Die Diagnose der Alzheimerschen Erkrankung ist mit klinischen Mitteln sowie den zur Verfügung stehenden paraklinischen und apparativ-technischen Methoden allein nicht mit letzter Si- cherheit zu stellen und bedarf daher stets der autoptischen Verifizierung. Insbesondere in Frühstadien der Erkrankung ist die differentialdiagnostische Abgrenzung anderer Demenzursa- chen oft schwierig. Gerade in diesen frühen Phasen der Erkran- kung ist jedoch eine sichere Stellung der Diagnose aus zweier- lei Gründen wichtig. Sie erlaubt zum einen die diagnostische Abgrenzung potentiell behandelbarer Demenzformen und kann die- se damit einer effektiven Therapie zuführen, zum anderen ist sie Voraussetzung für jegliche Form der therapeutischen Inter- vention in den Prozess der Neurodegeneration der Alzheimer- schen Erkrankung, der nur in diesen Frühstadien erfolgreich sein kann. Eine derartige diagnostische Sicherheit kann nur durch Biomarker der Alzheimerschen Erkrankung, d. h. durch leicht zu bestimmende biologische Veränderungen mit einer für die Erkrankung hinreichenden Sensitivität und Spezifität, ge- leistet werden.

Biomarker der Alzheimerschen Erkrankung haben damit zum einen diagnostischen Wert, und sollen hierbei insbesondere helfen, Risikogruppen bzw. Patienten in präklinischen Stadien und frü- hen klinischen Stadien sicher zu identifizieren. Zum anderen dienen Biomarker der Verlaufskontrolle und damit der Prognos- tik sowie der Kontrolle der Ansprechbarkeit auf therapeutische Interventionen. Ideale Biomarker sollten bestimmten theoreti- schen und praktischen Anforderungen genügen. Hierzu gehören insbesondere eine hohe Spezifität und Sensitivität, die Fähig- keit, präklinische Stadien zu identifizieren, sowie ein hoher positiver und negativer Vorhersagewert. Die Bestimmung der Biomarker sollte möglichst nicht-invasiv sein und den Patien- ten nicht belasten oder ängstigen. Die Analysen sollten preis- wert sein und sich einfach, möglichst unter Bedingungen der Hausarztpraxis, durchführen lassen. Leider genügt keiner der derzeit bekannten Biomarker der Alzheimerschen Erkrankung den o. g. Anforderungen. Insbesondere aufgrund der geringen Sensi- tivität und Spezifität der bekannten Biomarker sind diese als diagnostisches Hilfsmittel ungeeignet. Andere diagnostische Untersuchungen mit höherer Sensitivität und Spezifität erfor- dern aufwendige technische Voraussetzungen und sind daher nicht zum dezentralen Einsatz an einer größeren Patientengrup- pe geeignet.

Somit liegt der Erfindung im wesentlichen das technische Problem zugrunde, ein einfaches Verfahren zur Diagnose der Alzheimer- schen Erkrankung bereitzustellen, das die Diagnose der Alzhei- merschen Erkrankung, die Erfassung von präklinischen Erkran- kungsphasen sowie die differentialdiagnostische Abgrenzung der Alzheimerschen Erkrankung gegen andere Demenzen mit ausrei- chender Sensitivität und Spezifität erlaubt.

Die Lösung dieses technischen Problems wurde durch die Bereit- stellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausfüh- rungsformen erreicht.

