[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von "Dense Bodies" (DB) sowie eine DB-enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung.

[0002] Bei dem humanen Cytomegalievirus (HCMV), das auch als humanes Herpesvirus 5 bezeichnet wird, handelt es sich um ein behülltes, doppelsträngiges DNA- Virus, das zu den Herpesviren gehört. HCMV ist für gesunde Erwachsene in der Regel harmlos. In der Schwangerschaft stellt sich das Virus jedoch als besonders gefährlich dar und kann für ungeborene Kinder sogar lebensgefährlich sein. Auch für Menschen mit einem geschwächten Immunsystem kann sich aus einer Infektion mit HCMV eine schwerwiegende Erkrankung entwickeln. Besonders gefährdet sind deshalb Aids- Patienten, Transplantatempfänger, Leukämiepatienten nach Stammzelltransplantationen, Patienten, die mit Zytostatika behandelt werden etc.

[0003] Bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem kommen bei einer HCMV-Infektion Virostatika zum Einsatz, wie bspw. Ganciclovir, Foscarnet, Cidofovir und ggf. auch Aciclovir.

[0004] Ferner wird bereits seit vielen Jahren an der Entwicklung eines Impfstoffes bzw. Vakzins gegen HCMV gearbeitet. So wurde bspw. versucht, mit abgeschwächten bzw. attenuierten Lebendimpfstoffen, die gewünschte Immunität zu induzieren. Damit konnte allerdings lediglich ein eingeschränkter Schutz erzielt werden.

[0005] Ein weiterer Ansatz besteht darin, eine Vakzinierung mittels sog. "Dense Bodies" (DB) vorzunehmen. Hierbei handelt es sich um im Elektronenmikroskop sichtbare Strukturen, die sich von HCMV ableiten. DB sind umhüllte subvirale Partikel in deren Hülle, die sich aus einer zellulären Lipidmembran ableitet, virale Glycoproteine eingelagert sind. Diese viralen Proteine liegen in der viralen Lipidmembran mit hoher Wahrscheinlichkeit in natürlicher Konformation vor. DB werden, vergleichbar mit Viruspartikeln, im Zytoplasma der infizierten Zelle gebildet und anschließend aus der Zelle ausgeschleust. DB bestehen zu 90 % ihrer Proteinmasse aus dem viral codierten sog. pp65-Protein (UL83). Ferner konnten in den DB u.a. die viralen Proteine pp150 (UL32), gH (UL75), gM (UL100) und gB (UL55) nachgewiesen werden. Da DB keine virale DNA und kein virales Kapsid enthalten, sind sie nicht infektiös.

[0006] Im Stand der Technik ist beschrieben, dass DB aufgrund ihrer antigenen Eigenschaften, die denen von HCMV hochgradig ähnlich sind, geeignet sind, als Impfstoff gegen bzw. bei einer HCMV-Infektion zu fungieren. Ein solcher Impfstoff hat sich als besonders wirksam erwiesen. Da DB nicht infektiös sind, sind auch das Risikoprofil und die Nebenwirkungen deutlich weniger kritisch zu bewerten als bei einem Lebendimpfstoff. So befindet sich der DB-enthaltende Impfstoff mit der Bezeichnung "VPM2001 " bereits in klinischer Erprobung. Das Prinzip und die Vorteile einer Vakzinierung mit DB werden bspw. in der WO 00/5372 beschrieben.

[0007] Da DB im normalen Infektionszyklus von HCMV i) nur in geringem Maße gebildet werden und deshalb nur in begrenztem Maße zur Verfügung stehen und ii) DB- Präparationen u.U. mit infektiösem HCMV verunreinigt sein können, gibt es das Bedürfnis nach einem Verfahren, mit dem sich die Bildung von DB gezielt steigern lässt und eine Verunreinigung mit infektiösem HCMV verhindert wird.

[0008] Reefschlaeger et al. (2001), Journal of Antimicrobial Chemotherapy 48, 757-767 und Buerger et al. (2001), Journal of Virology 75, 9077-9086, beschreiben eine Substanz mit der Bezeichnung BAY 38-4766, die die Menge an gebildeten DB erhöhen soll.

[0009] Hwang et al. (2007), Journal of Virology 81 , 11604-1161 1 und Hwang et al. (2009), Antimicrobial Agents and Chemotherapy 53, 5095-5101 beschreiben Benzimi- dazol-D-Ribonucleoside, die ebenfalls zur Erhöhung der gebildeten Menge von DB geeignet sein könnten.

