本発明は、心臓壁肥厚の抑制作用を有する� ��効成分、該有効成分を含む心肥大予防剤お� ��び心不全予防剤、ならびに該有効成分を含� ��心肥大および心不全の予防効果が期待でき� ��機能性食品に関する。
 また、本発明は心臓壁肥厚を抑制する方法� ��関する。さらに本発明は心肥大および心不� ��を予防する方法に関する。

(背景技術)
 近年、一部の国では喫煙、高血圧、高血糖� ��高脂血症など、心疾患を引き起こすとされ� ��危険因子をかかえる人が多くなっており、� ��不全の患者数は増加する傾向にある。また� ��これらの病態は人間だけに限られず、犬や� ��その他コンパニオンアニマルやペットアニ� ��ルなど人間と密接な関係を有する動物にも� ��加する傾向にある。
 心不全の病態、分類、経過はさまざまなの� ��、簡単に定義することはできないものの、� ��縮期心不全と拡張期心不全の大きく2つのタ イプに大別でき、この2つが同時に起こる場� �もある。収縮期心不全は、心臓が正常に収� �できなくなるために生じる。心臓は血液を� �りこむが、心筋が弱くなっているため、満� �された血液を充分に押し出すことができず� �その結果、全身や肺に送られる血液量が少� �くなり、心臓、特に左心室が肥大し得る。� �方、拡張期心不全は、心臓の壁がかたく厚� �なり、心臓が血液を充分にためることがで� �なくなるために発症する。その結果、血液� �左心房内や肺の血管内にたまり、うっ血を� �こし得る。このように、一般に心不全とは� �心臓のポンプ機能が不全に陥ったために、� �臓が充分な量の血液を送り出せなくなるこ� �をいい、心不全によって、血流量の減少、� �脈や肺の中への血液の滞留など、心臓の機� �をさらに低下させる他の変化が生じ得る。

 心不全に至る原疾患として、例えば、高血� ��、大動脈狭窄症等による圧負荷の増大、弁� ��症等による容量負荷の増大等によって心臓� ��が肥厚する、心肥大が挙げられる。一方で� ��心筋梗塞の発症後に損傷組織において自発� ��な機能回復反応として心臓壁肥厚が形成さ� ��ることもある。また、心筋症等、原因不明� ��心筋障害が起こることによっても心臓壁が� ��大する。心臓への機械的負荷が持続するこ� ��により心筋の収縮力が次第に低下して心機� ��の低下を招き、ついには心室性不整脈、心� ��虚血、冠動脈疾患、うっ血性心不全へと至� ��。
 これらのことから、心臓壁の肥厚抑制作用� ��有する化合物は、心肥大や心不全の予防お� ��び治療に有用である。

 心臓壁肥厚改善の方法としては、例えば、� ��血圧等による心肥大の場合、原因である高� ��圧症を治療することにより心臓壁肥厚も改� ��される場合があるが、その作用は満足でき� ��ものではなく、しかも降圧剤には全く効果� ��ないものもある(Am J Hypertens.1997 Aug;10(8):913 ~20)。また、高血圧症が改善された場合であ� �ても、心臓壁肥厚が改善しない状態で残る� �合が多く、このような場合においては、な� �も心不全発症の危険性がある。
 心不全治療に有効な薬剤として、アンジオ� ��ンシンIから昇圧作用を有するアンジオテン シンIIへ変換する酵素(即ち、アンジオテンシ ン変換酵素; ACE)を阻害する物質で降圧作用� �有する、アンジオテンシン変換酵素阻害剤(A CEI)、例えば、エナラプリルが挙げられる。� �た、降圧剤は血圧を下げると同時に腎障害� �進行が改善されることが報告されている(J.  Clin. Invest, 77, 1993-2000,1986)。しかし一方では 、種々の原疾患から誘発される心不全に対し て、ACE阻害剤は必ずしもすべての症例に有効 なわけでなく、むしろ降圧に伴い急性腎不全 をきたす危険もあり慎重な投与が必要である ことが指摘されており(最新医学、48:1404 ~1409 , 1993)、すなわち降圧剤が心不全の予防に不� ��分なばかりか、むしろ腎不全を誘発する可� ��性がある。
 一方、カゼイン等の食品素材に由来するペ� ��チドにACE阻害活性のあることが報告されて� ��り、これらが血圧降下作用を有することが� ��られているが、心臓壁肥大抑制作用を有す� ��か否かは直接示されていない(特許第2782142� �公報、J. Dairy Sci. 1995, 78:777-78、J.Dairy Sci.� �1995, 78:1253-1257, Am. J. Clin. Nutr. 1996, 64:767- 771)。また、ACE阻害による心不全の予防また� �治療効果は前記のように限定的であるため� �ACE阻害に因らない疾患の予防または治療が� �まれる。

(発明の開示)
 本発明により、ACE阻害活性に依存せずに、� ��臓壁の肥厚抑制作用を有する化合物又は組� ��物が提供される。
 さらに、本発明により、前記化合物又は組� ��物を含む心不全予防剤が提供される。
 また本発明により、前記化合物又は組成物� ��含む、心不全の予防効果が期待できる機能� ��食品が提供される。
 さらに本発明により、前記化合物または組� ��物を対象者に投与することを含む、心臓壁� ��肥厚を抑制する方法が提供される。
 また本発明により、前記化合物または組成� ��を対象者に投与することを含む、心不全を� ��防する方法が提供される。
 また本発明は、前記化合物または組成物の� ��心臓壁の肥厚を抑制するための医薬の製造� ��おける使用でもある。特に、本発明は、前� ��化合物または組成物の、心肥大予防用医薬� ��造における使用でもある。また、本発明は� ��前記化合物または組成物の、心不全予防用� ��薬の製造における使用でもある。

