Quinacrin als Inhibitor viraler Cysteinproteasen und/oder Serinproteasen

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Quinacrin zur Verwendung als Inhibitor und für die Herstellung eines Inhibitors von viralen Cysteinproteasen und/oder Serinproteasen, insbeson- dere zur Inhibierung von viralen nsP2 Proteasen (nsP2 ^pro ) und/oder NS2B/NS3 Proteasen (NS2B/NS3 ^pro ), sowie die Verwendung von Quinacrin zur Herstellung eines Inhibitors für virale Cysteinproteasen und Serinproteasen.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf Quinacrin zur Verwendung in der medizinischen The- rapie. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die min- destens Quinacrin oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz davon und ein/einen pharmazeu- tisch geeigneten/geeignetes Träger, Verdünnungsmittel oder Arzneiträger davon umfasst. Quinacrin kann zur Verwendung bei der Vorbeugung oder Behandlung einer viralen Infektion in einem Organismus, insbesondere einer Infektion mit wenigstens einem Virus aus der Fami- lie der Flaviviridae und/oder Togaviridae dienen. Quinacrin kann dabei zur Behandlung einer viralen Infektion in einem Organismus, insbesondere zur Behandlung einer kombinierten In- fektion mit Viren aus der Familie der Flaviviridae und Togaviridae, sowie auf Quinacrin als Arzneimittel in der Behandlung von viralen Infektionen, insbesondere zur Behandlung einer kombinierten Infektion mit Viren aus der Familie der Flaviviridae und Togaviridae verwendet werden.

Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung von Quinacrin als therapeutisches Mittel, sowie in der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer viralen Infektion in einem Organismus, insbesondere zur Behandlung einer kombinierten Infektion mit Viren aus der Fa- milie der Flaviviridae und Togaviridae, und weiterhin auf ein Verfahren zur Behandlung von viralen Infektionen, insbesondere zur Behandlung von kombinierten Infektionen mit Viren aus der Familie der Flaviviridae und Alphaviren.

Stand der Technik

Quinacrin ist eine bekannte Substanz, die bereits als Arzneistoff zugelassen ist. Quinacrin wird beispielsweise unter dem Handelsnamen Mepacrin oder Atabrine eingesetzt. Quinacrin wurde in der Vergangenheit zur Malariaprophylaxe verwendet. Ein Einsatz von Quinacrin bei Gardia- und Protozoen Infektionen ist ebenfalls bekannt.

Quinacrin wird weiterhin bei der Behandlung von discoidem und subkutanem Lupus erythe- matodes verwendet und wird als Prophylaxe zur Verhinderung des Wiederauftretens von Pneumothorax bei Patienten mit hohem Risiko, zum Beispiel bei Mukoviszidose-Patienten, gegeben. Zu Quinacrin wird in der Literatur ein inhibierender Effekt gegen Zika und Dengue Virus Zellkul- turen beschrieben [1; 2; 3], Quinacrin zeigt weiterhin eine hemmende Wirkung gegen eine Ebola Virus Infektion in Mäusen [4],

Der genaue Wirkungsmechanismus von Quinacrin ist derzeit nicht bekannt, aber das Molekül scheint Translation und Transkription von DNA zu hemmen. Quinacrin wird auch als Inhibitor der sauren Sphingomyelinase und Cholinesterase beschrieben.

Aufgabe und Lösung

Die Aufgabe der Erfindung ist es, einen Wirkstoff zur Behandlung von viralen Infektionen, ins- besondere mit Viren aus der Familie der Flaviviridae und Togaviridae, vor allem mit Vertretern der Gattung der Flaviviren und Alphaviren, bereitzustellen, ganz besonders von Infektionen mit Zika, Dengue, Gelbfieber, West-Nil oder Chikungunya Viren und Kombinationen dieser Viren, wie beispielsweise Zika-Dengue, Zika-Gelbfieber, Zika-Dengue-Chikungunya. Es ist weiterhin Aufgabe der Erfindung einen Wirkstoff als Arzneimittel oder therapeutisches Mittel zur Behandlung dieser viralen Infektionen bereitzustellen.

Die Aufgaben der Erfindung werden gelöst durch Quinacrin mit den Merkmalen des Hauptan- spruchs sowie durch die Verfahren zur Behandlung gemäß nebengeordneter Ansprüche.

Vorteilhafte Ausgestaltungen der Verwendung von Quinacrin und der Verfahren ergeben sich aus den darauf rückbezogenen Ansprüchen.

Gegenstand der Erfindung:

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf einen Wirkstoff zur Inhibierung von Cysteinpro- teasen und Serinproteasen und damit verbunden auf eine Behandlung von Infektionen durch Viren aus der Gruppe der Flaviviridae und Togaviridae. Die Cysteinproteasen, die in Viren aus der Familie der Togaviridae Vorkommen, und/oder Serinproteasen, die in Viren aus der Familie der Flaviviridae Vorkommen, sind essentiell für den viralen Replikationsmechanismus im Wirt. Die Erfinder haben in überraschender Weise herausgefunden, dass Quinacrin diese beiden Proteaseklassen, insbesondere die virale Cysteinprotease nsP2 ^pro , und/oder die vi- rale Serinproteasen NS2B/NS3 ^pro hemmen kann. Es ist daher möglich, mit Quinacrin Viren aus der Gruppe der Flaviviridae und Togaviridae nicht nur einzeln, sondern auch in Kombi- nation aus diesen Gruppen zu hemmen. Gegenstand der Erfindung ist daher Quinacrin zur Verwendung für die Herstellung eines In- hibitors für virale Cysteinproteasen und/oder Serinproteasen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist Quinacrin zur Verwendung für die Herstellung ei- nes Inhibitors für Cysteinproteasen und/oder Serinproteasen von Viren aus der Familie der Flaviviridae und/oder Togaviridae.