Es konnte ein Diagnoseverfahren entwickelt werden, das auf der Bestimmung des mitogenen Index (Aktivierungsindex) an peripher zugänglichen Zellen, wie Hautzellen oder Blutlymphozyten, des Patienten mit und ohne mitogener Stimulation beispielsweise nach immuno-magnetischer Zellseparation basiert. Die Aktivie- rung dieser Zellen geht mit der Oberflächenpräsentation von Aktivierungsmarkern einher, die quantitativ nachgewiesen wer- den können, vorzugsweise anhand von Antigen-Antikörper- Wechselwirkungen, wobei vorzusgweise mit Antikörpern beschich- tete magnetische Partikeln verwendet werden, was die magneti- sche Zellseparation und anschließende Quantifizierung der An- zahl der Zellen erlaubt, die diesen Oberflächenmarker vor und nach mitogener Stimulation tragen. Dieses Merkmal zeigt er- krankungsspezifische Abweichungen vom Normalbefund. Das erfin- dungsgemäße Verfahren erlaubt somit die Diagnose der Alzhei- merschen Erkrankung, die Erfassung von präklinischen Erkran- kungsphasen sowie die differentialdiagnostische Abgrenzung der Alzheimerschen Erkrankung gegen andere Demenzen.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Di- agnose der Alzheimerschen Erkrankung oder eines Frühstadiums oder einer Prädisposition für diese Erkrankung anhand einer Probe von einem Patienten, wobei dieses Verfahren die folgen- den Schritte umfasst : (a) mitogene Stimulation der peripher zugänglichen Zellen in der Probe ; (b) quantitative Bestimmung der mitogen stimulierten Zellen innerhalb der Zellpopulation vor und nach Schritt (a) an- hand von einem oder mehreren nach mitogener Stimulation exprimierten Oberflächenmarkern, wobei die Oberflächenmar- ker tragenden Zellen von den keinen Oberflächenmarker tra- genden Zellen unter Verwendung von gegen die Oberflächen- marker gerichteten Antikörpern separiert werden ; und (c) Bestimmung des Stimulationsindex als Verhältnis der An- zahl der den oder die Oberflächenflächenmarker tragenden Zellen vor und nach Schritt (a), wobei ein Stimulationsindex, der mindestens das 10-fache, ma- ximal das 100-fache der unstimulierten Kontrollprobe erreicht, ein Anzeichen für eine Alzheimersche Erkrankung oder ein Früh- stadiums oder eine Prädisposition für diese Erkrankung ist.

Der Fachmann kennt geeignete Maßnahmen, um für das erfindungs- gemäße Verfahren geeignete Patientenproben zu erhalten und die mitogen stimulierbare Zellen in ausreichendem Maß enthalten, beispielsweise sind geeignete Proben Hautgewebeproben, Blut- proben, vorzugsweise von venösem Blut, Zellen aus dem Liquor cerebrospinalis, sowie Zellen aus Urin.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Di- agnoseverfahrens, z. B., bei Verwendung einer Blutprobe, er- folgt zur Stabilisierung vor den weiteren Verfahrensschritten die Zugabe einer koagulationshemmenden Verbindung, z. B., Nat- riumcitrat oder Heparin.

Der hier verwendete Begriff"Diagnose der Alzheimerschen Er- krankung"umfasst auch die Verlaufskontrolle und somit Prog- nostik, die Kontrolle der Effizienz therapeutischer Maßnahmen und die differentialdiagnostische Abgrenzung der Erkrankung von anderen Demenzen.

Der hier verwendet Begriff"peripher zugängliche Zellen"be- zieht sich auf Zellen, die ohne operative Eingriffe, oder aber (minimal) invasiv dem menschlichen Organismus entnommen werden können und dazu zählen beispielsweise Hautzellen und Lymphozy- ten der peripheren Bluts, wobei letztere für das erfindungsge- mäße Verfahren bevorzugt sind.

Die mitogene Stimulation zur Erzielung der Expression der Ex- pression von Oberflächenmarkern kann durch bekannte Stimulato- ren erfolgen, wie z. B. Phytohämagglutinin (PHA), Protein A, PWM oder andere trophisch oder mitogen wirkende Verbindungen.

Die Stimulation kann durch Zugabe der Einzelverbindungen oder durch kombinierte Zugabe erfolgen.

Der Fachmann kennt geeignete experimentelle Bedingungen für eine solche Stimulation, z. B. hinsichtlich der Konzentration der verwendeten Mitogene, Dauer der Stimulation und sonstigen Inkubationsbedingungen. Dabei sollte die Stimulation in geeig- neten Gefäßen erfolgen, die einen ausreichenden Gasaustausch zulassen. Die Konzentrationen der jeweiligen Stimulationsagen- tien sollten sich im physiologischen Bereich befinden, der z. B. für PHA lßg/ml bis 20g/ml, für PWM lßg/ml bis 50ßg/ml und für Protein A 10ßg/ml bis 200ßg/ml beträgt. Die Dauer der Stimulation richtet sich nach der Geschwindigkeit der Expres- sion des zu untersuchenden Moleküls. Für bestimmte Untersu- chungen können aber auch Stimulationszeiten von 2 bis 24 Sun- den erforderlich sein ; im Falle von CD69 ist eine Stimulati- onsdauer von 4 Stunden optimal. Die Stimulation sollte unter physiologischen Bedingungen erfolgen und kann z. B. in einem Begasungsbrutschrank bei 37°C und 5% C02 durchgeführt werden.