 本発明者等は、Xaa Pro Pro(Xaaは任意の天然� �アミノ酸)という特定の構造を有するトリペ� ��チドが心臓壁肥厚の抑制作用を有すること� ��見出し、心不全の予防に役立つ医薬及び機� ��性食品を発明するに至った。その具体的な� ��容は、以下の通りである。
 本発明は、Xaa Pro Proを有効成分として含有 する心臓壁の肥厚抑制剤を提供する。
 また本発明は、上述のような心臓壁の肥厚� ��制作用を有する心肥大予防剤を提供する。
 また本発明は、上述のような心臓壁の肥厚� ��制作用を有する心不全予防剤を提供する。
 また本発明は、上述のような心臓壁の肥厚� ��制剤を含む機能性食品を提供する。
 本発明は、Xaa Pro ProまたはXaa Pro Proを含� �組成物を対象者に投与することを含む、心� �壁の肥厚を抑制する方法を提供する。
 また、本発明は、Xaa Pro ProまたはXaa Pro Pr oを含む組成物を対象者に投与することを含� �、心肥大を予防する方法をも提供する。
 また、本発明は、Xaa Pro ProまたはXaa Pro Pr oを含む組成物を対象者に投与することを含� �、心不全を予防する方法を提供する。
 さらに、本発明は、Xaa Pro ProまたはXaa Pro� �Proを含む組成物の、心臓壁の肥厚を抑制す� �医薬の製造における使用でもある。特に、� �発明は、Xaa Pro ProまたはXaa Pro Proを含む組 成物の心肥大防用医薬の製造における使用で もある。また、本発明はXaa Pro ProまたはXaa  Pro Proを含む組成物の、心不全予防用医薬の� ��造における使用でもある。

 好ましくは、Xaa Pro ProがVal Pro Pro及び/又� ��Ile Pro Proである。
 本発明の別の態様においては、有効成分Xaa� �Pro Proが、獣乳カゼイン加水分解物又はその 濃縮物に由来する。
 本発明のさらに別の態様においては、有効� ��分Xaa Pro Proが、乳タンパク質を含む原料を ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus� �helveticus)種に属する菌により発酵させて得ら れる発酵物に由来する。
 好ましくは、ラクトバチルス・ヘルベティ� ��ス種に属する菌がラクトバチルス・ヘルベ� ��ィカスCM4株(FERM BP-6060)である。

(発明を実施するための最良の形態)
 本発明の心臓壁肥厚抑制剤は、Xaa Pro Proと いう構造のトリペプチドを有効成分として含 有する。ここで「剤」とは薬剤に限定される ものではなく、例えば、医薬組成物または食 品組成物などの組成物、あるいは、例えば食 品添加剤などの化合物をいう。本発明でいう 「心臓壁肥厚抑制剤」とは、心臓壁肥厚病変 の進行を抑えとどめる作用を有するか、心臓 壁肥厚病変を改善する作用を有するか、ある いは心臓壁肥厚発症の予防効果を有する化合 物又は組成物をいう。
 本発明の有効成分Xaa Pro ProのXaaは、任意の 天然のアミノ酸でよい。具体的には、Val Pro� �Pro(バリン-プロリン-プロリン)、Ile Pro Pro(� �ソロイシン-プロリン-プロリン)、Ser Pro Pro( セリン-プロリン-プロリン)、Leu Pro Pro(ロイ� ��ン-プロリン-プロリン)などが挙げられ、好� ��しくはVal Pro Pro、Ile Pro Proであり、より� �ましくはVal Pro Proである。また有効成分と� ��て、Val Pro Pro及びIle Pro Proといった1種以� ��のトリペプチドXaa Pro Proの組合せを含んで いてもよい。
 有効成分Xaa Pro Proは有機化学的に合成した トリペプチドであってもよく、また天然由来 のトリペプチドであってもよい。

 トリペプチドXaa Pro Proの有機化学的合成法 としては、固相法(Boc法、Fmoc法)や液相法とい った一般的な方法を用いることができ、例え ば、島津製作所製のペプチド合成装置(PSSM-8� �)といったペプチド自動合成装置を用いて合� ��したものであってもよい。ペプチド合成の� ��応条件等については、当業者の技術常識に� ��づき、選択する合成方法や所望のトリペプ� ��ドXaa Pro Proに合せて、適切な反応条件等を 任意で設定することができる。
 あるいは、天然由来のものとしては、獣乳� ��ゼイン加水分解物又はその濃縮物に由来す� ��ものであってもよく、タンパク質を含む食� ��原料を麹菌や乳酸菌といった菌類によって� ��酵させて得られる発酵物に由来するもので� ��ってもよい。
 獣乳カゼイン加水分解物又はその濃縮物や� ��乳タンパク質を含む原料をラクトバチルス� ��ヘルベティカス種に属する菌により発酵さ� ��て得られる発酵物を用いる場合は、本発明� ��有効成分であるトリペプチドXaa Pro Pro以外 に遊離アミノ酸を含んでいても良く、更に、 前記ペプチド及び遊離アミノ酸の他に、例え ば市販の獣乳カゼイン、乳タンパク質に通常 含まれる、脂質、灰分、炭水化物、食物繊維 、水分等が含まれていても良く、また、必要 に応じてこれらのうちの適当な成分の一部若 しくは全部を除去しても良い。

