Probenahmesystem'für fluide Proben Die vorliegende Erfindung betrifft ein Probenahme- system für fluide Proben. Derartige Probenahmesysteme werden insbesondere benötigt, wenn eine Probe aus ei- ner Flüssigkeit mit einer Simultan-Inaktivierung der Probe entnommen werden soll. Ziel einer derartigen schnellen Probenahme ist es dabei, trotz hoher Um- satzraten einer in der Flüssigkeit stattfindenden chemischen oder biologischen Reaktion ein repräsenta- tives Abbild der in der Flüssigkeit zum Zeitpunkt der Probenahme vorliegenden Konzentrationen zu erhalten.

Um trotz hoher Umsatzraten eine repräsentative Probe zu erhalten, ist es notwendig, während der Probenahme die Reaktion in wenigen Millisekunden abzustoppen.

Derartige Probenahmesysteme werden insbesondere benö- tigt, um intrazellulär vorliegende Stoffwechselpro- dukte (Metabolite) von biologischen Proben in einem Bioreaktor zu bestimmen. Sie werden jedoch auch ganz allgemein im Bereich der Biotechnologie, der Chemie- industrie, der Pharmaindustrie, der Lebensmittelin- dustrie, in der Umwelttechnik für Behörden, bei- spielsweise Umweltschutzbehörden sowie in Analysenla- boren eingesetzt

Eine allgemein anerkannte Methode (de Koning et al.

Anal Biochem 204,118-123, 1992) den Stoffwechsel ei- ner Zellprobe aus einem Biorektor abzustoppen, ist die Mischung der Probe unmittelbar nach der Probenah- me mit einer Inaktivierungsflüssigkeit. Danach kann durch das Einsprühen einer Zellprobe in ein auf-40°C gekühltes Gemisch aus Methanol und Wasser der Zell- stoffwechsel abrupt abgestoppt werden, so dass intra- zelluläre. Metabolite repräsentativ bestimmt werden können. Dazu kann beispielsweise die Probe über ein Tauchrohr durch schnelles Aufziehen einer Spritze in- dem Reaktor entnommen werden. Die Probe wird dabei in der Spritze mit der Inaktivierungsflüssigkeit ge- mischt und schnell auf tiefe Temperaturen abgekühlt und inaktiviert.

Alternativ kann auch eine. Probe aus einem Bioreaktor entnommen und anschließend das gefüllte Probenahmege- fäß in flüssigem Stickstoff gekühlt werden, so dass die enthaltene Probe inaktiviert wird.

Von Theobald et al. (Anal Biochem 214,31-37, 1993) ist eine Variante der Probenahme mit schneller Inak- tivierung bekannt, bei der eine Kapillare über ein manuelles Miniaturventil und eine Anstechnadel an ei- nem Bioreaktor gekoppelt wird. Zur Probenahme wird ein mit Perchlorsäure befülltes Reagenzglas mit einer Membran verschlossen, evakuiert und gekühlt. Um eine Probe aus dem Reaktor zu entnehmen wird die Membran mit der Kapillare durchstochen und das Ventil manuell geöffnet, so dass durch den Unterdruck im Reagenzglas eine Probe aus dem Reaktor gezogen und in die Inakti- vierungsflüssigkeit gesprüht wird.

Von Larsson et al. (J Biotechnol 49,69-82, 1996) wird eine schnelle Probenahme geschildert, bei der

ein Standardstutzen eines Bioreaktors mit einem 3/2- Wege-Magnetventil verbunden wird. Auch hier wird ein Reagenzglas mit Perchlorsäure niedriger Konzentration befüllt und gekühlt. Soll eine Probe entnommen wer- den, so wird das Reagenzglas unter dem einen Ausgang des 2/3-Wege-Ventils platziert und eine Zellprobe in das Reagenzglas gesprüht, wo sie durch die kalte Perchlorsäure inaktiviert wird.