[0010] Die bisher beschriebenen zur Optimierung der DB-Bildung vermeintlich geeigneten Substanzen haben sich jedoch in der Praxis nicht bewährt. [0011] Vor diesem Hintergrund ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, weitere Substanzen bereitzustellen, welche als Zusatz bei der Produktion von DBs i) verhindern, dass DB-Präparationen mit infektiösem HCMV verunreinigt sind ii) die Ausbeute an DBs im Rahmen ihrer Produktion erhöhen.

[0012] Diese Aufgabe wird durch die Verwendung einer Substanz gelöst, die ausgewählt ist aus folgenden Substanzen:

(D).

[0013] Eine weitere der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe ist es, ein neues Verfahren zur Herstellung von DB bereitzustellen.

[0014] Diese weitere Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das folgende Schritte aufweist (1) Bereitstellen von mit dem humanen Cytomegalovirus (HCMV) infizierten biologischen Zellen in einem geeigneten Medium, und (2) Inkubieren der infizierten biologischen Zellen mit einer Substanz, wobei die Substanz ausgewählt ist aus den vorstehend genannten Substanzen (A) bis (D).

[0015] Die Erfinder haben erkannt, dass sich die vorstehend identifizierten Substanzen außerordentlich gut dazu eignen, um DB herzustellen. Sie konnten insbesondere beobachten, dass mit HCMV-infizierte biologische Zellen, wie bspw. primäre Fibroblasten, in Gegenwart dieser Verbindungen hohe Konzentrationen von DB im Zytoplasma anreichern und in das Medium freisetzen. Dabei hat sich als besonderer Vorteil herausgestellt, dass die Substanzen (A) bis (D) den Zusammenbau intakter Viruspartikel im Zellkern verhindern und somit bewirken, dass kein infektiöses HCMV aus den infizierten Zellen ausgeschleust wird. Aus dem Medium oder dem Lysat der infizierten Zellen lassen sich deshalb die DB leicht isolieren, ohne dass eine Verunreinigung mit infektiösen Viruspartikeln zu befürchten ist.

[0016] Erfindungsgemäß sind für den Einsatz in dem Verfahren solche biologischen Zellen geeignet, die permissiv für HCMV sind.

[0017] Erfindungsgemäß wird unter einem "geeigneten Medium" ein übliches Zellkulturmedium verstanden Dabei richtet sich das vorzugsweise zu verwendende Medium nach dem jeweils eingesetzten Zelltyp. Geeignete Medien sind z.B. Eagle ^' s minimal essential medium (EMEM) + 10% fötales Kälberserum (FCS) + 2mM L-Glutamin + 1 % Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep; Penicillin G sodium 1000C^g/ml; 0,85% Strep- tomycin sulfate), EMEM + 10% FCS + 2mM L-Glutamin + 1 mM Natrium Pyruvate (NaP) + 1 % nicht essentielle Aminosäuren + 1 % Pen/Strep oder RPMI 1640 mit 100μg/ml Gentamycin; 5U/ml Heparin; 50μg/ml Endothelzell-Wachstumsfaktor; 15% Humanserum (seronegativ für HCMV) und 12^g/ml Cibrobay etc.

[0018] Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die biologischen Zellen Primärzellen sind, die vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: humane Endothelzellen, humane Fibroblasten, humane dendritische Zellen, humane Epithelzellen und humane Makrophagen.

[0019] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass solche Zellen Verwendung finden, die permissiv für HCMV und damit zur Herstellung von DB besonders geeignet sind.

[0020] Ferner ist es bevorzugt, wenn die Inkubation der biologischen Zellen mit der Substanz bei einer Konzentration von ca. 1 nmol/l bis ca. 100 μηιοΙ/Ι Medium erfolgt.

[0021] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein solcher Konzentrationsbereich gewählt wird, der nach Erkenntnissen der Erfinder zu besonders guten Ergebnissen führt. Die exakten Konzentrationen hängen von den verwendeten biologischen Zellen und dem zur Infektion verwendeten HCMV-Stamm ab. Sie lassen sich von einem Fachmann durch einfache Titrationsreihen ohne Schwierigkeiten im Einzelfall ermitteln. So konnten die Erfinder mit der Substanz (A) und humanen Vorhautfibroblasten (HFF), die mit dem HCMV-Stamm AD169 infiziert wurden, bei einer Konzentration von 50 nmol/l optimale Ergebnisse erzielen. Im gleichen Ansatz führten für die Subtanzen (B), (C), und (D) Konzentrationen von 5 nmol/l, 500 nmol/l bzw. 500 nmol/l zu optimalen Ergebnissen. Bei einer Inkubation mit humanen Endothelzellen aus der Nabelvene (HUVEC), die mit dem HCMV-Stamm TB40/E infiziert wurden, führten für die Subtanzen (A), (B), (C), und (D) Konzentrationen von 300 nmol/l, 300 nmol/l, 3 μηιοΙ/Ι bzw. 30 μηιοΙ/Ι zu optimalen Ergebnissen. Bei Verwendung von HFF, die mit einem klinischen Isolat von HCMV infiziert wurden, in Co-Kultur mit nicht-infizierten HFF, führten ebenfalls Konzentrationen von 300 nmol/l, 300 nmol/l, 3 μηιοΙ/Ι bzw. 30 μηιοΙ/Ι zu guten Ergebnissen.

