Die vorliegende Erfindung betrifft neue Pyrrolidinverbindungen und ihre Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Therapie von Erkrankungen, die durch Störungen in der Induktion des Zelltodes oder der Regulation des Zellzyklusses gekennzeichnet sind.

Die exakte Kontrolle von Ort und Zeitpunkt der Zellteilung ist für das Funktionieren und die Überlebensfähigkeit aller multizellulären Organismen von entscheidender Bedeutung. So ist es nicht überraschend, daß eine Vielzahl von Erkrankungen mit einer gestörten Kontrolle der Zellteilung einhergehen.

Beispielsweise führt die unkontrollierte Zellteilung, die auch Hyperproliferation genannt wird, zu so verschiedenen Erkrankungen wie Tumorerkrankungen und Psoriasis. Während man schon seit geraumer Zeit die molekularen Mechanismen untersucht, die für das beschleunigte Wachstum von beispielsweise Tumorzellen verantwortlich sind, ist erst in den letzten Jahren die Erkenntnis gewachsen, daß zur Tumorenstehung neben der fehlgesteuerten Aktivierung von wachstumsfördernden Prozessen gleichzeitig auch wachstumshindernde Mechanismen deaktiviert werden müssen. Ein wichtiger wachstumshindernder Mechanismus ist die Apoptose.

Die Apoptose, die auch programmierter Zelltod genannt wird, ist die kontrollierte Abfolge einer Reihe von molekularen Prozessen, die zu biochemischen und morphologischen Veränderungen und schließlich zum Tod einer Zelle führen. Sie ist ein Mittel der selektiven Zelltötung, das sowohl bei der Selektion autoantigenen T-Zellen in der Milz während der Bildung des Immunsystems, als auch bei der normalen Embryonalentwicklung von entscheidender Bedeutung ist.

Entsprechend der Bedeutung der Apoptose ist eine Störung der molekularen Prozesse, die mit der Apoptose einhergehen, für die Entstehung vieler Krankheiten verantwortlich (L. Aravind et al., TIBS 1999,24,47).

Apoptose ist durch Veränderungen, wie beispielsweise eine Verkleinerung des Zellvolumens, Chromatinkondensierung, DNA-Fragmentierung, Zelloberflächen- veränderungen, die Bildung von membrangebundenen, apoptotischen Körpern und die Aktivierung der sogenannten Caspasen (E. S. Alnemri et al., Cell 1996, 87, 171 ; D. W. Nicholson et al., Nature ; C. Widmann et al., J. Biol.

Chem. 1998,273,7141 ; S. M. Srinivasula et al., I. Biol. Chem. 1998,273,10107) gekennzeichnet. Diese morphologischen und biochemischen Veränderungen können durch eine Reihe von Verfahren nachgewiesen werden, wie beispielsweise durch eine DNA-Leiter (M. Herrmann et al., supra), PARP-cleavage (C. Widmann et al., supra), Annexin-V-Bindung (C. Widmann et al., supra) und Fluoreszenz- aktivierte-Zellsortierung (FACS)-Analyse.

Die Erkenntnis, daß beispielsweise Tumore durch die Blockierung bestimmter wachstumshindernder Mechanismen entstehen, hat die Suche nach Arzneimitteln, die diese Mechanismen induzieren, beflügelt. Die Bedeutung dieses Therapieansatzes wurde auch durch Untersuchungen über die molekulare Grundlage der Wirkung bereits bekannter Chemotherapeutika untermauert, in denen gezeigt werden konnte, daß viele bekannte Chemotherapeutika, wie beispielsweise cis-Platin, Apoptose induzieren (D. L. Evans und C. Dive, Cancer Res. 1993,5321,33).

Von dem Pyrrolidinolalkaloid (+)-Preussin, das erstmals aus den Mikroorganismen Preussia sp. und Aspergillus ochraceus isoliert wurde, war bisher nur bekannt, das es eine antifungizide Wirkung auf filamentöse Pilze und auf Hefen entfaltet (US 4,847,284 ; R. E. Schwartz et al., J. Antibiot. 1988, 41,1774 ; J. H. Johnson et al., J. Antibiot. 1989,42,1184).

Im Rahmen dieser Erfindung konnte nun überraschend gezeigt werden, daß Pyrrolidinverbindungen, insbesondere das Pyrrolidinol (+)-Preussin, Apoptose induzieren und spezifisch gegen Tumorzellen wirksam sind. Während für nicht

transformierte Zellen erst eine Konzentration von 47 gM (IC50-Wert) zur Zellzytotoxizität führte, induzierte (+)-Preussin bereits bei Konzentrationen zwischen 1-6 uM (IC50-Werte) Tumorzellzytotoxizität. Somit sind Tumorzellen 9- bis 47-mal empfindlicher gegenüber den erfindungsgemäßen Pyrrolidin- verbindungen, als nicht transformierte Zellen.

Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen Pyrrolidin- verbindungen in niedrigen Konzentrationen zu einer Akkumulation von Zellen in der G-Phase des Zellzyklus führen und dadurch auch zur Behandlung von Erkrankungen geeignet sind, die durch eine Störungen in der Regulation des Zellzyklusses gekennzeichnet sind.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind demnach Pyrrolidinverbindung der allgemeinen Formel 1, in der die Substituenten unabhängig voneinander folgende Bedeutung haben : Ri H, Cl-bis C2o-Alkyl, vorzugsweise Cl-bis Cl5-Alkyl, besonders bevorzugt Cl-bis Clo-Alkyl, insbesondere Cs-Alkyl, C2- bis C0-Alkenyl, vorzugsweise C2- bis C8-Alkenyl, besonders bevorzugt C2-bis C5-Alkenyl, insbesondere C2-Alkenyl, C3-bis C10-Cycloalkyl, vorzugsweise C3-bis C6- Cycloalkyl, C3-bis Clo-Cycloalkenyl, vorzugsweise C3-bis C6- Cycloalkenyl, C1-bis C20-Alkoxycarbonyl, vorzugsweise C15-bis Alkoxycarbonyl, besonders bevorzugt C1- bis C10-Alkoxycarbonyl, insbesondere CH2-Heteroaryl,CH2-Aryl,

vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S-und/oder O-Heteroatomen, Aryl oder Heteroaryl, vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S- und/oder O-Heteroatomen, gegebenenfalls substituiert ; R2 C1- bis C20-Alkyl, vorzugsweise C5-bis C15-Alkyl, besonders bevorzugt C8-bis C12-Alkyl, insbesondere C9-Alkyl, C2-bis Clo-Alkenyl, vorzugsweise C5-bis Clo-Alkenyl, besonders bevorzugt C8-bis Clo- Alkenyl, insbesondere C9-Alkenyl, C3-bis C10-Cycloalkyl, vorzugsweise C3-bis C6-Cycloalkyl, C3-bis Clo-Cycloalkenyl, vorzugsweise C3-bis C6- Cycloalkenyl, C10-Alkenyl),vorzugsweiseCH2-(C5-bisC10-bis Alkenyl), besonders bevorzugt CH2-(C8- bis C10-Alkenyl), insbesondere bisC10-Cycloalkyl),CH2-(C9-Alkenyl),CH2-(C3- vorzugsweise CH2-(C3- bis C6-Cycloalkyl), CH2- (C3-bis Clo-Cycloalkenyl), vorzugsweise CH2- (C3-bis C6-Cycloalkenyl), (CH2) m-Aryl, (CH2) m-Heteroaryl, vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S-und/oder O-Heteroatomen, CH2-O-(C1- bis C20-Alkyl), vorzugsweise CH2-O-(C5- bis C15-Alkyl), besonders bevorzugt C12-Alkyl),insbesondereCH2-O-(C9-Alkyl),bis C20-Acyl),vorzugsweiseCH2-O-(C5-bisC15-Acyl),CH2-O-(C1-bis besonders bevorzugt CH2-O-(C8- bis C12-Acyl), insbesondere CH2-0- (C9- bisC10-Alkenyl),vorzugsweiseCH2-O-(C5-bisC10-Acyl),CH2-O-(C2 - Alkenyl), besonders bevorzugt CH2-O-(C8-bis Cl0-Alkenyl, insbesondere bisC10-Cycloalkyl),vorzugsweiseCH2-CH2-O-(C9-Alkenyl),CH2-O- (C3- C6-Cyaloalkyl),CH2-O-(C3-bisC10-Cycloalkienyl),O-(C3-bis vorzugsweise CH2-0- (C3- bis C6-Cycloalkenyl), CH2-O-(Aryl), CH2-O- (Heteroaryl), vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S-und/oder O- Heteroatomen, oder C1- bis C12-Alkoxy, vorzugsweise C5-bis Clo-Alkoxy, besonders bevorzugt C8-bis C10-alkoxy, insbesondere Cg-Alkoxy, gegebenenfalls substituiert ; m 0 bis 10, vorzugsweise 0 bis 5, besonders bevorzugt 0 bis 2, insbesondere 0 bis 1 ;