Schäfer et al. (Anal Biochem 270,88-96, 1999) schil- dert eine Vorrichtung zur Bestimmung von intrazellu- lären Metabolitdynamikeri, bei der am Boden eines Bio- reaktors ein ansteuerbares Probenahmeventil befestigt ist. Zur schnell aufeinander folgenden Probenahme wird nun das Probenahmeventil geöffnet, so dass ein kontinuierlicher Probenstrom aus dem Reaktor ent- steht. Unter diesem Probenstrom wird eine Anordnung von Probenahmegefäßen vorbei transportiert, so dass in schneller Abfolge die einzelnen Proben in den Probenahmegefäßen gezogen werden.

Auch Lange et al. (Biotechnol Bioeng 75,406-415, 2001) offenbart eine Vorrichtung zur Bestimmung von intrazellulären. Metabolitkonzentrationen, bei der ein Reagenzglas mit einem Gemisch aus Methanol und Wasser befüllt und tiefgekühlt wird. Über zwei Quetschventi- le wird eine Probe aus einem Bioreaktor in das Rea- genzglas geleitet, in dem die Probe inaktiviert wird.

Diese dargestellten Vorrichtungen zur Probenahme und Inaktivierung besitzen sämtlich gravierende Nachtei- le.

Die manuelle Probenahme durch eine mit tiefgekühlter Inaktivierungsflüssigkeit gefüllte Spritze bedingt,

dass die Probe aus dem Reaktor von oben über ein Tauchrohr gezogen wird. Durch das manuelle Ansaugen, und die dadurch geringe Strömungsgeschwindigkeit im Tauchrohr, wird die Verweilzeit der Probe bis zur Durchmischung mit der Inaktivierungsflüssigkeit in der Spritze zu lang, so dass nicht mehr davon ausge- gangen werden kann, dass während der Probenahme keine Umsetzungen stattfinden. Es ist daher bei Reaktionen mit hohen Umsatzraten nicht möglich, eine repräsenta- tive Probe aus dem Reaktor zu entnehmen.

Auch bei der Probenahme mit anschließender Inaktivie- rung durch tiefe Temperaturen in flüssigem Stickstoff ist die Verweilzeit von der Probenahme bis zur Inak- tivierung zu lang, so dass nicht. von einer repräsen- tativen Probenahme ausgegangen werden kann.

Um bei den drei Varianten der schnellen Probenahme mit einem Probenahmeventil eine kurze Verweilzeit der Probe bis zur Inaktivierung (Kontakt mit der Inakti- vierungsflüssigkeit) verwirklichen zu können, befin- det sich der Probenahmestutzen jeweils unterhalb der Flüssigkeitsoberfläche im Reaktor. Dennoch wird in allen Fällen die Probe erst über eine Kapillare oder ein Rohr aus dem Reaktor entnommen und anschließend inaktiviert. So entsteht immer eine gewisse Verweil- zeit der Probe im Verbindungsrohr von der Entnahme bis zur Inaktivierung.

Zusätzlich wird die Probe jeweils von oben in die Probenahmegefäße eingesprüht, so dass die Möglichkeit besteht, dass die Probe an der tiefgekühlten Gefäß- wand gefriert. Es besteht die Gefahr, dass die Probe durch die Bildung von Eiskristallen verändert wird oder ungleich von der restlichen Probe inaktiviert

wird. Soll das Probenahmesystem eingesetzt werden, um intrazelluläre Metabolite zu untersuchen, so ist in der Bildung von Eiskristallen ein Problem zu sehen, da die Zellen durch deren Bildung zerstört werden können. Eine quantitative Trennung von extrazellulär und intrazellulär vorliegenden Metaboliten ist dann nicht mehr möglich.

Zusätzliche Nachteile sind darin zu sehen, dass im Falle eines manuellen Öffnens des Probenahmeventils nicht davon ausgegangen werden kann, dass die Proben- menge immer gleich groß ist. Hierdurch entstehen Un- terschiede bei der Probenbehandlung, da die Inakti- vierung nicht immer gleich erfolgt. Außerdem besteht durch das Anstechen der Probenahmegefäße mit der Ka- pillare die Gefahr, sich bei der Probenahme zu ver- letzen.