 本発明の有効成分Xaa Pro Proは、Xaa Pro Pro� �特にVal Pro Pro及びIle Pro Proが得られる酵素 群を用いて、獣乳カゼインを加水分解する方 法、獣乳カゼインを麹菌により発酵する方法 により得られる、獣乳カゼイン加水分解物又 はその濃縮物に由来するものであってもよい 。
 獣乳カゼインとしては、例えば、牛乳、馬� ��、山羊乳、羊乳等のカゼインが挙げられ、� ��に牛乳カゼインが好ましく使用できる。
 獣乳カゼインを加水分解又は発酵する際の� ��ゼイン濃度は、特に限定されないが獣乳カ� ��イン分解物を効率良く生産するために、1~19 重量%が好ましい。

 前記酵素群としては、例えば、Xaa Pro Pro X aa配列のカルボキシ末端のPro Xaa残基間が切� �可能なペプチダーゼを含む酵素群(X)が好ま� �く挙げられる。
 酵素群(X)は、活性中心にセリンを持つ、セ� ��ンタイプのプロティナーゼもしくは、活性� ��心に金属を持つ金属プロティナーゼを含む� ��とが好ましい。金属プロティナーゼとして� ��、中性プロテアーゼI、中性プロテアーゼII� ��びロイシンアミノペプチダーゼ等が挙げら� ��、これらの少なくとも1種を更に含むことが 、所望の加水分解物を効率良く、且つ短時間 で、更には1段階反応で得ることができる点� �好ましい。また前記Pro Xaa配列が切断可能な ペプチダーゼとしては、等電点が酸性域を示 す酵素であることが好ましい。

 前記酵素群又は酵素群(X)としては、例えば� ��アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)等� ��麹菌由来の酵素群が挙げられる。このよう� ��酵素群は、適当な培地で菌体を培養し、生� ��される酵素を水抽出した酵素群等が挙げら� ��、特に、アスペルギルス・オリゼ由来の酵� ��群のうちの等電点が酸性域を示す酵素群が� ��ましく挙げられる。
 アスペルギルス・オリゼ由来の酵素群とし� ��は、市販品を利用することができ、例えば� ��スミチームFP、LP又はMP(以上、登録商標、新 日本化学(株)製)、ウマミザイム(登録商標、� �野エンザイム(株)製)、Sternzyme B11024、PROHIDROX Y AMPL(以上、商品名、株式会社樋口商会製)、 オリエンターゼONS(登録商標、阪急バイオイ� �ダストリー(株)製)、デナチームAP(登録商標� �ナガセ生化学社製)等が挙げられ、特に、ス� ��チームFP(登録商標、新日本化学(株)製)の使� ��が好ましい。
 これら市販の酵素群を用いる場合には、通� ��、至適条件が設定されているが、前記カゼ� ��ン加水分解物が得られるように条件、例え� ��、使用酵素量や反応時間等を、用いる酵素� ��に応じて適宜変更して行なうことができる� ��

 前記獣乳カゼインを加水分解する際の酵素� ��の添加量は、例えば、獣乳カゼインを溶解� ��た水溶液に、酵素群/獣乳カゼインが重量比 で1/1000以上、好ましくは1/1000~1/10、特に好ま� ��くは1/100~1/10、更に好ましくは1/40~1/10の割合 となるような量である。
 反応条件は、使用する酵素群に応じて目的� ��カゼイン加水分解物が得られるように適宜� ��択できるが、温度は、通常25~60℃、好まし� �は45~55℃であり、pHは、3~10、好ましくは5~9、 特に好ましくは5~8である。また、酵素反応時 間は、通常2~48時間、好ましくは7~15時間であ� ��。
 酵素反応の終了は、酵素を失活させること� ��より行なうことができ、通常、60~110℃で酵� ��を失活させ、反応を停止させることができ� ��。
 酵素反応停止後、必要に応じて沈澱物を、� ��心分離除去や各種フィルター処理により除� ��することが好ましい。
 また、必要に応じて、得られる加水分解物� ��ら苦味や臭味を有するペプチドを除去する� ��ともできる。このような苦味成分や臭味成� ��の除去は、活性炭又は疎水性樹脂等を用い� ��行なうことができる。例えば、得られた加� ��分解物中に、使用したカゼイン量に対して� ��性炭を1~20重量%添加し、1~10時間反応させる� ��とにより実施できる。使用した活性炭の除� ��は、遠心分離や膜処理操作等の公知の方法� ��より行なうことができる。
 このようにして得られた獣乳カゼイン加水� ��解物又はその濃縮物を含む反応液は、その� ��ま飲料等の液体製品に添加して機能性食品� ��利用することができる。また、獣乳カゼイ� ��加水分解物の汎用性を高めるために、前記� ��応液を濃縮後、乾燥し粉末の形態とするこ� ��もできる。

 獣乳カゼイン加水分解物又はその濃縮物� ��含まれるXaa Pro Proの含有割合は、獣乳カゼ イン加水分解物又はその濃縮物中のペプチド 及び遊離アミノ酸の合計量に対して通常1重� �%以上、好ましくは1~5重量%である。該含有割 合を1重量%以上とすることにより、より高い� ��用が期待される。また、獣乳カゼイン加水� ��解物又はその濃縮物中に含まれるIle Pro Pro 又はVal Pro Proの含有割合は、獣乳カゼイン� �水分解物又はその濃縮物中のペプチド及び� �離アミノ酸の合計量に対して、それぞれ単� �で0.3重量%以上であっても、Ile Pro Pro及びVal  Pro Proの合計量が0.3重量%以上であっても、� ��い効果が期待される。更に、Ile Pro Pro及び Val Pro Proのそれぞれを0.3重量%以上含有する� ��合には、より高い効果が期待される。