R3 H, C-bis C2o-Alkyl, vorzugsweise C-bis C15-Alkyl, besonders bevorzugt C10-Alkyl,insbesondereC2-Alkyl,C2-bisC10-Alkenyl,C1-bis vorzugsweise C2-bis C8-Alkenyl, besonders bevorzugt C2-bis C5-Alkenyl, insbesondere C2-Alkenyl, C3-bis Clo-Cycloalkyl, vorzugsweise C3-bis C6- Cycloalkyl, C3-bis Clo-Cycloalkenyl, vorzugsweise C3-bis C6- Cycloalkenyl, Cl-bis C20-Acyl, vorzugsweise C1- bis Cl5-Acyl, besonders bevorzugt C-bis Clo-Acyl, insbesondere C1Acyl, (CH2) n-Aryl oder (CH2) n-Heteroaryl, vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S-und/oder O-Heteroatomen, gegebenenfalls substituiert ; n 0 bis 10, vorzugsweise 0 bis 5, besonders bevorzugt 0 bis 2, insbesondere 0 ; R4 (CH2)-Aryl oder (CH2)-Heteroaryl, vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S-und/oder O-Heteroatomen, gegebenenfalls substituiert.

Bei der bereits bekannten Pyrrolidinverbindungen (+)-Preussin haben die Substituenten gleichzeitig die folgende Bedeutung : R1 = CH3, R2 = n-C9H19, R3= H und R4= CH2-C6H5. Weitere bekannte Verbindungen, die unter die allgemeine Formel 1 fallen und für die bisher nicht beschrieben wurde, daß sie zur Therapie von Erkrankungen, die durch Störungen in der Induktion des Zelltodes oder der Regulation des Zellzyklusses ausgelöst sind, verwendet werden können, haben Substituenten, die gleichzeitig die folgende Bedeutung haben Ri = CH3, R2 = n- Col9, R3= C1- bis C5-Alkyl oder Cl-bis C5-Acyl und R4= CH2-C6H5, R, = CH3, COOCH3 oder COOC6H5, R2 = C9-Alkenyl, R3 = H und R4 = CH2-C6H5 oder R, = CH3, COOCH3, COOCH2CH3, COOtertButyl oder COOCH2-C6H5, R2 = n-C9H19, R3 = H oder C2-Acyl und R4 = CH2-C6H5. Die Pyrrolidinverbindungen der vorliegende Erfindung umfassen demnach keine Verbindungen, die unter die Formel 1 fallen und bei denen die Substituenten die vorangehend aufgeführten Bedeutungen haben.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Pyrrolidinverbindung nach der allgemeinen Formel 1, wobei der Substituent R4 die allgemeine Formel 1 a hat und wobei die Substituenten R5, R6, R7, R8 und Rg unabhängig voneinander gleichzeitig oder verschieden die folgenden Bedeutungen haben : F, Cl, Br, H, C-bis C20-Alkyl, vorzugsweise Cl-bis C15-Alkyl, besonders bevorzugt C10-Alkyl,insbesondereC1-bisC4-Alkyl,C2-bisC10-Alkenyl,bis vorzugsweise C2-bis Cg-Alkenyl, besonders bevorzugt C2-bis C4-Alkenyl, C3-bis C3-bisC6-Cycloalkyl,C3-bisC10-Cycloalkenyl,C10-Cycloalkyl,vo rzugsweise vorzugsweise C3-bis C6-Cycloalkenyl, C-bis Cl2-Alkoxy, vorzugsweise C-bis C8-Alkoxy, besonders bevorzugt Cl-bis C3-Alkoxy, insbesondere C2-Alkoxy, Cl- bis C20-Alkoxycarbonyl, vorzugsweise Cl-bis Cic-Alkoxycarbonyl, besonders bevorzugt Cl-bis C6-Alkoxycarbonyl, insbesondere Cl-bis C3-Alkoxycarbonyl, C20-Alkylamino,vorzugsweiseC1-bisC10-Alkylamino,besondersC1- bis bevorzugt Cl-bis C6-Alkylamino, insbesondere Cl-bis C3-Alkylamino, Cl-bis Co2-Dialkylamino, vorzugsweise C1- bis C8-Dialkylamino, besonders bevorzugt Cl-bis C3-Dialkylamino, insbesondere C2-Dialkylamino, (CH2) p-Aryl oder (CH2) p-Heteroaryl, gegebenenfalls substituiert ; p 0 bis 5, vorzugsweise 0 bis 3, besonders bevorzugt 0 bis 2, insbesondere 0 bis 1.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Pyrrolidinverbindung nach der allgemeinen Formel 1, wobei der Substituent R4 die allgemeine Formel lb hat, CH2-Rio lb und wobei Rlo : 2-Furyl, 3-Furyl, 2-Thiophenyl, 3-Thiophenyl, 2-Oxazolyl, 4-Oxazolyl, 5- Oxazolyl, 1-Pyrrolyl, 2-Pyrrolyl, 3-Pyrrolyl, 1-Pyrazolyl, 3-Pyrazolyl, 4-Pyrazolyl, 5-Pyrazolyl, 1-Imidazolyl, 2-Imidazolyl, 4-Imidazolyl, 5-Imidazolyl, 1-Triazolyl, 3-Triazolyl, 5-Triazolyl, 2-Pyridinyl, 3-Pyridinyl, 4-Pyridinyl, 2-Pyridazinyl, 3- Pyridazinyl, 2-Pyrimidinyl, 4-Pyrimidinyl, 5-Pyrimidinyl, 2-Pyrazinyl oder 3- Pyrazinyl, gegebenenfalls substituiert, bedeutet.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer oder mehrerer der im vorangehenden beschriebenen Pyrrolidinverbindung als Arzneimittel. Die erfindungsgemäßen Pyrrolidinverbindungen sind insbesondere zur Therapie von Erkrankungen geeignet, die durch Störungen in der Induktion des Zelltodes oder der Regulation des Zellzyklusses gekennzeichnet sind.

Ein weiterer Gegenstand ist demnach ein Arzneimittel, das eine oder mehrere der vorangehend beschriebenen Pyrrolidinverbindungen und gegebenenfalls geeignete Hilfs-und/oder Zusatzstoffe enthält.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer oder mehrerer Pyrrolidinverbindung nach der allgemeinen Formel 1

in der die Substituenten unabhängig voneinander folgende Bedeutung haben : R H, C-bis C20-Alkyl, vorzugsweise Cl-bis C15-Alkyl, besonders bevorzugt C10-Alkyl,insbesondereC1-Alkyl,C2-bisC10-Alkenyl,C1-bis vorzugsweise C2-bis C8-Alkenyl, besonders bevorzugt C2-bis C5-Alkenyl, insbesondere C2-Alkenyl, C3-bis Clo-Cycloalkyl, vorzugsweise C3-bis C6- Cycloalkyl, C3-bis C10-Cycloalkenyl, vorzugsweise C3-bis C6- Cycloalkenyl, C,-bis C20-Alkoxycarbonyl, vorzugsweise Cl-bis C15- Alkoxycarbonyl, besonders bevorzugt C-bis CIo-Alkoxycarbonyl, insbesondere C,-Alkoxycarbonyl, CH2-Aryl, CH2-Heteroaryl, vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S-und/oder O-Heteroatomen, Aryl oder Heteroaryl, vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S- und/oder O-Heteroatomen, gegebenenfalls substituiert ; R2 H, C1- bis C20-Alkyl, vorzugsweise C5-bis C, 5-Alkyl, besonders bevorzugt C8-bis C12-Alkyl, insbesondere C9-Alkyl, C2- bis C10-Alkenyl, vorzugsweise C5-bis C10-Alkenyl, besonders bevorzugt C8-bis Clo- Alkenyl, insbesondere Cg-Alkenyl, C3-bis Clo-Cycloalkyl, vorzugsweise C3-bis C6-Cycloalkyl, C3-bis C, 0-Cycloalkenyl, vorzugsweise C3-bis C6- Cycloalkenyl, CH2-(C2- bis C10-Alkenyl), vorzugsweise CH2- (C5- bis Clo- Alkenyl), besonders bevorzugt CH2-(C8- bis C10-Alkenyl), insbesondere bisC10-Cycloalkyl),vorzugsweiseCH2-(C3-CH2-(C9-Alkenyl),CH2- (C3- bis C6-Cycloalkyl), CH2- (C3- bis Clo-Cycloalkenyl), vorzugsweise CH2- (C3-bis C6-Cycloalkenyl), (Ch2)m-Aryl, (CH2)m-Heteroaryl, vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S-und/oder O-Heteroatomen, CH2-O-(C1- bis C20-Alkyl), vorzugsweise CH2-O-(C5- bis C15-Alkyl), besonders