Ein zusätzlicher Nachteil, wenn die Probe in offene Probenahmegefäße gesprüht wird liegt darin, dass von einer Aerosolbildung auszugehen ist. Nach dem Gen- technikgesetz ist aber bei der Probenahme aus einem Bioreaktor. bereits bei rekombinanten Organismen der niedrigsten Sicherheitsstufe (S1) die Aerosolbildung zu vermeiden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Probenahmesystem zur Verfügung zu stellen, bei dem die Verweilzeit der Probe bis zur Inaktivierung mini- mal ist. Weiterhin soll das Probenahmesystem einfach zu bedienen sowie leicht und kostengünstig herstell- bar sein.

Diese Aufgabe wird durch das Probenahmesystem nach Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Probenahmesystems werden in den je-

weiligen abhängigen Ansprüchen beschrieben.

Erfindungsgemäß, besteht das Probenahmesystem aus zwei Teilen, nämlich einer Probenahmesonde und einem Pro- benaufnahmegefäß. Die Probenahmesonde kann in das Fluidvolumen, aus dem eine Probe entnommen werden soll, eingetaucht werden, wobei die Probenahmesonde an dem eingetauchten Ende durch ein Ventil verschlos- sen ist. Das Probenaufnahmegefäß ist seinerseits so ausgebildet, dass es in die Probenahmesonde einge- führt werden kann. Es ist. ebenfalls an einem seiner Enden mit einem Ventil verschlossen. Zur Probenahme wird nun das Probenaufnahmegefäß in die Probenahme- sonde eingeführt und die beiden Ventile werden geöff- net. Dadurch strömt die Probe durch die beiden Venti- le in das Probenaufnahmegefäß. In. dem Probenaufnahme- gefäß befindet sich eine Inaktivierungsflüssigkeit, beispielsweise eine gekühlte Mischung aus Methanol und Wasser unter Unterdruck. Beim Einströmen der Pro- be durch den Unterdruck in das Probenaufnahmegefäß mischt sich diese mit der Inaktivierungsflüssigkeit und wird rasch inaktiviert.

Besonders vorteilhaft ist es, wenn sowohl die Probe- nahmesonde als auch das Probenaufnahmegefäß als Rohr bzw. Röhrchen ausgebildet ist, die ineinander ein- führbar sind. Die Ventile können ihrerseits so ausge- bildet sein, dass sie sich bei Aufeinanderdrücken ge- meinsam öffnen und bei Auseinanderziehen wieder beide schließen. Dadurch kann auf einfache Weise die Probe- nahmesonde in das Fluidvolumen eingetaucht werden und dann das Probenaufnahmegefäß in die Probenahmesonde eingedrückt und wieder herausgezogen werden, um eine zuverlässige Probenahme durchzuführen.

Im Gegensatz zur bisher durchgeführten Probenahme mit

einem Tauchrohr oder einer Kapillare kann mit dem er- findungsgemäßen Probenahmesystem durch die Probenah- me-und Inaktivierungsposition direkt im Reaktor die Verweilzeit von der Probenahme bis zur Probeninakti- vierung stark verringert werden.

Bisher besteht keine Möglichkeit, in Bioreaktoren aus Glas, die nur vom Deckel aus zugänglich sind, Unter- suchungen der im Bioreaktor vorliegenden intrazellu- lären Konzentrationen durchzuführen. Mit dem erfin- dungsgemäßen Probenahmesystem kann dieses Problem ge- löst werden, indem die Prdbenahmesonde beständig in den Bioreaktor eintaucht und von außen zur Einführung des Probenaufnahmegefäßes zugänglich ist.