Der Fachmann kennt auch geeignete Oberflächenmarker, anhand derer sich eine mitogene Stimulation manifestiert, z. B. CD69, CD25, CD45RO, CD63 oder HLA-DR, wobei der Oberflächenmarker CD69 bevorzugt ist. Es kann für die erfindungsgemäßen Zwecke auch die Bestimmung einer Kombination von Oberflächenmarkern erfolgen oder die weitere Spezifizierung der anhand eines be- stimmten Oberflächenmarkers, z. B. CD69, separierten Zellen hinsichtlich weiterer Subpopulationen, z. B. anhand von (z. B.

CD4+-und/oder CD8+-und/oder CD19+ und/oder CD56+) Subpopulationen.

Der Stimulationsindex (Aktivierungsindex) ergibt sich aus dem Verhältnis der Anzahl der den oder die Oberflächenmarker tra- genden Zellen vor und nach Stimulation. Ein Stimulationsindex, der mindestens das 10-fache, maximal das 100-fache der unsti- mulierten Kontrollprobe erreicht, stellt ein Anzeichen für ei- ne Alzheimersche Erkrankung oder eines Frühstadiums oder eine Prädisposition für diese Erkrankung dar. Ein Stimulationsin- dex, der weniger als das 10-fache der unstimulierten Kontroll- probe beträgt deutet nicht auf Anzeichen für eine Alzheimer- sche Erkrankung oder ein Frühstadiums oder eine Prädisposition für diese Erkrankung hin. Die Bestimmung der Oberflächenmarker tragenden Zellen kann nach üblichen Verfahren erfolgen, z. B., Western-Blot, ELISA, RIA, FACS, LSC etc.

Vorzugsweise erfolgt zur Bestimmung der Oberflächenmarker tra- genden Zelle deren Abtrennung von den keinen Oberflächenmarker oder andere Oberflächenmarker tragenden Zellen anhand charak- teristischer Zellmerkmale.

In dem Diagnoseverfahren der vorliegenden Erfindung erfolgt die Separierung der Oberflächenmarker tragenden Zellen von den nicht Oberflächenmarker tragenden Zellen durch gegen (den) die gewünschten Oberflächenmarker gerichtete Antikörper. Dabei kann es sich bei den dafür geeigneten Antikörpern um monoklona- le, polyklonale oder synthetische Antikörper oder Fragmente da- von handeln. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff Frag- ment"alle Teile des monoklonalen Antikörpers (z. B. Fab-, Fv- oder single chain Fv"-Fragmente), welche die gleiche Epi- topspezifität wie der vollständige Antikörper aufweisen. Die Herstellung solcher Fragmente ist dem Fachmann bekannt, viele gegen Oberflächenmarker gerichtete Antikörper sind auch im Handel erhältlich.

In der am meisten bevorzugten Ausführungsform des erfindungs- gemäßen Diagnoseverfahrens ist der (sind die) Oberflächenmar- ker-spezifischen Antikörper an magnetische Partikel, bei- spielsweise paramagnetische Perlen (z. B. erhältlich von DYNAL A. S, P. O. Box 158 Skyen, N-0212 Oslo, Norway) gebunden, was die Separation der Zellen mit den entsprechenden Oberflächen- markern über immuno-magnetische Separation gemäß gängiger Ver- fahren erlaubt.