bevorzugt CH2-O- (C8-bis C, 2-Alkyl), insbesondere CH2-O-(C9-Alkyl), C20-Acyl),vorzugsweiseCH2-O-(C5-bisC15-Acyl),CH2-O-(C1-bis besonders bevorzugt CH2-O-(C8- bis C12-Acyl), insbesondere CH2-0- (C9- Acyl), C10-Alkenyl),vorzugsweiseCh2-O-(C5-bisC10-bis Alkenyl), besonders bevorzugt CH2-O-(C8-bis C, 0-Alkenyl, insbesondere CH2-O- (C9-Alkenyl), CH2-O- (C3- bis Clo-Cycloalkyl), vorzugsweise CH2- 0- (C3- bis C6-Cycloalkyl), CH2-0- (C3- bis CIO-Cycloalkenyl), vorzugsweise CH2-O-(C3-bis C6-Cycloalkenyl), CH2-O-(Aryl), CH2-O- (Heteroaryl), vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S-und/oder O- Heteroatomen, oder C1- bis C12-Alkoxy, vorzugsweise C5-bis Clo-Alkoxy, besonders bevorzugt C10-Alkoxy,insbesondereC9-Alkoxy,bis gegebenenfalls substituiert ; m 0 bis 10, vorzugsweise 0 bis 5, besonders bevorzugt 0 bis 2, insbesondere 0 bis 1 ; R3 H, Cl-bis C20-Alkyl, vorzugsweise Cl-bis Cl5-Alkyl, besonders bevorzugt C1-C1-bis C2-Alkyl,C2-bisC10-Alkenyl,insbesondere vorzugsweise ¬2-bis C8-Alkenyl, besonders bevorzugt C2-bis C5-Alkenyl, insbesondere C2-Alkenyl, C3-bis Cs0-Cycloalkyl, vorzugsweise C3-bis C6- Cycloalkyl, C3-bis C, 0-Cycloalkenyl, vorzugsweise C3-bis C6- Cycloalkenyl, C-bis C20-Acyl, vorzugsweise C-bis C15-Acyl, besonders bevorzugt C10-Acyl,insbesondereC1-Acyl,(CH2)n-Aryloderbis (CH2)n-Heteroaryl, vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S-und/oder O-Heteroatomen, gegebenenfalls substituiert ; n 0 bis 10, vorzugsweise 0 bis 5, besonders bevorzugt 0 bis 2, insbesondere 0 ; R4 H, C1- bis C20-Alkyl, vorzugsweise C2-bis C 5-Alkyl, besonders bevorzugt C2-bis Clo-Alkyl, insbesondere C3-bis C6-Alkyl, C2-bis Clo-Alkenyl, vorzugsweise C3-bis C8-Alkenyl, besonders bevorzugt C3-bis C5-Alkenyl, insbesondere C3-Alkenyl, C3-bis Clo-Cycloalkyl, vorzugsweise C3-bis C6- Cycloalkyl, C3-bis Clo-Cycloalkenyl, vorzugsweise C3-bis C6-

Cycloalkenyl, C-bis C20-Alkoxycarbonyl, vorzugsweise ¬2-bisC- Alkoxycarbonyl, besonders bevorzugt C2-bis CIO-Alkoxycarbonyl, insbesondere C3-bis C6-Alkoxycarbonyl, (CH2) o-Aryl oder (CH2) o- Heteroaryl, vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S-und/oder O- Heteroatomen, gegebenenfalls substituiert ; o 0 bis 10, vorzugsweise 0 bis 5, besonders bevorzugt 0 bis 3, insbesondere l, gegebenenfalls zusammen mit Hilfs-und/oder Zusatzstoffen., zur Therapie von Erkrankungen, die durch Störungen in der Induktion des Zelltodes oder der Regulation des Zellzyklusses gekennzeichnet sind.

Unter Hilfs-und Zusatzstoffen werden Substanzen verstanden, die die Löslichkeit, Stabilität, Freisetzungskinetik und/oder die biologische Halbwertzeit der Pyrrolidinverbindung verändern, wie beispielsweise DMSO oder Pufferlösungen.

Unter Störungen in der Induktion des Zelltodes werden Störungen in Mechanismen verstanden, die zum Absterben der Zelle führen. Zu diesen Mechanismen zählen vor allem Nekrose und Apoptose. Eine Störung im Sinne der vorliegenden Erfindung liegt vor allem dann vor, wenn Zellen nicht mehr dazu in der Lage sind die Apoptose einzuleiten und/oder durchzuführen.

Der Zellzyklus ist die geregelte Abfolge einer Vielzahl molekularer Prozesse, die sich beim Fortschreiten der Zelle durch den Zellzyklus auch in morphologischen Änderungen manifestieren und die schließlich in der Teilung der Zelle kulminieren. Die Zelle bewegt sich dabei durch vier auf Grund mikroskopischer Beobachtung charakterisierter Phasen, der Gl-, S-, G2 und M-Phase. Proteine, denen eine Schlüsselfunktion beim Ablauf des Zellzyklusses zukommen sind die sogenannten Cycline. In der G-Phase ist beispielsweise das Cyclin/Cyclin- abhängige-Kinase Paar Cyclin E/cdk2 (cyclin dependent kinase) aktiv. Beim

Übergang in die S-Phase wird zusätzlich Cyclin A/cdk2 aktiv. In der G2-Phase wiederum wechselt Cyclin A seinen Kinasepartner und assoziiert mit cdc2. In der späten M-Phase wird Cyclin B, das auch mit cdc2 assoziiert, aktiviert. Die Aktivität der verschiedenen Cyclin Cyclin-abhängige-Kinase Paare wird sowohl durch die Assoziation mit weiteren Proteinen, wie beispielsweise p21ClP, p27, pl6NK oder p571NK2 als auch durch Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung oder Ubiquitinilierung reguliert (J. Zwicker und R. Müller, 91 ; C. Desdouets et al., 115 ; K. Sauer und C. F. Lehner, 125 ; A. Koffund K. Polyak, 141 ; L. Meijer 351 ; alle in Progress in Cell Cycle Research Volume 1 (Herausgeber : L. Meijer, S.

Guidet und H. Y. Lim Tung) Plenum Press, New York und London 1995). Durch die Kontrolle dieser Prozesse wird eine Zelle entweder veranlaßt durch den Zellzyklus fortzuschreiten und sich zu teilen oder sie wird daran gehindert sich zu teilen und tritt dann in eine fünfte Zellzyklusphase, die Go-Phase oder Ruhephase, oder auch in die Apoptose ein.