Damit verbunden ist insbesondere Quinacrin zur Verwendung für die Herstellung eines Inhi- bitors für die Serinprotease NS2B/NS3 ^pr0 und/oder Cysteinprotease nsP2 ^pro .

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von Quinacrin zur Herstellung eines Inhibitors für diese viralen Cysteinproteasen und/oder Serinproteasen aus der Familie der Flaviviridae und/oder Togaviridae, insbesondere für die Serinprotease NS2B/NS3 ^pro und/oder Cysteinprotease nsP2 ^pr0 .

Ein vierter Aspekt der Erfindung ist Quinacrin zur Verwendung in der medizinischen Thera- pie.

Ein fünfter Aspekt ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens Quinacrin oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz davon und ein/einen pharmazeutisch geeigne- ten/geeignetes Träger, Verdünnungsmittel oder Arzneiträger davon umfasst.

Ein sechster Aspekt der Erfindung ist Quinacrin als pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in der medizinischen Therapie.

Ein siebter Aspekt der Erfindung ist Quinacrin zur Verwendung bei der Vorbeugung oder Be- handlung einer viralen Infektion in einem Organismus, insbesondere einer Infektion mit we- nigstens einem Virus aus der Familie der Flaviviridae und/oder Togaviridae.

Ein weiterer Aspekt ist Quinacrin zur Verwendung bei der Vorbeugung oder Behandlung ei- ner viralen Infektion in einem Organismus, insbesondere einer Infektion mit wenigstens ei- nem Virus aus der Gruppe der Familie der Flaviviridae und/oder Togaviridae. Zu einer viralen Infektion aus der Familie der Flaviviridae können beispielhaft, jedoch nicht darauf be- schränkt, folgende Flaviviren genannt werden: Zika-Virus, Dengue-Virus, Gelbfieber-Virus, FSME-Virus, JE-Virus, SLE-Virus, Louping-Ill-Virus, Usutu-Virus, Wesselsbron-Virus, West- Nil-Virus, Gadgets-Gully-Virus, Langat-Virus, Modoc-Virus, Kadam-Virus, MVEV-Virus, POW-Virus, Karshi-Virus, Sepik-Virus, TBE-Virus, Yokose-Virus. Zu einer viralen Infektion aus der Familie der Togaviridae können beispielhaft, jedoch nicht darauf beschränkt, fol- gende Alphaviren genannt werden: Chikungunya-Virus, Mayaro-Virus, Getah-Virus, O’nyong-nyong-Virus, Ross-River-Virus, Sindbis-Virus, Ockelbo-Virus, Babanki-Virus, Bar- mah-Forest-Virus, Semliki-Forest-Virus, Venezuelan-Equine-Encephalitis-Virus, Everglades- Virus, Mucambo-Virus, Tonate-Virus, Eastern-Equine-Encephalitis-Virus, Western-Equine- Encephalitis-Virus, Highlands-Virus, Middelburg-Virus, Rio Negro-Virus, Aura Virus, Babanki Virus, Ockelbo Virus, Whataroa Virus. Gegenstand der Erfindung sind auch Arzneimittel enthaltend Quinacrin sowie einen pharma- zeutisch geeigneten Träger und die Verwendung von Quinacrin in der Herstellung eines Arz- neimittels zur Behandlung von Infektionen mit wenigstens einem Virus aus der Familie der Flaviviridae und/oder Togaviridae in einem Organismus.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Inhibierung viraler Serinproteasen und/oder Cysteinproteasen, von Viren aus der Familie der Flavirviridae und/oder Toga- viridae, sowie zur Behandlung oder Verhinderung einer Virusinfektion in einem Organismus, insbesondere zur Behandlung einer viralen Infektion durch wenigstens einen Virus aus der Gruppe der Flaviviridae, wie beispielsweise, jedoch nicht darauf beschränkt, durch einen Zika-Virus, Dengue-Virus, Gelbfieber-Virus, FSME-Virus, JE-Virus, SLE-Virus, Louping-Ill- Virus, Usutu-Virus, Wesselsbron-Virus, West-Nil-Virus, Gadgets-Gully-Virus, Langat-Virus, Modoc-Virus, Kadam-Virus, MVEV-Virus, POW-Virus, Karshi-Virus, Sepik-Virus, TBE-Virus, Yokose-Virus, und/oder beispielsweise, jedoch nicht darauf beschränkt, für die Familie der Togaviridae, durch einen Chikungunya-Virus, Mayaro-Virus, Getah-Virus, O’nyong-nyong- Virus, Ross-River-Virus, Sindbis-Virus, Ockelbo-Virus, Babanki-Virus, Barmah-Forest-Virus, Semliki-Forest-Virus, Venezuelan-Equine-Encephalitis-Virus, Everglades-Virus, Mucambo- Virus, Tonate-Virus, Eastern-Equine-Encephalitis-Virus, Western-Equine-Encephalitis-Virus, Highlands-Virus, Middelburg-Virus, Rio Negro-Virus, Aura Virus, Babanki Virus, Ockelbo Vi- rus, Whataroa Virus, bei dem Quinacrin oder eine pharmazeutische Zusammensetzung um- fassend Quinacrin gemäß zuvor genannter Merkmale in einer therapeutisch wirksamen Menge zugegeben wird.