 また、本発明の有効成分Xaa Pro Proは、乳タ ンパク質を含む原料をラクトバチルス・ヘル ベティカス種に属する菌により発酵させて得 られる発酵物に由来するものであってもよい 。
 ラクトバチルス・ヘルベティカス種に属す� ��菌は、ラクトバチルス・ヘルベティカス種� ��独で発酵に用いるのが好ましいが、本発明� ��所望の効果を損なわない範囲で他の乳酸菌� ��を含んでいても良い。
 ラクトバチルス・ヘルベティカス種に属す� ��菌としては、Ile Pro Pro及び/又はVal Pro Pro� ��高生産しうるプロティナーゼ生産菌が好ま� ��い。例えば、Twiningらの方法(Twining, S. Anal.� �Biochem. )143 3410(1984))をもとにしたYamamotoらの 方法(Yamamoto, N.ら J.Biochem. )(1993) 114, 740)に� ��じて測定したU/OD590の値が400以上を示す菌株 が好ましい。
 そのような好ましい菌株としては、例えば� ��ラクトバチルス・ヘルベティカスCM4株(通商 産業省工業技術院生命工学工業技術研究所、 日本国茨城県つくば市東1丁目1番3号、郵便番 号305(現、産業技術総合研究所特許生物寄託� �ンター、日本国茨城県つくば市東1-1-1 つく� ��センター中央第6、郵便番号305-8566)、受託番 号:FERM BP-6060,寄託日1997.8.15)(以下、CM4株と称� ��)が挙げられる。このCM4株は、特許手続上の 微生物寄託の国際的承認に関するブタペスト 条約の下に上記寄託番号で登録されており、 この株は既に特許されている。

 乳タンパク質を含む原料をラクトバチルス� ��ヘルベティカス種に属する菌により発酵さ� ��て得られる発酵物は、ラクトバチルス・ヘ� ��ベティカス種に属する菌株を含む発酵乳ス� ��ーターを乳タンパク質を含む原料に添加し� ��発酵温度等の発酵条件を適宜選択して発酵� ��せることにより得ることができる。
 また、このようにして得られた発酵物の濃� ��物等を凍結乾燥、噴霧乾燥等により粉末と� ��て用いてもよい。

 ラクトバチルス・ヘルベティカス種に属す� ��菌は、あらかじめ前培養しておき充分に活� ��の高いスターターとして用いることが好ま� ��い。初発菌数は、好ましくは10 ⁵ ~10 ⁹ 個/ml程度である。
 乳タンパク質を含む原料をラクトバチルス� ��ヘルベティカス種に属する菌により発酵さ� ��て得られる発酵物は、例えば、特定保健用� ��品等の機能性食品に利用するに際して、風� ��を良好にし、嗜好性を良好とするために、� ��記ラクトバチルス・ヘルベティカス種に属� ��る菌株に酵母を併用して発酵させることも� ��きる。酵母の菌種は特に限定されないが、� ��えば、サッカロマイセス・セレビシェ(Saccha romyces cerevisiae)等のサッカロマイセス属酵母� ��が好ましく挙げられる。酵母の含有割合は� ��その目的に応じて適宜選択することができ� ��。

 乳タンパク質を含む原料としては、例えば� ��牛乳、馬乳、羊乳、山羊乳等の動物乳、及� ��豆乳等の植物乳、これらの加工乳である脱� ��乳、還元乳、粉乳、コンデンスミルクが挙� ��られ、牛乳、豆乳、これらの加工乳が好ま� ��く、牛乳又はその加工乳が特に好ましい。
 乳の固形分濃度は特に限定されないが、例� ��ば、脱脂乳を用いる場合の無脂乳固形分濃� ��は、通常3~15重量%程度であり、生産性的に� �6~15重量%が好ましい。
 前記発酵は、通常静置若しくは撹拌発酵に� ��り、例えば、発酵温度25~45℃、好ましくは30 ~45℃、発酵時間3~72時間、好ましくは12~36時間 で、乳酸酸度が1.5%以上になった時点で発酵� �停止する方法により行なうことができる。

 乳タンパク質を含む原料をラクトバチルス� ��ヘルベティカス種に属する菌により発酵さ� ��て得られる発酵物中に含まれるXaa Pro Pro、 好ましくはIle Pro Pro及び/又はVal Pro Proの含 有割合は、該発酵物の凍結乾燥物100g中に換� �して10mg以上が好ましく、より好ましくは15mg 以上である。
 本発明の心臓壁肥厚抑制剤の投与量又は摂� ��量としては、1日あたり、ヒトの場合、有効 成分Xaa Pro Pro、好ましくはVal Pro Pro及び/又 はIle Pro Proを、通常10μg~10g、好ましくは1mg~5 g、さらに好ましくは3mg~1g程度含む用量であ� �、1日に何回かに分けて投与又は摂取しても� ��い。
 心臓壁肥厚抑制剤の投与又は摂取期間は、� ��与又は摂取するヒト又は動物の年齢やその� ��トや動物の心不全の危険因子に対する環境� ��を考慮して種々調整することができ、例え� ��通常1日以上、好ましくは7日~365日間とする� ��とが出来る。