Ein Großteil der menschlichen Körperzellen befindet sich in der Go-Phase des Zellzyklusses und nur bestimmte Zelltypen, wie beispielsweise Epithelzellen oder Blutzellen teilen sich regelmäßig. Viele Zelltypen besitzen jedoch noch das Potential sich zu teilen und tun dies unter bestimmten Bedingungen, wie beispielsweise Hautzellen nach Verletzung oder Brustdrüsenzellen während der Schwangerschaft. Unter Störung der Regulation des Zellzyklusses im Sinne der vorliegenden Erfindung werden demnach alle die Änderungen verstanden, die dazu führen, daß eine Zelle nicht die physiologisch normale Regulation des Zellzyklusses vornimmt, insbesondere das eine Zelle in den Zellzyklus eintritt oder im Zellzyklus verbleibt, obwohl sie sich in der Go-Phase befinden sollte oder in die Go-Phase eintreten sollte.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer oder mehrerer Pyrrolidinverbindung gemäß Formel 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Substituent R4 die allgemeine Formel la hat,

wobei die Substituenten R5, R6, R7, R8 und Rg unabhängig voneinander gleichzeitig oder verschieden die folgenden Bedeutungen haben : F, Cl, Br, H, C-bis C20-Alkyl, vorzugsweise C1- bis Cl5-Alkyl, besonders bevorzugt C10-Alkyl,insbesondereC1-bisC4-Alkyl,C2-bisC10-Alkenyl,bis vorzugsweise C2-bis C8-Alkenyl, besonders bevorzugt C2-bis C4-Alkenyl, C3-bis C10-Cycloalkyl, vorzugsweise C3-bis C6-Cycloalkyl, C3-bis CIO-Cycloalkenyl, vorzugsweise C3-bis C6-Cycloalkenyl, C,-bis C, 2-Alkoxy, vorzugsweise Cl-bis C8-Alkoxy, besonders bevorzugt Cl-bis C3-Alkoxy, insbesondere C2-Alkoxy, C,- bis C20-Alkoxycarbonyl, vorzugsweise C1- bis Clo-Alkoxycarbonyl, besonders bevorzugt Cl-bis C6-Alkoxycarbonyl, insbesondere Cl-bis C3-Alkoxycarbonyl, Cl-bis C20-Alkylamino, vorzugsweise C1- bis C10-Alkylamino, besonders bevorzugt C-bis C6-Alkylamino, insbesondere Cl-bis C3-Alkylamino, C-bis C12-Dialkylamino, vorzugsweise Cl-bis C8-Dialkylamino, besonders bevorzugt C1- bis C3-Dialkylamino, insbesondere C2-Dialkylamino, (CH2) p-Aryl oder (CH2) p-Heteroaryl, gegebenenfalls substituiert ; p 0 bis 5, vorzugsweise 0 bis 3, besonders bevorzugt 0 bis 2, insbesondere 0 bis l, gegebenenfalls zusammen mit Hilfs-und/oder Zusatzstoffen, zur Therapie von Erkrankungen, die durch Störungen in der Induktion des Zelltodes oder der Regulation des Zellzyklusses gekennzeichnet sind.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer oder mehrerer Pyrrolidinverbindung gemäß Formel 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Substituent R4 die allgemeine Formel lb hat, CH2-Rio lb wobei Rlo : 2-Furyl, 3-Furyl, 2-Thiophenyl, 3-Thiophenyl, 2-Oxazolyl, 4-Oxazolyl, 5- Oxazolyl, 1-Pyrrolyl, 2-Pyrrolyl, 3-Pyrrolyl, 1-Pyrazolyl, 3-Pyrazolyl, 4-Pyrazolyl, 5-Pyrazolyl, 1-Imidazolyl, 2-Imidazolyl, 4-Imidazolyl, 5-Imidazolyl, 1-Triazolyl, 3-Triazolyl, 5-Triazolyl, 2-Pyridinyl, 3-Pyridinyl, 4-Pyridinyl, 2-Pyridazinyl, 3- Pyridazinyl, 2-Pyrimidinyl, 4-Pyrimidinyl, 5-Pyrimidinyl, 2-Pyrazinyl oder 3- Pyrazinyl, gegebenenfalls substituiert, bedeutet, gegebenenfalls zusammen mit Hilfs-und/oder Zusatzstoffen, zur Therapie von Erkrankungen, die durch Störungen in der Induktion des Zelltodes oder der Regulation des Zellzyklusses gekennzeichnet sind.

Eine bevorzugte Verwendung, der im vorangehenden beschriebenen Pyrrolidin- verbindungen ist dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere der Pyrrolidin- verbindungen, gegebenenfalls zusammen mit Hilfs-und/oder Zusatzstoffen, zur Induktion von Apoptose verwendet werden.

Eine weitere bevorzugte Verwendung, der im vorangehenden beschriebenen Pyrrolidinverbindungen ist dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere der Pyrrolidinverbindungen, gegebenenfalls zusammen mit Hilfs-und/oder Zusatz- stoffen, zur Therapie von hyperproliferativen Erkrankungen verwendet werden.

Hyperproliferative Erkrankungen im Sinn der vorliegenden Erfindung sind alle Erkrankungen, die durch Zellteilung gekennzeichnet sind, daie stärker ist, als es physiologisch normal wäre.

Eine weitere bevorzugte Verwendung, der im vorangehenden beschriebenen Pyrrolidinverbindungen ist dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere der Pyrrolidinverbindungen, gegebenenfalls zusammen mit Hilfs-und/oder Zusatz- stoffen, zur Therapie von Tumoren, Autoimmunerkrankungen und Psoriasis verwendet werden.

Die Pyrrolidinverbindungen der vorliegenden Erfindung induzieren in einer Reihe von Tumorzellininen Apoptose. Insbesondere (+)-Preussin induzierte in 8 verschiedenen Tumorzellininen bei Konzentration von 1-5,8 uM (IC50-Werte) Apoptose während in nicht transformierten Kontrollzellen (NIH3T3) erst bei einer Konzentration von 47 uM (IC5o-Wert) Zellzytotoxizität beobachtet wurde. Somit sind die vorangehend beschriebenen Pyrrolidinverbindungen, insbesondere Preussin nicht nur dazu in der Lage Tumorzellen effizient abzutöten, sie zeigen auch noch eine bemerkenswerte Tumorzellspezifität. Dieser differenzielle Effekt auf Tumorzellen und"normale"Zellen ist in der Regel Voraussetzung für die erfolgreiche Verwendung eines neuen Chemotherapeutikums.

Die Pyrrolidinverbindungen bei denen der Rest R4 in Pyrrolidinverbindungen des Typs 1 die Bedeutung, die für die Substituenten la oder lb angegeben sind, hat, werden im folgenden auch durch die Formeln 2a und 2b dargestellt.

Schema 1 : Pyrrolidinverbindungen der allgemeinen Formel 2a und 2b, die aus der allgemeinen Formel I unter Hinzufugung der Substituenten la und lb abgeleitet sind.

Ein Startpunkt der Synthese der Pyrrolidinverbindungen der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise kommerziell erhältliche (S)-beziehungsweise (R)- Pyroglutaminsäure, die in 8 Stufen zu enantiomerenreinen 2,3-Dihydropyrrolen des Typs 3 umgesetzt wird (T. Bach und H. Brummerhop, Angew. Chem. 1998, 110,3577 ; T. Bach und H. Brummerhop, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1998,37, 3400 ; T. Bach und H. Brummerhop, J. Prakt. Chem. Die Umsetzung dieser 2,3-Dihydropyrrole mit aromatischen oder heteroaromatischen Aldehyden in einer [2+2]-Photocycloaddition und anschließender hydrogenolytischer Oxetanöffnung führt zu Pyrrolidinolen des Typs 4, die gegebenenfalls durch Inversion der Hydroxyfunktion (O. Mitsunobu, Synthesis 1981,1), Derivatisierung der Hydroxyfunktion und Variation des Stickstoffsubstituenten Ri zu sämtlichen Diastereomeren und Enantiomeren der Pyrrolidinverbindungen des Typs 2a und 2b umgesetzt werden können (Schema 2). Schema 2 : Retrosynthetische Betrachtung zur Synthese von Pyrrolidin- verbindungen des Typs 2a und 2b

Die 2,3-Dihydropyrrole des Typs 3 können wie folgt synthetisiert werden. Von Pyroglutaminsäure ausgehend läßt sich die Toluolsulfonyl-Verbindung 6 in 3 Stufen darstellen (E. Hardegger, H. Ott, Helv. Chim. Acta und sowohl zum Methyl-substituierten Pyrrolidinon 5a reduzieren (B. Ringdahl et al., J. Med. Chem. als auch im Sinne einer Corey-House-Reaktion mit Cupraten effizient substituieren (J. Ackermann et al. Helv. Chim. Acta 1990,73, 122 ; M. Matthes und C. Tamm, Helv. Chim. Acta dadurch wird 6 in Pyrrolidinone des Typs 5b überführt.