[0022] Weiter ist es bevorzugt, wenn die Inkubation über eine Dauer von 1 Tag bis 14 Tagen, vorzugsweise von 3 bis 10 Tagen, höchst vorzugsweise von 5 Tagen erfolgt.

[0023] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass bei einer Inkubation innerhalb der angegebenen Zeiträume ausreichend hohe Mengen von DB erhalten werden.

[0024] Erfindungsgemäß ist es ferner bevorzugt, wenn nach der Inkubation der biologischen Zellen mit der Substanz eine Isolierung der DB erfolgt.

[0025] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die DB in einer Form bereitgestellt werden können, die eine direkte Weiterverarbeitung ermöglichen, wie bspw. die Formulierung zu einem Vakzin. Die Isolierung der DB erfolgt nach dem Fachmann bekannten Verfahren. Bspw. wird das zellfreie Medium zentrifugiert und dabei werden die DB sedimentiert. Diese lassen sich dann einfach vom Überstand abtrennen.

[0026] Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, vorzugsweise eines Vakzins, das folgende Schritte aufweist: (1) Herstellen von "Dense Bodies" (DB), (2) Bereitstellen der in Schritt (1) hergestellten DB, und (3) Formulieren der in Schritt (2) bereitgestellten DB in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, wobei das Herstellen in Schritt (1) nach dem zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt.

[0027] Pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Stand der Technik allgemein bekannt, sie umfassen bspw. Bindemittel, Sprengmittel, Füllmittel, Gleitmittel sowie Puffer, Salze und sonstige zur Formulierung von Arzneimitteln geeignete Substanzen; vgl. Rowe E. et at. (2006), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5th Edition, Pharmaceutical Press; oder Bauer et al. (1999), Lehrbuch der pharmazeutischen Technology, 6. Auflage, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart mbH. Der Inhalt der vorliegenden Publikationen ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.

[0028] Bei der Herstellung eines Vakzin können ferner Adjuvantien vorgesehen werden, die die Verstärkung der Immunantwort bewirken. Dabei kann es sich um Öl- Wasser-Gemische, Lipopolysaccharide, Aluminiumhydroxid, etc. handeln. Adjuvantien sind im Stand der Technik umfassend beschrieben.

[0029] Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, vorzugsweise ein Vakzin, die bzw. das. nach dem zuvor beschriebenen Verfahren hergestellt ist.

[0030] Die in Bezug auf die erfindungsgemäße Verwendung und das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von DB beschriebenen Merkmale, Eigenschaften und Vorteile, gelten gleichermaßen für das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung und für die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung.

[0031] Im Anschluss werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beschrieben, die rein illustrativ sind und die Reichweite der Erfindung nicht einschränken. Dabei wird Bezug genommen auf die beiliegende Figur, in der Folgendes dargestellt ist:

Fig. 1 zeigt elektronenmikroskopische Aufnahmen von mit den Substanzen (A), (B),

(C) und (D) inkubierten und zuvor mit HCMV-infizierten Zellen, die im Vergleich zu unbehandelten Zellen (E) in ihrem Zytoplasma große Mengen von DB (Pfeile) anreichern.

Ausführungsbeispiele

1. Erfindungsgemäße Substanzen (A) bis (D) Die Synthese der Substanz (A) (4S)-{8-Fluor-2-[4-(3-methoxyphenyl)-1 - piperazinyl]-3-[2-methoxy-5-(trifluormethyl)-phenyl]-3,4-dih ydro-4- chinazolinyl}essigsäure ist ausführlich in der WO 2004/096778, Ausführungsbeispiele 14 und 15 auf den S. 72 und 73 beschrieben.

Die Synthese der Substanz (B) N-{1 -Methyl-2-[(4-(5-methyl-pyridin-2-yl)-piperazin- 1-yl)carbonyl]-1 /-/-imidazol-4-yl}-N'-[4-(trifuormethoxy)phenyl]harnstoff ist ausführlich in der WO 2006/089664, Ausführungsbeispiel 2 auf den Seiten 39 und 40 beschrieben.