 また本発明の心不全予防剤は、上述のよう� ��トリペプチドを有効成分とする。
 本発明の心不全予防剤の投与量又は摂取量� ��しては、1日あたり、ヒトの場合、有効成分 Xaa Pro Pro、好ましくはVal Pro Pro及び/又はIle  Pro Proを、通常10μg~10g、好ましくは1mg~5g、� �らに好ましくは3mg~1g程度含む用量であり、1� ��に何回かに分けて投与又は摂取しても良い� ��
 心不全予防剤の投与又は摂取期間は、投与� ��は摂取するヒト又は動物の年齢やそのヒト� ��動物の心不全の危険因子に対する環境等を� ��慮して種々調整することができ、例えば、� ��常1日以上、好ましくは7日~365日間とするこ� ��ができる。
 また本発明の心肥大予防剤は、上述のよう� ��トリペプチドを有効成分とする。本発明の� ��肥大予防剤の投与量又は摂取量、および投� ��又は摂取の期間は本発明の心不全予防剤と� ��等である。
 本発明の心臓壁肥厚抑制剤、心肥大の予防� ��並びに心不全の予防剤の投与又は摂取の方� ��は、経口的であるのが好ましい。

 本発明の心臓壁肥厚抑制剤、心肥大の予防� ��並びに心不全の予防剤を医薬として用いる� ��合の形態は、経口投与用の製剤の形態とす� ��ことができる。例えば、錠剤、丸剤、硬カ� ��セル剤、軟カプセル剤、マイクロカプセル� ��散剤、顆粒剤、液剤等が挙げられる。
 医薬として製造する場合は、例えば、適宜� ��要に応じて、製薬的に許容される担体、ア� ��ュバント、賦形剤、補形剤、防腐剤、安定� ��剤、結合剤、pH調節剤、緩衝剤、増粘剤、� �ル化剤、保存剤、抗酸化剤等を用い、一般� �認められた製剤投与に要求される単位用量� �態で製造することができる。

 本発明の食品は、本発明の心臓壁肥厚抑制� ��を有効成分として含み、例えば、心臓壁肥� ��抑制作用、心肥大の予防および心不全の予� ��といった効能を有する特定保健用食品等の� ��能性食品とすることができる。
 このような効能を得るための摂取量は、食� ��、例えば機能性食品が、日常的、連続的又� ��断続的に長期間摂取することを鑑みると、� ��トの場合、1日あたり、有効成分Xaa Pro Pro� �量として、あるいはVal Pro Pro及び/又はIle P ro Proの量として、通常10μg~10g、好ましくは1m g~5g、さらに好ましくは3mg~1g程度であり、1日� ��たりの摂取回数に応じて、食品、例えば機� ��性食品における1回あたりの摂取量を前記量 より更に低くすることも可能である。
 有効成分Xaa Pro Proを含む獣乳カゼイン加水 分解物又はその濃縮物をそのまま用いる際に は、ヒトの場合、1日あたり、該加水分解物� �はその濃縮物を通常1mg~100g、特に100mg~10g程度 摂取するのが好ましい。
 有効成分Xaa Pro Proを含む発酵物の凍結乾燥 物をそのまま用いる際には、ヒトの場合、1� �あたり、該発酵物の凍結乾燥物を乾燥量と� �て、通常1~100g、特に2~50g程度摂取するのが好 ましい。
 本発明の食品、例えば機能性食品の摂取期� ��は、特に限定されず、長期間摂取すること� ��好ましいが、上記効能を得るために、例え� ��、通常1日以上、好ましくは7日~365日間とす� ��ことができる。

 本発明の食品、例えば機能性食品は、本発� ��の有効成分Xaa Pro Pro、好ましくはVal Pro Pr o及び/又はIle Pro Proを含む心臓壁肥厚抑制剤 を含み、例えば、上述のようにして得た獣乳 カゼイン加水分解物又はその濃縮物や乳タン パク質を含む原料の発酵物をそのまま、ある いは粉末状や顆粒状にして各種食品に添加す ることができる。また必要に応じて、ラクト バチルス・ヘルベティカス以外の乳酸菌の発 酵物や、食品に用いる他の成分、例えば、糖 類、タンパク質、脂質、ビタミン、ミネラル 、フレーバー、例えば、各種炭水化物、脂質 、ビタミン類、ミネラル類、甘味料、香料、 色素、テクスチュア改善剤等又はこれらの混 合物等の添加物を添加し、栄養的バランスや 風味等を改善してもよい。
 本発明の食品、例えば機能性食品は、固形� ��、ゲル状物、液状物の何れの形態とするこ� ��ができ、例えば、乳酸菌飲料等の発酵乳製� ��、各種加工飲食品、乾燥粉末、錠剤、カプ� ��ル剤、顆粒剤等が挙げられ、更には各種飲� ��、ヨーグルト、流動食、ゼリー、キャンデ� ��、レトルト食品、錠菓、クッキー、カステ� ��、パン、ビスケット、チョコレート等とす� ��ことができる。
 以下、実施例を用いて本発明をより詳細に� ��明するが、本発明の範囲は実施例に限られ� ��い。