Das in 2 Stufen aus Pyroglutaminsäure erhältliche Pyroglutaminol 7 (S. Saijo et al. Chem. Pherm. Bull. läßt sich durch nucleophile Substitution am Sauerstoffatom ebenfalls einfach zu 5c derivatisieren. Darüber hinaus liefert der entsprechende Aldehyd 8 (G. Rassu et al., Tetrahedron Lett. in einer Wittigreaktion auch Alkenyl-substituierte Pyrrolidinone des Typs 5d (Schema 3).

R2 = C2-C2o-Alkyl, CH2- (C3-Cl O-Cycloalkyl),<BR> CH2- (C3-C o-Cycloalkenyl), CH2-Aryl, CH2-Heteroaryl CH2-O-(C1-C20-Alkyl).R2= CH2-O-(C3-C10-Cycloalkyl)m, CH2-O-(C3-C10-Cycloalkenyl), CH2-0-(Ci-C2o-Acyi).<BR> CH2-O-Aryl, CH2-O-Heteroaryl R2 = C2-C20-Alkenyl Schema 3 : Synthese substituierter Pyrrolidinone

Die substituierten Pyrrolidinone des Typs 5 lassen sich in einer 4-stufigen Sequenz in die Dihydropyrrole des Typs 3 iiberfiihren (T. Bach und H.

Brummerhop, 1999, supra).

R2 = Wasserstoff, C1-C20-Alkyl, <BR> <BR> CH2- (C3-Cl O-Cycloalkyl),<BR> <BR> <BR> <BR> CH2-(C3-Ca O-Cycloalkenyl), CH2-Aryl, CH2-O-(C1-C20-Alkyl), CH2-O-(C3-C10-Cycloalkyl), CH2-O-(C3-C10-Cycloalkenyl), <BR> <BR> CH2-0- (Cl-C20-ACyl), CH2-0-Aryl,<BR> <BR> <BR> CH2-O-Heteroaryl, C2-C20-Alkenyl Schema 4. Synthese substituierter 2, 3-Dihydropyrrole Die cyclischen Enamide des Typs 3 lassen sich in einer [2+2]-Photocycloaddition mit aromatischen Aldehyden zu diastereomeren, bicyclischen Verbindungen des Typs 9a und 9b umsetzen (T. Bach und H. Brummerhop, Angew. Chem. 1998, 110,3577 ; T. Bach und H. Brummerhop, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1998,37, 3400). Anschließende hydrogenolytische Oxetanring-Offnung (T. Bach, Tetrahedron Lett. ; T. Bach, Liebigs Ann. 1995,1045) fiihrt zu Pyrrolidinolen des Typs 10a und 10b, die durch Mitsunobu-Inversion in die diastereomeren Pyrrolidinole 10c und l Öd überführt werden (Schema 5).

ARCHO, hv).....a + N N R2 Ar N R2 Ar-''R2 COOR COOR COOR 3 9a 9b H2, Pd (OH) 2/C R2 = Wasserstoff, Ci-C20-Alkyl, (MeOH) CH2- (C3-Co-Cycloalkyl), CH2-(C3-C10-Cycloalkenyl), HO,(C3-C10-Cycloalkenyl), HO, HO CH2-Aryl, CH2-0- (C-C2o-Alkyl),' CH2-0- (C3-Clo-Cycloalkyl), Ar,,,,,,,, Ar CH2-0- (C3-Co-Cycloalkenyl), N R2 N R2 CH2-0- (Cl-C20-Acyl), CH2-0-Aryl, COOR COOR CH2-O-Heteroaryl, C2-C20-Alkenyl 10a 10b 1. PPh3, DEAD, PhCOOH Ar = Aryl, Heteroaryl, 2. K2CO3, (MeOH), gegebenenfalls substituiert HO HO, Ar ArlR2 NUA R2 _N_-Rz COOR COOR lOc 10d Schema 5 : Synthese von Pyrrolidinolen des Typs 10 Durch Wahl des Startmaterials ((R)-oder (S)-Pyroglutaminsäure) sind beide Enantiomere sämtlicher Diastereomere des Pyrrolidingerüstes der Verbindungsklasse 1 zugänglich.

Weitere Modifikation gelingt durch O-Alkylierung und O-Acylierung der Verbindungen des Typs 10. Anschließendes Entschützen des Stickstoffatoms und Substitution mit Halogenverbindungen liefert Pyrrolidine des Typs 2a und 2b (Schema 6).

Alkyl = tBu : HO R30 1 TFA R30 HO R30 1. TFA R30 N R2 A N RZ R4 N R2 COOR COOR R, COOR COOR Ri 10 11 2b Ri = Wasserstoff, R2 = Wasserstoff, C1-C20-Alkyl, R3 = Wasserstoff, Cl-C20-Alkyl, C2-Clo-Alkenyl, CH2- (C3-Clo-Cycloalkyl), Cl-C20-Alkyl,<BR> <BR> C2-C10-Alkenyl,C3-C10-Cycloalkyl,CH2#(C3-C10-Cycloalkenyl), <BR> <BR> C3-Clo-Cycloalkenyl, CH2-Aryi, CH2-0- (Cl-C20-Alkyl), C3-Clo-Cycloalkyl, C1-C20-Alkoxycarbonyl, C3-C10-Cycloalkenyl, CH2-Aryl,C1-C20Acyl,Aryl,CH2-O-(C3-C10-Cycloalkenyl), Aryl,Heteroaryl, CH2-O-(C1-C20-Acyl), CH2-O-Ary, Heteroaryl, CH2-Aryl, gegebenenfalls substituiert CH2-O-Heteroaryl, CH2-Heteroaryl, substitulertC2-C20-Alkenylgegebenenfalls <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Ar = Alyl, Heteroaryl, R4 = CH2-Aryl, CH2-(2-Furyl), CH2-(3-Furyl), CH2-(2-Thiophenyl),<BR> <BR> gegebenenfalls substituiert CH2- (3-Thiophenyl), CH2- (2-Oxazolyl), CH2- (4- Oxazolyl),<BR> <BR> <BR> CH2- (5-Oxazolyl), CH2- (1-Pyrrolyl), CH2- (2-Pyrrolyl),<BR> <BR> CH2- (3-Pyrrolyl), CH2- (1-Pyrazolyl), CH2- (3-Pyrazolyl),<BR> <BR> CH2- (4-Pyrazolyl), CH2- (5-Pyrazolyl), CH2- (1-lmidazolyl), CH2-(2-Imidazolyl),CH2-(4-Imidazlyl), CH2- (5-Imidazolyl), CH2- (1-Triazolyl), CH2- (3-Triazolyl),<BR> <BR> CH2- (5-Triazolyl), CH2- (2-Pyridinyl), CH2- (3-Pyridinyl),<BR> <BR> CH2- (4-Pyridinyl), CH2- (2-Pyridazinyl), CH2- (3-Pyridazinyl), CH2-(2-Pyrimidinyl),CH2-(4-Pyrimidinyl), CH2- (5-Pyrimidinyl), CH2- (2-Pyrazinyl), CH2- (3-Pyrazinyl), gegebenenfalls substituiert ; Schema 6 : Synthese von Pyrrolidinen des Typs 2b Ein weiterer Startpunkt der Synthese der Pyrrolidinverbindungen der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise eine a-Aminosäure (M. Overhand und S. M. Hecht, J. Org. Chem. Dabei stehen neben den natürlichen Aminosäuren auch die entsprechenden Enantiomere und nicht-natürliche Aminosäuren, die leicht durch eine Vielzahl synthetischer Methoden (R. M. Williams, Synthesis of Optically Active a-Amino Acids, Pergamon Press, Oxford 1989 ; H.-J. Altenbach in Organic Synthesis Highlights, Herausgeber : J. Mulzer, H.-J. Altenbach, M.

Braun, K. Krohn, VCH, Weinheim 1991,300), wie der Schöllkopf'schen Bislactimethersynthese (U. Schöllkopf, Top. Curr. Chem. der asymmetrische Strecker-Synthese (M. S. Iyer et al., J. Am. Chem. Soc. 1996,118,

4910 ; M. S. Sigman und E. N. Jacobsen, J. Am. Chem. Soc. etc. zugänglich sind.