Darüber hinaus umfasst die Erfindung auch ein Verfahren zur Inhibierung der viralen Cys- teinprotease und/oder Serinproteasen, insbesondere der viralen NS2B/NS3 ^pro und/oder der nsP2 ^pro , in einem Organismus, bei dem eine Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge von Quinacrin oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend Quinacrin, erfolgt.

Auch ein Verfahren zur Inhibierung oder zur Inaktivierung viraler Cysteinproteasen und/oder Serinproteasen von Viren aus der Familie der Flaviviridae und/oder Togaviridae, umfassend den Schritt des Inkontaktbringens der Zellen des Organismus mit einer therapeutisch wirksa- men Menge von Quinacrin oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung ist Gegenstand der Erfindung. Dieses Verfahren kann sowohl in-vivo als auch ex-vivo durchgeführt werden und ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Erfindungsgemäß sind insbesondere Cysteinproteasen als Target für die erfindungsgemäße Verwendung von Quinacrin geeignet, die in humanpathogenen oder tierpathogenen Alphavi- ren aus der Gruppe der Chikungunya-Virus, Mayaro-Virus, Getah-Virus, O’nyong-nyong-Vi- rus, Ross-River-Virus, Sindbis-Virus, Ockelbo-Virus, Babanki-Virus, Barmah-Forest-Virus, Semliki-Forest-Virus, Venezuelan-Equine-Encephalitis-Virus, Everglades-Virus, Mucambo- Virus, Tonate-Virus, Eastern-Equine-Encephalitis-Virus, Western-Equine-Encephalitis-Virus, Highlands-Virus, Middelburg-Virus, Rio Negro-Virus, Aura Virus, Babanki Virus, Ockelbo Vi- rus, Whataroa Virus Vorkommen.

Serinproteasen als Target für die erfindungsgemäße Verwendung von Quinacrin, kommen vorzugsweise in humanpathogenen oder tierpathogenen Flaviviren aus der Gruppe des Zika- Virus, Dengue-Virus, Gelbfieber-Virus, FSME-Virus, JE-Virus, SLE-Virus, Louping-Ill-Virus, Usutu-Virus, Wesselsbron-Virus, West-Nil-Virus, Gadgets-Gully-Virus, Langat-Virus, Modoc- Virus, Kadam-Virus, MVEV-Virus, POW-Virus, Karshi-Virus, Sepik-Virus, TBE-Virus, Yokose- Virus vor.

Quinacrin kann daher als Breitband Inhibitor gegen einzelne Virusinfektionen und/oder Ko- Infektionen verwendet werden, da es die essentiellen viralen Proteasen, insbesondere die Cystein- und Serin-Proteasen, dieser verschiedenen Virusfamilien hemmen kann.

Unter der Bezeichnung Quinacrin wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Verbin- dung der folgenden Strukturformel (I) verstanden, die aus einem 1 :1 Gemisch aus einer R- Form (oben) und einer S-Form (unten) besteht:

Quinacrin kann im Rahmen der Erfindung beispielsweise in Form seiner Hydrolysate oder anderer im Handel erhältlichen Formen eingesetzt werden. Im Rahmen der Erfindung wurde herausgefunden, dass Quinacrin virale Cysteinproteasen und/oder Serinproteasen, effizient hemmen kann.

Primäre Inhibitionstests haben gezeigt, dass Quinacrin, Proteasen von Viren, die zu den Fla- viviridae gehören, wie beispielsweise Zika Virus (ZIKV), Dengue Virus (DENV), Gelbfieber Virus (YFV), West-Nile Virus (WNV), aber auch Proteasen von Viren, die zu den Viren der Togaviridae, speziell der Alphaviren gehören, wie beispielsweise den Chikungunya Virus (CHIKV), effizient hemmt. Im Fall der Flaviviridae betrifft dies NS2B/NS3 ^pro und im Fall der Togaviridae, insbesondere Alphaviren, nsP2 ^pro .

Zusätzliche Aktivitätstests, basierend auf klassischen Michaelis-Menten Annahmen, konnten zeigen, dass Quinacrin ein kompetitiver Inhibitor für Serinproteasen und Cysteinproteasen insbesondere NS2B/NS3 ^pro und nsP2 ^pro ist (siehe Figur 4). Quinacrin als kompetitiver Inhi- bitor tritt dabei in Konkurrenz mit dem Substrat und bindet also im aktiven Zentrum der Pro- teasen.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens Quinacrin oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz davon und ein/einen pharmazeutisch geeigneten/geeig- netes Träger, Verdünnungsmittel oder Arzneiträger davon umfasst, können beispielsweise, jedoch nicht darauf beschränkt Salze oder Komplexe davon umfassen, die Basenadditions- salze, die durch Reaktion von Quinacrin mit organischen oder anorganischen Basen wie Hydroxid, Carbonat oder Bicarbonat eines Metallkations gebildet werden, wie sie in der Gruppe ausgewählt sind, die aus Alkali besteht Metalle (Natrium, Kalium oder Lithium), Erdalkalimetalle (z. B. Calcium oder Magnesium). Es können weiterhin auch Salze umfasst sein, die aus mit anorganischen Säuren gebildeten Säureadditionssalzen (z. B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und dergleichen) ge- bildet werden, sowie Salze, die mit organischen Säuren wie z. B. Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Ascorbinsäure, Benzoe- säure, Benzolsulfonsäure, Methansulfonsäure, Gerbsäure, Palmoesäure, Alginsäure, Poly- glutaminsäure, Naphthalinsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure und Polygalacturonsäure ge- bildet werden.