Eine weitere Verbesserung besteht darin, dass die Probe nicht direkt mit der kalten Gefäßwand in Berüh- rung kommt, sondern erst nachdem sie mit der Inakti- vierungsflüssigkeit durchmischt wurde. Sollen z. B. intrazelluläre Metabolite bestimmt werden, dann wird die Probe mit dem tiefgekühlten Gemisch aus Methanol und Wasser in Kontakt gebracht, so dass sich der Ge- frierpunkt erniedrigt und sich keine Eiskristalle bilden können. Die Zerstörung von Zellen durch die Bildung von Eiskristallen wird vermieden.

Weiterhin besteht durch die Konstruktion des Probe- nahmesystems keinerlei Verletzungsgefahr.

Durch die Probenahme bis zum Druckausgleich ist die Probenmenge bei gleichem Unterdruck im Probenahmege- fäß und bei gleicher Füllmenge mit Inaktivierungs- flüssigkeit immer gleich groß.

Eine zusätzliche Verbesserung der Probenahme besteht

darin, dass mit dem erfindungsgemäßen System keine Aerosolbildung auftritt und so auch gentechnisch ver- änderte Organismen untersucht werden können.

Neben der Bestimmung von intrazellulären Metaboliten von Zellproben aus Bioreaktoren kann die hier ange- meldeten Erfindung noch in vielen weiteren Bereichen eingesetzt werden : Grundsätzlich kann eine Probenahme mit Hilfe dieser Probenahmetechnik in der beschriebenen Weise bei al- Ien schnellen Reaktionen chemischer oder biochemi- scher Art erfolgen, wenn jeweils ein geeignetes Inak- tivierungsreagenz eingesetzt wird.

Da die Probenahme auf einfache Weise manuell durchge- führt werden kann, ist bei Verwendung genormter Pro- benahmegefäße der Einsatz bei Routinekontrollen von Prozessen und Anlagen durch das Schichtpersonal der Betreiber'oder durch Aufsichtsbehörden möglich. Die oftmals aufwendige und qualifiziertes Personal und Gerät erfordernde Analytik kann nachfolgend in ent- sprechend qualifizierten und zertifizierten Labors erfolgen.

Von besonderem Vorteil ist die geschlossene Konstruk- tion des Probenahmegefäßes, da eine Manipulation bei der Probenahme und dem anschließenden Transport zur Analyse mit einfachen Maßnahmen ausgeschlossen werden kann.

Weiterhin können aufgrund der geschlossenen Konstruk- tion auch gesundheitsgefährdende bzw. toxische Proben aus Apparaten, Anlagen oder Kanälen entnommen werden, ohne das Personal zu gefährden.

Die Anwendung dieser einfachen, manuellen Probenahme- technik ist nicht auf Flüssigkeiten beschränkt, son- dern kann ebenso auf Gase angewendet-werden.

Im Folgenden werden nun einige Beispiele erfindungs- gemäßer Probenahmesysteme beschrieben.

Es zeigen Fig. 1 ein Probenahmesystem in einem Bioreaktor ; Fig. 2 eine Probenahmesonde ; Fig. 3 ein Probenaufnahmegefäß ; Fig. 4 das Zusammenwirken der Ventile in der Pro- beaufnahmesonde und dem Probenaufnahmege- fäß ; Fig. 5 Bis 7 verschiedene Formen von Probenaufnahmegefä- ßen ; Fig. 8 Messergebnisse mittels eines Probenahme- Systems ; und Fig. 9 die Ergebnisse eines Steriltests an einem Probenahmesystem.

