una variante o subtipo genético de una especie de microorganismo, preferiblemente una especie bacteriana.

Los términos “Lactobacilus salivarius" y “Lagilactobacillus salivarius" se emplean como sinónimos en el contexto de la pr"esente invención.

En una realización, la invención se refiere a una cepa de la especie Lactobacillus salivarius depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso 5713 o un mutante de la misma para el tratamiento y/o prevención de infertilidad o de pérdida recurrente del embarazo en un sujeto femenino.

En otra realización, la invención se refiere a un mutuante de la cepa de la especie Lactobacillus salivarius depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso 5713 para el tratamiento y/o prevención de infertilidad o de pérdida recurrente del embarazo en un sujeto femenino.

El término “mutante de la cepa de la especie Lactobacillus salivarius depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso 5713”, tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier cepa obtenida de forma natural o específicamente desarrollada a partir de la cepa de referencia, principalmente por mutación, que mantenga las propiedades de la cepa de referencia. La cepa de L salivarius 5713 se caracteriza por la presencia de las siguientes propiedades.

(a) Actividad antimicrobiana frente a patógenos vaginales y/o cervicales.

El término “patógeno vaginal y/o cervical” se refiere a un microorganismo, principalmente un hongo o una bacteria, capaz de colonizar la mucosa de la vagina y/o la cérvix, potencialmente capaz de producir una enfermedad, como por ejemplo vaginitis, vaginosis, tricomoniasis, candidiasis, o infecciones del tracto urinario inferior. El término “patógeno vaginal” incluye tanto microrganismos de origen extemo como microorganismos que, si bien pueden estar presentes en una mucosa vaginal sana, pueden dar lugar a una enfermedad cuando se produce un desequilibrio en la flora bacteriana de la vagina, incluyendo una disminución de ciertos microrganismos que tienen un efecto beneficioso o protector, y/o un aumento del microorganismo potencialmente patogénico. Ejemplos ilustrativos no limitativos de patógenos vaginales incluyen Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Gardnerella vaginalis, Streptococcus agalactias, Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Prevotella, Peptostreptococcus, Escherichia coli, Enterococcus faecaiis y Ureaplasma urealyticum. En una realización particular, el patógeno vaginal se selecciona del grupo que consiste en Gardnerella vaginalis ( G . vaginalis MP14, G. vaginalis MP17, G. vaginalis MP20, G. vaginalis MP24, G. vaginalis MP29), Streptococcus agalactias (S. agalactias MP07, S. agalactias MP12, S. agalactias MP46), Candida albicans (C. albicans MP09, C. albicans MP18, C. albicans MP31), Candida glabrata (C. glabrata MP33, C. glabrata MP37), Candida parapsilosis (C. parapsilosis MP36, C. parapsilosis MP48), y Ureaplasma urealyticum ( U . urealyticum MP39, U. urealyticum MP57).

El término “actividad antimicrobiana”, tal y como aquí se utiliza, se refiere a la capacidad de matar o inhibir el crecimiento de un microorganismo, en este caso del microorganismo patógeno vaginal. La actividad antimicrobiana incluye actividad bactericida (capacidad de matar bacterias), actividad bacteriostática (capacidad de inhibir el crecimiento de las bacterias), actividad fungicida (capacidad de matar hongos) y actividad fungistática (capacidad de inhibir el crecimiento de los hongos).

(b) Capacidad de co-agregar con patógenos vaginales y cervicales.

El término “patógeno vaginal y/o cervical” se ha definido previamente. En una realización particular, el patógeno vaginal se selecciona del grupo que consiste en Gardneralla vaginalis (G. vaginalis MP14, G. vaginalis MP17, G. vaginalis MP20, G. vaginalis MP24, G. vaginalis MP29), Streptococcus agalactiae (S. agalactiae MP07, S. agalactiae MP12, S. agalactiae MP46), Candida albicans (C. albicans MP09, C. albicans MP18, C. albicans MP31), Candida glabrata (C. glabrata MP33, C. glabrata MP37), Candida parapsilosis (C. parapsilosis MP36, C. parapsilosis MP48), y

Ureaplasma urealyticum ( U . urealyticum MP39, U. urealyticum MP57). En una realización más particular, la cepa de L. salivarius CECT 5713 tiene la capacidad de co-agregar con G. vaginalis, S. agalactiae y C. albicans.

El término “capacidad de co-agregar” se refiere a la capacidad de la cepa de L. salivarius CECT 5713 de adherirse a otros microorganismo de diferente especie.

(c) Elevada adhesión a células epiteliales vaginales.

El término “adhesión” se refiere a la capacidad de la cepa de L. salivarius CECT 5713 de unirse a los tejidos del hospedador, en este caso, a las células del epitelio vaginal. Se considera que la adhesión a las células vaginales es elevada cuando es al menos un 90 % de la adhesión de la cepa de L salivarius CECT 9145 cuando se determina en las mismas condiciones experimentales, más particularmente, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, un 100% o superior.

(d) Elevada actividad a-amilasa

El término “actividad α-amilasa", tal y como aquí se utiliza, se refiere a la actividad enzimática identificada por el número EC 3.2.1.1 capaz de hidrolizar enlaces glucosídicos a lo largo de cualquier punto de la cadena de carbohidratos, descomponiéndolos para generar maltotriosa y maltosa a partir de amilosa y maltosa, glucosa y dextrina a partir de amilopectina. La actividad α-amilasa de una bacteria se considera elevada cuando es superior a 0.50 U/mL cuando se determina mediante el método de Narita et al. (2006), Appl. Environ. Microbiol. 72: 269-275.

(e) Elevada producción de ácido láctico.

El término “producción de ácido láctico”, tal y como aquí se utiliza, se refiere a la capacidad de la cepa de producir ácido láctico, cuya nomenclatura oficial es ácido 2- hidroxipropanoico o ácido α-hidroxi-propanoico, en cualquier de sus dos isómeros L o D. La producción de ácido láctico de una bacteria se considera elevada cuando es superior a 8 mg/ml en los sobrenadantes de los cultivos tras una Incubación en condiciones óptimas de crecimiento.

Por tanto, en una realización particular, el mutante de la cepa de L. salivarius CECT 5713 mantiene una o más de la propiedades anteriores. El término “mantiene”, tal y como aquí se utiliza, se refiere a que el mutante muestra una actividad de un 100% o superior o de al menos un 99%, al menos un 98%, al menos un 97%, al menos un 96%, al menos un 95%, al menos un 94%, al menos un 93%, al menos un 92%, al menos un 91%, al menos un 90%, al menos un 85%, al menos un 80%, al menos un 75%, al menos un 70%, al menos un 60% o al menos un 50% de la actividad de la cepa de L. salivarius CECT 5713 de la que deriva, cuando dicha propiedad se mide mediante ensayos cuantitativos y adecuados.

En una realización particular, el mutante de la cepa de L. salivarius CECT 5713 mantiene la actividad antimicrobiana frente a patógenos vaginales de la cepa de L. salivarius CECT 5713. En una realización más particular, el mutante mantiene al actividad antimicrobiana frente a un patógeno vaginal seleccionado del grupo que consiste en Gardneraila vaginalis (G. vaginalis MP14, G. vaginalis MP17, G. vaginalis MP20, G. vaginalis MP24, G. vaginalis MP29), Streptococcus agalactiae (S. agalactiae MP07, S. agalactiae MP12, S. agalactiae MP46), Candida albicans (C. albicans MP09, C. albicans MP18, C. albicans MP31), Candida glabrata (C. glabrata MP33, C. glabrata MP37), Candida parapsilosis (C. parapsilosis MP36, C. parapsilosis MP48), y

Ureaplasma urealyticum ( U . urealyticum MP39, U. urealyticum MP57). En una realización más particular, el mutante mantiene al actividad antimicrobiana frente a un patógeno vaginal seleccionado del grupo que consiste en Gardnarella vaginalis, Streptococcus agalactiae, Candida albicans, Candida glabrata y Ureaplasma urealyticum. La actividad antimicrobiana se puede determinar mediante cualquier ensayo cuantitativo que permita determinar la capacidad del mutante de matar a las células del microorganismo patógeno o de inhibir su crecimiento, por ejemplo, métodos de difusión o de dilución en agar así como otros métodos descritos por ejemplo en Balouri et al., Journal of Pharmaceutical Analysis, 6 (2016), 71-79. En una realización particular, el mutante mantiene la actividad antimicrobiana de la cepa de L. salivarius

CECT 5713 cuando dicha actividad se determina mediante el método de superposición descrito por Magnusson and Schnürer, Appl. Environ. Microbiol. 2001, 67, 1-5 que se emplea en los ejemplos. En una realización particular, el mutante mantiene el 100% o más, o al menos un 99%, al menos un 98%, al menos un 97%, al menos un 96%, al menos un 95%, al menos un 94%, al menos un 93%, al menos un 92%, al menos un 91%, al menos un 90%, al menos un 85%, al menos un 80%, al menos un 75%, al menos un 70%, al menos un 60% o al menos un 50% de la actividad de la cepa de L. salivarius CECT 5713 sobre el patógeno vaginal, preferiblemente un patógeno seleccionado del grupo que consiste en Gardneralla vaginalis, Streptococcus agalactiae, Candida albicans, Candida glabrata y Ureaplasma urealyticum, cuando dicha actividad se determina mediante el ensayo de superposición aquí mencionado.

En una realización particular, el mutante de la cepa de L. salivarius CECT 5713 mantiene la capacidad de co-agregar con patógenos vaginales y/o cervicales de la cepa de L salivarius CECT 5713. En una realización más particular, el mutante mantiene la capacidad de co-agregar con un patógeno vaginal y/o cervical seleccionado del grupo que consiste en G. vaginalis, S. agalactiae y C. albicans. La capacidad de co-agregar con un patógeno vaginal y/o cervical se puede determinar mediante cualquier ensayo de co-agregación conocido, por ejemplo, el ensayo descrito por Younes et al. ( PLoS One 2012, 7, e36917) que se emplea en los ejemplos del presente documento. En una realización particular, el mutante mantiene la capacidad de co-agregar con patógenos vaginales y/o cervicales de la cepa de L salivarius CECT 5713 cuando dicha actividad se determina mediante el ensayo de coagregación descrito por Younes et al. ( supra ). En una realización particular, el mutante mantiene el 100% o más, o al menos un 99%, al menos un 98%, al menos un 97%, al menos un 96%, al menos un 95%, al menos un 94%, al menos un 93%, al menos un 92%, al menos un 91%, al menos un 90%, al menos un 85%, al menos un 80%, al menos un 75%, al menos un 70%, al menos un 60% o al menos un 50% de la capacidad de co-agregar de la cepa de L salivarius CECT 5713 sobre el patógeno vaginal y/o cervical preferiblemente un patógeno seleccionado del grupo que consiste en G. vaginalis, S. agalactiae y C. albicans, cuando dicha actividad se determina mediante el ensayo de co-agregación anteriormente mencionado.