Dabei kann diese pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Quinacrin, ein oder meh- rere pharmazeutisch geeignete Träger beinhalten. Hier sind alle nach dem Stand der Tech- nik bekannten Arzneiträgerstoffe geeignet. Quinacrin oder die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung können zusam- men mit einem herkömmlich verwendeten Adjuvans, Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfs- stoff in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen und Einheitsdosierungen davon gegeben werden und können in dieser Form als Feststoffe wie Tabletten oder gefüllte Kap- seln eingesetzt werden oder in Form von Flüssigkeiten wie Lösungen, Suspensionen, Emul- sionen, Elixiere oder damit gefüllte Kapseln, alle zur oralen Anwendung oder in Form von sterilen injizierbaren Lösungen zur parenteralen (einschließlich subkutanen) Anwendung. Quinacrin oder die Pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung können dem Organis- mus beispielsweise oral, intravenös oder durch Inhalation verabreicht werden.

Quinacrin oder die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung können ferner einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche zusätzliche Bestandteile wie Alaun, Stabi- lisatoren, antimikrobielle Mittel, Puffer, Farbstoffe, Aromastoffe, Adjuvantien und dergleichen umfassen.

Quinacrin oder die pharmazeutische Zusammensetzung von Quinacrin oder das Arzneimittel enthaltend Quinacrin ist insbesondere zur Verwendung bei der Vorbeugung, in der anti-vira- len Therapie oder zur Behandlung einer viralen Infektion in einem Organismus ersetzbar, wobei hier insbesondere die virale Infektion durch Viren aus der Familie der Flaviviridae, ins- besondere human- und tierpathogene Viren aus der Gruppe der Flaviviren, wie beispielhaft, jedoch nicht darauf beschränkt, durch einen Zika-Virus, Dengue-Virus, Gelbfieber-Virus, FSME-Virus, JE-Virus, SLE-Virus, Louping-Ill-Virus, Usutu-Virus, Wesselsbron-Virus, West- Nil-Virus, Gadgets-Gully-Virus, Langat-Virus, Modoc-Virus, Kadam-Virus, MVEV-Virus, POW-Virus, Karshi-Virus, Sepik-Virus, TBE-Virus, Yokose-Virus und/oder Viren aus der Fa- milie der Togaviridae, insbesondere human- und tierpathogene Viren aus der Gruppe der Al- phaviren, wie beispielhaft, jedoch nicht darauf beschränkt, durch einen Chikungunya-Virus, Mayaro-Virus, Getah-Virus, O’nyong-nyong-Virus, Ross-River-Virus, Sindbis-Virus, Ockelbo- Virus, Babanki-Virus, Barmah-Forest-Virus, Semliki-Forest-Virus, Venezuelan-Equine-Ence- phalitis-Virus, Everglades-Virus, Mucambo-Virus, Tonate-Virus, Eastern-Equine-Encephali- tis-Virus, Western-Equine-Encephalitis-Virus, Highlands-Virus, Middelburg-Virus, Rio Negro- Virus, Aura Virus, Babanki Virus, Ockelbo Virus, Whataroa Virus, Anwendung finden. Quinacrin, seine pharmazeutische Zusammensetzung oder das Arzneimittel enthaltend Quinacrin, kann daher vorteilhaft zur Behandlung viraler Infektionen, sowohl einer einzelnen Infektion, als auch einer kombinierten Infektion durch Flaviviren und Alphaviren, in einem Menschen oder Tier eingesetzt werden. Der im Rahmen der Erfindung verwendete Begriff „Behandlung“ und „behandeln“ bedeutet, im Allgemeinen eine gewünschte pharmakologische und physiologische Wirkung zu erhal- ten. Diese Wirkung kann prophylaktisch sein, um eine Krankheit, ein Symptom oder einen Zustand davon zu verhindern oder teilweise zu verhindern, und / oder kann therapeutisch sein, um eine Krankheit, einen Zustand, ein Symptom oder eine nachteilige Wirkung, die der Krankheit zugeschrieben wird, teilweise oder vollständig zu heilen. Der Begriff "Behandlung", wie er hier verwendet wird, umfasst jede Behandlung einer Krankheit bei einem Säugetier, insbesondere einem Menschen, und umfasst: (a) Verhindern des Auftretens der Krankheit bei einem Subjekt, das für die Krankheit prädisponiert sein kann, aber noch nicht diagnosti- ziert wurde; (b) Hemmung der Krankheit, d.h. Stillstand ihrer Entwicklung; oder Linderung der Krankheit.

Der verwendete Begriff „wirksame Menge“ umfasst sowohl eine Menge, die vorbeugend wirkt, als auch eine „behandlungswirksame Menge“. Die vorbeugend wirksame Menge be- zieht sich auf eine Konzentration von Quinacrin, die wirksam ist, um die Wahrscheinlichkeit einer Infektion durch Flaviviridae und/oder durch Togaviridae zu hemmen, zu verringern oder zu verhindern oder das verzögerte Auftreten der Krankheit durch Viren aus der Gruppe der Flaviviridae und/oder Togaviridae zu verhindern, wenn vor einer Infektion verabreicht, d.h. vor, während und / oder kurz nach der Expositionsdauer gegenüber den genannten Viren. Ebenso kann der Begriff „wirksame Menge“ sich auf eine Konzentration von Quinacrin bezie- hen, die bei der Behandlung einer Infektion durch die genannten Viren, beispielsweise zu ei- ner Verringerung der Virenkonzentration führt.

Unter der Bezeichnung Organismus sollen vorzugsweise Säugetiere, insbesondere Men- schen, verstanden werden.

Es wird angenommen, dass die antivirale Wirkung von Quinacrin darauf beruht, dass durch Hemmung der viralen Cysteinproteasen und/oder Serinproteasen, die Polyproteinverarbei- tung des translatierten, viralen Genoms in der Wirtszelle gestört oder verhindert wird, wodurch das Virus replikationsunfähig wird.