Zunächst wird die Aminosäure 12 mit einer Boc-Schutzgruppe versehen und in das entsprechende Weinreb-Amid 13 (S. Nahm und S. M. Weinreb, Tetrahedron Lett. 1981,22,3815 ; J.-A. Fehrentz und B. Castro, Synthesis 1983,676) überführt (Schema 7).

Schema 7 : Synthese des Weinreb-Amids des Typs 13 Umsetzung der Amide des Typs 13 mit Alkinyllithiumverbindungen 14, die leicht durch Lithiierung der Alkine erhältlich sind (R. H. Boutin, H. Rapoport, J. Org.

Chem. liefert Ketone des Typs 15, die durch Quecksilber- (II)- acetat in Nitrometan (R. C. Larock und L. W. Harrison, J. Am. Chem. Soc. 1984, 106,4218 ; E. Harding und T. H. Tiner in Comprehensive Organic Synthesis (Herausgeber : B. M. Trost), Pergamon, New York 1990, Vol. 6,363) eine 5-endo- dig Cyclisierung eingehen und Pyrrolidinone des Typs 16 liefern (Schema 8).

Schema 8 : Synthese der Pyrrolidinone des Typs 16 Die Verbindungen des Typs 16 können diastereoselektiv zu den Pyrrolidinolen des Typs 17a reduziert werden und durch Mitsunobu-Inversion (O. Mitsunobu, supra) in Pyrrolidinole des Typs 17b transformiert werden.

Verbindungen des Typs 17a, bei denen R2 = OCH3 (17c) ist, lassen sich darüber hinaus durch nucleophile Substitution (H. de Koning, W. N. Speckamp in Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), 4te Aufl., Herausgeber : G.

Helmchen, R. W. Hoffinann, J. Mulzer, E. Schaumann), Thieme, Stuttgart 1995, Vol. E 21,1952) in Pyrrolidinole des Typs 17d und durch Mitsunobu-Inversion in 17e transformieren. Damit sind durch Wahl des Startmaterials alle Enantiomere sämtlicher Diastereomere des Grundgerüstes 1 zugänglich (Schema 9).

Schema 9 : Synthese der Pyrrolidinole des Typs 17 Weitere Modifikation gelingt durch O-Alkylierung und O-Acylierung der Verbindungen des Typs 17. Anschließendes Entschützen des Stickstoffatoms und Substitution mit Halogenverbindungen RI-Hal liefert eine große Anzahl Pyrrolidine des Typs 1 (Schema 10).

Wasserstoff,R2=Wasserstoff,R3=Wasserstoff,R1= C1-C20-Alkyl,C1-C20-Alkyl,C1-C10-Alkyl,-O-(C1-C20-Alkyl), C2-C10-Alkenyl,C2-C10-Alkenyl,C3-C10-Cycloalkyl, C3-Clo-Cycloalkyl, C3-Clo-Cycloalkenyl, C3-Clo-Cycloalkyl, Aryl,C3-C10-Cycloalkenyl,C3-C10-Cycloalkenyl,C2-C20-Alkenyl, CH2-Aryl,C1-C20Acyl,Aryl,C1-C20-Alkoxycarbonyl,Heteroaryl, CH2-Aryl, CH2-Heteroaryl, CH2-Heteroaryl, Heteroaryl, CH2-Aryl, Aryl, Heteroaryl, gegebenenfalls substituiert CH2-Heteroaryl, gegebenenfalls substituiert gegebenenfalls substituiert R4 = Wasserstoff, C3-C10-Cycloalkyl,C2-C10-Alkenyl, C3-C10-Cycloalkenyl,C3-C10-Cycloalkenyl,(CH2)n-Aryl, (CH2)n-Heteroaryl, Aryl, Heteroaryl, gegebenenfalls substituiert 0bis10n= Schema 10 : Synthese der Verbindungsklasse 1 Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung lediglich näher beschreiben ohne sie zu beschränken.

Die Beschreibung, Ansprüche und Zusammenfassung der Prioritätsanmeldung DE 199 36 789.2, die am 9. August 1999 eingereicht wurde, werden hierin durch Bezugnahme aufgenommen. Alle Publikationen, auf die in dieser Anmeldung verwiesen wird, werden hierin ebenfalls durch Bezugnahme aufgenommen.

Beispiele 1. Herstellung von svnthetischem (+)-Preussin Die Synthese von (+)-Preussin erfolgte gemäß der von T. Bach und H.

Brummerhop beschriebenen Synthese (Angew. Chem. ; Angew.

Chem. Int. Ed. Engl. Ausgehend von kommerziell erhältlichem (S)-Pyroglutaminol 19 (siehe Schema 11) wurde nach Tosylierung des primären Alkohols zum Tosylat 20 die n-Nonylseitenkette durch eine nucleophile Susbstitution mit einem Di-n-octylcuprat aufgebaut. Die endocyclische Doppelbindung wurde nach Acylierung des Pyrrolidinons 21 mit Chlorameisensäuremethylester gebildet. Hierzu wurde zunächst das Pyrrolidinon 22 mit LiBEt3H zum Halbaminal reduziert, das nicht isoliert, sondern direkt mit Dimethoxypropanon in Gegenwart von Camphersulfonsäure zum N, O-Acetal 23 umacetalisiert wurde. Dieses wurde nach einer Eliminierungsmethode mit EtNiPr2/TMSOTf in das Dihydropyrrol 24 überführt.

Die Paterno-Büchi-Reaktion des Dihydopyrols 24 mit Benzaldehyd verlief glatt und lieferte drei Produkte. Bei einem der Produkte handelte es sich den NMR- Spektren zufolge um ein 2-Aminooxetan, das wegen seiner Säurelabilität nicht isoliert werden konnte. Die beiden anderen Produkte waren zueinander diastereomere 3-Amino-oxetane und wurden in 53% und 12% Ausbeute erhalten.

Gemäß NOESY-NMR-Studien sind diese beiden Produkte (25a und 25b) am Oxetanring all-cis-substituiert. Die Synthese von (+)-Preussin wurde vervollständigt indem das Hauptdiastereomer 25a durch Hydrogenolyse in das Pyrrolidinol 26 überführt wurde. Die Reduktion der Methoxycarbonylgruppe mit LiAlH4 zur Methylgruppe verlief glatt und (+)-Preussin 27 konnte als hellgelbes Öl isoliert werden. Die Gesamtausbeute über neun Stufen betrug 10%. Die Reinheit der als hellgelbes Wachs erhaltenen Verbindung war > 97% (GC). Die analytischen Daten stimmen mit den für den Naturstoff berichten Daten (J. H.

Johnson et al., J. Antibiot. überein (Massenspektrum, H- NOESY,Drehwert).NMR,13C-NMR, Schema 11 : Synthese des (+)-Preussins : a) TsCl, Pyridin, 25°C, 5 h ; b) (2/1),-78°C#25°C,16h;c)BuLi,THF/HexanLi2Cu(nC8H17)2CN,THF/ Hexan (4/1),-78°C # 0°C, 1 h ; ClCOOMe,-78°C # 0°C, 3 h ; d) LiBEt3H, THF,-78°C i 0°C, 3 h ; e) Me2C (OMe) 2, CSA, CH2CI2, 0°C 0, 5 h ; J) TMSOTf, EtNiPr2, CH2Cl2, 0°C, 0,5 h, g) H2, Pd (OH) 2/C, MeOH, 25°C, 3, 5 h ; h) LiAlH4, THF, 66°C, 2,5 h.-CSA = Camphersulfonsäure, Tf = Trifluormethansulfonyl, TMS = Trimethylsilyl,Trimethylsilyl,Ts = Toluol-4-sulfonyl 2. Antitumorale Wirksamkeit von Pyrolidinolderivaten Materialien MeerrettichPeroxidase-konjugierterZiegeanti-Maus-IgG,Fötale sKälberserum, Aprotinin, Leupeptin, Camptothecin (Cam) wurden von Sigma (Deisenhofen,

Deutschland) erhalten. Monoklonaler Maus anti-humaner p27P Antikörper und Caspase 3 (CPP32) Antikörper wurden von Transduction Laboratories, Dianova (Hamburg, Deutschland), Monoklonaler Maus anti-Actin Antikörper wurde von Boehringer Mannheim (Mannheim, Deutschland) und E2F-1 und Cyclin A Antikörper von Santa Cruz (Heidelberg, Deutschland) erhalten. Die ECL Immunoblotanalysereagenzien wurden von Amersham Life Science, Inc.