(実施例)
[ペプチド合成例]
 本発明の有効成分Ile Pro Pro及びVal Pro Pro� �、以下に示す有機化学合成法(Fmoc法)により� �成した。合成は島津製作所製のペプチド自� �合成装置(PSSM-8型)を用いた固相法によって行 った。
 固相担体として2-クロロトリチル(2-Chlorotrity l)タイプのポリスチレン樹脂であって、アミ� ��基をフルオレニルメチルオキシカルボニル� ��(以下Fmocと略す)で保護されたプロリンが結� ��した樹脂50mgを使用した(島津製作所社製 登 録商標SynProPep Resin)。前記アミノ酸配列に従� ��て、アミノ基がFmoc基で保護されたFmoc-Ile、F moc-Pro及びFmoc-Valを100μmolずつ、常法に従い、� ��プチド配列通り順次反応させてペプチド結� ��樹脂を得た。
 次にこのペプチド結合樹脂を1mlの反応液A(10 容量%酢酸、10容量%トリフルオロエタノール� �80容量%ジクロロメタン)に懸濁し、室温で30~6 0分間反応させてペプチドを樹脂から切離し� �後、反応液Aをガラスフィルターで濾過した� ��濾液の溶媒を減圧除去後、直ちに1mlの反応� ��B(82.5%容量トリフルオロ酢酸、3%容量エチル� ��チルスルフィド、5%容量純水、5%容量チオア ニソール、2.5%容量エタンジチオール、2%容量 チオフェノール)を加え、室温で6時間反応さ� ��て側鎖保護基を外した。これに無水エーテ� ��10mlを加えてペプチドを沈殿させ、3000回転� �5分間遠心して分離した。その沈殿を無水エ� ��テルにて数回洗浄した後、窒素ガスを吹き� ��けて乾燥した。このようにして得られた未� ��製の合成ペプチド全量を、0.1N塩酸水溶液2ml に溶解した後に、C18の逆層カラムを用いたHPL Cで、以下の条件に従って精製した。

 ポンプ:形式L6200インテリジェントポンプ( 日立製作所)、検出機:形式L4000UV検出器(日立� �作所)にて215nmの紫外部吸収を検出カラム:マ� ��クロボンダスフェアー5μC18(ウォーターズ社 製)、溶出液:A液;0.1重量%TFA水溶液、B液;0.1重� �%TFA入りアセトニトリル(B/A+B)×100(%):0→40%(60� �)、流速:1ml/分。最大吸収を示した溶出画分� �分取し、これを凍結乾燥することにより目� �とする合成ペプチドIle Pro Pro及びVal Pro Pro をそれぞれ5.7mg、6.5mg得た。精製ペプチドを� �自動タンパク質一次構造分析装置(形式PPSQ-10 、島津製作所製)により、ペプチドのN末端か� ��分析し、さらにアミノ酸分析装置(形式800シ リーズ、日本分光社製)にて分析した結果、� �計通りであることが確認できた。

[獣乳カゼイン加水分解物の調製例]
 牛乳由来カゼイン(日本NZMP社製)1gを約80℃に 調整した蒸留水99gに加えて充分に撹拌した後 、1N水酸化ナトリウム(和光純薬社製)溶液を� �加してpH7.0とし、また温度を20℃に調整して� ��質溶液を調製した。
 得られた基質溶液にアスペルギルス・オリ� ��由来であり、少なくとも金属プロテアーゼ� ��セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼI、 中性プロテアーゼII及びロイシンアミノペプ� ��ダーゼを含む市販の酵素(登録商標「スミチ ームFP」、新日本化学工業社製)を、酵素/カ� �インの重量比が1/25となるように添加して、5 0℃で14時間反応させた。続いて、110℃で10分� ��のオートクレーブを行い、酵素を失活させ� ��カゼイン酵素分解物溶液を得た。次に、得� ��れた酵素分解物溶液をスプレードライヤー� ��より乾燥し、粉末を調製した。
 得られた粉末中の含有成分の分析を行なっ� ��。タンパク質はケルダール法で測定し、ア� ��ノ酸はアミノ酸分析装置にて測定した。ま� ��、該タンパク質量からアミノ酸を引いた量� ��ペプチド量とした。更に、脂質は酸分解法� ��、灰分は直接灰化法で、水分は常圧加熱乾� ��法でそれぞれ測定した。尚、100%から各成分 を引いた残りを炭水化物量とした。その結果 、アミノ酸は35.8重量%、ペプチドは45.7重量%� �水分は6.6重量%、脂質は0.2重量%、灰分は4.1重 量%及び炭水化物は7.6重量%であった。

 <ペプチド構成アミノ酸の測定>
 上記で調製した粉末を適量の蒸留水に溶解� ��、自動ペプチド分析機(商品名PPSQ-10(株)島津 製作所製)を用いて解析し、粉末中においてN� ��端側から順に如何なるアミノ酸が位置する� ��を調べた。尚、自動ペプチド分析機は遊離� ��ミノ酸を検出しない。
 また、5残基目のアミノ酸の合計は120pmol、6� ��基目のアミノ酸の合計は100pmolであった。こ れらの結果より、前記粉末中に含まれるペプ チドのほとんどがジペプチド及びトリペプチ ドであることが判った。また、2残基目のア� �ノ酸がProであるペプチドの割合が49.5%と顕著 に上昇していた。更に3残基目のアミノ酸がPr oであるペプチドの割合も29.8%と多かった。
 従って、前記粉末には、Xaa Pro Proが多く含 まれており、これらペプチドは生体内プロテ アーゼによる酵素分解作用に対する抵抗性が 高いペプチドであると推定できる。

 <酵素分解物中に含まれるペプチドの測定 >
 上記酵素分解物の粉末について、各種の化� ��合成標準ペプチドを用いて、常法に従い、� ��粉末に含まれる表1に示すトリペプチド量を 求めた。結果を表1に示す。

 [表1]