Dementsprechend ist ein Verfahren zur Behandlung einer Virusinfektion oder eines Virus aus der Familie der Flaviviridae und Togaviridae vorgesehen, das für eine virale Cysteinpro- tease-Inhibierung und/oder Serinprotease-Inhibierung, insbesondere eine virale NS2B/NS3 ^pro -lnhibierung und/oder nsP2 ^pra -lnhibierung, in einem Organismus empfänglich ist, einschließlich der Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge von Quinacrin oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes, Solvats oder Hydrats hiervon an den Or- ganismus, wobei der Organismus vorzugsweise ein Säugetier, insbesondere ein Mensch oder ein Tier sein kann. Die Verabreichung von Quinacrin, der pharmazeutischen Zusam- mensetzung oder des Arzneimittels der Erfindung kann dabei auch zusammen mit anderen therapeutischen Mitteln erfolgen, die bei der Behandlung von Infektionen durch Viren nützlich sind.

In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Inhibierung der vi- ralen Cysteinprotease und/oder Serinproteasen, insbesondere der viralen NS2B/NS3 ^pr0 und/oder der nsP2 ^pro , in einem Säugetier vorgesehen, das die Verabreichung einer therapeu- tisch wirksamen Menge von Quinacrin oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes, Solvats oder Hydrats davon an das Säugetier einschließt. In einer Ausgestaltung ist das Säugetier ein Mensch oder ein Tier. Quinacrin kann dabei oral, intravenös oder durch Inhala- tion verabreicht werden.

Obwohl die Erfindung in den Figuren und der vorangegangenen Beschreibung ausführlich dargestellt und beschrieben wurde, sind diese Abbildungen und Beschreibungen als illustra- tiv oder exemplarisch und nicht einschränkend zu betrachten. Es versteht sich, dass Ände- rungen und Modifikationen durch gewöhnliche Fertigkeiten im Rahmen der folgenden An- sprüche vorgenommen werden können. Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung weitere Ausführungsformen mit einer beliebigen Kombination von Merkmalen aus verschie- denen Ausführungsformen, die oben und unten beschrieben sind.

Spezieller Beschreibunqsteil

Im Weiteren wird die Erfindung anhand von exemplarischen und experimentellen Untersu- chungsergebnissen und einigen Figuren näher und detaillierter erläutert. Die Erfindung ist nicht auf die hier offenbarten exemplarischen Ausführungsbeispiele beschränkt. Alle be- schriebenen und/oder bebilderten Merkmale können sich einzeln oder auch kombiniert in un- terschiedlichen Ausführungsformen manifestieren. Die Merkmale der unterschiedlichen Aus- führungsformen dieser Erfindung und ihre jeweiligen Vorteile werden beim Lesen der nach- folgend ausgeführten Ausführungsbeispiele in Zusammenhang mit den Figuren offenbart. Dabei zeigen:

Figur 1 : Primäre Inhibitions Tests von Quinacrin gegen NS2B/NS3 ^pr0 aus ZIKV, YFV, DENV and WNV (20 μmol/L Quinacrin) und nsP2 ^pro aus CHIKV (5 μmol/L Quinacrin)

Figur 2: Quinacrin Titration gegen verschiedene Flavivirus und Alphavirus Proteasen; Ordinatenachse Y: normalisierte Protease Aktivität (schwarze Balken) bzw. Inhi- bition (graue Balken) in [%] von Flavivirus und Alphavirus Proteasen Abszissenachse X: Stoffmengenkonzentration Quinacrin [μmol/L]

A: Quinacrin und ZIKV NS2B/NS3 ^pro B: Quinacrin und DENN/ NS2B/NS3 ^pro

C: Quinacrin und WNV NS2B/NS3 ^pro D: Quinacrin und YFV NS2B/NS3 ^pro E: Quinacrin und CHIKV nsP2 ^pro Figur 3: Dosis-Wirkungs-Kurve zur ICso-Bestimmung Ordinatenachse Y: normalisierte Proteaseaktivität [%] von Flavivirus und Alpha- virus Proteasen

Abszissenachse X: Logarithmus der Stoffmengenkonzentration von Quinacrin [μmol/L]

A: Dosis-Wirkungs-Kurve von Quinacrin und ZIKV NS2B/NS3 ^pro B: Dosis-Wirkungs-Kurve von Quinacrin und DENV NS2B/NS3 ^pro

C: Dosis-Wirkungs-Kurve von Quinacrin und WNV NS2B/NS3 ^pro D: Dosis-Wirkungs-Kurve von Quinacrin und YFV NS2B/NS3 ^pro E: Dosis-Wirkungs-Kurve von Quinacrin und CHIKV nsP2 ^pro Figur 4: Lineweaver-Burk-Diagramme zur Bestimmung des Inhibitionsmodus von Quinacrin gegen Flavivirus und Alphavirus Proteasen.

Ordinatenachse Y: 1/v mit v = Reaktionsgeschwindigkeit Abszissenachse X: 1/[S] mit [S] =Substratkonzentration

A: Lineweaver-Burk-Diagramm zur ZIKV NS2B/NS3 ^pr0 Hemmung durch Quinacrin B: Lineweaver-Burk-Diagramm zur DENV NS2B/NS3 ^pro Hemmung durch Quinacrin

C: Lineweaver-Burk-Diagramm zur WNV NS2B/NS3 ^pro Hemmung durch Quinacrin D: Lineweaver-Burk-Diagramm zur YFV NS2B/NS3 ^pro Hemmung durch Quinacrin E: Lineweaver-Burk-Diagramm zur CHIKV nsP2 ^pro Hemmung durch Quinacrin I) Aktivitätstest und Inhibitionstest

Zum Nachweis der Wirkung von Quinacrin auf die virale Cysteinproteaseaktivität und/oder Serinproteaseaktivität, wurden Inhibitionstests durchgeführt.