(Braunschweig, Deutschland) und die BIOMAX Filme von Kodak (N. Y., USA) erhalten. Das Annexin-V Kit wurde von Nexins Research B. V (Holland), ATP von Pharmacia Biotech (USA), der PARP monoklonale Maus Antikörper von Pharmingen, Signal Transduction, Dianova (Hamburg, Deutschland) und der Caspaseinhibitor zVAD-fmk von Biomol (Hamburg, Deutschland) erhalten.

Als Kontrollsubstanz wurde Flavopiridol (FP) (H. H. Sedlacek et al., Int. J. Oncol. verwendet. Cdk2 Kinase wurde in mit Baculovirus infizierten SF9- Insektenzellen überexprimiert und aufgereinigt.

Zellen HeLa, MeWo, MCF-7 (mit 0,9 mg/l Insulin), NIH3T3 und A549 wurden in DMEM, PC-3, LNCaP, DU-145 und HL60 in RPMI 1640 Medium kultiviert, je mit 10 % Fetal-bovine-Serum, 100 units/ml Penecillin und 100 ug/ml Streptomycin.

Behandlung von Zellen mit Chemotherapeutica (+)-Preussin, Cam, Anisomycin und FP wurden in DMSO (Ethanol) gelöst und in verschiedenen Konzentrationen in dem Zellkulturmedium verdünnt. Die Konzentrationen an DMSO (Ethanol) im Medium betrug immer weniger als 1% (v/v). Die Zellen wurden für verschiedene Zeiten bei 37° C inkubiert.

Behandlung von Zellen mit dem Caspaseinhibitor zVAD-fmk Die Zellen wurden 1 Stunde in Vollmedium mit dem Inhibitor (zVAD-fmk ; 50 pLM Endkonzentration) vorinkubiert und dann mit den Chemotherapeutika, wie oben beschrieben, behandelt.

Präparation von Zellextrakten Die Zellen von 10 cm Platten wurden geerntet und zweimal in Phosphatsalzpuffer (PBS) gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Pellets in einem gleichen Volumen Puffer mit 20 mM HEPES, pH 7,8 ; 450 mM NaCl ; 0,2 mM EDTA ; 25% Glycerol ; 5 pM DTT (Dithiothreitol), 5 uM PMSF ; 0,5 ug/ml Leupeptin und 5 pg/ml Aprotinin resuspendiert. Die Zellen wurden für 5 min. auf Eis inkubiert und dann durch dreimaliges Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Auftauen in einem 30°C Wasserbad lysiert. Die Lysate wurden bei 13000 x g für 10 min. bei 4° C zentrifugiert und in ein neues Eppendorfgefaß überführt. Die Proteinkonzentration bestimmt und die Extrakte bei-80°C wurden aufgehoben.

Westernblot-Analyse Lösliche Proteine wurden auf eine SDS-Polyacrylamid Gel aufgetragen und durch Elektrophorese aufgetrennt. Die Proteine wurden anschließend durch Elektrophorese auf eine Nitrocellulose geblottet und durch Immunoblotanalyse mit den jeweils spezifischen Antikörpern identifiziert. Die Nitrocellulosemembran wurde für 2 Stunden mit den Antikörpern (1 : 1000 verdünnt in 1 x PBS mit 5% Milchpulver) inkubiert, 5x mit 1 x PBS gewaschen und durch Meerrettichperoxidase-konjugierte Zweitantikörper IgG (1 : 2000 verdünnt) und das Enhanced Chemiluminescence (ECL) Immunoblot-System visualisiert.

FACS-Analysen Die Zellen wurden von einer 10 cm Platte geerntet, zweimal mit PBS gewaschen, mit 75% Ethanol für l Stunde fixiert und mit Hoechst 33258 gefärbt. Die Durchflußzytometrieanalysen wurden an einem FACStarPlus (Becton Dickenson)

durchgeführt. Die Zellzyklus DNA-Verteilung wurde durch das Cell-fit Program oder manuelle Einteilung bestimmt.

Fluoreszenz Mikroskopie Zellen wurden mit Hoechst 33342 (10 pM) und Propidiumiodid (10 uM) für 10 min. gefärbt und unter dem Floureszenzmikroskop bei einer Wellenlänge von 360 nm analysiert. Da Hoechst 33342 alle Kerne und Propidiumiodid Kerne mit zerstörter Plasmamembran färbt, konnten Kerne von lebenden, nekrotischen und apoptotischen Zellen als blaue runde, rosa runde und fragmentierte blaue oder rosane Kerne analysiert werden.

Zvtotoxizitätsassavs Die Zellen wurden in 96er Mikrotiterplatten ausplattiert (20.000 Zellen/well). 16 Stunden später wurden serielle Verdünnungen von (+)-Preussin auf die Zellen gegeben und inkubiert. Nach 24 Stunden (oder anderen im Text erwähnten Zeitspannen) wurden die Zellen gewaschen und mit Medium versorgt. Nach 72 Stunden wurden die Zellen mit Krystallviolett gefärbt. Der verbleibende Farbstoff konnte bei einer Wellenlänge von 540 nM an einem ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) Lesegerät gemessen werden.

Wells, die nur Zellen und Medium beinhalten, wurden als Negativkontrolle benutzt. Jedes Experiment wurde pro Zelllinie mit vier gleichbehandelten Wells durchgeführt und dieses Experiment wurde dreimal unabhängig voneinander wiederholt. Die Überlebensrate der Zellen wurde wie folgt berechnet : (Absorption der mit Chemotherapeutika behandelten Zellen)/ (Absorption der unbehandelten Zellen) x 100 Der IC50-Wert wurde als Konzentration an Chemotherapeutika definiert, die in jedem Test benötigt wurde, um eine 50% ige Reduktion der Absorbtion zu erreichen. Der IC50-Wert wurde graphisch durch eine"dose-response"Kurve bestimmt.

Annexin-V-Färbung Die zu untersuchende Zelllinie wurde ausplattiert und mit FP oder (+)-Preussin in verschiedenen Konzentrationen behandlet. Die Zellen wurden mit dem Überstand geerntet und zweimal in PBS gewaschen. Nach Aufnahme des Pellets in 440 ul Annexin-V Bindungspuffer wurden 10 ul Annexin FITC (1 : 10 verdünnt mit Annexin-Bindungspuffer) und 50 ul Propidiumiodid (100 pg/ml} zugegeben und 10 min. auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden sofort im FACStar gemessen um unspezifische Bindungen zu vermeiden.

Isolierung von genomischer DNA (DNA-Leiter) HL-60 Zellen wurden in RPMI-Medium kultiviert und mit FP (Kontrolle) oder (+)-Preussin in verschiedenen Konzentrationen behandelt. Alle Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und das Pellet in 200 ul eiskaltem Lysispuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5,10 mM EDTA, 0,2% Triton X-100) aufgenommen. Nach der Extraktion der DNA mit Phenol und Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) wurde die wäßrige Lösung mit Ethanol präzipitiert. Das Pellet wurde in 20 ul TE Puffer (10 mM Tris-HCI, pH 7,5,1 mM EDTA) aufgenommen, 5-10 ul auf ein 2% iges Agarosegel aufgetragen und durch Ethidiumbromid und UV- Bestrahlung visualisiert.

35S Methionin Einbau Eine radioaktive Markierung der Proteine wurde in Zellen durchgeführt, die vorher mit definierten Konzentrationen an (+)-Preussin, Anisomycin und FP behandelt worden sind. Der Einbau wurde in L-Methionin freiem RPMI 1640 Medium mit 7,5 RCi [35S]-Methionin pro 200 ul Medium für die letzten zwei Stunden der Chemotherapeutikainduktion durchgeführt. Die Zellen wurden in methioninfreiem Medium gewaschen und, wie vorher unter Proteinextraktion beschrieben, aufgearbeitet. Trichloressigsäure wurde den Proben zugefügt (10% Endkonzentration) und für 10 min. auf Eis inkubiert, um die Proteine zu

präzipitieren. Nach Zentrifugation wurden die Pellets in 50 ul 0,1 M NaOH resuspendiert und mit 3 ml Scintillationsmix versehen. Die Proben wurden am Scintillationsgerät (Beckman, USA) gemessen.