En una realización particular, el mutante de la cepa de L. salivarius CECT 5713 mantiene la elevada adhesión a células del epitelio vaginal de la cepa de L salivarius CECT 5713. La adhesión a células del epitelio vaginal se puede determinar mediante cualquier ensayo de adhesión conocido, por ejemplo, el ensayo descrito por Boris et al., Infect. Immun. 1998, 66, 1985-1989 que se emplea en los ejemplos del presente documento en el que se emplean células epiteliales vaginales recolectadas de mujeres premenopáusicas. En una realización particular, el mutante mantiene la elevada adhesión a células del epitelio de la cepa de L salivarius CECT 5713 cuando dicha actividad se determina mediante el ensayo de co-agregación descrito por Younes et al. ( supra ). En una realización particular, el mutante mantiene el 100% o más, o al menos un 99%, al menos un 98%, al menos un 97%, al menos un 96%, al menos un 95%, al menos un 94%, al menos un 93%, al menos un 92%, al menos un 91%, al menos un 90%, al menos un 85%, al menos un 80%, al menos un 75%, al menos un 70%, al menos un 60% o al menos un 50% de la adhesión de la cepa de L salivarius CECT 5713 a células del epitelio vaginal, cuando dicha actividad se determina mediante el ensayo de adhesión anteriormente mencionado. Dado que, tal y como se describe en los ejemplos del presente documento, la cepa de L salivarius CECT 5713 tiene una adhesión media a células epiteliales vaginales obtenidas mujeres premenopaúsicas de 329 ± 46 lactobacilos adherentes en 20 campos microscópicos aleatorios cuando la adhesión se determina mediante el ensayo descrito por Younes et al., en una realización particular el mutante de la cepa de L salivarius CECT 5713 presenta una adhesión similar, es decir de aproximadamente 329 ± 46 lactobacilos adherentes en 20 campos microscópicos aleatorios, o superior cuando se mide mediante ese mismo ensayo.

En una realización particular, el mutante de la cepa de L salivarius CECT 5713 mantiene la elevada actividad α-amilasa de la cepa de L salivarius CECT 5713. La actividad α-amilasa se puede determinar mediante cualquier ensayo conocido, por ejemplo, mediante el método descrito por Narita el al. (Narita et al. Appl Environ Microbiol. 2006; 72(1):269-275) empleado en los ejemplos, que se basa en la determinación de la actividad sobre el sustrato 2-chloro-4-nitrophenyl 6 ⁵ -azido-6 ⁵ - deoxy-β-maltopentaosideas. En una realización particular, el mutante mantiene la elevada actividad α-amilasa de la cepa de L salivarius CECT 5713 cuando dicha actividad se determina mediante el ensayo descrito por Narita et al. (supra). En una realización particular, el mutante mantiene el 100% o más, o al menos un 99%, al menos un 98%, al menos un 97%, al menos un 96%, al menos un 95%, al menos un 94%, al menos un 93%, al menos un 92%, al menos un 91%, al menos un 90%, al menos un 85%, al menos un 80%, al menos un 75%, al menos un 70%, al menos un 60% o al menos un 50% de la actividad α-amilasa de la cepa de L salivarius CECT 5713, cuando dicha actividad se determina mediante el ensayo anteriormente mencionado. Dado que, tal y como se describe en los ejemplos del presente documento, la cepa de L salivarius CECT 5713 tiene una actividad α-amilasa de 0,83 U/mL a las 16 horas, cuando dicha actividad se determina mediante el ensayo descrito por Narita et al., en una realización particular el mutante de la cepa de L salivarius CECT 5713 presenta una actividad α-amilasa similar, es decir de aproximadamente 0,83 U/ml a las 16 horas, o superior cuando se mide mediante ese mismo ensayo.

En una realización particular, el mutante de la cepa de L. salivarius CECT 5713 mantiene la elevada producción de ácido láctico de la cepa de L. salivarius CECT 5713. En una realización particular, el mutante de la cepa de L. salivarius CECT 5713 mantiene la elevada producción de ácido láctico, en particular de ácido L-láctico de la cepa de L. salivarius CECT 5713, en condiciones aeróbicas y/o en condiciones anaeróbicas. La producción de ácido láctico se puede determinar mediante cualquier ensayo conocido, por ejemplo, mediante el método descrito por Martín et al. (Martín et al. 2006. Int. J. Food Microbiol. 112:35-43) empleado en los ejemplos, que se basa la cuantificación de ambos enantiómeros del ácido láctico mediante un kit enzimático en el sobrenadante de un cultivo en MRS. En una realización particular, el mutante mantiene la elevada producción de ácido láctico de la cepa de L. salivarius CECT 5713 cuando dicha actividad se determina mediante el ensayo descrito por Martín et al., 2006 ( supra ). En una realización particular, el mutante mantiene el 100% o más, o al menos un 99%, al menos un 98%, al menos un 97%, al menos un 96%, al menos un 95%, al menos un 94%, al menos un 93%, al menos un 92%, al menos un 91%, al menos un 90%, al menos un 85%, al menos un 80%, al menos un 75%, al menos un 70%, al menos un 60% o al menos un 50% de la producción de ácido láctico de la cepa de L. salivarius CECT 5713, cuando dicha producción se determina mediante el ensayo anteriormente mencionado. Dado que, tal y como se describe en los ejemplos del presente documento, la cepa de L. salivarius CECT 5713 es capaz de producir 11.07 ± 0.42 mg/ml y 11.69 ± 0.58 mg/ml de ácido L-láctico en condiciones aerobias y anaerobias respectivamente cuando dicha producción se determina mediante el ensayo descrito por Martín et al., 2006, en una realización particular el mutante de la cepa de L. salivarius CECT 5713 es capaz de producir una cantidad de ácido L-láctico similar, es decir de aproximadamente 11 mg/ml a tanto en condiciones aerobias como anaerobias, o superior cuando se mide mediante ese mismo ensayo.

En una realización particular, el mutante de la cepa de L. salivarius CECT 5713 es un mutante isogénico, es decir, una cepa que tiene un genoma que sólo se diferencia de la cepa de L. salivarius CECT 5713 por la presencia de una mutación.

En otra realización particular, el mutante de la cepa de L. salivarius CECT 5713 tiene un genoma que comparte una identidad de secuencia de al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con el genoma de la cepa de L. salivarius CECT 5713. En otra realización particular, el mutante de la cepa de L. salivarius CECT 5713 se caracteriza por la presencia de un gen ARNr 16S que tiene al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con el gen ARNr 16S de la cepa de L. salivarius CECT 5713.

En otra realización particular, el grado de identidad entre un mutante y la cepa parental se determina como la identidad nucleotídica media (ANI, del inglés “average nucleotide identity”), que detecta la conservación del ADN del genoma central (Konstantinidis K y Tiedje JM, 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 2567-2592). En algunas realizaciones, el ANI entre la variante y la cepa original es de aproximadamente 95%, aproximadamente, 96%, aproximadamente 97%, de aproximadamente 98%, de aproximadamente 99%, de aproximadamente 99,1%, de aproximadamente 99,5 %, de aproximadamente 99,6%, de aproximadamente 99,7%, de aproximadamente 99,8%, de aproximadamente 99,9%, de aproximadamente 99,99%, de aproximadamente 99,999%, de aproximadamente 99,9999%, de aproximadamente 99,99999%, de aproximadamente 99,999999% o más pero menos del 100%.

En otra realización, el grado de relación entre el mutante y la cepa original se determina como el coeficiente de correlación de frecuencia de firma de tetranucleótido, que se basa en frecuencias de oligonucleótidos (Bohlin J. et al. 2008, BMC Genomics, 9: 104). En algunas realizaciones, el coeficiente de correlación de frecuencia de firma de tetranucleótido entre el mutante y la cepa de L. salivarius CECT 5713 es de aproximadamente 0,99, 0,999, 0,9999, 0,99999, 0,999999, 0,999999 o más, pero menos de 1.

En otra realización, el grado de relación entre el mutante y la cepa parental se determina como el grado de similitud obtenido al analizar los genomas del parental y de la cepa variante mediante electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) usando una o más endonucleasas de restricción. El grado de similitud obtenido por PFGE puede medirse mediante el coeficiente de similitud de dados. En algunas realizaciones, el coeficiente de similitud de dados entre el mutante y la cepa de L salivarius CECT 5713 es de aproximadamente 95%, aproximadamente, 96%, aproximadamente 97%, de aproximadamente 98%, de aproximadamente 99%, de aproximadamente 99,1%, de aproximadamente 99 , 5%, de aproximadamente 99,6%, de aproximadamente 99,7%, de aproximadamente 99,8%, de aproximadamente 99,9%, de aproximadamente 99,99%, de aproximadamente 99,999%, de aproximadamente 99,9999%, de aproximadamente el 99,99999%, de aproximadamente el 99,999999% o más pero menos del 100%.

En otra realización, una cepa se considera un mutante de una cepa parental dada cuando ambas cepas tienen el mismo ribotipo, tal como se obtiene usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica y descritos, por ejemplo, por Bouchet et al. (Clin. Microbiol. Rev., 2008, 21: 262-273).

En otra realización, el grado de relación entre el mutante y la cepa original es el coeficiente de correlación de Pearson obtenido mediante la comparación de los perfiles genéticos de ambas cepas obtenidas por PCR repetitiva basada en elementos palindrómicos extragénicos (REP-PCR) (véase, por ejemplo, Chou y Wang, Int J Food Microbiol.2006, 110: 135-48). En algunas realizaciones, el coeficiente de correlación de Pearson obtenido al comparar los perfiles REP-PCR del mutante y la cepa de L salivarius CECT 5713 es de aproximadamente 0,99, 0,999, 0,9999, 0,99999,

0,999999, 0,999999 o más, pero menos que 1.

En otra realización, el grado de relación entre el mutante y la cepa parental es la distancia de enlace obtenida comparando los perfiles genéticos de ambas cepas obtenidas por la secuenciación de secuencia de Multilocus (MLST) (véase, por ejemplo, Maiden, MC, 1998, Proc. Nati. Acad Sci. USA 95: 3140-3145). En algunas realizaciones, la distancia de enlace obtenida por MLST del mutante y la cepa de L salivarius CECT 5713 es de aproximadamente 0,99, 0,999, 0,9999, 0,99999,

0,999999, 0,999999 o más pero menos de 1.

El término “tratamiento”, tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier tipo de terapia, que tenga como objetivo la terminación, mejora o reducción de la susceptibilidad a padecer una condición clínica, como se describe aquí. Así, “tratamiento”, “tratar”, y sus términos equivalentes se refieren a la obtención de un efecto deseado farmacológica o fisiológicamente, que cubre cualquier tratamiento de una afección patológica o trastorno en un mamífero, incluyendo el ser humano. El efecto puede ser profiláctico en términos de proporcionar prevención total o parcial de un trastorno y/o efecto adverso atribuible al mismo. Es decir, "tratamiento" incluye (1) inhibir la enfermedad, por ejemplo deteniendo su desarrollo, (2) interrumpir o finalizar el desorden o por lo menos los síntomas asociados al mismo, por lo que el paciente ya no sufriría la enfermedad o sus síntomas, por ejemplo provocar la regresión de la enfermedad o sus síntomas mediante la restauración o reparación de una función perdida, ausente o defectuosa, o estimular un proceso ineficiente, o (3), aminorar, aliviar o mejorar la enfermedad, o los síntomas asociados a la misma, donde aminorar se utiliza en un sentido amplio para referirse a, al menos, una reducción en la magnitud de un parámetro, tal como inflamación, dolor, o deficiencia inmune.

El término "prevención", "prevenir" o "prevenir", como se usa en el presente documento, se refiere a la administración de la cepa de L. salivarius CECT 5713 o el mutante de la misma a un sujeto femenino al que no se le ha diagnosticado infertilidad o pérdida recurrente del embarazo en el momento de la administración, pero quién normalmente esperaría desarrollar dicha enfermedad o estar en mayor riesgo de dicha enfermedad. La prevención pretende evitar la aparición de dicha enfermedad. La prevención puede ser completa (por ejemplo, la ausencia total de una enfermedad). La prevención también puede ser parcial, de modo que, por ejemplo, la aparición de una enfermedad en un sujeto es menor que la que habría ocurrido sin la administración de la combinación o composición de la presente invención. La prevención también se refiere a la susceptibilidad reducida a una condición clínica. La prevención también incluye reducir el riesgo de padecer la enfermedad.

