Die vorliegende Erfindung betrifft einen NADP(H)-Nanosensor, eine Zelle, ein Verfahren zum Isolieren von Genen, welche für NADP(H)-abhängige Enzyme kodieren, sowie die Verwendung eines NADP(H)-Nanosensors.

Die Nutzung von NADP(H)-abhängigen Enzymen in der chemischen Industrie als Katalysator ist in einer Vielzahl von Beispielen offenbart. So werden Alkoholdehydrogenasen, auch Oxidoreduktasen oder Ketoreduktasen genannt, zur Reduktion von Carbonylgruppen eingesetzt. Insbesondere wird die Enantiospezifität und Regiospezifität zur Reduktion prochiraler Ketone benutzt. Beispiele solcher Ketoreduktasen die zur Synthese nutzbarer chemischer Verbindungen dienen sind die asymetrische Reduktion von 4-Chloroacetoacetatestern (US 5,559,030, US 5,700,670 und US 5,891,685), die Reduktion von Dicarboxylsäuren (US 6,399,339), die Reduktion von tert-butyl (S) Chloro-5-hydroxy-3- oxohexanoat (US 6,645,746 und WO- A-01/40450), die Reduktion von Pyrrolotri- azine-basierten Verbindungen (US-A-2006/0286646), die Reduktion substituierter Acetophenone (US 6,800,477, US-A-2012/0178142) oder die Reduktion von Hydroxythiolanen (WO-A-2005/054491). Ebenso werden enzymatisch alpha-halo Ketone zu alpha-halo Alkoholen reduziert. Auch dies kann durch isolierte Enzy- me oder mit ganzen Zellen erfolgen (WO-A-2008/038050). Mittels spezifischer Alkoholdehydrogenasen aus Lactobacillus brevis oder Thermoanaerobium brokii erfolgt die Reduktion des 8-Chloro-6-oxooctanoicsäurealkylesters zum (R) oder (S)-8-Chloro-6-hydroxyoctanoicsäurealkylester, der jeweils als Vorstufe der (R)- α-Liponsäure und (S)-a- Liponsäure Verwendung findet (US 7,157,253). Auch sind Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven- Alkanolen beschrieben, wobei

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BESTÄTIGUNGSKOPIE durch enzymatische Reduktion der entsprechenden Ketone, die Herstellung von beispielsweise (l S)-3-Methylamino-l-(2-thienyl)-propan-l-ol und (lS)-3-Chlor- l-(2-thienyl)-propan-l-ol erfolgt ( WO- A-2006/094945). Ein Verfahren, um mittels Ketoreduktase oder Alkoholdehydrogenase enantiospezifisch 3-Hydroxy- butyl-3-hydroxybutyrate herzustellen, ist ebenfalls bekannt (US-A- 2012/0064611). In US 6,645,746 wird eine Aminosäuresequenz aus Candida magnoliae offenbart, die genutzt werden kann, um mit Hilfe von NADP(H) tert- Butyl (5S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoat zu tert-Butyl (3R,5S)-6-chloro-3,5- dihydröxyhexanoat zu reduzieren. In der Beschreibung dieses Dokuments wird das Enzym bevorzugt koexprimiert mit Glucosedehydrogenase aus Bacillus mega- terium eingesetzt, wobei die Regenerierung des Cofaktors NADP(H) mit Hilfe der Glucosedehydrogenase und mit Glucose als Cosubstrat erfolgt. Die WO-A- 2004/111083 beschreibt ein Verfahren zur enantioselektiven enzymatischen Reduktion von Ketonen, insbesondere 2- und 3-Oxosäureestern, wobei die Reaktion von einer Oxidoreduktase aus Pichia capsulata katalysiert wird. In der WO-A- 2005/108593 wird ein Verfahren zur Herstellung von 1-Butanol beschrieben, bei dem 2-Butanon mit einer Carbonylreduktase, beispielsweise aus Candida parapsi- losis, und einem Coenzym in einem Zweiphasensystem reduziert wird. In der EP- A-2 061 880 ist ein Verfahren zur NADP(H)-abhängigen enzymatischen Herstel- lung von Alkenon-Derivaten aus α,β-ungesättigten Alkinon-Derivaten offenbart, wobei die entsprechende Reduktase in gereinigter Form oder auch in Form des Mikroorganismus selbst verwendet werden kann. In der EP-A-2 087 127 wird ein Verfahren zur Herstellung von Secolderivaten durch enantioselektive enzymatische Reduktion von Secodionderivaten unter Verwendung einer Oxidoredukta- se/Dehydrogenase in Gegenwart von NADP(H) beschrieben.