Fig. 1 zeigt die Konstruktion und Funktionsweise ei- nes erfindungsgemäßen Probenahmesystems am Beispiel eines Laborbioreaktors 2. In dem Laborbioreaktor 2 befindet sich eine Zellsuspension. 4 mit einem Flüs- sigkeitsspiegel 6. Die Zellsuspension 4 wird durch einen Rührer 3 in Suspension gehalten. In diese Zell- suspension taucht nun ein Probenahmesystem 1 ein, das

aus zwei ineinander gesteckten zylinderförmigen Gefä- ßen besteht. Die sind zum einen das äußere Gefäß, die Probenahmesonde 10 sowie das in diese eingeführte Probenaufnahmegefäß 20. Die Probenahmeposition inner- halb des Bioreaktors 2 ist mit dem Bezugszeichen 5 bezeichnet. Dadurch wird die Probe unmittelbar in der Flüssigkeit entnommen, so dass der Transport der Pro- be aus der Flüssigkeit in die in dem Probenaufnahme- gefäß 20 befindliche Inaktivierungsflüssigkeit mini- miert wird. Dadurch kann sichergestellt werden, dass die Verweilzeit bis zur Inaktivierung nur kurz ist und während der Probenahme möglichst keine Umsetzun- gen erfolgen.

Fig. 2 zeigt nun eine Probenahmesonde 10 in verschie- denen Ansichten 2A, 2B und 2C. Die Probenahmesonde 10 ist ein oben an seinem einen Ende 16 offenes Edel- stahlrohr, das in einen Standardstutzen 13 eines Re- aktors passt. Am anderen Ende 17 des Edelstahlrohres 10 befindet sich ein Ventil 12 zur Probenahme. Nach Einführen der Probenahmesonde 10 in den Standardstut- zen 13 eines Bioreaktors kann über die Probenahmeson- de 10 eine Überwurfmutter 14 auf den'Standardstutzen 13 geschraubt werden, so dass ein dichter Abschluss zwischen dem Standardstutzen 13 und der Probenahme- sonde 10 vorliegt.

Während Fig. 2A einen Schnitt A-A (siehe Fig. 2B) zeigt, stellt Fig. 2C eine Vergrößerung des Ventils 12 und des Endes 17 aus Fig. 2A dar.

In die Edelstahlwandung 11 der Probenahmesonde 10 ist an deren Ende 17 das Ventil 12 abdichtend einge- bracht. Das Ventil 12 besitzt dabei eine durchgehende Bohrung 33a in der Längsrichtung der Probenahmesonde 10. In diese Bohrung 33a ist ein Ventilzylinder 31a

eingebracht, der seinerseits an den Wänden der Boh- rung dichtend anliegt. Dieser Ventilzylinder ist über eine Feder 35a federnd gelagert, so dass er in Längs- achse der Probenahmesonde 10 verschieblich ist. Die Feder drückt dabei den Ventilzylinder 31a in die Pro- benahmesonde 10 hinein.

Das Ventil 12 besitzt am Ende der Probenahmesonde 10 eine Nut 37a, an der der Ventilzylinder 31a hervor- steht. Dort ist der Ventilzylinder 31a mit einer um- laufenden Gummiringdichtung 36a versehen, die den Spalt zwischen dem Ve zylinder 31a und dem Ventil- gehäuse 32a abdichtet, wenn der Ventilzylinder 31a durch die Feder 35a maximal in das Innere der Probe- nahmesonde verschoben ist.

Der Ventilzylinder 31a besitzt weiterhin eine Innen- bohrung 33a', die mit der Bohrung 33a kommuniziert.

Diese Bohrung ist jedoch am nach außen gerichteten Ende des Ventilzylinders 31a verschlossen. In der seitlichen Wandung des Ventilzylinders 31a sind je- doch Durchgangsbohrungen 34a vorgesehen, die die Au- ßenseite der Wandung des Ventilzylinders 31a mit der Bohrung 33a'verbinden.

Wird nun der Ventilzylinder 31a entgegen der Feder- kraft der Feder 35a nach außen gedrückt, so werden die Bohrungen 34a offengelegt und ein Fluid kann von außerhalb der Probenahmesonde 10 in die Bohrung 33a' durch die Bohrung 34a einströmen und so in das Innere der Probenahmesonde 10 gelangen.