El término “sujeto femenino”, referido en la presente invención, se aplica a un miembro del sexo femenino de una especie de un animal mamífero, e incluye, pero no se limita, a animales domésticos, primates y humanos; el sujeto es preferiblemente un ser humano de cualquier edad o raza.

Para el uso en la prevención y/o tratamiento acorde a la invención, la cepa de L. salivarius CECT 5713 o el mutante de la misma se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz.

El término cantidad "eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un fármaco o agente farmacológicamente activo se entiende como una cantidad no tóxica pero suficiente del fármaco o agente para proporcionar el efecto deseado. En la terapia de la presente invención, una "cantidad eficaz" de la cepa de L. salivarius CECT 5713, o un mutante de la misma, es la cantidad de ese microorganismo que es efectiva para proporcionar el efecto deseado.

A pesar de que las necesidades individuales varían, la determinación de los intervalos óptimos para las cantidades eficaces microorganismo de la invención pertenece a la experiencia común de aquellos expertos en la técnica. En general, la dosis necesaria para proporcionar una cantidad eficaz de dicho microorganismo, que puede ser ajustado por un experto en la técnica variará dependiendo de la edad, salud, condición física, sexo, dieta, peso, frecuencia del tratamiento y la naturaleza y grado de deterioro o enfermedad, condición médica del paciente, la vía de administración, consideraciones farmacológicas tales como la actividad, eficacia, perfil farmacocinético y de toxicología del compuesto particular utilizado, si se utiliza un suministro de fármaco del sistema, y si el compuesto se administra como parte de una combinación de fármacos.

El término “infertilidad”, tal y como se usa en el presente documento, se refiere a la incapacidad de una mujer para reproducirse por medios naturales. En particular, es una enfermedad del sistema reproductivo definida por la imposibilidad de lograr un embarazo clínico después de 12 meses o más de relaciones sexuales sin protección regulares en ausencia de otra razón, como la lactancia materna o la amenorrea posparto. La infertilidad femenina puede deberse a diferentes causas, incluyendo:

- Alteraciones del ciclo menstrual, incluyendo anovulación, hiperprolactinemia, síndrome de ovario poliquístico, insuficiencia lútea, insuficiencia oválica precoz.

- Enfermedades de las trompas de Falopio y del útero, incluyendo oclusión de las trompas de Falopio, inflamación de la pelvis menor (o infección genital alta), malformaciones congénitas del útero y la vagina.

- Alteraciones del moco cervical

- Endometriosis

- Infecciones, como gonorrea y clamidia no tratadas, infecciones crónicas del cuello del útero y el tratamiento quirúrgico de lesiones del cuello del útero asociadas con infección por el virus del papiloma humano (HPV, del inglés “human papiloma virus”),

- Enfermedades graves como el cáncer.

- Delgadez excesiva u obesidad.

- Trastornos endocrinos, como enfermedad tiroidea, disfunción hipotalámica e hiperprolactinemia.

- Trastornos autoinmunes como lupus, enfermedad de Hashimoto y otros tipos de tiroiditis y artritis reumatoide.

En una realización particular, la infertilidad es inexplicable. El término “infertilidad inexplicable” o “infertilidad idiopática”, tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a una infertilidad de la cual, tras la realización de una batería de pruebas diagnósticas tanto a la mujer como a la pareja masculina, no se identifica una causa de la misma. En una realización particular, se considera que la infertilidad femenina es inexplicable cuando:

El examen físico no muestra signos de anomalías en el útero, las trompas de Falopio o los ovarios. Todas las pruebas de reserva oválica muestran niveles normales de suministro del óvulo.

La histerosalpingografía (HSG o) muestra unos tubos normales de la cavidad uterina y de las trompas de Falopio.

El análisis de semen del hombre muestra cantidades adecuadas de espermatozoides sanos.

La actividad de la ovulación de la mujer es normal, o cualquier trastorno de la ovulación (como el síndrome de ovario poliquístico) han sido tratados con éxito. Todos los análisis de sangre de ambos sexos muestran resultados normales.

El término “pérdida recurrente del embarazo” o “aborto espontáneo recurrente”, tal y como aquí se utiliza, se refiere a una situación en la que el sujeto femenino logra un embarazo clínico pero dicho embarazo no llega a término. En particular, se considera que existe una pérdida recurrente del embarazo en los siguientes casos

3 pérdidas de embarazo consecutivas, incluyendo embarazos no visualizados (European Society for Human Reproduction and Embryology, Royal College of Obstetricians and Gynaecologists)

2 o más pérdidas de embarazo, habiendo sido el embarazo documentado por ecografía o examen histopatológico, no necesariamente consecutivas.

La pérdida recurrente de embarazo puede deberse a diferentes causas, incluyendo: Causas anatómicas: malformaciones en el útero, fibromas.

Causas relacionadas con el estilo de vida o el medio ambiente: tabaquismo, consumo de drogas, consumo excesivo de alcohol o cafeína, obesidad. Enfermedades no tratadas como enfermedad de la tiroides o diabetes, anormalidades del sistema inmune o del sistema de coagulación sanguínea.

En una realización particular, la pérdida recurrente de embarazo es inexplicable. El término “pérdida recurrente de embarazo inexplicable”, tal y como aquí se utiliza, se refiere a una pérdida recurrente de embarazo de la cual, tras la realización de una batería de pruebas diagnósticas tanto a la mujer como a su pareja masculina, no se identifica una causa. En una realización particular, se considera que la pérdida recurrente de embarazo es inexplicable cuando las siguientes pruebas son normales:

Prueba de la cavidad uterina, dirigidas a detectar anormalidades en el útiero. Pueden incluir ultrasonido transvaginal, histerosalpinogografía, ecografía con infusión salina o resonancia magnética. Pruebas genéticas en la mujer y en el hombre, incluyendo pruebas cromosómicas del tejido fetal abortado y de la pareja.

Pruebas hormonales, incluyendo entre otros estudio de la tiroides, y análisis de prolactina, de la hormona estimulante de folículos, de glucosa en ayunas y de insulina.

Pruebas hematológicas e inmunológicas.

Es posible tratar con la cepa de L salivarius CECT 5713, o un mutante de la misma, a un sujeto femenino con infertilidad o pérdida recurrente de embarazo que va a someterse a un tratamiento de reproducción asistida, aumentando así las probabilidades de éxito del tratamiento de reproducción asistida. Por tanto, en una realización particular, la cepa de L salivarius CECT 5713, o un mutante de la misma, se administra a una mujer con infertilidad o pérdida recurrente del embarazo en combinación con un tratamiento de reproducción asistida.

El término “tratamiento de reproducción asistida” o “tratamiento de reproducción médicamente asistida” tal y como aquí se utiliza, se refiere a un tratamiento médico destinado a favorecer el embarazo en el caso de problemas de infertilidad, ya sea masculina, femenina o de ambos tipos, así como en el caso de mujeres sin pareja o con una pareja femenina que desean un embarazo con semen de un donante. La reproducción asistida se caracteriza por la estimulación o inducción de la ovulación y puede comprender la actuación directa sobre los gametos (ovocitos y/o espermatozoides) con el fin de favorecer la fecundación y la transferencia o depósito de los embriones en la cavidad uterina. Ejemplos de tratamientos de reproducción asistida incluyen inducción de la ovulación, estimulación ovárica controlada, coito programado, inseminación artificial intrauterina, intracervical e intravaginal, ya sea con semen de la pareja o de un donante, fecundación in vitro (FIV), microinyección espermática (ICSI), extracción espermática, donación de ovocitos, preservación de la fertilidad.

En una realización particular, la administración de la cepa de L salivarius CECT 5713, o un mutante de la misma, en combinación con un tratamiento de reproducción asistida supone que dicha cepa se administra a un sujeto femenino que ha recibido, está recibiendo o va a recibir una tratamiento de reproducción asistida. En una realización particular, la cepa de L. salivarius CECT 5713, o un mutante de la misma, se administra antes del tratamiento durante un cierto periodo de tiempo, por ejemplo, durante al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 8 meses, al menos 9 meses, al menos 10 meses, al menos 11 meses, al menos 1 año antes de recibir el tratamiento de reproducción asistida. En una realización particular, la cepa de L. salivarius CECT 5713, o un mutante de la misma se administra durante todo el periodo de tiempo que el sujeto femenino recibe el tratamiento de reproducción asistida. En una realización particular, la cepa de L salivarius CECT 5713, o un mutante de la misma, se administra después de que el sujeto haya recibido el tratamiento de reproducción asistida, por ejemplo, durante al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas y, en el caso de que se haya logrado embarazo, al menos hasta la semana 4, al menos hasta la semana 5, al menos hasta la semana 6, al menos hasta la semana 7, al menos hasta la semana 8, al menos hasta la semana 9, al menos hasta la semana 10, al menos hasta la semana 11, al menos hasta la semana 12, al menos hasta la semana 13, al menos hasta la semana 14, al menos hasta la semana 15 de embarazo, o durante todo el embarazo. En una realización más particular, la cepa de L salivarius CECT 5713, o un mutante de la misma, se administra al menos hasta la semana 15 de embarazo.

El término “semana de embarazo” se refiere al tiempo transcurrido desde la fecha de la última menstruación, asumiendo que el ciclo menstrual dura 28 días y que la fecundación se ha producido en el día 14 de dicho ciclo.

La cepa de L salivarius CECT 5713, o un mutante de la misma, se puede administrar por vía vaginal u oral, preferentemente por vía oral.

En una realización particular, la cepa de L. salivarius CECT 5713, o un mutante de la misma, se administra en forma de liofilizado.

La cantidad de la cepa de L. salivarius CECT 5713, o un mutante de la misma, a administrar variará dependiendo del sujeto y el modo particular de administración. Los expertos en la materia apreciarán que las dosis también pueden determinarse con la orientación de Goodman and Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Novena edición (1996), Apéndice II, pp. 1707-1711 y de Goodman y Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Décima edición (2001), Apéndice II, pp. 475-493. En una realización particular, la cepa de L. salivarius CECT 5713, o un mutante de la misma, se administra a una dosis diaria comprendida entre

5,0 log ₁₀ ufc (unidades formadoras de colonias) y 13,0 log ₁₀ ufc, por ejemplo, entre 5,5 log ₁₀ ufc y 12,5 log ₁₀ ufc, entre 6,0 log ₁₀ ufc y 12,0 log ₁₀ ufc, entre 6,5 log ₁₀ ufc y 11,5 log ₁₀ ufc, entre 7,0 log ₁₀ ufc y 11 ,0 log ₁₀ ufc, entre 7,5 log ₁₀ ufc y 10,5 log ₁₀ ufc, entre 8,0 logio ufc y 10,0 log ₁₀ ufc, entre 8,5 log ₁₀ ufc y 9,5, aproximadamente 9,0 log ₁₀ ufc. Preferiblemente, la cepa de L salivarius CECT 5713, o un mutante de la misma, se administra a una dosis diaria comprendida entre 8,5 log ₁₀ ufc y 9,5 log ₁₀ ufc, más preferiblemente a una dosis diaria de aproximadamente 9 log ₁₀ ufc.