 また、前記粉末を蒸留水で希釈溶解した� ��液中のペプチド及び遊離アミノ酸量が8.15mg/ mlであり、ペプチド量が4.57mg/mlであり、該ペ� ��チド中のXaa Pro量が514.5μgであったので、粉 末中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に 対するXaa Proの割合は6.3重量%であり、更に、 該ペプチド中のXaa Pro Pro量が116.5μgであった ので、粉末中のペプチド及び遊離アミノ酸の 合計量に対するXaa Pro Proの割合は1.4重量%で� ��ることを確認した。

[CM4発酵乳飼料の調製例]
 乳タンパク質を含む原料をCM4株により発酵� ��せて得られる発酵乳を用い、本発明の有効� ��分Xaa Pro Proを含む動物飼料を調製した。
 市販の脱脂粉乳を固形率9%(w/w)となるように 蒸留水で溶解し、オートクレーブで105℃、10� ��間、高温加熱殺菌した後、室温まで冷却し� ��CM4株スターター発酵液(菌数5×10 ⁸ 個/ml)を3%(v/w)接種して、37℃で24時間、静置状 態で発酵させCM4発酵乳を得た。
 得られたCM4発酵乳を80℃達温殺菌後、凍結� �燥により粉末を得た。得られた凍結乾燥粉� �と市販の粉末飼料(商品名「CE-2」、日本クレ ア株式会社製)を、質量比10:90で混合し、固型 飼料を作成し、CM4発酵乳飼料とした。この飼 料には、CM4発酵乳由来のVal Pro Proが34.1mg/kg� �びIle Pro Proが17.1mg/kg含まれていた。

[試験1:Val Pro Pro(VPP)の左心室壁の肥厚抑制効 果]
 トリペプチドVal Pro Pro(VPP)の左心室壁の肥� ��抑制効果について、試験を行った。
 7週齢、雄のWistar系ラット(日本エスエルシ� �株式会社)を一群9~12匹として計3群で試験を� �った。一週間馴化飼育した後、一酸化窒素� �成阻害剤であるNG-ニトロ-L-アルギニンメチ� �エステル塩酸塩(L-NAME、Sigma社製)を1g/Lの濃度 で溶解した飲水、L-NAMEとVPPをそれぞれ1g/Lと0. 3g/Lの濃度で溶解した飲水、L-NAMEとアンギオ� �ンシン変換酵素(ACE)阻害剤であるエナラプリ ルをそれぞれ1g/Lと0.5mg/Lの濃度で溶解した飲� ��を8週間自由摂取させた。ここでエナラプリ ルの投与量はVPPとACE阻害活性が同等になるよ うに設定した。
 ラットはジエチルエーテル麻酔下で放血致� ��させ、心臓を摘出後、10%中性緩衝ホルマリ� ��液にて固定した。固定した心臓から右心室� ��中隔、左心室および冠動脈を含むように心� ��の下部を水平に切断し、輪状の組織片を作� ��した。組織片をパラフィン包埋した後3.0~3.5 μmの厚さでミクロトームにより薄切を行った 。各ラットについて、2~5の切片を作製した。 薄切した切片をヘマトキシリン・エオジン染 色し、左心室壁の厚さを測定した。心室壁の 厚さの測定は、1の切片について顕微鏡下で� �均的な厚さがあると思われる複数点の厚さ� �接眼マイクロメーターにより実測し、その� �均の厚さをその切片の測定値として、統計� �理を行った。厚さの測定および評価は、各� �ンプル名を知らされない病理学者が行った� �
 得られた結果を図1に示す。L-NAMEのみを与え た群に比べ、L-NAME及びVPPを与えた群では左心 室壁の厚さが減少しており、VPPにより左心室 壁の肥厚が抑えられ、心不全の予防に有効で あることが示された。また、同等のACE阻害活 性となるように投与量を設定したエナラプリ ルでは効果が認められなかったことから、本 効果がACE阻害によらないものであることが確 認された。

[試験2:Val Pro Pro(VPP)の右心室壁の肥厚抑制効 果]
 トリペプチドVal Pro Pro(VPP)の右心室壁の肥� ��抑制効果についても確認するため、試験1と 同様に試験し、測定および評価した。
 得られた結果を図2に示す。L-NAMEのみを与え た群に比べ、L-NAME及びVPPを与えた群では右心 室壁の厚さが減少していた。したがって、VPP により右心室壁の肥厚も抑えられ、心不全の 予防に有効であることが示された。試験1と� �様、エナラプリルでは効果が認められなか� �たので、本効果がACE阻害によらないもので� �ることが確認された。