Neben der NADP(H)-abhängigen Reduktion von Ketonen und Aldehyden werden NADP(H)-abhängige Enzyme, sogenannte Enoatreduktasen, auch zur enantiospe- zifischen Reduktion von Enoaten benutzt. So berichteten Kataoka und Mitarbei- ter, dass durch Nutzung einer Enoatreduktase von Candida macedoniensis zu- sammen mit einer NADP(H) generierenden Glukosedehydrogenase aus E. coli präparativ Ketoisophoron zu (6R)-Levodione reduziert wird (Kataoka, Kotaka, Thiwthong, Wada, Nakamori, and Shimizu, J. Biotechnol., 2004, 114, 1-9). Ferner wird die Nutzung NADP(H)-abhängiger Enzyme in gekoppelten Systemen beschrieben, wo beispielsweise der Reduktion eine Cyclisierung zum Epoxid nachgeschaltet ist. So wird die Nutzung von (R)- oder (S)-selektiven Alkoholde- hydrogenasen beschrieben, um das entsprechende Enantiomer zu bilden und anschließend die Basen-induzierte Cyclisierung zum jeweiligen Epoxid zu erreichen (CA 2 612 407).

Die enzymatische Bereitstellung von NADP(H) ist auch erforderlich, wenn Mo- nooxygenasen eingesetzt werden, wie im Falle der sehr gut untersuchten Mo- nooxygenase P450 BM3 (CYP102A1) aus Bacillus megaterium (Appl. Microbiol. Biotechnol. (2012) 95:357-367). Diese Fettsäurehydroxylase oxidiert eine breite Palette von Substraten, wie Alkane, Alkene und aromatische Hydrocarbone. Die Monooxygenase katalysiert die Hydroxylierung, sie benötigt aber die stöchiomet- rische Versorgung mit NADP(H). Auch werden NADP(H)-abhängige Enzyme zur reduktiven Aminierung eingesetzt, wie beispielsweise von 2-Ketosäuren zur entsprechenden D-Aminosäure (WO- A-2006/113085), oder von 6-Aminocapronsäure aus 2-Ketopimelat (WO-A- 2012/031911). Eine Übersicht über die verschiedensten Anwendungen NADP(H)-abhängiger Enzyme kann zum Beispiel Hollmann, Arendsa und Holtmann {Green Chemistry, 2011, 13, 2285-2313), oder auch dem Lehrbuch Jndustrial Biotransformations" von Liese, Seelbach, und Wandrey (Wiley-VCH Verlag, 2006, ISBN: 3-527- 31001-0) entnommen werden. Unabhängig davon, für welche konkrete Umsetzung NADP(H)-abhängige Enzyme eingesetzt werden sollen, ist es zunächst eine Vorraussetzung, geeignete Enzyme zur Verfügung zu stellen, welche hohe Umsätze und eine hohe Stereospezi- fität gewährleisten. Dieses wiederum setzt ein Screening nach solchen Enzymen voraus, das auf unterschiedliche Weise erfolgen kann.

So bieten Unternehmen Enzymsammlungen an, die dann getestet werden müssen, ob sie das gewünschte Edukt zum gewünschten Produkt umsetzen, wie beispielsweise Novozymes A/S mit Sitz in Bagsvaerd, Dänemark. Gewünschte Enzyme können auch durch Nutzung der natürlichen Diversitivität genutzt werden. Zum Beispiel, indem Enzyme aus Organismen oder Metagenombanken gewonnen werden, die wiederum spezifisch getestet werden müssen. Die Diversitivität kann auch durch den Menschen hergestellt werden, indem vorhandene Enzyme muta- genisiert werden, und anschließend gewonnene Enzyme auf veränderte Sub- stratspezifität getestet werden. Beispiele zur Erzeugung diverser Enzyme durch molekulare Techniken sind in der WO-A-2012/069434 offenbart, wo NADP(H)- abhängige Enzyme zur Herstellung n-heterozyklischer optisch aktiver Alkohole gewonnen werden. Auch sind ähnliche Verfahren zur Herstellung von 12 a- Hydroxysteroiddehydrogenase-Mutanten beschrieben (EP-A-2 441 771). Die Her- Stellung großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfasst das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, das Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und das Exprimieren der kombinatorisch erhaltenen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität und die Isolation des Vektors, der das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert.