Dabei wurde beispielhaft der Einfluss von Quinacrin auf die Protease Enzym-Aktivität der NS2B/NS3 ^pro der Flaviviridae und nsP2 ^pro der Togaviridae untersucht. Die Aktivitätstests der Flaviviridae Proteasen (ZIKV, DENN/, YFV und WNV NS2B/NS3 ^pro ) wurden unter Verwendung des fluorogenen Substrats BOC-GRR-AMC (Bachem, Schweiz) in 20 mmol/L Tris pH 8,5, 10% Glycerol, 0.01% Triton X-100 [1-3] durchgeführt.

Die Aktivitätstests der Togaviridae Protease (CHIKV nsP2 ^pr0 ) wurden unter Verwendung ei- nes fluorogenen Substrats DABCYL-KTSAVLQjSGFRKME-EDANS (Bachem, Schweiz) in einem Puffer mit 20 mmol/L Tris pH 7,2, 200 mmol/L NaCI, 1 mmol/L EDTA und 1 mmol/L TCEP durchgeführt.

Diese Reaktionsmischungen wurde in eine Corning 96-Well-Platte (Sigma Aldrich), enthal- tend 0,5 μmol/L NS2B/NS3 ^pro Proteinase Protein bzw. nsP2 ^pro Proteinase Proteins, pipettiert, und der Assay wurde mit der Zugabe der jeweiligen zuvor genannten Substrate in einer End- konzentration von 50 μmol/L gestartet.

Die Inhibierung der Serinprotease bzw. der Cysteinprotease-Aktivität aus unterschiedlichen Viren (ZIKV, YFV, DENV, WNV und CHIKV) durch Quinacrin wurde mit dem oben beschrie- benen Aktivitätsassay untersucht. 10 μmol/L der Proteasen wurden jeweils einzeln für einen ersten Screening-Test verwendet.

Für die anschließenden Inhibitionstests wurden 0,5 μmol/L des NS2B/NS3 ^pro bzw. des nsP2 ^pro Proteins mit 20 μmol/L Quinacrin für die NS2B/NS3 ^pro Protease und 5 μmol/L Quinacrin für die nsP2 ^pro Protease inkubiert. Die Mischungen wurden 30 Minuten lang bei RT inkubiert. Nach Zugabe des Substrats mit einer Endkonzentration von 50 μmol/L wurde die Zunahme/Änderung der Fluoreszenzintensitäten in 60 s-lntervallen über 30 Minuten mit ei- nem Plattenlesegerät Infinite 200 PRO (Tecan, Männedorf, Schweiz) gemessen. Die Tempe- ratur wurde auf 37 °C eingestellt. Sobald das fluorogene Substrat von der NS2B/NS3 ^pr0 Pro- tease bzw. der nsP2 ^pro Protease gespalten wird, erhöht sich die messbare Fluoreszenz, da der FRET (Förster-Resonanzenergietransfer) Farbstoff des Substrats freigesetzt und damit messbar wird. Also entspricht eine hohe Fluoreszenzintensität einer hohen Proteaseaktivität- Aktivität. Eine Reduktion der Fluoreszenzintensität kann daher auf eine entsprechende Inhi- bierung dieser Protease zurückgeführt werden.

Die Anregungs- und Emissionswellenlängen betrugen 360 nm bzw. 460 nm für nsP2 ^pro des CHIKV und 380 nm bzw. 465 nm für NS2B/NS3 ^pro der ZIKV, DENV, YFV und WNV. Die Inhi- bitionstests wurden als Triplikate durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Figur 1 dargestellt. Auf der Abszisse (X-Achse) sind unterschiedliche Versuchsansätze (ZIKV, YFV, DENV, WNV und CHIKV) mit den unterschiedlichen Virusproteasen dargestellt. Versuchsansatz „Kontrolle“ zeigt Ergebnisse ohne Zusatz von Quinacrin bzw. Inhibitor (schwarzer Balken).

Versuchsansatz „ZI KV“ zeigt Ergebnisse der Serin-Proteaseaktivität aus dem Zika Virus nach Zusatz von 20 mGhoI/I- Quinacrin.

Versuchsansatz „YFV“ zeigt Ergebnisse der Serin-Proteaseaktivität aus dem Gelbfieber Vi- rus nach Zusatz von 20 mGhoI/I_ Quinacrin.

Versuchsansatz „DENV“ zeigt Ergebnisse der Serin-Proteaseaktivität aus dem Dengue Virus nach Zusatz von 20 μmol/L Quinacrin.

Versuchsansatz „WNV“ zeigt Ergebnisse der Serin-Proteaseaktivität aus dem West-Nile Vi- rus nach Zusatz von 20 mihoI/L Quinacrin.

Versuchsansatz „CHIKV“ zeigt Ergebnisse der Cystein-Proteaseaktivität aus dem Chikungunya Virus nach Zusatz von 5 mihoI/L Quinacrin.

Jeder Versuchsansatz wurde mit frischem, gereinigtem Protease Protein durchgeführt.

