OBTENTION DE MOLLUSQUES BIVALVES TETRAPLOïDES A PARTIR DU CROISEMENT DE FEMELLES DIPLOïDES ET DE MALES TETRAPLOïDES.

La présente invention est relative à la production de mollusques bivalves tétraploïdes viables, et notamment d'huîtres.

La production de bivalves polyploïdes ^' fait actuellement l'objet d'un grand intérêt, en particulier en ce qui concerne les huîtres.

En effet, les huîtres triploides, également dénommées « huîtres des 4 saisons » présentent plusieurs avantages. Du fait de leur nombre impair de chromosomes, elles sont normalement stériles, ce qui leur permet d'une part d'avoir une croissance plus rapide (leur énergie étant utilisée pour la croissance plutôt que pour la reproduction) , et d' autre part de ne pas produire de laitance pendant les mois d'été, ce qui leur assure une qualité constante toute 1' année .

Il est possible de produire des huîtres triploides à partir du croisement de géniteurs diploides, suivi de la rétention du premier ou du second globule polaire par traitement chimique, principalement par la cytochalasine B

(CB) , ou par traitement physique (notamment choc thermique ou hyperbare) . Cependant, la méthode actuellement privilégiée pour la production d'huîtres triploides consiste à croiser des huîtres tétraploides avec des huîtres diploides.

Les géniteurs tétraploïdes utilisés pour la production d'huîtres triploïdes sont eux mêmes obtenus en croisant des femelles triploïdes avec des mâles diploïdes, et en bloquant la première phase de la méiose (MI) en induisant la rétention du premier globule polaire (GUO & ALLEN, Mol Mar Biol Biotechnol 3, 42-50, 1994) .

L'utilisation d'ovocytes de femelles triploïdes est basée sur l'hypothèse généralement admise du « rapport nucléo-cytoplasmique » qui a été formulée pour expliquer les échecs observés précédemment lors des tentatives d'obtention de tétraploïdes à partir de géniteurs diploïdes. Selon cette hypothèse, les ovocytes produits par les géniteurs diploïdes femelles possèdent une taille trop faible pour supporter un

noyau dont le matériel génétique se trouve doublé suite à la tétraploldisation. Les quelques rares femelles triploïdes qui ne sont pas stériles produisent des ovocytes dont la taille est bien supérieure à celle des ovocytes produits par les femelles diploïdes, ce qui leur permet de supporter un noyau tétraploïde .

Ces géniteurs tétraploïdes de première génération actuellement disponibles ont donc été produits à partir d'un faible nombre de femelles triploïdes. Cette population de géniteurs tétraploïdes de première génération possède donc une base génétique plutôt étroite d'autant plus que, depuis leur première obtention, ces géniteurs ont été toujours multipliés et maintenus par croisements entre eux. Il devient donc de plus en plus urgent d'élargir la base génétique de ces géniteurs. Dans cette optique, deux approches sont possibles :

1) Produire d'autres géniteurs tétraploïdes à partir d'un nouveau stock de femelles triploïdes (apport de sang neuf de première génération) ,

2) Utiliser une méthode qui permette l'apport d'un nouveau fond génétique à partir de stocks diploïdes sauvages, ou mieux, résultant d'une sélection.

La deuxième approche, qui a été utilisée avec succès chez la truite arc en ciel (CHOURROUT et al., Theor Appl Genêt, 72, 193-286, 1986), consiste à procéder à la rétention du second globule polaire lors d'un croisement de géniteurs femelles diploïdes avec des mâles tétraploïdes. Les tétraploïdes qui en résultent sont issus à partir des ovocytes produits par les géniteurs diploïdes et ont donc élargi leur base génétique en intégrant le patrimoine génétique diploïde. Chez les mollusques bivalves cette approche n'était a priori pas envisageable, du fait que, comme mentionné ci-dessus, il était généralement admis que la taille des ovocytes des femelles diploïdes n' était pas suffisante pour supporter un noyau tétraploïde. Récemment, il a été proposé de contourner ce problème en choisissant des géniteurs femelles préalablement sélectionnés sur la base de la grande taille de leurs ovocytes. Le croisement de ces femelles diploïdes ayant de