Fig. 3 zeigt in den Teilbildern A bis C ein erfin- dungsgemäßes Probenaufnahmegefäß 20. Dieses Proben- aufnahmegefäß besitzt eine Wandung 21 aus einem Kunststoffrohr, das an einem Ende 26 durch ein Ventil

22 und an seinem anderen Ende 25 durch einen Deckel 23 verschlossen ist. Dieses Kunststoffrohr 21 passt genau in die in Fig. 2 dargestellte Probenahmesonde 10 hinein. Fig. 3B zeigt nun einen Schnitt durch das Probenaufnahmegefäß 20 längs der Linie A-A in Fig. 3C während Fig. 3A ein Detail entsprechend dem unteren Ende 26 wie in Fig. 3B dargestellt, darstellt.

In dem Probenaufnahmegefäß 20 befindet sich. wie in Fig. 3B dargestellt, eine Inaktivierungsflüssigkeit 28r beispielsweise eine gekühlte Mischung aus Wasser und Methanol. Oberhalb dieser Flüssigkeit 28 befindet sich ein Bereich 27, der unter, Unterdruck steht bzw. teil-oder ganzevakuiert ist. Wird nun das Ventil 22 geöffnet, so kann aufgrund des Unterdrucks in den Be- reich 27 ein Fluid durch das Ventil in das Innere des Probenaufnahmegefäßes eingesaugt werden und sich mit der Inaktivierungsflüssigkeit 28 mischen.

Der Aufbau des Ventils 22 ist ähnlich dem Aufbau des Ventils 12 in Fig. 2. Das Ventil 22 besitzt wiederum ein Ventilgehäuse 32B als Führung für einen zentral angeordneten Ventilzylinder 31b. Dieser Ventilzylin- der ist wiederum über eine Feder 35b gelagert, wobei dieses Mal die Feder 35b den Ventilzylinder 31b'nach außen drückt. Dementsprechend ist der Ventilzylinder an seinem oberen Ende über einen Dichtring 36b'in dem nach außen gedrückten Zustand gegen das Ventilge- häuse 32B, 38B'abgedichtet. Weiterhin besitzt das Ventilgehäuse einen äußeren Dichtring 36b, mit dem das Ventilgehäuse 32B in die Probenahmesonde 10 ein- geführten Zustand gegen das Ventilgehäuse 32A abge- dichtet werden kann. Wiederum besitzt das Ventilge- häuse 32B eine Durchgangsbohrung 33b, in der die Fe- der 35b und der Ventilzylinder 31b angeordnet sind.

Fig. 4 zeigt das Zusammenwirken der Ventile 12 und 22, wobei Fig. 4A den Zustand zeigt unmittelbar vor Zusammenstecken der Probenahmesonde 10 und des Pro- benaufnahmegefäßes 20, während Fig. 4B die beiden Ventile in zusammengestecktem und geöffnetem Zustand zeigt. Hier wie in den vorigen und nachfolgenden Fi- guren werden für gleiche oder ähnliche Elemente glei- che oder ähnliche Bezugszeichen verwendet.

Auch die Wandung des Ventilzylinders 31b sowie die Wandung des Ventilzylinders 31a besitzt Bohrungen, die einen Durchgang zwischen ihrem Innenlumen 33a' bzw. 33b'und dem Raum außerhalb des Ventilzylinders 31a bzw. 31b herstellen.

In Fig. 4B ist gezeigt, wie beim Zusammenstecken der beiden Ventile 12 und 22 die beiden Ventilzylinder 31a und 31b aufeinander drücken und sich jeweils ent- gegen der Kräfte der Federn 35a bzw. 35b gegeneinan- der verschieben.

Dadurch werden die Bohrungen 34a und 34b in'einen Be- reich verschoben, in dem sie bezüglich der Bohrung 34a mit der die Probenahmesonde umgebende Flüssigkeit bzw. bezüglich der Bohrung 34b mit dem. Innenlumen der Bohrung 33b kommunizieren können. In Fig. 4B ist durch eine Pfeil der so eröffnete Weg für die Flüs- sigkeit der Probe von außerhalb der Probenahmesonde durch die beiden Ventile 12 und 22 in das Innenvolu- men 24 des Probenaufnahmegefäßes 20 eingezeichnet.