Die Hemmung der Protease-Aktivität wurde mit folgender Gleichung (1) berechnet:

(1) Protease-Aktivität in [%] = Fluoreszenz-Intensität der nach der Inhibition ver- bleibenden Enzymaktivitäts-Intensität / Fluoreszenz-Intensität der Enzymakti- vität ohne Inhibition

Die Ergebnisse zeigen, dass eine Zugabe von 20 μmol/L Quinacrin die Aktivität der NS2B/NS3 ^pro Protease der Flaviviridae um mehr als 88% effizient hemmen konnte (siehe Fi- gur 1).

Da bei einer Quinacrin Konzentration von 20 mhioI/I_ die CHIKV nsP2 ^pro Aktivität bereits um 100% gehemmt war, wurde das Experiment für diese Protease noch einmal mit einer gerin- geren Konzentration, und zwar mit einer Konzentration von 5 mhioI/I- Quinacrin wiederholt. Nach Zugabe dieser geringeren Konzentration wurde die CHIKV nsP2 ^pro Protease Aktivität um ca. 95% inhibiert (Siehe Figur 1).

Die Ergebnisse zeigen insgesamt, dass Quinacrin die Protease Aktivität aller getesteten Vi- rus Proteasen um mehr als 88% hemmen konnte.

Anschließend wurden Quinacrin Titrationsexperimente mit allen fünf Virus Proteasen durch- geführt, um den Konzentrationseffekt des Inhibitors auf die Protease Aktivität zu untersuchen (siehe Figur 2 und Tabelle 1).

Basierend auf diesen Titrationsexperimenten des erfindungsgemäßen Inhibitors in einem spezifischen Aktivitätstest mit verschiedenen Flavivirus und Alphavirusproteasen (Zika Virus (ZIKV), Dengue Virus (DENV), Gelbfieber Virus (YFV), West-Nil Virus (WNV) und auch Pro- tease des Chikungunya Virus (CHI KV), konnte jeweils ein IC50 Wert bestimmt werden (siehe Figur 2 und Tabelle 1).

Basierend auf diesen Quinacrin Titrationsexperimenten konnten die IC50 und K, Werte für diese Serin- und Cystein- Virus Proteasen bestimmt werden. Insgesamt lagen diese IC50 Werte alle < 3 μmol/l:

ZIKV NS2B/NS3 ^pro : 2,5 ± 0,7 μmol/L DENV NS2B/NS3 ^pro : 2,8 ± 1,0 μmol/L YFV NS2B/NS3 ^pro : 1 ,6 ± 0,4 μmol/L WNV NS2B/NS3 ^pro : 1 ,3 ± 0,5 μmol/L CHIKV nsP2 ^pro : 0,46 ± 0,1 μmol/L

(Siehe Figur 3 und Tabelle 2).

Die folgende Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der Messungen der Proteaseaktivität unter- schiedlicher Viren bei unterschiedlich zugegebenen Stoffmengenkonzentrationen von Quinacrin.

Tabelle 1 : Abnahme der getesteten Virus Protease Aktivität unterschiedlicher Viren in Abhängigkeit der zugegebenen Quinacrin Konzentration

II) IC ₅₀ Bestimmung: Um den Wert der halbmaximalen Inkubationskonzentration (IC5 ₀ Wert) für Quinacrin zu be- stimmen, wurde die Anfangsgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion gegen verschie- dene Konzentrationen von Quinacrin mit Hilfe einer Dosis-Wirkungs-Kurve in der Software GraphPad Prism5 aufgetragen.

In Figur 3 ist auf der Ordinate (Y-Achse) die normalisierte Aktivität [%] von Flavivirus und Al- phavirus Proteasen gegen den Logarithmus der Stoffmengenkonzentration in mihoI/L (Abs- zisse X-Achse) von Quinacrin, aufgetragen. Dabei zeigen die einzelnen Graphen folgendes: Figur 3 Graph A: Dosis-Wirkungs-Kurve von Quinacrin auf ZIKV NS2B/NS3 ^pro Figur 3 Graph B: Dosis-Wirkungs-Kurve von Quinacrin auf DENV NS2B/NS3 ^pro Figur 3 Graph C: Dosis-Wirkungs-Kurve von Quinacrin auf WNV NS2B/NS3 ^pr0 Figur 3 Graph D: Dosis-Wirkungs-Kurve von Quinacrin und YFV NS2B/NS3 ^pro Figur 3 Graph E: Dosis-Wirkungs-Kurve von Quinacrin und CHIKV nsP2 ^pr0

Tabelle 2 zeigt die IC5 ₀ und K Werte, die aus den zuvor aufgeführten Dosis-Wirkungs-Kurven erhalten wurden.

Tabelle 2: ICsoWerte und K Werte von Quinacrin als Inhibitor gegen Proteasen unter- schiedliche Vertreter von Flaviviren und Alphaviren

III) Bestimmung von Inhibitionsmodus und Inhibitionskonstante Basierend auf der bekannten Michaelis-Menten-Gleichung/ Kinetik wurden zusätzliche Pro- teaseaktivitätstests durchgeführt, um den Inhibitionsmodus von Quinacrin auf die Protease- aktivität näher zu untersuchen.

Dazu wurde bei verschiedenen Endkonzentrationen des Inhibitors Quinacrin und des zuvor genannten Substrats die Reaktionsgeschwindigkeit der NS2B/NS3 Protease bzw. der nsP“ Protease bestimmt. 0,5 μmol/L dieser Proteasen wurde dazu mit Quinacrin in verschiedenen Konzentrationen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion durch Zugabe der entsprechenden Konzentrationsreihe des Substrats eingelei- tet und die Reaktionsgeschwindigkeit durch Bestimmung der Fluoreszenzintensität gemäß den zuvor unter I) beschriebenen allgemeinen Versuchsbedingungen bestimmt. Die Daten- analyse wurde mit Hilfe eines Lineweaver-Burk-Plots durchgeführt. Dabei wurde der Kehr- wert der Reaktionsgeschwindigkeit (1/V) gegen den Kehrwert der Substratkonzentration (1/[S]) aufgetragen [5, 6],

Alle Messungen wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die Inhibitionskonstante (K) wurde mit der folgenden Gleichung (2) ermittelt:

(2) K _i = IC ₅₀ /(([S]/KM)+1))

Der Ki Wert gibt die Affinität des Enzyms bzw. der Protease zum jeweiligen Inhibitor an.