En una realización particular, la cepa de L. salivarius CECT 5713, o un mutante de la misma, se administra durante un periodo de tiempo de al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 8 meses, al menos 9 meses, al menos 10 meses, al menos 11 meses, al menos 1 año, preferiblemente al menos 3 meses, o hasta el diagnóstico de embarazo, más preferiblemente al menos 6 meses o hasta el diagnóstico del embarazo. Si se diagnostica embarazo, preferiblemente la cepa de L salivarius CECT 5713, o un mutante de la misma, se administra al menos hasta la semana 4, al menos hasta la semana 5, al menos hasta la semana 6, al menos hasta la semana 7, al menos hasta la semana 8, al menos hasta la semana 9, al menos hasta la semana 10, al menos hasta la semana 11, al menos hasta la semana 12, al menos hasta la semana 13, al menos hasta la semana 14, al menos hasta la semana 15 de embarazo, o durante todo el embarazo, más preferiblemente, al menos hasta la semana 15 de embarazo.

Método de monitorización de la invención

Los autores de la presente invención ha detectado un aumento en las concentraciones vaginales de los factores de crecimiento VEGF, TGF-β1 y ΤGF-β2 inducidos por el tratamiento con la cepa de L salivarius CECT 5713 en las mujeres que finalmente consiguieron embarazo frente a las que no lo lograron (Tabla 8), de forma que las concentraciones de estos factores de crecimiento pueden ser un biomarcador de la eficacia del tratamiento.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para monitorizar el efecto de un tratamiento para infertilidad o pérdida recurrente de embarazo en un sujeto femenino con una cepa de la especie Lactobacillus salivarius depositada en la CECT con el número de acceso 5713 o un mutante del mismo que comprende:

(i) determinar el nivel en una muestra de la mucosa de la vagina y/o de la mucosa de la cérvix de dicho sujeto femenino de un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en VEGF, TGF-β1 y ΤGF-β2 y

(ii) comparar dicho nivel con un valor de referencia obtenido del mismo sujeto antes de la terapia, en donde un aumento de dicho nivel con respecto al valor de referencia es indicativo de que el tratamiento está siendo eficaz y una disminución o falta de cambio en dicho nivel con respecto al valor de referencia es indicativo de que el tratamiento está siendo ineficaz.

El término “in vitro", tal y como aquí se utiliza, se refiere a que el método no se lleva a cabo sobre el cuerpo de un sujeto, humano o animal, sino sobre una muestra aislada a partir de dicho sujeto.

El término "monitorizar el efecto de un tratamiento" se refiere a la respuesta del paciente que padece una enfermedad al tratamiento para tratar dicha enfermedad.

Los términos “infertilidad”, “pérdida recurrente de embarazo”, “sujeto femenino”, “cepa de la especie Lactobacillus salivarius depositada en la CECT con el número de acceso 5713”, “mutante de la misma” han sido previamente definidos en relación con el primer aspecto inventivo. Todas las realizaciones particulares y preferidas del primer aspecto en relación con dichos términos aplican igualmente al método para monltorizar el tratamiento de la invención.

El método de monitorización de la invención comprende determinar el nivel en una muestra de la mucosa de la vagina y/o de la mucosa de la cérvix de un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en VEGF, TGF-β1 y ΤGF-β2.

El término “muestra de la mucosa de la vagina y/o de la mucosa de la cérvix”, tal y como aquí se utiliza, se refiere a una muestra de la superficie de la mucosa de la vagina y del cuello del útero y que incluye moléculas pequeñas, polímeros extracelulares, proteínas y péptidos, células microbianas y células del huésped, en este caso del sujeto femenino. Dicha muestra se puede obtener mediante cualquier técnica conocida, por ejemplo, mediante frotis o mediante lavado con un fluido, por ejemplo, suero salino, lo cual se conoce como lavado “cervicovaginal” o “CVL” (del inglés “cervicovaginal lavage”). En una realización particular, la muestra de la mucosa de la vagina y/o de la mucosa de la cérvix es un lavado cervicovaginal.

El término “nivel de VEGF, TGF-β1 o ΤGF-β2", tal y como aquí se utiliza, se refiere a la cantidad de las correspondientes proteínas presentes en la muestra. El nivel de una proteína se puede determinar mediante cualquier método conocido en la técnica adecuado para la determinación y cuantificación de una proteína en una muestra. A modo de ilustración no limitante, el nivel de una proteína se puede determinar mediante una técnica que comprende el uso de anticuerpos con la capacidad de unirse específicamente a la proteína analizada (o a fragmentos de la misma que contienen los determinantes antigénicos) y posteriormente la cuantificatión de los complejos antígeno-anticuerpo resultantes, o alternativamente mediante una técnica que no comprende el uso de anticuerpos tales como, por ejemplo, mediante técnicas basadas en espectroscopia de masas. Los anticuerpos pueden ser monoclonales, policlonales o fragmentos de los mismos, Fv, Fab, Fab 'y F (ab') 2, scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y anticuerpos humanizados. Del mismo modo, los anticuerpos pueden estar marcados. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de marcadores que pueden usarse Incluyen Isótopos radiactivos, enzimas, fluoróforos, reactivos quimioluminiscentes, cofactores o sustratos enzimáticos, Inhibidores enzimáticos, partículas o colorantes. Existe una amplia variedad de pruebas conocidas que se pueden usar de acuerdo con la presente invención, como la aplicación combinada de anticuerpos no marcados (anticuerpos primarios) y anticuerpos marcados (anticuerpos secundarios), transferencia Western o inmunotransferencia, ELISA (inmunosorbente ligado a enzimas ensayo), RIA (radioinmunoensayo), EIA competitiva (inmunoensayo enzimático), DAS-ELISA (ELISA sándwich de doble anticuerpo), electroforesis en gel bidimensional, electroforesis capilar, técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, inmunoturbidimetría, inmunofluorescenda, técnicas basadas en el uso de biochips o microarrays de proteínas que incluyen anticuerpos específicos o ensayos basados en la predpitación coloidal en formatos tales como tiras reactivas y ensayos basados en puntos cuánticos unidos a anticuerpos. Otras formas de detectar y cuantificar proteínas incluyen, por ejemplo, técnicas de cromatografía de afinidad o ensayos de unión a ligando.

En una realización particular, el nivel de VEGF se determina mediante un inmunoensayo multiplex. En una realización particular, el nivel de TGF-β1 o ΤGF-β2 se determina mediante ELISA.

El término "VEGF" o “VEGF- A” o "Factor de crecimiento endotelial vascular” se refiere a un miembro de la familia de factores de crecimiento PDGF/VEGF. Se trata de una proteína de unión a heparina, que existe como un homodímero unido por disulfuro. Este factor de credmiento induce la proliferación y migración de las células endoteliales vasculares, y es esendal para la angiogénesis fisiológica y patológica. En humanos, el VEGF corresponde con la proteína definida por el número de acceso P15692 en la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot (versión 248 de la entrada, 22 de abril de 2020; versión 2 de la secuenda, 16 de noviembre de 2001).

El término TGF-β1" o “factor de crecimiento transformante beta 1" se refiere a una proteína perteneciente a la superfamilia de factores de crecimiento transformantes beta de las citoquinas. Es una proteína de secreción implicada en funciones como el control del crecimiento celular, proliferación celular, procesos de diferenciación y apoptosis. En humanos, el TGF-β1 corresponde con la proteína definida por el número de acceso P01137 en la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot (versión 253 de la entrada, 22 de abril de 2020; versión 2 de la secuencia, 1 de febrero de 1991).

El término “ΤGF-β2" o “factor de crecimiento transformante beta 2" se refiere a una proteína perteneciente a la superfamilia de factores de crecimiento transformantes beta de las citoquinas. Es una proteína implicada en funciones la angiogénesis y el desarrollo del corazón. En humanos, el ΤGF-β2 corresponde con la proteína definida por el número de acceso P61812 en la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot (versión 181 de la entrada, 22 de abril de 2020; versión 1 de la secuencia, 1 de agosto de 1988).

En una realización el método de monitorización de la invención comprende determinar el nivel en una muestra de la mucosa de la vagina y/o de la mucosa de la cérvix de VEGF. En una realización el método de monitorización de la invención comprende determinar el nivel en una muestra de la mucosa de la vagina y/o de la mucosa de la cérvix de TGF-β1. En una realización el método de monitorización de la invención comprende determinar el nivel en una muestra de la mucosa de la vagina y/o de la mucosa de la cérvix de ΤGF-β2.

En una realización el método de monitorización de la invención comprende determinar el nivel en una muestra de la mucosa de la vagina y/o de la mucosa de la cérvix de VEGF y TGF-β1. En una realización el método de monitorización de la invención comprende determinar el nivel en una muestra de la mucosa de la vagina y/o de la mucosa de la cérvix de VEGF y ΤGF-β2. En una realización el método de monitorización de la invención comprende determinar el nivel en una muestra de la mucosa de la vagina y/o de la mucosa de la cérvix de TGF-β1 y ΤGF-β2.

En una realización el método de monitorización de la invención comprende determinar el nivel en una muestra de la mucosa de la vagina y/o de la mucosa de la cérvix de VEGF, TGF-β1 y ΤGF-β2.

El método de monitorización de la invención comprende comparar el nivel de VEGF, TGF-β1 y/o ΤGF-β2 con un valor de referencia.

El nivel de VEGF, TGF-β1 y/o ΤGF-β2 se determina en una muestra de la mucosa de la vagina y/o de la mucosa de la cérvix del sujeto femenino tomada tras recibir el tratamiento, en concreto, tras recibir la administración de la cepa de L. salivarius CECT 5713, o un mutante de la misma, durante un periodo de tiempo de al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 8 meses, al menos 9 meses, al menos 10 meses, al menos 11 meses, al menos 1 año, preferiblemente al menos 3 meses, o más preferiblemente, al menos 6 meses.

El término “valor de referencia”, como se usa en el presente documento, se refiere a criterios predeterminados usados como referencia para evaluar los valores o datos obtenidos de las muestras recogidas de un sujeto. El valor de referencia puede ser un valor absoluto, un valor relativo, un valor que tiene un límite superior o inferior, un intervalo de valores, un valor medio, un valor mediana, un valor de media, o un valor comparado con un control particular o valor basal. Un valor de referencia se puede basar en un valor de una muestra individual, tal como, por ejemplo, un valor obtenido de la muestra del sujeto que se analiza, pero en un momento anterior en el tiempo. En una realización particular, el valor de referencia es el nivel en una muestra de la mucosa de la vagina y/o de la mucosa de la cérvix de dichos factores de crecimiento antes de que el sujeto femenino comience el tratamiento con la cepa de L. salivarius CECT 5713, o el mutante de la misma, por ejemplo, 4 semanas antes, 3 semanas antes, 2 semanas antes, 1 semana antes, 6 días antes, 5 días antes, 4 días antes, 3 días antes, 2 días antes, 1 día antes, o el propio día que comienza dicho tratamiento.

De acuerdo el método de monitorización de la invención, un aumento en el nivel de cualquiera de VEGF, TGF-β1 y ΤGF-β2 con respecto a su valor de referencia es indicativo de que el tratamiento está siendo eficaz, mientras que una disminución o falta de cambio en dicho nivel con respecto al valor de referencia es indicativo de que el tratamiento está siendo ineficaz.

El término “aumento del nivel con respecto al valor de referencia” indica que el nivel del factor de crecimiento es mayores que su valor de referencia. Se considera que el nivel del factor de crecimiento es mayor que su valor de referencia cuando es al menos el 1,5%, al menos el 2%, al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 100%, al menos el 110%, al menos el 120%, al menos el 130%, al menos el 140%, al menos el 150%, al menos el 200% o más mayores que el valor de referencia.