Durch diese konstruktive Ausgestaltung der beiden Ventile 12 und 22 ist es daher möglich, beide Ventile gleichzeitig zu öffnen und so einen Durchgang für die Probenahme zu schaffen. Es sind jedoch ohne weiteres weitere konstruktive Ausgestaltungen von Ventilen

vorstellbar, die gemeinsam öffnen. und schließen.

Soll also eine Probe aus dem Bioreaktor 2 entnommen werden, so wird das Probenaufnahmegefäß 20 teilweise mit der Inaktivierungsflüssigkeit 28, z. B. einem Ge- misch aus Methanol und Wasser befüllt. Anschließend wird die_im Probenaufnahmegefäß 20 befindliche Luft 27 über das Ventil 22 evakuiert. Das Gefäß 20 und die Flüssigkeit 28 werden auf tiefe Temperaturen gekühlt.

Zur Probenahme wird dann das gekühlte Probenaufnahme- gefäß 20. so in die Probenahmesonde 10 eingeführt, dass beide Ventile 12, 22, sich automatisch zeit- gleich öffnen. Die Funktionsweise der beiden Ventile ist in Fig. 4 dargestellt und dort beschrieben. Im geschlossenen Zustand pressen beide Federn 35a, 35b die Dichtringe 36a, 36b'auf ihre. jeweiligen Dicht- flächen und dichten dadurch die Ventile 12,22 ab.

Werden die beiden Ventile 12,22 zusammengeführt, dann stoßen die beiden Ventilzylinder 31a, 31b paßge- nau aufeinander und beide Federn 35a, 35b werden komprimiert. Beide Dichtringe 36a, 36b'werden von ihren Dichtsitzen entfernt und die Öffnungen 34a, 34b in den Ventilzylindern 31a, 31b freigegeben. Im ge- öffneten Zustand kann dann'die Probe wie in Fig. 4b durch die Pfeile dargestellt durch die Öffnungen 34a, 34b in den Ventilzylindern 31a, 31b strömen.

Durch den Druckunterschied zwischen Probenahmegefäß 20 und Reaktorinhalt wird die Zellsuspension aus dem Bioreaktor 2 in das Probenahmegefäß 20 (bis zum Druckausgleich) gesaugt, wo sie sich innerhalb von wenigen Millisekunden mit der gekühlten Flüssigkeit 28 vermischt. Dadurch wird der Zellstoffwechsel abge- stoppt. Anschließend wird das Probenahmegefäß 20 ma- nuell aus der Probenahmesonde 10 entnommen, wobei sich beide Ventile 12,22 wieder automatisch schlie-

ßen. Die inaktivierte Probe wird dann entweder sofort aus dem Probenaufnahmegefäß 20 entnommen und weiter aufbereitet, oder bis zur weiteren Probenbehandlung (tief) gekühlt. Sollen intrazelluläre Metabolite un- tersucht werden, so werden die Zellen (beispielsweise bei-20 °C) abzentrifugiert und das Zellpellet wird extrahiert. Danach werden die intrazellulären Metabo- lite im Zellextrakt analysiert.

Die Fig. 5 bis 7 zeigen verschiedene Möglichkeiten, das Probenaufnahmegefäß 20 auszugestalten, um eine optimale Vermischung von Probenflüssigkeit und Inak- tivierungsreagenz 28 zu erhalten.

Fig. 5 zeigt, wie an dem oberen Ende des Ventilgehäu- ses 32b eine Düse 40 angeordnet ist, die die Bohrung 33b in Richtung des Innenvolumens 24 des Probenauf- nahmegefäßes 20 fortsetzt und sich im Querschnitt dann düsenartig erweitert. Dadurch wird ein besseres Vermischen der Probeflüssigkeit mit der Inaktivierungsflüssigkeit 28 erzielt.