Der ICsoWert wurde wie zuvor beschrieben bestimmt. Der KM Wert wurde aus einer Daten- bank (BRENDA-Datenbank) gewonnen und [S] ist die Konzentration des in den Versuchsan- sätzen verwendeten Substrats [7],

In Figur 4 ist auf der Abszisse (X-Achse) der Kehrwert der Substratkonzentration [1/S] ange- geben. Auf der Ordinate (Y-Achse) ist der Kehrwert der Reaktionsgeschwindigkeit [1/V] auf- getragen.

Die Graphen A bis E in Figur 4 zeigen:

A: Lineweaver-Burk-Diagramm zur ZIKV NS2B/NS3 ^pr0 Hemmung durch Quinacrin bei unter- schiedlichen Endkonzentrationen von Quinacrin und zwar 0; 0,25; 0,5; und 1 ,0 μmol/L. Die Ergebnisse bei den unterschiedlich eingestellten Endkonzentrationen von Quinacrin und die dazugehörigen Werte der Reaktionsgeschwindigkeiten sind in Graph A durch unterschiedli- che Symbole (●, ■, ♦ ,▲) dargestellt.

B: Lineweaver-Burk-Diagramm zur DENV NS2B/NS3 ^pro Hemmung durch Suramin bei unter- schiedlichen Endkonzentrationen von Quinacrin und zwar 0; 0,5; 0,75; 1 ,0 μmol/L. Die Er- gebnisse bei den unterschiedlich eingestellten Endkonzentrationen von Quinacrin und die dazugehörigen Werte der Reaktionsgeschwindigkeiten sind in Graph B durch unterschiedli- che Symbole (●, ■, ♦ ,▲) dargestellt.

C: Lineweaver-Burk-Diagramm zur WNV NS2B/NS3 ^pr0 Hemmung durch Quinacrin bei unter- schiedlichen Endkonzentrationen von Quinacrin und zwar 0; 0,5; 0,75; und 1,0 μmol/L. Die Ergebnisse bei den unterschiedlich eingestellten Endkonzentrationen von Quinacrin und die dazugehörigen Werte der Reaktionsgeschwindigkeiten sind in Graph A durch unterschiedli- che Symbole (●, ■, ♦ ,▲) dargestellt.

D: Lineweaver-Burk-Diagramm zur YFV NS2B/NS3 ^pr0 Hemmung durch Quinacrin bei unter- schiedlichen Endkonzentrationen von Quinacrin und zwar 0; 0,5; 0,75; und 1 ,0 μmol/L. Die Ergebnisse bei den unterschiedlich eingestellten Endkonzentrationen von Quinacrin und die dazugehörigen Werte der Reaktionsgeschwindigkeiten sind in Graph A durch unterschiedli- che Symbole (●, ■, ♦ ,▲) dargestellt.

E: Lineweaver-Burk-Diagramm zur CHIKV NS2B/NS3 ^pro Hemmung durch Quinacrin bei un- terschiedlichen Endkonzentrationen von Quinacrin und zwar 0; 0,1; 0,25; und 0,5 μmol/L. Die Ergebnisse bei den unterschiedlich eingestellten Endkonzentrationen von Quinacrin und die dazugehörigen Werte der Reaktionsgeschwindigkeiten sind in Graph A durch unterschiedli- che Symbole (●, ■, ♦ ,▲) dargestellt.

Die in dieser Darstellung erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass Quinacrin ein kom- petitiver Inhibitor für die viralen Cysteinproteasen und/oder Serinproteasen, insbesondere vi- rale NS2B/NS3 und/oder nsP2 Proteasen ist.

Während die Erfindung anhand von besonderen Ausführungsbeispielen im vorangehenden Teil der Anmeldung eingehend beschrieben und bebildert wurde, sollen diese Beschreibung und die Figuren lediglich als Beispiel gelten, ohne dadurch einschränkend zu wirken. Es ist davon auszugehen, dass ein Fachmann im Rahmen seines Fachwissens selbst weitere Än- derungen und Modifikationen der nachfolgenden Ansprüche vornehmen würde und könnte, die durch den Schutzbereich der Ansprüche mit abgedeckt sind. Insbesondere sind im Rah- men der Erfindung weitere Ausführungsformen mit jeder Art von Kombinationen der erwähn- ten Merkmale einzelner Ausführungsbeispiele mit umfasst.

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[5] Roy A, Lim L, Srivastava S, Lu Y, Song J, Solution conformations of Zika NS2B-NS3pro and its Inhibition by natural products from edible plants. PloS one 2017;12:e0180632 [6] Motulsky H, Christopoulos A, Fitting models to biological data using linear and nonlinear regression: a practical guide to curve fitting. Oxford University Press. 2004 [7] Wu QY, Jiang LL, Yang SG, Zuo Y, Wang ZF, Xi Z, et al. Hexahydrophthalimide-benzo- thiazole hybrids as a new dass of protoporphyrinogen oxidase Inhibitors: synthesis, struc- ture-activity relationship, and DFT calculations. New J. Chem. 2014;38(9): 4510-4518