grands ovocytes avec des mâles tétraploïdes, suivi de la rétention du second globule polaire a permis la production de naissains contenant une proportion notable (30%) de tétraploïdes de seconde génération. (MCCOMBIE et al., Mar Biotechnol (NY), 7, 318-30, 2005). Cependant, la sélection . des femelles sur la base de la taille de leurs ovocytes implique des manipulations délicates et fastidieuses ; en effet, pour sélectionner les génitrices, on doit prélever séparément les ovocytes de chacune des femelles, et mesurer leur taille par observation au microscope. D'autre part, cette méthode aboutit à exclure l'apport génétique pouvant provenir de femelles possédant des ovocytes de plus petite taille, qui peuvent cependant posséder par ailleurs des caractéristiques génétiques intéressantes. Les Inventeurs ont émis l'hypothèse que la non- survie, au delà du stade larvaire, des tétraploïdes produits à partir de géniteurs femelles diploïdes pouvait avoir d' autres causes que la taille trop faible de l'ovocyte diploïde par rapport au noyau tétraploïde, et que parmi ces causes pouvait notamment figurer une baisse de la valeur adaptative générale (c'est-à-dire de l'aptitude globale à la survie) résultant de la tétraploïdie . Cette baisse de la valeur adaptative pourrait être due à l'expression de certains allèles négatifs qui se trouvent normalement réprimés chez les diploïdes et les triploïdes et ne seraient pas réprimés, ou seulement partiellement réprimés chez les tétraploïdes.

Elle aurait pour résultat une plus grande sensibilité des tétraploïdes aux conditions environnementales, ce qui inclut notamment les effets toxiques des traitements utilisés pour induire la polyploïdie, ainsi qu'une faible compétitivité des larves tétraploïdes, entrainant leur disparition plus rapide lorsqu' elles sont élevées en mélange avec des larves diploïdes et triploïdes, qui sont également présentes dans les populations larvaires résultant de l'induction de la polyploïdie.

A partir de cette hypothèse, les Inventeurs ont postulé que l'optimisation des conditions d'induction de polyploïdie, combinée à un tri des larves permettant d'isoler

les tétraploïdes et de leur permettre de s'affranchir de la très forte compétition exercée par les larves diploïdes et triploïdes, permettrait d'obtenir des tétraploïdes viables, à partir de femelles diploïdes et de mâles tétraploïdes, sans qu' il soit nécessaire de procéder à la sélection préalable de géniteurs femelles sur la taille de leurs ovocytes.

La présente invention a en conséquence pour objet un procédé d'obtention de bivalves tétraploïdes, caractérisé en ce qu'il comprend : a) la fécondation d' ovocytes de femelles diploïdes, par du sperme de mâles tétraploïdes, suivie de 1' induction de la rétention du second corps polaire des œufs fécondés par traitement à la cytochalasine B à une concentration finale de 0.3 à 0.7 mg par litre de milieu de traitement, ledit traitement étant effectué entre la 20 ^eme et la 40 ^eme minute après la fécondation ; b) la culture des larves obtenues à l'issue de cette fécondation ; c) l'isolement, à partir de la population de larves cultivées à l'étape b) , d'une sous-population enrichie en tétraploïdes, comprenant au moins 50%, de préférence au moins 70%, et de manière tout à fait préférée au moins 80% de larves tétraploïdes ; d) la culture de la sous-population de larves isolée à l'étape c) .

Les conditions du traitement à la cytochalasine B permettent de limiter son effet toxique sans toutefois diminuer l'efficacité de l'induction de polyploïdie.

Selon un mode de mise en œuvre préféré de la présente invention, ce traitement à la cytochalasine B est effectué à partir de la 20 ^ème minute après la fécondation, pendant environ 15 minutes. Avantageusement la cytochalasine B est utilisée à une concentration finale par litre de milieu de traitement de l'ordre de 0,5 mg. On peut également utiliser, à la place de la cytochalasine B, un autre agent chimique, tel que colchicine, caféine, nocodazole, ou 6-DMAP (300 à 400 μM) , ou un traitement physique tel qu'un choc thermique modéré (30 à

4O ⁰ C) ou un choc hyperbare. Pour chacun de ces traitements, les conditions choisies seront de préférence plus modérées que lorsque le même traitement est mis en œuvre pour induire la rétention du second corps polaire dans le cadre de la production d' huîtres triploïdes .

De manière particulièrement avantageuse, le procédé conforme à l'invention comprend les étapes supplémentaires suivantes : e) l'isolement, à partir de la sous-population de larves cultivées à l'étape précédente, d'une sous-population riche en tétraploïdes comprenant au moins 50%, avantageusement au moins 80%, et de manière tout à fait préférée au moins 90 % de larves tétraploïdes ; f) la culture de la sous-population de larves isolée à l'étape e) .