Die Synthese der Substanz (C) 1-[6-Fluor-8-methoxy-3-({[2-methyl-4- (trifluormethoxy)benzyl]amino}carbonyl)-4-oxo-1 -(2,2,2-trifluorethyl)-1 ,4- dihydrochinolin-7-yl]piperidin-4-carbonsäure ist ausführlich in der WO

2007/090579, Ausführungsbeispiel 47 auf den Seiten 96und 97 beschrieben.

Die Synthese der Substanz (D) N-{3-[({4-[5-(6-Aminopyridin-2yl)-1 ,2,4-oxadiazol-3- yl]phenyl}sulfonyl)amino]-5-fluorphenyl}-1 -cyanocyclopropancarboxamid ist ausführlich in der WO 2007/101573, Ausführungsbeispiel 1 , Seite 49 beschrieben.

Der Inhalt der vorstehenden Dokumente WO 2004/096778, WO 2006/089664, WO 2007/090579 und WO 2007/101573, insbesondere betreffend die identifizierten Synthesebeschreibungen, ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Offenbarung. Herstellung der "Dense Bodies" (DB) Herstellung in mit dem HCMV-Stamm AD169 infizierten Fibroblasten

Humane Vorhautfibroblasten ("human foreskin fibroblasts, HFF") wurden am Tag vor der Infektion in einer Menge von 1 x 10 ⁶ Zellen pro Flasche in 5 T75- Zellkulturflaschen gegeben. Der HCMV-Stamm AD169 wurde als gefrorene zellfreie Viruspräparation bereitgestellt, die aus Zellen gewonnen wurde, welche in ei- nem späten Infektionsstadium vorlagen. Die erfindungsgemäßen Substanzen (A), (B), (C) und (D) wurden als Stammlösungen von je 50 mmol/1 in DMSO bereitgestellt.

Die Stammlösungen wurden 1 : 1000 auf eine Endkonzentration von 50 μηιοΙ/Ι verdünnt. Die Lösungen wurden wie folgt weiter verdünnt: A: 1 : 1000 (50 nmol/l) 12 μιτιΙ in 12 ml MEM; B: 1 : 10.000 (5 nmol/l) 1 ,2 μπιΙ in 12 ml MEM; C: 1 :100

(500 nmol/l) 120 μπιΙ in 12 ml MEM; D: 1.100 (500 nmol/l) 120 μπιΙ in 12 ml MEM.

Die HFF-Zellen wurden mit der Viruspräparation bei einer m.o.i. ("multiplicity of in- fection"; Multiplizität der Infektion) von ^ ^ 1 TCID 50/Zelle (1 :20 Verdünnung) für eine Stunde inkubiert. Anschließend wurde der Virusüberstand entfernt und es erfolgte eine Inkubation der infizierten Zellen mit den erfindungsgemäßen Substanzen bei folgenden Konzentrationen: A: 50 nmol/l; B: 5 nmol/l; C: 500 nmol/l; D: 500 nmol/l.

Die Zellen wurden für 5 Tage inkubiert, wobei eine Erneuerung des substanzenthaltenden Mediums nach dem ersten und vierten Tag vorgenommen wurde. Nach der Inkubation wurden die infizierten Zellen elektronenmikroskopisch auf die Formierung von DB untersucht.

Das Ergebnis ist in der beigefügten Fig. 1 dargestellt. Hierbei zeigt sich, dass sämtliche mit den erfindungsgemäßen Substanzen (A), (B), (C) und (D) behandelten Zellen hohe Konzentrationen von DB (Pfeile) anreicherten, wohingegen die unbehandelten Zellen (E) in ihrem Zytoplasma kaum DB anreicherten. Die DB sind mit Pfeilspitzen gekennzeichnet. Darüber hinaus war im Zytoplasma der behandelten Zellen kein einziges infektiöses Viruspartikel zu finden, während entsprechende Partikel in rel. großer Anzahl im Zytoplasma unbehandelter Zellen nachzuweisen waren. Herstellung in mit dem HCMV-Stamm TB40/E infizierten Endothelzellen In einem weiteren Experiment wurden humane Endothelzellen aus der Nabelvene (HUVEC) mit dem HCMV-Stamm TB40/E infiziert, der aus Zellen in einem späten Infektionsstadium isoliert wurde. Das experimentelle Design entspricht dem unter 2.1 dargestellten, wobei die Inkubation der Zellen bei folgenden Konzentrationen der erfindungsgemäßen Substanzen erfolgte: A: 300 nmol/l; B: 300 nmol/l; C: 3 μιηοΙ/Ι; D: 30.000 μηιοΙ/Ι.