Fig. 6 zeigt ebenfalls ein Probenaufnahmegefäß 20, bei dem die Innenbohrung 33b nicht in Form einer Düse sondern in Form eines Innenrohres 41 fortgesetzt wird, das in Fig. 6 etwa in der Mitte der Inaktivie- rungsflüssigkeit 28 endet und dort eine Öffnung auf- weist. Dadurch wird die Probeflüssigkeit mitten in die Inaktivierungsflüssigkeit 28 eingebracht, so dass eine vollständige und raschere Vermischung mit einem größeren Inaktivierungsflüssigkeitsvolumen erzielt werden kann.

Fig. 7 zeigt eine ähnliche Strömungsführung wie in Fig. 6 mit einem Innenrohr 41, wobei dieses Innenrohr 41 nunmehr jedoch an seinem Ende in der Inaktive-

rungsflüssigkeit 28 verschlossen. ist. Stattdessen be- sitzt seine Wandung. über den Umfang verteilt Durch- lassbohrungen 42a-42c, 42a'-42c', 42a''-42b''und weitere Bohrungen, über die der Innenraum der Bohrung 41 mit der Inaktivierungsflüssigkeit 28 kommuniziert.

Diese Bohrungen sind jeweils um 90° gegeneinander auf dem Umfang des Strömungsrohres 41 verteilt. Die bei der Probenahme in das Strömungsrohr 41 einfließende Probeflüssigkeit wird. nun durch diese Bohrungen 42a- 42b''in die Inaktivierungsflüssigkeit 28 verteilt.

Bei der vorliegenden Erfindung ist es vorteilhaft, dass der Zellstoffwechsel der Mikroorganismen in der Probe innerhalb von einigen Millisekunden gestoppt wird. Dies wird durch den schnellen Abfall der Tempe- ratur während der Probenahme erreicht. Um die vorlie- gende Erfindung auf diese Anforderung hin zu überprü- fen, wurde mit einem NiCrNi-Thermoelement der Tempe- raturverlauf in einem Probenahmegefäß nach Fig. 3 aufgezeichnet. Die Messstelle befand sich 5 mm ober- halb des Einlassventils. Das Probenahmegefäß war mit 7 ml Inaktivierungsflüssigkeit mit einer Temperatur von-50°C befüllt und es wurde 1 ml Zellsuspension mit einer Temperatur von 37°C aus dem Reaktor entnom- men. In Fig. 8A ist der gesamte Temperaturverlauf , dargestellt, in Fig. 8B der zeitliche Ausschnitt un- mittelbar nach der Probenahme. Es ist deutlich zu er- kennen, dass die Probentemperatur in allen drei ge- messenen Fällen nach 100 ms unter-10°C gesunken ist.

Anzumerken ist hierbei, dass die Temperatur der Probe tatsächlich noch schneller absinkt als hier darge- stellt, da das Messsignal durch die Ansprechzeit des Thermoelementes stark verzögert ist.

Um die vorliegende Erfindung zur Probenahme aus Bio- reaktoren einsetzen zu können, muss sichergestellt

sein, dass der Reaktorinhalt durch die Probenahme nicht kontaminiert wird. Um dies zu überprüfen wurde ein Steriltest mit wiederholter Probenahme durchge- führt. Hierbei wurde zunächst über 5 Tage die Probe- nahmevorrichtung mit einem Probenahmegefäß nach Fig.

3 in einem Reaktor auf Sterilität geprüft. Ab dem 6.

Tag wurde mehrmals am Tag eine Probe mit dem Probe- nahmegefäß in der beschriebenen Weise aus dem Reaktor entnommen. Für die positive Gegenprobe wurde nach weiteren 5 Tagen der Reaktor mit E. coli K12 ange- impft. Die Sterilität des Reaktors bis zur positiven Gegenprobe und das-danach erfolgte Wachstum ist in Fig. 9 deutlich an dem Verlauf der CO2-und Os- Konzentrationen im Abgas zu erkennen, da erst durch die Zellatmung COs entsteht und Os verbraucht wird.