Der Stimulationsindex kann dann dadurch bestimmt werden, dass die Menge der mittels des gewünschten Oberflächenmarkers sepa- rierten Zellen anhand ihres Nukleinsäuregehalts und/oder Pro- teingehalts mittels gängiger Verfahren bestimmt wird, z. B. nach Lyse der Zellen durch spektrophotometrische Bestimmung des Nukleinsäure-bzw. Proteingehalts oder nach Anfärbung der Nukleinsäure mittels spezifischer Farbstoffe, z. B. Ethidi- umbromid, Propidiumjodid, Acridinorange, DAPI etc über photo- metrische Quantifizierung. Unter Verwendung von Eichkurven kann aus dem Protein-und/oder Nukleinsäuregehalt der Probe die Zellzahl rechnerisch ermittelt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Kit, der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens geeignet ist-und wenigstens folgende Bestandteile enthält : (a) Eine Verbindung zur mitogenen Stimulation ; (b) mindestens einen gegen einen nach mitogener Stimulation exprimierten Oberflächenmarker gerichteten Antikörper, vor- zugsweise einen an ein magnetisches Partikel gebundenen An- tikörper.

Vorzugsweise enthält der erfindungsgemäße Kit außerdem (a) mindestens ein Reaktionsgefäß ; (b) eine koagulationshemmde Verbindung und/oder einen Puf- fer zur Zell-Lyse ; (c) einen Puffer zur Fixierung der Zellen ; (d) Substanzen die für die quantitative Ermittlung der DNA- bzw. Proteinkonzentration erforderlich sind, sowie vor- gefertigte Lösungen zur Herstellung einer Eichkurve ; (e) einen Magneten zum Separieren der an die Magnetpartikel gebundenen Zellen (enthalten sofern ein an ein magneti- sches Partikel gebundener Antikörper eingesetzt wird) ; und (f) ein Reagenz zum Ablösen gebundener magnetischer Parti- kel (enthalten sofern ein an ein magnetisches Partikel gebundener Antikörper eingesetzt wird) In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits ist der Antikörper ein anti-CD69-Antikörper. Der Kit kann außerdem noch zusätzlich oder anstelle des anti-CD-69- Antikörpers einen anti-CD4-und/oder anti-CD8-Antikörper ent- halten.

Schließlich kann der erfindungsgemäße Kit gegebenenfalls in Kombination mit einem oder mehreren geeigneten weiteren Nach- weismitteln, z. B., fluoreszenzgekoppelten Primärantikörpern, sekundären Antikörpern, Nachweismitteln für Proteine und/oder Nukleinsäuren, z. B. einem interkalierenden Farbstoff etc., vorliegen.

Beispiel Bestimmung des mitogenen Stimulationsindex anhand CD69 bei Pa- tienten mit Alzheimerscher Erkrankung Bestimmungen bisher bekannter Merkmale der Alzheimerschen Er- krankung, die sich am lebenden Patienten durchführen lassen (Biomarker), zeigen nur eine ungenügende Sensitivität und Spe- zifität oder sind aus Kostengründen oder Gründen des hohen Aufwandes der Testanordnung nicht für Untersuchungen mit hohen Fallzahlen geeignet. Mit klinischen Mitteln beträgt die dia- gnostische Sicherheit nur 80% bis 90% und bereitet insbesonde- re in Erkrankungsfrühphasen differential-diagnostische Schwie- rigkeiten. Die Erkennung von präklinischen Erkrankungsphasen ist aufgrund des Fehlens eines geeigneten Biomarkers derzeit nicht möglich.

Den neurodegenerativen Veränderungen liegen bei der Alzheimer- schen Erkrankung gestörte Prozesse der intrazellulären Ver- mittlung trophischer und mitogener Signale zugrunde. Diese Störungen der intrazellulären Signaltransduktion sind nicht auf das Nervensystem beschränkt. Sie lassen sich in ähnlicher Weise auch an Hautzellen sowie an Lymphozyten des peripheren Blutes dieser Patienten finden. Aufgrund ihrer Erkrankungsspe- zifität besitzt diese Veränderung diagnostischen Wert und eig- net sich als Biomarker.

Im nachfolgenden Beispiel erfolgte die Ermittlung, ob die für die Alzheimersche Erkrankung typische Störung der intrazellu- lären Vermittlung trophischer und mitogener Signale vorliegt, durch immuno-magnetische Zellseparation CD69 präsentierender Lymphozyten vor und nach mitogener Stimulation.