Généralement, la culture de l'étape b) est effectuée pendant 6 à 10 jours, de préférence pendant environ 8 jours, et la culture des étapes d) et f) est effectuée pendant 2 à 3 jours. Ces étapes d'isolement d'une sous-population riche en tétraploïdes et de culture de la sous-population isolée peuvent être répétées plusieurs fois, jusqu'à ce que les larves aient atteint le stade pédivéligère . Avantageusement elles sont répétées au moins 3 fois, de préférence au moins 4 fois, à des intervalles de 2 à 3 jours.

Selon un mode de mise en œuvre particulièrement préféré du procédé conforme à l'invention, le tri des larves pour isoler une sous-population enrichie en tétraploïdes, est effectué sur la base de leur taille. En effet, comme indiqué ci-dessus, les larves tétraploïdes ont une taille plus réduite que les larves diploïdes et triploïdes au même stade de développement. Généralement, la taille moyenne des larves tétraploïdes est inférieure de 20 à 30% à celle des larves diploïdes, et de 25 à 35% à celle des larves triploïdes de la même espèce au même stade de développement, et cultivées dans les mêmes conditions .

Ceci permet de trier facilement les larves, par simple passage à travers un tamis ayant une taille de maille appropriée, choisie en fonction de l'espèce concernée, du stade de développement larvaire, et des conditions de culture. Après chacune des étapes d'isolement d'une sous- population, le pourcentage de tétraploïdes dans la sous- population sélectionnée peut, si on le souhaite, être vérifié par des méthodes classiques de détermination de niveau de ploïdie. On peut par exemple utiliser la cytométrie de flux, sur un échantillon, d'au moins 100 individus, prélevé à partir de ladite sous-population.

Le procédé conforme à l'invention peut être utilisé pour toutes les espèces de bivalves (par exemple pectinidés, moules (Mytilus edulis et Mytilus galloprovincialis) , palourdes, etc.) chez lesquelles on désire produire des tétraploïdes (notamment en vue de les utiliser pour la production de triploïdes) . Il est tout particulièrement intéressant pour la production d'huîtres tétraploïdes, et peut par exemple être utilisé, non seulement chez des huîtres de l'espèce Crassostrea gigas, comme illustré par les exemples ci-après, mais également chez toute autre espèce du genre Crassostrea (notamment Crassostrea virginica) , Saccostrea (par exemple Saccostrea commercialis) , ou chez des espèces du genre Ostrea, telles qu' Ostrea edulis. Le procédé conforme à l'invention est effectué sans sélection préalable des géniteurs femelles sur la base de la taille de leurs ovocytes ; il permet donc d' obtenir des bivalves tétraploïdes viables, et notamment des huîtres, à partir de n'importe quels géniteurs femelles diploïdes. Le procédé conforme à l'invention permet également d'introduire directement chez des tétraploïdes, des améliorations génétiques obtenues chez des diploïdes. Il suffit en effet pour cela d'utiliser comme matériel de départ pour la mise en œuvre de ce procédé, des ovocytes obtenus à partir d'animaux d'une lignée diploïde sélectionnée. Les tétraploïdes obtenus peuvent ensuite être utilisés à leur tour pour la production d'autres tétraploïdes, ^' ou pour l'obtention de triploïdes intégrant également la même amélioration.

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La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples illustrant la mise en œuvre de la présente invention pour l'obtention d'huîtres tétraploïdes viables. EXEMPLE 1 : INDUCTION DE LA POLYPLOïDIE ET ELEVAGE LARVAIRE

Les géniteurs diploïdes femelles utilisés pour les expérimentations proviennent d'un captage naturel dans le bassin de Marennes Oléron de naissain diploïde sauvage. Les géniteurs tétraploïdes mâles proviennent du stock de tétraploïdes maintenu dans des conditions strictes de confinement au sein de l'écloserie IFREMER-LGP de la Tremblade. Six géniteurs femelles et quatre géniteurs mâles ont été utilisés pour la récolte des gamètes par scarification des gonades. 15 millions d'ovocytes et 3 milliards de spermatozoïdes issus des dix géniteurs ont été utilisés pour réaliser le croisement dans 1 1 d'eau de mer filtrée à 25°C. La rétention du second globule polaire a été réalisée en utilisant la cytochalasine B (CB) , dissoute dans le DMSO, et à la concentration finale de 0,5 mg/1. La CB a été administrée pendant 15 minutes et ceci à partir de la vingtième minute après la fécondation.

La CB est ensuite éliminée après tamisage des embryons au travers d'un filtre nylon de 10 μm de taille de mailles et un lavage de 15 minutes dans de l'eau de mer filtrée contenant 0,1% DMSO.