El término “disminución o falta de cambio del nivel con respecto al valor de referencia” indica que el nivel del factor de crecimiento es menor o igual que su valor de referencia. Se considera que el nivel del factor de crecimiento es menor o igual que su valor de referencia cuando es de menos de un 1,5%, menos de un 1,0%, menos de un 0,5%, o igual al valor de referencia, cuando es al menos un 1 ,5%, al menos el 2%, al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 100% menos que el valor de referencia.

En una realización particular, la infertilidad es infertilidad inexplicable.

En una realización particular, la pérdida recurrente del embarazo es pérdida recurrente del embarazo inexplicable.

En una realización particular, el tratamiento con la cepa de L salivarius CECT 5713, o el mutante de la misma, se administra en combinación con un tratamiento de reproducción asistida.

En una realización particular, la cepa se administra por vía oral.

En una realización particular, la cepa se administra durante un periodo de tiempo de al menos 3 meses, al menos 6 meses, o hasta el diagnóstico de embarazo.

En una realización particular, si se diagnostica embarazo, la administración de la cepa se mantiene al menos hasta la semana 15 de embarazo.

En una realización particular, la cepa se administra a una dosis diaria comprendida 8,5 log ₁₀ ufc y 9,5 log ₁₀ ufc. En una realización más particular, la cepa se administra a una dosis diaria de aproximadamente 9 log ₁₀ ufc.

La invención se describe a continuación por medio de los siguientes ejemplos que tienen carácter meramente ilustrativo y no limitativo del ámbito de la invención.

EJEMPLOS

Materiales y métodos

Participantes· muestra y diseño del estudio

Un total de 58 mujeres, de entre 28 y 45 años, participaron en este estudio. Las voluntarias fueron distribuidas en 3 grupos. Todas las voluntarias en el grupo de AR (n = 21) tenían antecedentes de aborto espontáneo recurrente con tres o más pérdidas de embarazo durante las primeras 12 semanas de embarazo. Todas las mujeres del grupo INF (n = 23) tenían antecedentes de infertilidad (incapacidad para concebir) a pesar de ser receptoras de TRA durante al menos tres veces, incluido un ciclo, al menos, de fertilización in vitro (FIV). Finalmente, el grupo control (n = 14) incluyó mujeres control que tenían al menos dos hijos después de embarazos a término sin complicaciones. Ninguna de las mujeres de los grupos de AR e INF recibió TRA durante todo el período de estudio. Ninguna de las mujeres del grupo de AR fue diagnosticada con síndrome antifosfolípido y, por lo tanto, no recibieron heparina y / o ácido salicílico durante el estudio. Ninguna de las mujeres participantes había recibido o consumido terapia hormonal, antibióticos o probióticos en las 4 semanas previas al muestreo. Se tomaron muestras vaginales al menos 7 días después del coito para evitar o minimizar el impacto del semen de la pareja en el pH vaginal, el microbioma y el perfil inmunológico (en el último caso, particularmente en relación con la concentración de TGF-β 1 y TGF-β 2). Las mujeres con intolerancia a la lactosa o alergia a la proteína de la leche de vaca fueron excluidas debido al excipiente utilizado para administrar la cepa en el ensayo piloto posterior (ver más abajo).

En el reclutamiento (día 0), se recogieron dos muestras de mujeres de los tres grupos dentro de los primeros tres días después de la ovulación: una muestra de torunda vaginal para una nueva determinación del puntaje Nugent y un lavado cervicovaginal (CVL) del orificio cervical y paredes vaginales con 10 mi de solución salina normal estéril (Nakra et al., J Infect Dis. 2016, 213(5):840-7) para todos los demás análisis. Se usaron partes alícuotas de las muestras de CVL para análisis basado en cultivo. Posteriormente, las muestras CVL se clarificaron por centrifugación a baja velocidad a 800 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Se almacenaron alícuotas de sobrenadante de CVL y sedimentos celulares a -80 ° C hasta que se realizaron los análisis inmunológicos y metataxonómicos.

Después del día 0, las mujeres de los grupos RA e INF consumieron (vía oral) un sobre diario con ~ 50 mg de probiótico liofilizado (~ 9 Iog10 ufc de L salivarius CECT 5713) durante 6 meses o hasta el diagnóstico de embarazo (lo que sucedió primero). En ese punto, se recogieron las mismas dos muestras de cada mujer. Después de un diagnóstico de embarazo, la administración oral de la cepa se mantuvo hasta la semana 15 de embarazo. Todos los embarazos espontáneos que ocurrieron dentro del primer año después del día 0 se registraron en este estudio.

Los sobres que contenían el probiótico se mantuvieron a 4°C durante todo el estudio. Todos los voluntarios recibieron cuestionarios para registrar el cumplimiento de la ingesta de productos del estudio. La tasa mínima de cumplimiento (% de las dosis totales de tratamiento) se estableció en 86%. Todos los voluntarios dieron su consentimiento informado por escrito al protocolo, que había sido aprobado por el Comité Ético de Investigación Biomédica de la Consejería de Salud y Familias (Junta de Andalucía, Granada, España) (PO50 / 19, Ley 11/19).

Medida de PH vaginal y puntuación Nugent

En cada una de las dos visitas de estudio, se midió el pH de la pared vaginal lateral (Whatman pH paper, pH 3.8-5.5 y pH 6.0-8.1). La puntuación de Nugent se realizó como se describió anteriormente (Nugent et al., J Clin Microbiol. 1991, 29(2):297-301). Brevemente, el material de la torunda se transfirió a un portaobjetos de vidrio, se fijó con calor y se realice una tinción Gram. Se cuantificaron los morfotipos bacterianos Gram-positivos, Gram-negativos y Gram-variables. Un puntaje de Nugent de 0-3 se consideró normal, 4-6 se consideró intermedio y 7-10 se consideró compatible con la vaginosis bacteriana (Nugent et al., supra).

Análisis dependiente de cultivo

Las muestras de CVL recogidas durante el ensayo se diluyeron en serie y se colocaron en placas sobre placas de agar con ácido nalidíxico de Columbia (CNA), Gardnerella (GAR), CHROMagar StrepB (CHR) Mac Conkey (MCK), Mycoplasma (MYC) y Sabouraud Dextrosa Cloranfenicol (SDC) (BioMerieux , Marcy l'Etolle, Francia) para el aislamiento selectivo y la cuantificación de las principales bacterias no Lactobacillus y levaduras cultivables que se pueden encontrar en la vagina, incluidos los agentes más frecuentemente Involucrados en infecciones vaginales. También se extendieron sobre placas de agar de MRS (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) suplementario con L-cisteína (2.5 g / L) (MRS-C) o sangre de caballo (5%) (MRS-B) para el aislamiento de lactobacilos, incluyendo L. iners (MRS-B). Todas las placas se incubaron durante 48 horas a 37°C en condiciones aeróbicas, con la excepción de las MRS-C y MRS-B, que se incubaron anaeróbicamente (85% de nitrógeno, 10% de hidrógeno, 5% de dióxido de carbono) en una estación de trabajo anaeróbica. (DW Scientific, Shipley, Reino Unido). Después de la incubación, se registraron los recuentos en cada medio de crecimiento y, posteriormente, se seleccionó al menos un representante de cada morfología de la colonia de las placas de agar. Los aislamientos se identificaron mediante espectrometríí de masas por ionización por desorción asistida por matriz de ionización-tiempo de vuelo (MALDI-TOF) (Bruker, Alemania). Cuando la identificación por MALDI-TOF no fue posible a nivel de especie (particularmente en el caso de los aislados de lactobacilos), la identificación se llevó a cabo mediante secuenciación del gen de ARN ribosómico 16S (ARNr) según lo descrito por Mediano et al. (J Hum Lact. 2017, 33(2): 309-318) Extracción de ADN de las muestras

Se usó aproximadamente 1 mi de cada muestra de CVL para la extracción de ADN siguiendo un método descrito anteriormente (Lackey et al., Front Nutr. 2019, 17; 6:45). El ADN extraído se eluyó en 22 μΙ de agua libre de nucleasas y se almacenó a - 20 °C hasta su posterior análisis. La pureza y la concentración de cada ADN extraído se estimaron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 1000 (NanoDrop Technologies, Inc., Rockland, EE. UU.). Se agregaron controles negativos (sin muestra) durante la extracción.

Detección v cuantificación de ADN de Lactobacillus salivarius por q PCR (PCR cuantitativa a tiempo real)

Los cebadores y las condiciones para la cuantificación del ADN que pertenece específicamente a la especie L. salivarius se han descrito previamente (Harrow et al., Appl Environ Microbiol. 2007, 73(22): 7123-7). La concentración de ADN de todas las muestras se ajustó a 5 ng μL ^-1 . Se usó un termociclador de PCR en tiempo real comercial (CFX96 ™, Biorad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.) para todos los experimentos. Se usaron curvas estándar usando 1:10 diluciones de ADN (que varían de 2 ng a 0.2 pg) de L salivarius CECT 5713 para calcular los objetivos genómicos bacterianos desconocidos. Se obtuvieron valores de ciclo de umbral (Ct) entre 15.29 y 20.07 para este rango de ADN de L. salivarius (R2 = 0.9915). Los valores de Ct medidos para el ADN extraído de especies no objetivo (L. reuteri MP07 y L. plantarum MP02; colección propia) fueron ≥39.27 ± 0.64. Estas dos cepas de control se seleccionaron porque pertenecen a la especie taxonómicamente más cercana a L. salivarius (Salvetti et al., 2018). Todas las muestras y estándares se procesaron por triplicado.

Análisis metataxonómico

Las regiones hipervariables V3-V4 del ADNr 16S se amplificaron por PCR utilizando los cebadores universales SD-Bact-0341-bS-17

(CCTACGGGNGGCWGCAG, SEQ ID NO: 1) y SD-Bact-129 0785-aA-21 (GACTACHVGGGTATCTAATCC, SEQ ID NO: 2) y se secuenciaron en el sistema MiSeq de lllumina en las instalaciones del Parque Científico de Madrid (Tres Cantos, España) (Klindworth et al., Nudeic Acids Res. 2013, 41, e1). Los códigos de barras anexados a los extremos 3 'y 5' terminales de los amplicones de PCR en una segunda reacción de PCR permitieron separar las secuencias directa e inversa. La concentración de ADN en los productos de PCR se cuantificó a través del sistema 2100 Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.). Después de agrupar los productos de PCR a proporciones molares aproximadamente iguales, los amplicones de ADN se purificaron usando un kit de extracción de gel QIAEX II (Qiagen) de la banda extirpada que tenía el tamaño correcto después de correr sobre el gel de agarosa. La concentración de ADN se cuantificó luego con PicoGreen (BMG Labtech, Jena, Alemania). Los amplicones de ADN agrupados, purificados y con código de barras se secuenciaron usando el protocolo de fin de par lllumina MiSeq (lllumina Inc., San Diego, CA, EE. UU.) Siguiendo los protocolos del fabricante. Análisis de parámetros inmunológicos

El factor de credmiento vascular endotelial (VEGF) se analizó utilizando un panel multiplex premezclado (Bio-Rad, San Diego, CA). Paralelamente, los niveles de TGF-β 1 y TGF-β 2 se midieron por ELISA con los kits RayBio® Human TGF-β 1 y Human TGF-β 2 ELISA, respectivamente (RayBlotech, Norcross, GA, EE. UU.). Todas las determinadones se llevaron a cabo siguiendo el protocolo del fabricante y se realizaron curvas estándar para cada analito .