Kinaseassa 2 u der in SF9 überexprimierten und aufgreinigten cdk2 Kinase wurden mit 18 gl Kinasepuffer (10 mM MnCl2,10 mM MgCl2,10 mM KCl, 20 mM HEPES pH 7,3, Leupeptin, Aprotinin, ß-Glycerophosphat, PMSF, DTT und NaF) gemixt und mit 1,25 nl Histon H1 (Sigma) und 1,25 mM ATP (Sigma) versetzt. Bei einer Vorinkubation wurde nun das Chemotherapeutikum (FP, Cam, Anisomycin oder (+)-Preussin) hinzugegeben und bei 37°C für 30 min. inkubiert. Nach dieser Vorinkubation wurden 0,25 p132P-(-ATP (10 aCi/nl) dem Gemisch beigefugt und dieses 30 min. bei 30°C inkubiert. Die Reaktion wurde mit lOx SDS Probenpuffer gestoppt und auf ein 12% SDS Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach der Gelelektrohorese wurde das Gel getrocknet und die radioaktive Phosphorylierung des Histon Hl durch einen BIOMAX Film (Kodak, N. Y., USA) sichtbar gemacht.

(+)-Preussin induziert Apoptose in HL-60 Zellen Die molekularen Mechanismen der Apoptose beinhalten Chromatinkondensierung, DNA Fragmentierung, Caspaseaktivierung und Annexin-V Bindung, die hier näher untersucht wurden.

Die Behandlung von Zellen mit 5 iM (+)-Preussin führt zu einer starken Induktion von Apoptose. Dies wurde durch Propidiumiodid-Hoechst Färbung, Annexin-V Färbung und eine sehr charakteristische DNA Leiter bewiesen. (+)-Preus PrI/Annexin Facs DNA-Caspase Protein- sin [pM] Hoechst-V (sub Leiter Aktivierung expression Gi)/Parp Spaltung 0 3% 9% 12%-p27 CyclinA/E2F-l + 33%33%-#/-p27#0.526% CyclinA/E2F-1 55%37%++/#p27+2.552% CyclinA/E2F-1- 54%n.d.+++/+n.d.575% 10 90%n.d.++/++n.d.60%

Tabelle 1 : Induktion von Apoptose durch (+)-Preussin in HL-60-Zellen Propidiumiodid-Hoechst Färbung Etwa 75% der HL-60 Zellen zeigen nach 18 Stunden einen kondensierten Zellkern. Allgemein zeigen Zellen eine punktierte Färbung charakteristisch für Chromatinkondensierung, die während der Apoptose eintritt. Die Induktion von Apoptose in (+)-Preussin behandelten HL-60 Zellen variiert zwischen 27% (500 nM) und 45% (2,5 pM) (Tabelle 1).

Annexin-V-Färbung Phosphatidylserin ist ein Oberflächenmarker, der nur während der Apoptose an der Oberfläche präsentiert wird und durch Annexin-V zu detektieren ist. Die Zellen werden mit FITC gekoppeltem Annexin-V behandelt und am FACS-Gerät gemessen. Die Ergebnisse korrelieren mit der Propidiumiodid-Hoechst Färbung (Tabelle 1).

DNA-Leiter Da eine DNA-Leiter ein charakteristisches Merkmal für Apoptose ist, wurde DNA von (+)-Preussin behandelten Zellen isoliert. Die DNA wurde auf einem Agarosegel aufgetragen und detektiert Als Marker wurde eine 100 bp Leiter benutzt Es wurde DNA von Zellen aufgetragen, die mit verschiedenen (+)- Preussin Konzentrationen behandelt wurden (0,5-5 ßM). Eine charakteristische DNA Leiter ist Zellen zu erkennen, die mit 2,5 und 5 uM behandelt wurden.

Bei (+)-Preussin induzierter Apoptose wird Caspase 3 aktiviert und PARP gespalten Da Caspase 3 ein Protein ist, welches für viele charakteristischen Merkmale der Apoptose wichtig ist, wurde die Aktivierung von Caspase 3 und der Abbau von PARP, einem wichtigen Reparaturenzym und Substrat von Caspase 3, durch Westernblotanalyse verfolgt (siehe Tabelle 1). Es wurde sowohl eine Aktivierung von Caspase 3, als auch das 85 kDa große, charakteristische Spaltprodukt von PARP in den Proteinextrakten detektiert. Während die Behandlung von HL-60 Zellen mit 5 und 10 uM (+)-Preussin war das ungespaltene 116 kDa PARP Protein nicht mehr detektierbar, was mit den Beobachtungen aus der Propidiumiodid-Hoechstfarbung korreliert.

Zytotoxizität von (+)-Preussin in verschiedenen humanen Zelllinien (+)-Preussin induziert Apoptose in HL-60 Zellen. Es wurde deshalb getestet, ob (+)-Preussin auch in anderen Tumorzelllinien Effekte zeigt. Alle schnell- wachsenden Zellen sollten für einen Effekt von (+)-Preussin empfänglich sein, da (+)-Preussin den Zellzyklus beeinflußt (siehe Zellzyklusanalysen). Drei verschiedene Prostatakarzinomzellinien (PC-3, DU-145 und LNCaP) wurden getestet und nach einer Inkubation der Zellen für 48 Stunden mit (+)-Preussin variierten die IC50-Werte zwischen 3 und 5,8 uM (Tabelle 2). Als Kontrolle wurde die zwar immortalisierte aber nicht transformierte Zelllinie NIH3T3 verwendet.

Der ICso-Wert liegt für diese Zelllinie bei 47 uM (siehe Tabelle 2) und damit 9-

bis 47-mal höher als in den getesteten Tumorzelllinien. Die Induktion von Apoptose ist p53 unabhängig, da die Zelllinien PC-3 und DU-145 p53 negativ sind. In den Lungen und Brustkarzinomzelllinien A549 und MCF-7 wurden ähnliche Beobachtungen gemacht (Tabelle 2). Zelllinie HL60 HeLa A549 PC-3 DU-145 LnCaP MeWo MCF-7 NIH3T3 µM2,5µM5,5µM5,8µM3,7µM3,0µM4,6µM4,1µM47µMIC50-1,4 Werte Tabelle2 : IC50-Werte von (+)-Preussin-behandelten Zelllinien Zellzyklusanalysen (+)-Preussin löst in niedrigen Konzentrationen (0,2-2 µM) eine Zellzyklusblockierung in Gl aus. Die Zellzyklusphase wurde mit FACS-Analysen bestimmt. Die Anzahl der Zellen, die sich in der GI-Phase befinden, ist in allen getesteten Tumorzellinien höher als in der Kontrolle.

Analyse von zellzvklusspezifischen Proteien Es wurden Westernblotanalysen verschiedener zellzyklusrelevanter Proteine in (+)-Preussin behandelten Zellextrakten durchgeführt (Tabelle 1). Da nach FACS- Analysen der Anteil an Zellen in der Gl-Phase erhöht war, wurden Glspezifische Protein untersucht. Die Westernblotaanalyse zeigte eine Erhöhung der Proteinexpression des Gl spezifischen Zellzyklusinhibitors p27KIP und eine schwache Expression von S-Phase spezifischen Proteinen wie Cyclin A und dem Transkriptionsfaktor E2F-1. Das Expressionsmuster dieser Proteine unterstützt die These, daß (+)-Preussin auch ein spezifischer Zellzyklusinhibitor ist.

Kinaseassays Da (+)-Preussin Zellen in G, blockiert, wurden Kinaseassays mit der Gt spezifischen Kinase cdk2 durchgeführt. Im Vergleich mit dem cdk2 Kinaseinhbitor FP war nach Zugabe von (+)-Preussin qualitativ eine deutliche Inhibierung der Kinaseaktivität zu erkennen. Es wurden auch kompetetive Studien durchgeführt, bei denen zu erkennen war, daß (+)-Preussin ein schwächerer kompetitiver Inhibitor als FP ist. Die Analyse der Kinaseaktivität deutet daraufhin, daß (+)-Preussin ein selektiver cdk2 Kinaseinhibitor ist.