A titre de témoin, 15 millions d'ovocytes et 3 milliards de spermatozoïdes issus de géniteurs diploïdes ont été utilisés pour réaliser un croisement dans les mêmes conditions, à l'exception du traitement à la CB. Ensuite, les embryons de chacun des deux groupes

(groupe témoin et groupe traité à la CB) sont remis en culture dans des bacs cylindro-coniques contenant 150 1 d'eau de mer filtrée à 22 ⁰ C et aérée grâce à un bulleur incorporé dans le bac d'élevage. Afin de pouvoir estimer les taux d'éclosion et une éventuelle mortalité des larves, ces dernières sont tamisées après 24 heures post-fécondation, au travers d'un filtre de 45 μm de diamètre, reprises dans une éprouvette graduée

o contenant 1 ou 2 1 d'eau de mer filtrée et le nombre total de larves est estimé à partir d'un comptage dans un échantillon de 50 μl.

D'autre part, la ploïdie des larves est déterminée par cytométrie en flux. Après chaque tamisage, un échantillon de larves (100 larves au minimum) est prélevé et mis dans un tube de 1,5 ml. Après élimination de l'eau de mer par une brève centrifugation, les larves sont reprises dans 1 ml de tampon de lyse (5 mM MgCl ₂ , 85 mM NaCl, 10 mM Tris, 0,1% Triton X-100, pH7) . Ensuite, les larves sont broyées à l'aide d'un piston en plastique et les noyaux libérés sont filtrés au travers d'un filtre en nylon de 30 μm de taille de maille (Partec Celltrics) et recueillis dans un tube d'analyse de cytométrie, puis marqués au DAPI (4 ' , 6-Diamidino-2- phenylindole dihydrochloride) à la concentration finale de 1 μg/ml, par addition de 1 ml de tampon de lyse contenant le DAPI à 2 μg/ml et 2 μl de témoin interne de ploïdie (érythrocytes de truite, TRBC, coulter DNA Référence Calibrator, 629972) . Après une incubation minimale de 30 min sur glace, les analyses cytométriques sont réalisées en utilisant un cytomètre Partec PAII. Chaque analyse (canal FL4, échelle linéaire de 1024 canaux) se fait sur un minimum de 2000 particules. Les résultats obtenus sont présentés sous forme d'histogrammes de fréquences avec une distribution gaussienne des événements au sein de chaque pic. Les pics sont noté « peak x » quand leur identification a été réalisée de façon automatique par le logiciel FloMax™, ou « RN/PK x » quand leur identification a été réalisée manuellement par l'opérateur (x étant le numéro du pic) .

* A Jl, dans le groupe traité à la CB, le taux de larves D est estimé à 7% (contre 60% pour le témoin) . D'autre part, alors que le croisement témoin entre géniteurs diploïdes présente une population de noyaux exclusivement diploïdes (Figure 1, « peakl », « peak2 » correspondant au témoin interne TRBC) , les échantillons de larves issus du groupe traité montrent trois types de populations nucléaires correspondant aux niveaux de ploïdie suivants : diploïde (4%,

pic « RNl ») , triplolde (16%, pic « RN2 ») et surtout tétraploïde (80%, pic « RN3 ») , (Figure 2, le pic « RN4 » représente le témoin interne TRBC) . Ce résultat montre donc la grande efficacité du traitement à la CB aboutissant à une production majoritaire de larves tétraploïdes .

A partir du deuxième jour post-fécondation, le renouvellement d'eau se fait tous les deux jours après tamisage. Jusqu'à J6 post-fécondation, les larves ont été tamisées, de manière non-sélective au travers d'un filtre de 45 μm. A chaque renouvellement, les larves sont comptées et leur niveau de ploïdie déterminé par cytométrie de flux, comme décrit ci-dessus.

Ensuite, les larves sont remises dans leurs cuves d'élevage cylindroconiques respectives en respectant une densité maximale de 10000 larves/1 à J4 post-fécondation et de 6500 larves/1 à J6 post-fécondation.

Les larves sont nourries tous les jours par un mélange d'algues fourrage cultivées dans le laboratoire et contenant 70% de Isochrysis galbana souche Tahiti et 30% de Chaetoceros gracilis à la concentration de 25 cellules/μl/jour .

* A 72 h post-fécondation, le taux de survie des larves traitées est de 6,18%. Les résultats d'analyse de cytométrie de flux à J4 post-fécondation (Figure 3) montrent une répartition des diploïdes (pic « RNl ») , triploïdes (pic « RN2 ») , et tétraploïdes (pic « RN3 ») , similaire à celle observée à Jl.