Die Gewinnung des Blutes erfolgte durch Venenpunktion unter Verwendung eines Blutentnahmesystems der Firma SARSTEDT. Das Blut wird dabei während der Entnahme durch im Blutentnahmesys- tem integrierte Antikoagulantien, wie z. B. Natriumzitrat oder Natrium-Heparin stabilisiert. In dieser Form kann es 24 bis 48 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Die Stimulati- onsexperimente wurden in gut zu belüftenden Reaktionsgefäßen, wie z. B. einer 24 well Suspension-culture-plate der Firma Greiner bio-one durchgeführt. Dafür wurden zu je 400gel stabi- lisiertem Vollblut die Mitogene Phytohaemagglutinin (PHA), Protein A und Pokeweed-Mitogen (PWM) jeweils einzeln oder in unterschiedlichen Kombinationen eingesetzt. Die Endkonzentra- tionen der jeweiligen Mitogene lag im physiologischen Bereich und betrug in diesem Beispiel für PHA 12g/ml, für Protein A 50g/ml und für PWM 4 µg/ml. Die Stimulation erfolgte unter physiologischen Bedingungen bei 37°C und einer CO2- Konzentration von 5% in einem Begasungsbrutschrank für eine Dauer von 4 Stunden. Jeweils 100gel des stimulierten Vollblutes wurden mit verschiedenen Antikörper-beschichteten Magnetparti- keln inkubiert. In diesem Beispiel wurden anti-CD4 sowie anti CD8 beschichtete Magnetpartikel der Firma DYNAL verwendet. Die entsprechenden Magnetpartikel wurden der jeweiligen Probe im Überschuß (10gel Magnetpartikel-Suspension) zugesetzt, um eine vollständige Isolation der entsprechenden Lymphozyten- Subpopulation zu gewährleisten. Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten bei 4°C wurden die entsprechende Lymphozyten- Subpopulation magnetisch separiert und nach darauffolgenden Waschschritten in 100gel definiertes Medium, in diesem Beispiel RPMI1640, versetzt mit 1% fötalem Kälberserum (FKS), über- führt. Das Ablösen der gebundenen Magnetpartikel erfolgte in diesem Beispiel unter Verwendung von jeweils logl DETACHABEAD der Firma DYNAL. Nach einer Inkubationszeit von 45 Minuten bei Raumtemperatur wurden die abgelösten Magnetpartikel separiert und die Zellsuspension nach mehrmaligem Waschen in ein defi- niertes Medium, in diesem Beispiel RPMI1640 aufgenommen. Durch Zugabe eines spezifischen Lysepuffers wurden die Zellen aufge- schlossen, die DNA mit spezifischen DNA Farbstoffen, wie z. B.

Ethidiumbromid, Propidiumiodid, Acridinorange oder DAPI mar- kiert und diese im Anschluß photometrisch quantifiziert. Unter Verwendung der Proteinbestimmungsmethode nach Bradford wurde der Proteingehalt der Proben verglichen. Unter Verwendung von Eichkurven wurde aus dem DNA-und/oder Proteingehalt der Probe die Zellzahl rechnerisch ermittelt. Diese Vorgehensweise er- laubte einen direkten Rückschluß auf die Zellzahl. Die Berech- nung des Quotienten aus der Zahl CD69 präsentierender Zellen vor und nach mitogener Stimulation (Stimulationsindex) gab Aufschluss über Veränderungen mitogener Stimulierbarkeit die- ser Zellen.

Ein Stimulationsindex, der mindestens das 10-fache, maximal das 100-fache der unstimulierten Kontrollprobe erreicht, ist ein Anzeichen für eine Alzheimersche Erkrankung oder ein Früh- stadiums oder eine Prädisposition für diese Erkrankung. *Ein Stimulationsindex, der weniger als das 10-fache der unstimu- lierten Kontrollprobe beträgt, deutet nicht auf Anzeichen für eine Alzheimersche Erkrankung oder ein Frühstadiums oder eine Prädisposition für diese Erkrankung hin.

In einem weiteren Experiment erfolgte die Bestimmung des Pro- teingehaltes der Probe, sowie die Bestimmung des DNA-Gehaltes ohne Zugabe von DNA-färbenden Substanzen zur quantitativen Er- mittlung der CD69-präsentierenden Zellen. In diesem Fall wurde die Absorption von DNA bzw. Protein von Licht einer bestimmten Wellenlänge (z. B. 260 nm bzw. 280 nm) gemessen.