Actividad antimicrobiana de L salivarius CECT5713 frente a patógenos vaginales

Se usó un método de superposición (Magnusson and Schnürer, Appl. Environ. Microbiol. 2001, 67, 1-5) para determinar la capacidad de L. salivarius CECT5713 para inhibir el crecimiento de diversas especies de bacterias y levaduras. Se realizó según lo descrito por Martín et al. (2006). Todas las cepas empleadas como organismos indicadores (nuestra propia colección de cultivos) habían sido aisladas previamente de casos clínicos de infecciones vaginales o cervicales, e incluyeron anco cepas de Gardnerella vaginalis, tres cepas de Streptococcus agalactiae, tres cepas de Candida albicans, dos cepas de Candida glabrata, dos cepas de Candida parapsilosis y dos cepas de Ureaplasma urealyticum. Todos los experimentos que ensayaron la actividad inhibitoria se realizaron por triplicado. Producción de compuestos antimicrobianos por L salivarius CECT5713 La producción de peróxido de hidrógeno por la cepa Lactobacillus se midió utilizando el método cuantitativo de Yap y Gilliland, 2000, J.Dairy Sei. 83, 628-632, modificado por Martín et al. (Int. J. Food Microbiol. 2006, 112: 35-43). La producción de ácido láctico (isómeros L y D) y ácido acético por L. salivarius CECT5713 se determinó utilizando kits enzimáticos (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), según lo descrito por Martín et al. (2006). También se midieron los valores de pH de los sobrenadantes de cultivo. Estos ensayos se realizaron por triplicado en condiciones aeróbicas y anaeróbicas estrictas, y los valores se expresaron como la media ± DE. La actividad de la bacteriocina no se analizó ya que los análisis fenotípicos anteriores y el análisis del genoma de L. salivarius CECT5713 habían demostrado la incapacidad de esta cepa para producir tales compuestos antimicrobianos (Martín et al., supra; Langa et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2012, 94(5): 1279-87). Ensavos de coagregación v adhesión a líneas celulares epitelio vacinal

La capacidad de la cepa para agregarse con las células de las cepas indicadoras citadas anteriormente se investigó siguiendo el procedimiento de Younes et al. ( PLoS One 2012, 7, e36917) Las suspensiones se observaron bajo un microscopio de contraste de fase después de la tinción de Gram. La adherencia a las células epiteliales vaginales recolectadas de mujeres premenopáusicas sanas se realizó e interpretó como se describió anteriormente (Boris et al., Infecí Immun. 1998, 66, 1985-1989). La adherencia se midió como el número de lactobacilos adheridos a las células vaginales en 20 campos microscópicos aleatorios. L. salivarius CECT 9145 se utilizó como cepa de control debido a su alta adherencia a las células vaginales (Martín et al., Nutriente. 2019, 11(4). pii: E810). El ensayo se realizó por triplicado.

Actividad α-amilasa de L. salivarius CECT5713

Por una parte, la actividad de α-amilasa de L. salivarius CECT5713 se evaluó cualitativamente utilizando el método descrito por Padmavathi et al. (J Genet Eng Biotechnol. 2018; 16(2): 357-362). Brevemente, la cepa se inoculó en un medio MRS modificado (0,5% de peptona, 0,7% de extracto de levadura, 0,2% de NaCI, 2% de almidón y 1,5% de agar) suplementado con 0,25% de almidón. Las placas se incubaron a 37°C durante 48 h en anaerobiosis y, luego, se observó la zona de despeje agregando yodo de Gram como agente de detección. Posteriormente, también se midió la actividad de la α-amilasa en la superficie de L salivarius CECT5713 con un kit de medición de la α-amilasa (Kikkoman Co., Tokio, Japón), utilizando 2-cloro-4- nitrofenilo 65-azido-65-desoxi- β-maltopentaosideas sustrato utilizando un protocolo y condiciones descritas anteriormente (Narita et al., 2006). Una unidad de actividad se definió como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 μmol de 2-cloro-4- nitrofenol a partir de 2-cloro-4-nitrofenilo 65-azido-65-desoxi-β-maltopentaósido por minuto a 37 ° C.

Análisis bioinformáticos

Los datos crudos sin procesar se demultiplexaron y se filtraron por calidad utilizando el software de análisis lllumina MiSeq Repórter. La bioinformática del microbioma se realizó con QIIME 2 2019.1 (Bolyen et al., Natura Biotechnology, 2019, 37: 852-857). La desinfección se realizó con DADA2 (Callahan et al., Nat Methods. 2016; 13:581-583). La taxonomía se asignó a los ASV utilizando el clasificador de características q2 (Bokulich et al. Microbiome. 2018, a; 6:90) que clasifica el clasificador de taxonomía Bayes ingenuo skleam contra las secuencias de referencia SILVA 132 OTU (Quast, Nucí. Acids Res. 2013, 41 (D1): D590-D596). El análisis bioinformático posterior se realizó utilizando la versión R 3.5.1 (R Core Team, 2013; https://www.R-project.org). Se generó una tabla de recuentos de OTU por muestra, y las abundancias de taxones bacterianos se normalizaron con el número total de secuencias en cada muestra. El alfa y la diversidad se estudiaron con los índices de diversidad de Shannon y Simpson con el paquete R Vegan (Versión: 2.5.6) (Oksanen et al., Community Ecology package, 2007, 10; 631-637). Los estudios de diversidad beta se realizaron utilizando el Análisis de coordenadas principales (PCoA) para trazar patrones de diversidad de la comunidad bacteriana a través de una matriz de distancia que contiene un valor de disimilitud para cada comparación de muestras por pares. Los análisis cuantitativos (abundancia relativa) y cualitativos (presencia / ausencia) se realizaron con el índice Bray-Curtis y el índice binario Jaccard, respectivamente. El análisis de varianza de las matrices de distancia se realizó con la "prueba de manova no paramétrica" Adonis con 999 permutaciones para revelar estadísticamente significativa con el paquete R Vegan.

Análisis estadístico

Los datos microbiológicos se registraron como UFC / mi y se transformaron a valores logarítmicos antes del análisis estadístico. Los datos cuantitativos se expresaron como la mediana y el rango intercuartil (RIC). Las diferencias entre los grupos se evaluaron mediante las pruebas de Kruskal-Wallis y las pruebas de suma de rangos de Wilcoxon por pares para calcular las comparaciones entre los grupos. Se realizó la prueba de correcciones de Bonferroni. La correlación entre los 20 géneros relativamente abundantes se visualizó utilizando el paquete R "qgraph" (Epskamp 2012). El análisis estadístico y el trazado se realizaron en el entorno R con la biblioteca ggplot2 (Wickham, 2016). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas con un valor P <0,05. La contribución de una variable es (en porcentaje): (variable cos2 * 100) / (cos2 total del componente). Cos2 = calidad de representación o peso de la variable en la representación PCA.

Resultados

Datos demográficos y características clínicas de las participantes

Las características de las 58 mujeres que participaron en este estudio se presentan en la Tabla 1. La edad media (IC 95%) de las mujeres en el grupo control fue de 34,6 años (33,4-35,8 años), mientras que las de mujeres con abortos repetitivos (AR) y las mujeres con infertilidad de origen desconocido (INF) tenían 39,4 (38,5-40,4) años y 38,0 (37,1-38,9) años (tabla 1). Las mujeres en el grupo de control eran aproximadamente 4-5 años más jóvenes que otros participantes (p <0.001; ANOVA unidireccional), pero no hubo diferencias en los valores medios de peso corporal y altura entre los tres grupos de mujeres (Tabla 1).

Tabla 1. Características de las participantes (n = 58), que estaban distribuidas en tres grupos: grupo control (mujeres que tenían al menos dos hijos después de embarazos a término sin complicaciones), grupo RA (mujeres con antecedentes de aborto involuntario recurrente) y grupo INF (mujeres con antecedentes de infertilidad).

SD: desviación estándar; Cl: intervalo de confianza.

# Se utilizaron pruebas ANOVA unidireccionales para evaluar las diferencias en las medias de edad, peso, altura y duración media del ciclo menstrual entre grupos. ‘Extensión de Freeman-Halton de las pruebas de probabilidad exacta de Fisher para una tabla de contingencia 2 x 3.

Alrededor del 71% de las mujeres en el grupo de control tenían un ciclo menstrual regular, mientras que en los otros dos grupos (RA e INF) este porcentaje fue del 48%, aunque esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p = 0.337; extensión de Freeman-Halton de las pruebas de probabilidad exacta de Fisher para una tabla de contingencia 2 x 3). No se observaron diferencias en la duración media del ciclo menstrual que fue de 28, 27,4 y 27,5 días para las mujeres en los grupos control, AR e INF, respectivamente (Tabla 1). Parámetros básales de salud vaginal

El pH vaginal en mujeres del grupo control tuvo un valor medio (IC del 95%) de 4,53 (4,38-4,68) (tabla 2). En contraste, el pH vaginal fue más alto en los dos grupos de estudio: 5.67 (5.55-5.79) en el grupo RA y 5.96 (5.84-6.07) en el grupo INF (p = 0.000; ANOVA de un vay). Se registraron puntuaciones Nugent medias más altas significativas (IC 95%) 5.95 (5.54-6.37) y 6.30 (5.91-6.70) en mujeres de los grupos RA e INF, respectivamente, que en los controles (p = 0.000; ANOVA de un vay) (Tabla 2) También hubo diferencias en los niveles de las citocinas ΤGFβ1, ΤFGβ2 y VEFG en CVL. El contenido de CVL de estas tres citocinas en mujeres del grupo control fue de 4,83 pg / mi (4,65-5,01) pg / mi, 3,22 pg / mi (4,65-5,01) pg / mi y 406,0 pg / mi (322,0- 490,0) pg / mL para ΤGFβ1, ΤFGβ2 y VEFG, respectivamente, mientras que se redujeron aproximadamente a la mitad en ambos grupos de estudio (RA e INF) (Tabla

2).

Tabla 2. Comparación de los parámetros vaginales básales (pH, puntuación de Nugent, citoquinas y microbiología) de las participantes (n = 58) de los grupos control (mujeres que tenían al menos dos hijos después de embarazos a término sin complicaciones), RA (mujeres con antecedentes de aborto involuntario recurrente) e INF (mujeres con antecedentes de Infertilidad).

SD: desviación estándar; Cl: intervalo de confianza, ΤGFβ1, factor de crecimiento transformante β1; ΤGFβ2, factor de crecimiento transformante β2; VEGF, factor de crecimiento endotelial vascular.

# Se utilizaron pruebas ANOVA unidireccionales para evaluar las diferencias en las medias entre grupos. Las diferentes letras en negrita en la misma fila indican diferencias estadísticamente significativas entre los grupos.

‘Extensión de Freeman-Halton de las pruebas de probabilidad exacta de Fisher para una tabla de contingencia 2 x 3.

“Media en aquellas mujeres en las que se pudieron aislar lactobacilos a partir de sus muestras.