Le Tableau I ci-dessous compare les conditions de mise en œuvre, et les résultats de survie à 24 et 72 heures, dans le cas de la méthode conforme à l'invention et dans celui de la méthode décrite par McCOMBIE et al. (2005, précité) .

Tableau I

Après 24 heures post-fécondation, alors que les témoins non traités montrent des taux comparables en larves D

(autour de 60%), une différence significative de ces mêmes taux de larves D apparaît chez les larves traitées. Ainsi, le taux de larves D est 1,75 fois plus élevé dans le cas de la méthode conforme à l'invention que dans celle publiée par

McCOMBIE et al. De plus, à 72 heures post-fécondation, le taux de survie des larves traitées observé dans le cas de la méthode conforme à l'invention est 5,6 fois plus élevé que celui observé dans l'expérience menée par McCOMBIE et al. Il parait donc que l'optimisation des conditions d'induction de la rétention du second globule polaire, par réduction de moitié de la concentration en CB et diminution du temps de traitement améliore non seulement l'induction immédiate de la rétention du second globule polaire, mais améliore aussi très significativement la survie des larves traitées.

Le dernier tamisage non-sélectif a été réalisé à J6 post-fécondation. Par la suite, des tamisages sélectifs ont été effectués, le matin et tous les deux ou trois jours, en adaptant la taille des tamis à la population de larves ciblée, et différentes populations de larves ont été constituées, en se basant sur leur vitesse de croissance (estimée par les différentes tailles des tamis) , et leurs niveaux de ploïdie (vérifiés par cytométrie en flux) .

De cette manière, des populations à fort développement dites « tête de lot », à développement moyen dites « corps de lot » et à développement lent dites « queue de lot » ont été constituées en fonction de ces deux critères, et mises en élevage dans des cuves séparées. Cette méthode de

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tri sélectif en fonction de la taille et de la ploïdie a pour but final de favoriser au plus la croissance et la survie des larves tétraploïdes et ceci en maximisant, au sein des différentes parties du lot d'élevage, leur effectif relativement aux larves diploides et triploïdes.

* Ainsi, à J8 post-fécondation, le premier tamisage sélectif sur la taille des larves a été réalisé et deux populations de larves ont été élevées séparément : la population « tête de lot I » ayant une croissance normale et une taille minimale de 80 μm et une population « queue de lot I » avec croissance plus lente, et une taille comprise entre 65 μm et 80 μm.

Les tamisages suivants ont été effectués à JIl, J13, J15, J18, J20, J23, et J25 post-fécondation. * A JIl post-fécondation, les analyses cytométriques réalisées sur le groupe témoin, ainsi que sur les deux populations de larves traitées à la CB montrent que :

Le croisement témoin présente toujours une population de noyaux exclusivement diploïde (Figure 4, « peakl », le témoin interne TRBC correspondant au « peak2 ») ,

- Les échantillons de larves traitées issues de la population « tête de lot » ayant une taille minimale de 80 μm

(T≥80μm) montrent que cette population est constituée de larves tétraploïdes (56%, pic « RN2 ») et de larves triploïdes (44%, pic « RNl ») (Figure 5, le témoin interne TRBC correspondant au pic « RN3 ») .

- Les échantillons de larves traitées issues de la population « queue de lot » ayant une taille inférieure à 80 μm (65μm <T< 80μm) montrent que cette population présente une constitution comparable à la population « tête de lot » en ce qui concerne les niveaux de ploïdie présents ; toutefois cette population « queue de lot » se distingue de la population « tête de lot » par son extrême richesse en larves tétraploïdes (92%, contre 56%, pic « RN2 ») , (Figure 6). Ce résultat montre que la fraction tétraploïde de la population totale de larves en élevage est plutôt confinée dans la partie « queue de lot » de l'élevage larvaire. Beaucoup de ces larves tétraploïdes montrent une vitesse de

croissance plus lente par rapport à la plupart des larves triploïdes obtenues dans la même expérience. Dans notre cas, la tétraploïdie des larves s'accompagne d'une baisse notable de la valeur adaptative générale. Toutefois, une bonne partie des larves tétraploïdes arrive quand même à avoir une vitesse de croissance élevée et se trouve de ce fait dans la partie « tête de lot » de l'élevage. Ceci suggère que même si le niveau de ploïdie tétraploide se révèle comme étant celui qui confère le moins de vitesse de croissance lorsqu'il est en compétition avec le niveau triploïde, les effets de cette tétraploïdie se retrouvent atténués, ou même annulés, suite à 1 ' introgression de caractères génétiques favorables issus des parents diploïdes femelles.