[試験3:Ile Pro Pro(IPP)の左心室壁の肥厚抑制効 果]
 トリペプチドIle Pro Pro(IPP)についても心室� ��の肥厚抑制効果を試験した。
 7週齢、雄のWistar系ラット(日本エスエルシ� �株式会社)を一群9~11匹として計3群で試験を� �った。一週間馴化飼育した後、L-NAME(Sigma社� �)を1g/Lの濃度で溶解した飲水、L-NAMEとIPPをそ れぞれ1g/Lと0.3g/Lの濃度で溶解した飲水、L-NAM Eとアンギオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤であ るエナラプリルをそれぞれ1g/Lと0.5mg/Lの濃度� ��溶解した飲水を8週間自由摂取させた。ここ でエナラプリルの投与量はIPPとACE阻害活性が 同等になるように設定した。
 ラットはジエチルエーテル麻酔下で放血致� ��させ、心臓を摘出後、10%中性緩衝ホルマリ� ��液にて固定した。固定した心臓から右心室� ��中隔、左心室および冠動脈を含むように心� ��の下部を水平に切断し、輪状の組織片を作� ��した。組織片をパラフィン包埋した後3.0~3.5 μmの厚さでミクロトームにより薄切を行った 。各ラットについて、2~5の切片を作製した。 薄切した切片をヘマトキシリン・エオジン染 色し、左心室壁の厚さを測定した。心室壁の 厚さの測定は、1の切片について顕微鏡下で� �均的な厚さがあると思われる複数点の厚さ� �接眼マイクロメーターにより実測し、その� �均の厚さをその切片の測定値として、統計� �理を行った。厚さの測定および評価は、各� �ンプル名を知らされない病理学者が行った� �
 得られた結果を図3に示す。L-NAMEのみを与え た群に比べ、L-NAME及びIPPを与えた群では左心 室壁の厚さが減少しており、IPPによっても左 心室壁の肥厚が抑えられ、心不全の予防に有 効であることが示された。また、同等のACE阻 害活性となるように投与量を設定したエナラ プリルでは効果が認められなかったことから 、本効果がACE阻害によらないものであること が確認された。

[試験4:Ile Pro Pro(IPP)の右心室壁の肥厚抑制効 果]
 トリペプチドIle Pro Pro(IPP)の右心室壁の肥� ��抑制効果についても確認するため、試験3と 同様に試験し、測定および評価した。
 7週齢、雄のWistar系ラット(日本エスエルシ� �株式会社)を一群9~12匹として計3群で試験を� �った。一週間馴化飼育した後、L-NAME(Sigma社� �)を1g/Lの濃度で溶解した飲水、L-NAMEとIPPをそ れぞれ1g/Lと0.3g/Lの濃度で溶解した飲水、L-NAM Eとアンギオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤であ るエナラプリルをそれぞれ1g/Lと0.5mg/Lの濃度� ��溶解した飲水を8週間自由摂取させた。ここ でエナラプリルの投与量はIPPとACE阻害活性が 同等になるように設定した。
 ラットはジエチルエーテル麻酔下で放血致� ��させ、心臓を摘出後、10%中性緩衝ホルマリ� ��液にて固定した。固定した心臓から右心室� ��中隔、左心室および冠動脈を含むように心� ��の下部を水平に切断し、輪状の組織片を作� ��した。組織片をパラフィン包埋した後3.0~3.5 μmの厚さでミクロトームにより薄切を行った 。各ラットについて、2~5の切片を作製した。 薄切した切片をヘマトキシリン・エオジン染 色し、右心室壁の厚さを測定した。心室壁の 厚さの測定は、1の切片について顕微鏡下で� �均的な厚さがあると思われる複数点の厚さ� �接眼マイクロメーターにより実測し、その� �均の厚さをその切片の測定値として、各個� �の心室壁の厚さを決定した。厚さの測定お� �び評価は、各サンプル名を知らされない病� �学者が行った。
 心室壁の肥厚の判定は、L-NAMEを加えずに、� ��常の水道水で飼育した同じ週齢のラット6匹 の心室壁の厚さを測定して、その平均を基準 値とした。基準値より心室壁の厚さが大きい ものを肥厚あり、同じもしくはそれ未満の厚 さのものを正常として、肥厚ありと正常のラ ットの数から尤度比検定による比較を行った 。その結果を以下の表2に示す。

 [表2]ラット右心室壁の肥厚の判定結果
**:p<0.01

 得られた結果により、IPPによっても右心� ��壁の肥厚が抑えられることが明らかになり� ��IPPも心不全の予防に有効であることが明ら� ��となった。また、同等のACE阻害活性となる� ��うに投与量を設定したエナラプリルでは効� ��が認められなかったことから、本効果がACE� ��害によらないものであることが確認された� ��

[試験5:Ile Pro Pro(IPP)の心臓中隔壁の肥厚抑制 効果]
 トリペプチドIle Pro Pro(IPP)の心臓中隔壁の� ��厚抑制効果についても確認するため、試験3 と同様に試験し測定および評価した。
 得られた結果を図4に示す。L-NAMEのみを与え た群に比べ、L-NAME及びIPPを与えた群では心臓 中隔壁の厚さが減少しており、IPPにより心臓 中隔壁の肥厚が抑えられ、心不全の予防に有 効であることが示された。また、同等のACE阻 害活性となるように投与量を設定したエナラ プリルでは効果が認められなかったことから 、本効果がACE阻害によらないものであること が確認された。

 本発明の心臓壁肥厚抑制剤は、アンジオテ� ��シン変換酵素(ACE)阻害剤に抑制作用が認め� �れない場合においても、有効性を示すこと� �ら、ACE阻害活性に因らない心肥大や心不全� �予防用及び/又は治療用の医薬、特に予防剤� ��して非常に有用である。また、有効成分が� ��品等に由来する天然に存在するトリペプチ� ��であるため、副作用の心配が少なく、且つ� ��い効力を有する医薬の提供が期待される。
 また本発明の心臓壁肥厚抑制剤を飲料や食� ��に用いるか又は添加することにより、安全� ��つ日常的に摂取しつつ、心肥大および心不� ��を予防する効果が期待できる機能性食品が� ��供される。

参考文献
1.特許第2782142号公報
2.Am J Hypertens.1997 Aug;10(8):913~20
3.J. Clin. Invest. 77, 1993-2000, 1986
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7.Am. J. Clin. Nutr. 1996, 64:767-771