Se detectaron lactobacilos en la CVL de todas las mujeres del grupo de control (n = 14) y el valor medio (IC 95%) de los recuentos de lactobacilos fue de 7.24 log ufc / ml (6.89-7.60) Iog10 ufc/ml utilizando una evaluación dependiente del cultivo. La frecuencia de detección de lactobacilos en CVL fue menor en los grupos RA e INF: 57% y 26%, respectivamente (p <0.001, extensión de Freeman-Halton de las pruebas de probabilidad exacta de Fisher para una tabla de contingencia 2 x 3). Además, las concentraciones de lactobacilos también fueron 2.20 y 1.46 unidades Iog10 más bajas en muestras de CVL de mujeres con lactobacilos positivos en grupos de AR e INF, respectivamente. Otra diferencia entre estos grupos fue en relación con el perfil de lactobacilos (Figura 1). Se identificaron hasta seis especies diferentes de lactobacilos en muestras CVL de mujeres en el grupo de control, induidas L. crispatus (la especie dominante), L. jensenii, L gasseri, L fermentum, L salivarius y L. vaginalis. Los perfiles de especies de lactobacilos en los grupos de estudio RA e INF fueron más estrechos que en los controles y L. fermentum, L salivarius y L. vaginalis no se encontraron en ninguna muestra de grupos RA e INF. Es significativo observar que L. iners no se aisló de ninguna muestra de CVL del grupo de control, pero se aisló de aproximadamente un tercio (5 de un total de 18 muestras positivas para lactobacilos) de muestras de grupos RA e INF. Los niveles de L. salivarius en hisopos vaginales también se determinaron por qPCR específico de la especie. Mediante el uso de esta técnica, esta especie bacteriana se detectó solo en la muestra de una mujer en el grupo de control (7,29 Iog10 coplas / hisopo). Esta mujer fue la única Identificada como L. salivarius positiva (a una concentración de 7.3 Iog10 ufc / hisopo) utilizando técnicas de cultivo. La cepa de L. salivarius aislada de una mujer de este grupo fue genéticamente diferente a L. salivarius CECT 5713 (resultados no mostrados).

El análisis de secuendación del gen 16S rRNA de las muestras CVL (n = 58) arrojó 4,363,364 secuendas filtradas de alta calidad, que van desde 33,160 a 139,044 por muestra (mediana [IQR] = 73,383 [66,587-82,821]). Se asignaron secuencias a un total de 23 phyla y 453 géneros. El análisis de la diversidad alfa, calculado ya sea por los índices de Shannon o de Simpson, reveló diferencias significativas entre la microbiota vaginal de las mujeres en el grupo de control fértil y las mujeres con Infertilidad de origen desconocido (p <0.001) (Figura 2). El análisis de la diversidad beta, calculado de acuerdo con la abundanda relativa de OTU (distancia de Bray- Curtís) y la presencia / ausencia de OTU (matriz de distancia de Binnary Jaccard), Indicó que la bacteria vaginal de los 3 grupos se agrupó (p = 0.004 y p = 0.002, respectivamente) (Figura 3). Además, las muestras de los controles fértiles se agruparon más cercanos (distancia más corta al centroide) de acuerdo con la abundancia relativa de OTU (distancia Bray-Curtis) que las de los grupos RA e INF, lo que indica que el perfil bacteriano en las muestras CVL de los controles fue muy uniforme (Figura 3).

El análisis de PCA se realizó para una evaluación inicial de patrones potencialmente dominantes en el perfil bacteriológico de las muestras vaginales (Figura 4). Las dos primeras dimensiones de PCA explicaron el 84.9% de la variación total presente en las muestras, con la primera dimensión (componente principal) representando el 74.7% y la segunda dimensión representando el 10.2% de la varianza total. De forma global, este análisis reveló una mayor similitud entre las muestras del grupo de control fértil y las mujeres con antecedentes de aborto repetitivo que entre el grupo de control fértil y las mujeres con infertilidad de origen desconocido.

La comparación de la abundancia relativa (% del total) de OTU a nivel de phylum en muestras de CVL de los tres grupos reveló diferencias estadísticamente significativas con respecto a los 4 phyla dominantes: Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria y Bacteroidetes (Tabla 3) El phylum más frecuente (presente en todas las muestras) y abundante fue Firmicutes. La abundancia relativa de Firmicutes en muestras proporcionadas por controles fértiles [mediana (IQR) = 95.01% (99.18% - 99.8%)] fue mayor que en muestras de mujeres de grupos de AR e INF [mediana (IQR) = 97.29% (72.34% -99.35%) y 89.96% (52.46% -98.85%), respectivamente] (p <0.050 y p <0.001; pruebas de Wilcoxon) (Tabla 3). En contraste, los valores de la mediana (IQR) de la abundancia relativa de Actinobacteria, Proteobacteria y Bacteroidetes fueron más altos en las mujeres de los grupos RA e INF que en los controles fértiles (p <0.012, p <0.003 y p <0.006, respectivamente; Kruskal -Pruebas de rango de Wallis) (Tabla 3).

A nivel de género, el único género bacteriano que se detectó en todas las muestras fue Lactobacillus, pero hubo diferencias significativas en su abundancia relativa en las muestras de los tres grupos (Tabla 3). La mediana (IQR) de la abundancia relativa de Lactobacillus en muestras de mujeres de grupos RA e INF [93.49% (67.18% -97.53%) y 71.95% (0.76% -94.09%), respectivamente] fue menor que en muestras de mujeres control fértiles [97.88% (96.92% -99.31%)] (p = 0.001; pruebas de rango de Kruskal-Wallis) (Tabla 3). Otros géneros estuvieron presentes en un número variable de muestras, que oscilaron entre el 96% ( Staphylococcus en el grupo INF) y el 7% (Escherichia / Shigella en el grupo control), pero la mediana de la abundancia relativa de cualquiera de estos géneros fue inferior a <1%. El perfil bacteriano a nivel de género en algunas muestras individuales de mujeres en grupos de AR e INF no difirió del de las muestras de mujeres del grupo de control fértil, que eran altamente homogéneas. Sin embargo, se registraron perfiles aberrantes con contenido reducido o incluso ausencia total de Lactobacillus en algunas muestras de mujeres de grupos de AR e INF (datos no mostrados).

Globalmente, la comparación de los grupos RA e INF al comienzo del estudio reveló algunas diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos (Figura 6). El pH vaginal fue mayor en las mujeres en el grupo INF que en las del grupo RA, pero se observó lo contrarío para ΤGFβ1 y VEGF. No se observaron diferencias con respecto a otras características, como edad, peso, altura, puntuación Nugent, ΤGFβ2 y recuentos viables de lactobacilos (Figura 5).

Parámetro principal del estudio clínico: efectividad del embarazo v embarazos a término (Resultados reproductivos / Embarazo)

En general, la administración de probióticos de la cepa a las mujeres de los grupos RA e INF condujo a 29 embarazos de las 44 mujeres participantes. Esto significa una efectividad del embarazo del 66% con un IC del 95% del 51-78% (p = 0.017) (Tabla 4). Entre ellas, hubo 25 embarazos exitosos y 4 abortos de las 44 mujeres participantes. Esto significa una efectividad para el éxito reproductivo del 56% con un IC del 95% del 42-70% (p = 0.183) (Tabla 4). Curiosamente, todos los embarazos exitosos condujeron a embarazos únicos a término (edad g estacional ≥38 semanas). Las edades gestacionales, los valores de peso y longitud al nacer y el sexo de los bebés se muestran en la Tabla 1.

Tabla 4. Principales resultados después del tratamiento probiótico. # Proporción Chi-cuadrado de Pearson.

*2 mujeres en cada grupo tuvieron un aborto.

Las mujeres del grupo de AR tuvieron la tasa más alta de éxito reproductivo ya que hubo 17 embarazos (15 embarazos a término y 2 abortos) de 21 participantes durante el período de estudio. La tasa en el grupo INF fue menor aunque aún notable: 12 embarazos (10 embarazos a término y 2 abortos) de 23 participantes. La comparación de la efectividad del embarazo y las tasas de embarazo exitosas (IC 95%) entre mujeres en AR e INF [1.55 (0.70-3.56) y 1.64 (0.69-4.09, respectivamente) revelaron que no hubo diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos (Tabla 4). Sin embargo, debe destacarse que todas las mujeres de estos grupos habían sido sometidas sin éxito a intervenciones de TAR en intentos previos para evitar un aborto espontáneo (grupo AR) o quedar embarazadas (grupo INF).

Parámetros secundarios de respuesta asociados con el tratamiento con probióticos: cambios en los parámetros vaginales en mujeres en el grupo de AR

No hubo diferencias en edad, peso o estatura entre aquellas mujeres en el grupo de AR que terminaron teniendo un embarazo exitoso (n = 15) y aquellas que no

(n = 6).

Sin embargo, se observaron cambios diferenciales en este grupo de mujeres (grupo de AR) después del tratamiento con probióticos dependiendo de los resultados finales del embarazo (Tabla 5). En aquellas mujeres que pudieron completar un embarazo exitoso, el valor medio (DE) del pH vaginal fue 1,13 (0,38) unidades más bajas si quedaban embarazadas en comparación con las que no lo hicieron. Se observaron cambios similares para la puntuación Nugent, que registró 3.33 (1.11) unidades de diferencia entre el embarazo exitoso y el no exitoso] (p = 0.000, ANOVA de medidas repetidas unidireccionales) (Tabla 5, Figura 6).

Tabla 5. Diferencias en las características y comparación de los cambios en los parámetros vaginales entre las mujeres que pudieron completar un embarazo a término (n = 15) y aquellas que no lo hicieron (n = 6) después de la intervención con L salivarius CECT 5713 en el grupo RA, que incluía a mujeres que tenían antecedentes de aborto espontáneo recurrente (n = 21). # Se utilizaron pruebas ANOVA unidireccionales para evaluar las diferencias en las medias entre grupos, excepto para la presencia de lactobacilos.*Prueba de probabilidad exacta de Fisher para una tabla de contingencia 2 x 2. † Se utilizaron pruebas ANOVA unidireccionales para determinar si hubo cambios en cada grupo de participantes.

Los cambios en las concentraciones de citoquinas vaginales también fueron distintos en ambos grupos después del tratamiento con probióticos. No hubo modificaciones en las concentraciones vaginales de ΤGFβ1, ΤGFβ2 y VEGF en las mujeres que no quedaron embarazadas, pero hubo un aumento significativo (DE) medio de 1.40 (0.62) pg / mL, 1.25 (0.34) pg / mL y 402 (252) pg / mL], respectivamente, en aquellas que lo hicieron (Tabla 5, Figura 7). Además, debe tenerse en cuenta que ya había diferencias en la concentración de estas citocinas, incluso antes de comenzar el tratamiento, entre las que quedaron embarazadas y las que no quedaron embarazadas (Tabla 5, Figura 7).

Por otro lado, el tratamiento con probióticos resultó en un aumento medio (DE) en los recuentos de lactobacilos de 3.52 (2.99) Iog10 ufc / mi en mujeres que finalmente quedaron embarazadas, pero no en aquellas que no lo hicieron (Tabla 5, Figura 6). La presencia de L. salivarius [media (DE) = 6,85 (0,61) copias / hisopo] fue confirmada por qPCR en todas las mujeres que quedaron embarazadas, pero solo en el 50% de las mujeres con embarazos no exitosos y, luego, a una concentración más baja [media (DE) = 2,63 (1,17) copias / hisopo] (Tabla 5). El perfil de lactobacilos en las muestras de CVL obtenidas al comienzo del tratamiento con probióticos y después de 6 meses o hasta que se presenta un diagnóstico de embarazo en la Figura 8. Las diferencias más notables fueron con respecto a la presencia de L. salivarius viable en la mayoría de las mujeres (17). / 21) después del tratamiento probiótico. Además, L. iners, que estaba presente en 3 mujeres al comienzo del estudio, se aisló al final del tratamiento solo de 2 mujeres que, en particular, no terminaron en el embarazo.