Pour la suite de l'élevage, des tamisages sélectifs (65, 80 et 100 μm de taille de maille) ont été réalisés afin de pouvoir isoler des sous populations de plus en plus riches en larves tétraploïdes. Ainsi, des populations « tête de lot » ayant une taille minimale de 100 μm, « corps de lot » avec une taille comprise entre 80 et 100 μm et « queue de lot » avec une taille comprise entre 65 et 80 μm ont été identifiées grâce à leur cinétique de croissance et ensuite caractérisées pour leurs niveaux de ploïdie et élevées séparément .

* A J13 post-fécondation, les analyses cytométriques réalisées à partir de larves traitées ou non à la CB montrent que :

- Le témoin non traité continue à ne montrer que des noyaux exclusivement diploïdes (Figure 7 et pic « RNl », le témoin interne TRBC correspondant au pic « RN2 ») . - La population des larves traitées « tête de lot » est majoritairement constituée de larves triploïdes

(45%, pic « RN2 ») et tétraploïdes (45%, pic « RN3 ») , le reste étant constitué d'une fraction de larves diploïdes vraisemblablement d'origine gynogénétique (pic « RNl », Figure 8 où le pic « RN4 » correspond au témoin interne TRBC) . Cette population « tête de lot » est composée de larves qui présentent une croissance normale et qui ont atteint une taille minimale de 100 μm.

- Les populations des larves traitées « corps de lot » et « queue de lot » sont très majoritairement constituées de larves tétraploïdes (77 à 85%, pics « RN2 »,

Figures 9-10 où les pics « RNl » et « RN3 » correspondent respectivement aux noyaux triploïdes et témoin interne TRBC) .

* Le résultat obtenu à J13 post-fécondation est confirmé par la suite de l'élevage. En effet, A J15 postfécondation, le témoin non traité continue à ne montrer que des larves diploïdes (pic « RNl », Figure 11. Le témoin interne TRBC est représenté par la pic « RN2 ») alors que les parties « tête de lot » et « corps de lot » des larves traitées montrent une moyenne de 50% de larves tétraploïdes

(pics « RN3 », Figures 12-13 où les pics « RNl », « RN2 » et

« RN4 » correspondent respectivement aux noyaux diploïdes, triploïdes et témoin interne TRBC). Toutefois, c'est la partie « queue de lot » de l'élevage qui montre le taux le plus élevé en larves tétraploïdes (99%), (pic « RNl », Figure 14 où le témoin TRBC est représenté par le pic « RN2 ») .

* A partir de J18 post-fécondation, une partie des larves traitées de la population « tête de lot » sont pédivéligères et commencent à se fixer et ceci deux jours avant les larves diploïdes du témoin non traité. Les analyses cytométriques réalisées à J18 post-fécondation continuent à montrer un niveau exclusivement diploïde chez le témoin (pic « RNl », (Figure 15) . Le témoin interne TRBC est représenté par le pic « RN2 ») . Chez les larves traitées ayant atteint le stade pédivéligère, presque la moitié (47%, pic « RN3 ») des larves mises à fixer sont tétraploïdes (Figure 16 où les pics « RNl », « RN2 » et « RN4 » correspondent respectivement aux noyaux diploïdes, triploïdes et témoin interne TRBC) . Le fait que la fixation de cette population « tête de lot », constituée de moitié de larves tétraploïdes, se fasse deux jours avant celle du témoin diploïde non traité suggère que ces larves tétraploïdes ont acquis une valeur adaptative générale supérieure à celle des larves non traitées. Parallèlement, la nouvelle « tête de lot » de l'élevage larvaire montre une composition très majoritaire en larves tétraploïdes (75%, pic « RN3 ») , (Figure 17 où les pics

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« RNl », « RN2 » et « RN4 » correspondent respectivement aux noyaux diploïdes, triploïdes et témoin interne TRBC). Cette nouvelle « tête de lot » est issue du reste des larves de l'ancienne « tête de lot » ainsi que des larves issues des partie « corps et queue de lot » ayant atteint une taille minimale de 180 μm. Après cette première fixation de larves tétraploïdes, réalisée à J18 post-fécondation, deux autres mises en fixation de larves pédivéligères ont été réalisées à J23 et J25 post-fécondation : La fixation réalisée à J23 post- fécondation contient 87% de larves tétraploïdes (pic « RN3, Figure 18 ; les pics « RNl », « RN2 » et « RN4 » correspondent respectivement aux noyaux diploides, triploïdes et témoin interne TRBC) . La fixation réalisée à J25 post-fécondation contient 90% de larves tétraploïdes (pic « RNl », Figure 19 où le pic « RN2 » représente le témoin interne TRBC) . Les trois lots de fixation ont été par la suite élevés séparément durant les phases de micronursage et de nursage.