In der elektronenmikroskopischen Untersuchung zeigte sich ebenfalls eine starke Anreicherung von DB im Zytoplasma der infizierten Zellen, die mit den erfindungsgemäßen Substanzen (A), (B), (C) und (D) inkubiert wurden. Im Kontrollansatz (E) konnten nur wenige DB identifiziert werden. In Analogie zu den in 2.1. beschriebenen Beobachtungen konnten ebenfalls keine Virionen im Zytoplasma der behandelten nachgewiesen werden.

Herstellung in mit einem klinischen HCMV-Isolat infizierten Fibroblasten in Co- Kultur mit nicht-infizierten Fibroblasten

HFF wurden mit einem klinischen HCMV-Isolat, das aus Zellen in einem späten Infektionsstadium isoliert wurde, infiziert, wie weiter oben unter 2.1 beschrieben. Die infizierten HFF wurden mit nicht-infizierten HFF in Minitrays (3.000 Zellen/Vertiefung) co-kultiviert. Es wurden drei verschiedene Verhältnisse von infizier- ten/nicht-infizierten Zellen hergestellt: unverdünnt; 1 :2 verdünnt; 1 :4 verdünnt. Die erfindungsgemäßen Substanzen wurden mit den Zellen bei folgenden Konzentrationen inkubiert. A: 300 nmol/l; B: 300 nmol/l; C: 3 μηιοΙ/Ι; D: 30 μηιοΙ/Ι.

Nach 5-tägiger Inkubation bei 37 °C erfolgte die elektronenmikroskopische Untersuchung. Dabei zeigte sich, dass in den Ansätzen, in denen die höchsten Anteile von infizierten Zellen vorlagen, d.h. den "unverdünnten" Ansätze, die Zellen nach Inkubation mit den erfindungsgemäßen Substanzen sehr große Mengen von DBs in ihrem Zytoplasma akkumulierten. Je stärker die Verdünnung mit nicht-infizierten Zellen war, desto weniger DB akkumulierten in den Cytoplasmen. Im Kontrollansatz ohne erfindungsgemäße Substanz konnten nur sehr wenige DBs identifiziert werden. Darüber hinaus wurde durch die Zugabe der erfindungsgemäßen Substanzen wiederum das Ausschleusen von Infektiösen Partikeln aus dem Zellkern verhindert.

Isolierung der Dense Bodies

Die Isolierung ist im Stand der Technik ausführlich beschrieben, bspw. in Pepperl et al. (2000), Journal of Virology 74, 6132-6146, und in Irmiere, A. und W. Gibson (1993), Virology 130, 118-133. Die Inhalte der vorstehend genannten Publikationen sind durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.

Demnach werden die Partikel wie folgt aus dem Kulturmedium der infizierten Zellen gereinigt: Die infizierten Zellen werden 6 Tage nach der Infektion vom Boden des Zellkulturgefäßes abgeschabt und in dem Medium resuspendiert. Die Suspension wird bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert, bspw. bei 1.500 g für 4°, 10 min. Das erhaltene zellfreie Medium wird auf einem Kaliumtartrat-Glycerol- Gradienten, hergestellt in 0,05 ml Tris HCl, pH 7,4, 0, 1 M NaCI (TN-Puffer; Talbot und Almeda, 1977) gegeben und bei 40.000 rpm für 4°, 15 min unter Verwendung eines Beckman-Rotors SW41 und einer Sorvall-Ultrazentrifuge OTD-50 bei niedriger Beschleunigung und im "Raking"-Modus zentrifugiert. Die DB-enthaltende Bande wurde im Gradienten durch ihre charakteristische lichtstreuende Eigenschaft identifiziert. Die Bande wurde durch Aspiration unter Verwendung einer 32- Gauge-Nadel durch die Wand des Zentrifugenröhrchens abgezogen. Gegebenenfalls können die DBs durch erneute entsprechende Sedimentationen oder längere Zentrifugationsvorgänge bis zu einem Äquilibrium, d.h. für 18 Stunden, unter Verwendung des gleichen Gradienten/und Zentrifugationsbedingungen weiter aufgereinigt werden.

Fazit

Die Erfinder konnten zeigen, dass mit den Substanzen (A), (B), (C) und (D) außerordentlich effizient große Mengen von Dense Bodies hergestellt werden können, die bspw. nach erfolgter Isolierung und Aufreinigung als Vakzin eingesetzt werden können. Besonders vorteilhaft ist, dass mittels der oben genannten Substanzen DB in hoher Reinheit isoliert werden können.