No hubo diferencias en el perfil metataxonómico a nivel de género de muestras de CVL de mujeres del grupo RA con respecto al resultado del embarazo (Tabla 6). Tabla 6. Frecuencias relativas, medianas y rango intercuartil (IQR) de los filos (sombreados en gris) y los géneros bacterianos más abundantes detectados en muestras vaginales de las mujeres del grupo RA (mujeres con antecedentes de aborto involuntario recurrente) que tuvieron o no tuvieron un embarazo tras el tratamiento probiótico. ^a n (%): Número de muestras en las que se detectó el filo/género (frecuencia relativa de detección). ^b Pruebas de rango de Kruskal-Wallis con corrección de Bonferroni. Parámetros secundarios de respuesta asociados con el tratamiento probiótico: cambios en parámetros vaginales en mujeres del grupo INF

Las mujeres en el grupo INF que quedaron embarazadas después del tratamiento con probióticos y las que no lo hicieron no diferían en edad, peso y altura (resultados no mostrados).

El pH CVL y el puntaje Nugent disminuyeron significativamente en todas las mujeres del grupo INF después del tratamiento con probióticos (p <0.05; ANOVA de medidas repetidas unidireccionales; Figura 9), aunque la magnitud del cambio fue menor en las mujeres que no se quedaron embarazadas en comparación con las que quedaron embarazadas (Tabla 7, Figura 10). Específicamente, las reducciones medias (DE) en el pH CVL y el puntaje Nugent en las mujeres que quedaron embarazadas fueron 1.32 (0.31) y 3.90 (0.74), respectivamente, y en las mujeres que no quedaron embarazadas, estas reducciones fueron solo 0.19 (0.18) y 0.54 (0,78), respectivamente. (Tabla 7, Figura 9).

Tabla 7. Diferencias en las características y comparación de los cambios en los parámetros vaginales entre las mujeres que pudieron completar un embarazo a término (n = 10) y aquellas que no lo hicieron (n = 13) después de la intervención con L. salivarius CECT 5713 en el grupo INF, que incluía a mujeres con una historia de infertilidad de origen desconocido (n= 23).

#Se utilizaron pruebas ANOVA unidireccionales para evaluar las diferencias en las medias entre grupos.*Prueba de probabilidad exacta de Fisher para una tabla de contingenda 2 x 2. **ANOVA unidireccional; Kruskal-Wallis, p=0,007.

El cambio en las concentraciones de citoquinas vaginales después del tratamiento con probióticos fue similar al descrito en el grupo RA: no hubo modificación en las concentraciones vaginales de ΤGFβ1, ΤGFβ2 y VEGF en las mujeres que no quedaron embarazadas, pero hubo una media (DE) aumento significativo de 2.29 (0.34) pg / mL, 1.25 (0.24) pg / mL y 462 (252) pg / mL], respectivamente, en los que sí lo hicieron (Tabla 7, Figura 9). En este grupo de mujeres, ya había diferencias en la concentración de ΤGFβ2 y VEGF, pero no en la de ΤGFβ1, incluso antes de comenzar el tratamiento entre las que quedaron y las que no quedaron embarazadas (Tabla 7, Figura 9).

El tratamiento con probióticos resultó en un mayor número de muestras de CVL donde se detectaron lactobacilos (en todas las mujeres que finalmente quedaron embarazadas) y un recuento bacteriano medio (DE) más alto [(6,46 (0,51) Iog10 ufc / mi] que en aquellas mujeres que lo hicieron no (los lactobacilos se detectaron solo en el 46% y los recuentos bacterianos medios (DE) fueron 4,95 (1,66) Iog10 ufc / mi) (Tabla 7, Figuras 9 y 10). Del mismo modo, la presencia de L. salivarius [media (DE) = 6.85 (0.61) coplas / hisopo] fue confirmado por qPCR en todas las mujeres que quedaron embarazadas, pero solo en el 25% de las mujeres con embarazos no exitosos y, luego, a una concentración más baja [media (DE) = 3.55 (0.39) coplas / hisopo] (Tabla 7). El perfil de lactobacilos en muestras de CVL obtenidas al comienzo del tratamiento con problóticos y después de 6 meses o hasta que se presenta un diagnóstico de embarazo en la Figura 11 , que muestra que se detectaron L. salivarius viables en todas las mujeres quienes se quedaron embarazadas, pero solo en 4 de 13 de las mujeres que no lograron quedar embarazadas después del tratamiento problótico.

No hubo diferencias en el perfil metataxonómico a nivel de género de muestras de CVL de mujeres del grupo RA con respecto al resultado del embarazo (resultados no mostrados). Comparación de parámetros vaginales entre todas las mujeres que se quedaron embarazadas v las que de ambos grupos RA e INF

El valor medio del pH en las muestras de CVL fue un poco más ácido en las mujeres que quedaron embarazadas [5,69 (0,48) unidades] que en las que no lo hicieron [5,99 (0,33) unidades] (p = 0,024; ANOVA unidireccional) (Tabla 7). También hubo diferencias en la concentración de citoquinas vaginales al comienzo del estudio de acuerdo con el resultado final del embarazo, pero las diferencias fueron similares a las descritas ya por separado para los grupos RA e INF (Tabla 8; Figuras 12 y 13). Los únicos parámetros que no diferían inicialmente entre ambos grupos fueron el puntaje de Nugent y la frecuencia de detección y recuento de lactobacilos (Tabla 8). A nivel global, se detectó Lactobacillus en todas las mujeres que quedaron embarazadas, pero solo en la mitad de las que no lo hideron (p <0,001; prueba de Chi-cuadrado). Además, hubo un aumento de 1.6 unidades logarítmicas en los recuentos de Lactobacillus después del tratamiento con probióticos en el grupo de mujeres que quedaron embarazadas, pero no hubo cambios en las que no lo hideron (Figura 14). Las diferencias también fueron significativas con respecto a la detección de L salivarius en muestras de CVL. Esta especie también se detectó, y a una alta concentración [media (DE) = 6,70 (0,56) copias / hisopo], en todas las mujeres que tuvieron un embarazo exitoso en contraste con las mujeres que no quedaron embarazadas (Figura 14).

Tabla 8. Diferencias en las características y comparación de los cambios en los parámetros vaginales entre las mujeres que pudieron completar un embarazo a término (n = 25) y aquellas que no lo hicieron (n = 19) después de la intervención con L. salivarius CECT 5713, incluyendo a todas las mujeres de los grupos RA e INF (n=44).

# Se utilizaron pruebas ANOVA unidireccionales para evaluar las diferencias en las medias entre grupos. *Prueba de Chi-cuadrado (Pearson) para una tabla de contingencia 2 x 2.

** Prueba de probabilidad exacta de Fisher para una tabla de contingencia 2 x 2.

** Diferencias en las medias de las muestras positivas.

Comparación de los parámetros vaginales entre las mujeres control, todas las mujeres que quedaron embarazadas v las que no lo hicieron de los grupos RA e INF

El análisis de los parámetros vaginales (pH, puntaje Nugent, ΤGFβ1, ΤGFβ2, VEGF, recuento de lactobacilos) reveló diferencias estadísticamente significativas para todos ellos entre los tres grupos (grupo de control, mujeres de los grupos RA e INF que experimentaron un embarazo a término completo, y mujeres de los grupos RA e INF que no quedaron embarazadas o tuvieron un aborto) (Tabla 9; Fig. 15).

Tabla 9. Comparación de los parámetros vaginales (pH, puntuación de Nugent, citoquinas y recuento de lactobacilos) entre las participantes del grupo control (n=14) y las participantes de los grupos RA e INF (conjuntamente) que tuvieron un embarazo (n = 25) o no (n = 19) después del tratamiento probiótico. SD: desviación estándar; Cl: intervalo de confianza, ΤGFβ1, factor de crecimiento transformante β1; ΤGFβ2, factor de crecimiento transformante β2; VEGF, factor de crecimiento endotelial vascular.

# Se utilizaron pruebas ANOVA unidireccionales para evaluar las diferencias en las medias entre grupos. Las diferentes letras en negrita en la misma fila indican diferencias estadísticamente significativas entre los grupos.

‘Extensión de Freeman-Halton de las pruebas de probabilidad exacta de Fisher para una tabla de contingencia 2 x 3.

“Media en aquellas mujeres en las que se pudieron aislar lactobacilos a partir de sus muestras.

Actividad antimicrobiana de L salivarius CECT5713 contra patógenos vacinales v cervicales

L salivarius CECT 5713 mostró actividad antimicrobiana inhibitoria (zona de 2 mm alrededor de la línea) contra todos los organismos indicadores utilizados en este estudio, tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas. Para dilucidar el (los) compuesto (s) responsable (s) de la actividad antimicrobiana, esta cepa no bacteriogénica se seleccionó para la producción de peróxido de hidrógeno, lactato y / o acetato. Un ensayo cuantitativo mostró que la cantidad media (± DE) de peróxido de hidrógeno producida por esta cepa fue de 0.729 μg / mi (± 0.122) en condiciones aeróbicas. No se encontró producción de este compuesto cuando los ensayos se realizaron en condiciones anaeróbicas. Las concentraciones medias (± DE) de ácido L-láctico en los sobrenadantes obtenidos de cultivos MRS (pH inicial = 6.2) de la cepa fueron 11.07 ± 0.42 mg / mi y 11.69 ± 0.58 mg / mi en condiciones aeróbicas y anaeróbicas, respectivamente, mientras que los valores medios de pH en los sobrenadantes fueron 3,91 y 3,86 en condiciones aeróbicas y anaeróbicas, respectivamente. D-Lactato no se detectó en los sobrenadantes de cultivo. Las concentraciones medias (± DE) de ácido acético en los mismos sobrenadantes fueron 0,70 mg / mi (± 0,11) y 0,46 mg / mi (± 0,14) en condiciones aeróbicas y anaeróbicas, respectivamente.

Tabla 10. Actividad antimicrobiana y congregación de L salivarius CECT 5713 frente a diversos patógenos cérvico-vaginales. aCoagregación se define como grupos visibles de bacterias y se clasifican como (++): grupos grandes y densos; (+): grupos pequeños y escasos; (-): no existen grupos visibles, siguiendo el criterio de Younes et al., (2012). Referencia completa: Younes, J. A., van der Mei, H. C., van den Heuvel, E., Busscher, H. J., and Reid. G. (2012). Adhesión forces and coaggregation between vaginal staphylococci and lactobacilli. PLoS One, 7, e36917. doi: 10.1371/¡oumal.pone.0036917 Co-agregación de L salivarius CECT5713 con patógenos vaginales v adhesión a células vacinales

La cepa pudo formar coagregados grandes y bien definidos con todos los patógenos vaginales y cervicales seleccionados. La agregación conjunta fue particularmente intensa con las cepas de G. vaginalis, S. agalactiae y C. albicans. En este estudio, la cepa probada fue fuertemente adhesiva a las células epiteliales vaginales, una media de 329 ± 46 lactobacilos adherentes en 20 campos microscópicos aleatorios. El valor medio (± DE) para L salivarius CECT 9145, una cepa de control con una alta adherencia a las células vaginales, fue 336 ± 52 lactobacilos adherentes.

Actividad α-amilasa de L. salivarius CECT5713

La producción de amilasa extracelular por L salivarius CECT 5713 se observó por la zona de aclaramiento alrededor de las colonias (~ 2.0 mm) cuando se trató con solución de yodo. Más tarde, cuando se midió la actividad de la α-amilasa, esta cepa mostró un alto nivel de actividad de la α-amilasa (0,83 U / ml) a las 16 h (concentración de L. salivarius CECT 5713: ~ 8,6 Iog10 ufc / ml), y pudo detectarse en sobrenadantes a un nivel similar durante las 48 h (cuando se terminó el ensayo).