EXEMPLE 2 : FIXATION ET DEVELOPPEMENT DE NAISSAINS TETRAPLOïDES Les analyses cytométriques réalisées à un et à deux mois post-fixation ont pour but de contrôler la présence d'individus tétraploïdes au sein des naissains qui ont réussi à se métamorphoser, se fixer et se développer. A un mois postfixation, ces analyses, réalisées sur un mélange de naissains, montrent la présence constante de fortes fractions de tétraploïdes (pic « RN2 », Figure 20 où les pics « RNl » et « RN3 » représentent respectivement les noyaux triploïdes et le témoin interne TRBC) . A deux mois post-fixation, les mêmes analyses réalisées sur des naissains individuels montrent aussi la présence de fortes proportions de naissains tétraploïdes (pic « peakl/2 », Figure 21 ; Le pic « peak3 » représente le témoin interne TRBC) .

A partir de six mois post-fixation, le tri des jeunes huîtres tétraploïdes a commencé et a permis l'obtention d'une population de plus de 500 huîtres tétraploïdes issues de femelles diploïdes sauvages (Figure 22, pic « RNl » ; Le pic « RN2 » représente le témoin interne TRBC) . De façon analogue à ce qui a été observé durant l'élevage larvaire, où la

proportion des tétraploïdes est beaucoup plus élevée dans la « queue de lot » que dans la « tête de lot », la proportion des huîtres tétraploïdes triées dans le premier lot de fixation (issu de la tête de lot larvaire) représente 45% de l'effectif total analysé tandis que, dans le troisième lot de fixation (issu du queue de lot larvaire) , cette proportion des huîtres tétraploïdes de seconde génération triées dépasse 80% de l'effectif total analysé. Ceci montre que, d'une part, le comportement larvaire est reproduit après métamorphose et fixation, et que, d'autre part, la tétraploïdie même si elle entraîne une baisse de valeur adaptative générale, baisse révélée ici par une vitesse de croissance plus lente des larves de la « queue de lot », cette baisse est largement contrebalancée par 1 ' introgression de caractères favorables apportés par le parent femelle diploïde et s ' exprimant particulièrement dans la portion tétraploïdes des larves et naissains de la tête de lot.

Le Tableau II ci-dessous compare les résultats de l'induction de tétraploïdes 8 mois après fécondation, dans le cas de la méthode conforme à l'invention et dans celui de la méthode décrite par McCOMBIE et al. (2005, précité) .

Tableau 11

* Les animaux ont été perdus probablement suite à des mortalités aiguës au sein de l'écloserie du LGP la Tremblade. A huit mois post-fixation, une comparaison de la croissance de trois populations de naissains d'huîtres élevés dans les mêmes conditions au sein de notre écloserie permet de montrer que les huîtres tétraploïdes produites conformément à l'invention, présentent une croissance proche de celle des triploïdes obtenus par rétention du premier globule polaire mais largement supérieure à celle des tétraploïdes de première génération destinés à fournir les écloseries commerciales en géniteurs tétraploïdes mâles.

9 mois post-fixation

A neuf mois post-fixation, une trentaine d' individus dont la taille moyenne était d' au moins 6 cm ont été mis en conditionnement permettant le déclenchement de la maturation et la production de gamètes. Ces futurs géniteurs ont été conditionnés dans une eau de mer de 20 ⁰ C et contenant 2.10 ⁹ cellules de phytoplancton par jour et par individus. Au terme de cette période de conditionnement à la maturation, les géniteurs tétraploïdes ont été soumis à plusieurs chocs (thermiques et d' exondation) afin de déclencher leur ponte. Sur la trentaine de géniteurs mis en maturation, 21 ont pondu avec un sex ratio nettement favorable aux mâles (20 mâles et 1 femelle) ce qui est parfaitement conforme à la nature protandre de l'huître creuse C. gigas. Afin de tester les gamètes produits par ces géniteurs tétraploïdes, nous avons réalisé un croisement en fécondant les ovocytes tétraploïdes, issus de la seule femelle tétraploïde, par le mélange du sperme tétraploïde, produit par les 20 mâles tétraploïdes. Nos résultats montrent clairement que les gamètes produits par les géniteurs testés sont pleinement viables et fécondants. Ainsi, croisés entre eux, les nouveaux tétraploïdes produisent des larves uniquement tétraploïdes (Figure 23, 100% de tétraploïdes représentés par le pic « RNl », le pic « RN2 » représentant le témoin interne TRBC) . Actuellement, cette nouvelle génération de tétraploïdes s'est métamorphosée et fixée et se trouve actuellement en élevage en micronurserie (taille entre 500 et 1000 μm) .

En conclusion, nous avons réussi à produire des huîtres tétraploïdes suite à un croisement impliquant des femelles diploïdes et des mâles tétraploïdes. Les tétraploïdes obtenus, après avoir subi un traitement de conditionnement de la maturation gamétique, réussissent à entrer en gamétogenèse et à produire des gamètes mâles et femelles tétraploïdes pleinement viables et fécondants. Enfin, quand ces tétraploïdes sont croisés entre eux, ils réussissent à produire une nouvelle génération de tétraploïdes pleinement viables .

Au-delà de 9 mois post fixation (féyrier 2007 - mars 2008)

La tétraploïdie des huîtres de première génération issues du croisement de mâles tétraploïdes par des femelles diploïdes, dénommées ci-après « Ronçoises », est confirmée par analyses cytométriques et aussi après comptage chromosomique à partir de tissu branchial en utilisant les techniques de caryotype classiques. Comparativement aux huîtres tétraploides classiques (c'est à dire issues de femelles triploïdes) de même âge et élevées dans les mêmes conditions, les huîtres tétraploïdes « Ronçoises » de première génération ont montré une grande rusticité et une croissance pondérale bien plus importantes. Ainsi, au bout de vingt mois d'élevage, les tétraploïdes de première génération (Ronçoises) sont 1.87 fois plus lourdes que les tétraploïdes classiques (2006-01), (Figure 24) . De plus le cheptel « Ronçoise » s'est montré particulièrement résistant puisque aucune mortalité ne s'y est manifestée à la différence du cheptel de tétraploïdes classiques (2006-01) qui a connu plusieurs épisodes de mortalité surtout estivale. Début 2007, les huîtres tétraploïdes « Ronçoise » de première génération ont été utilisées comme géniteurs mâles et femelles afin de produire, suite à une ponte naturelle induite, une deuxième génération d'huîtres tétraploïdes « Ronçoise », dénommées ci-après G2R. La tétraploïdie des larves et naissains G2R a été aussi confirmée à la fois par analyses cytométriques et aussi après comptage chromosomique en utilisant les techniques de caryotype classiques. Les naissains G2R sont tous tétraploïdes et leur élevage, que ce soit au stade larvaire, micronurserie ou nurserie, ne diffère aucunement d'un élevage classique. Durant leur élevage, les naissains G2R ont montré un très bon comportement surtout en termes de rusticité, de croissance et de stabilité du niveau de tétraploïdie (Figure 25) . En effet, même si leur croissance ne semble pas significativement différente de celle des naissains tétraploïdes classiques de même âge et élevés dans les mêmes conditions (2007-01) , les naissains G2R montrent une survie et surtout une stabilité de l'état tétraploïde bien supérieure. Le cheptel G2R se compose uniquement d'individus

tétraploïdes sans aucune réversion vers les états de ploldie inférieurs ce qui n'a pas été le cas pour le naissain (2007- 01) qui a montré une tendance significative à la réversion vers les états de ploldie inférieurs (mosaïques triploïdes et diploïdes) .

A partir du mois de novembre 2007, les tétraploïdes G2R âgées de 9 mois post fixation ont été conditionnés à la maturation, et deux mois et demi plus tard, utilisés comme géniteurs afin de produire par ponte induite des gamètes tétraploïdes mâles et femelles qui ont été utilisés afin de produire en février 2008 la troisième génération de tétraploïdes dénommées ci-après G3R. Le sex ratio des géniteurs tétraploïdes G2R ainsi que leur fécondité ne différent pas de ceux des géniteurs diploïdes. Les larves produites sont bien tétraploïdes (pic « peak 1 », Figure 26, le « peak 2 » correspondant au témoin interne TRBC) . Les mâles G2R ont aussi été utilisés afin de féconder des femelles diploïdes, permettant de produire des triploïdes (pic « RNl », Figure 27, le pic « RN2 » correspond au témoin interne TRBC) .