Der unmittelbare Test auf gewünschte Umwandlung des Edukts zum Produkt erfolgt bisher bevorzugt in Mikrotiterplatten mit 96, 384 oder auch 1536 Vertiefungen („we/fa"). Diese Platten ermöglichen den parallelen Test von 96, 384, oder 1536 Enzymen. Das Produkt der gewünschten Enzymreaktion kann direkt durch chromatographische Techniken bestimmt werden. Diese Methode erfordert die Entnahme einer Probe aus den 96, 384 oder 1536 wells und die chromatographische Trennung zum Nachweis der Reaktionsprodukte, bei denen es sich beispielsweise um Alkohole oder Carbonylverbindungen handeln kann. Solch eine Prozedur ist allerdings komplex und zeitaufwendig. Deswegen werden oft indirekte Tests angewendet. So wird ausgenutzt, dass NADP(H) bei 340 nm absorbiert, nicht aber NADP. Darüber kann prinzipiell die verbrauchte NADP(H)-Menge bestimmt werden. Alternativ kann so auch bei der Carbonylreduktase- katalysierten Oxidation eines Alkohols die Umwandlung von NADP zu NADP(H) gemessen werden. In dieser und vergleichbaren Reaktionen wird die Reduktion des Co-Faktors NADP durch Zunahme der Absorbtion bei 340 nm bestimmt. Gleichermaßen kann auch die Eigenfluoreszenz des reduzierten Cofaktors zur Quantifizierung benutzt werden. Dies geschieht in Mikrotiterauslesegeräten. In einem anderen Verfahren zur Bestimmung des NADP(H)-Verbrauchs zum Nachweis der enzymatischen reduktiven Transaminierung und auch der Reduktion von Ketonen wird die mit dem NADP (H)- Verbrauch einhergehende pH- Änderung durch einen Farbindikator bestimmt (US 7,642,073). Durch eine geeignete Wahl des Farbindikators kann die Wellenlänge der Farbänderung bestimmt werden, die wiederum in Mikrotiterauslesegeräten bestimmt wird.

Auch sind spezielle Mikro titerplatten- Systeme beschrieben, in denen über Membranen mit spezifischen Analyt-bindenden Eigenschaften und Flüssigkeitsströmen ein Screening im Mikrotiterplattenformat mit bis zu 1536 wells durchgeführt wird (EP-A-1 628 768).

Auch ist versucht worden, Analyten durch Kopplung mit einer nachweisbaren Gruppe, beispielsweise eines Fluorophors, leichter nachweisbar zu machen. Dazu wird der Analyt vor Durchfuhren der Reaktion kovalent mit einer fluoreszieren- den Gruppe verbunden. Bei Durchfuhren der Reaktion und entsprechender Um- setzung des Analyten soll die Fluoreszenz der fluoreszierenden Gruppe geändert werden, beispielsweise durch Abspaltung der Gruppe oder durch Änderung der Struktur des Analyten. Die Fluoreszenzänderung ist dann ein Maß für die Umsetzung des Analyten. Nachteilig hieran ist jedoch, dass die fluoreszierende Gruppe die Reaktionsfähigkeit des Analyten häufig beeinflusst. In der WO-A- 2007/131696 wird beschrieben, dass durch Bereitstellen eines Fluoreszenzfarbstoffs und eines Makrozyklus in der zu untersuchenden Probe und Messen einer Fluoreszenzeigenschaft des Fluoreszenzfarbstoffs an zumindest zwei Zeitpunkten die Analytkonzentration bestimmt werden kann. Dabei bindet der Makrozyklus den Farbstoff und innerhalb des zu untersuchenden Konzentrationsbereiches des Analyten verdrängt dieser den Fluoreszenzfarbstoff vom Makrozyklus.

Bei den aus dem Stand der Technik bekannten in vitro Screening-Ansätzen zum Isolieren neuer NADP(H)-verbrauchender Enzyme oder NADP(H)- verbrauchender Enzyme aus Genbanken mit veränderter Substratspezifität ist ein genereller Nachteil, dass Microtiterplatten-Systeme benutzt werden, die kein Hochdurchsatzscreening ermöglichen, wie es zum Beispiel mit Fluoreszenz aktivierter Zellsortierung (FACS, Fluorescence Activated Cell Sorting) möglich ist. Darüberhinaus werden in in vitro Screening-Ansätzen zum Isolieren neuer NADP(H)-abhängiger Enzyme oft Zelllysate als potentielle Quelle neuer Enzyme eingesetzt, da die Isolierung in reiner Form Operationen schwierig ist. Das Problem solcher Lysate oder Präparate beim Routinescreening nach neuen NADP(H)- abhängigen Enzymen besteht jedoch darin, dass der Reaktionsansatz typischer- weise nicht lösliches Material oder andere Enzyme enthält, die mit dem NADP(H) interagieren. Dies führt zu hohen Blindwerten oder auch veränderter unspezifischer Absorbtion bei 340 nm, was die Genauigkeit und den Wert der Absobti- onsmessung schmälert. Das gleiche gilt für Fluoreszenzmessung des Cofaktors, die ebenfalls durch unlösliches Material erschwert wird. Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die sich aus dem Stand der Technik ergebenden Nachteile im Zusammenhang mit der Isolierung neuer NADP(H)-abhängiger Enzyme zu überwinden. Insbesondere lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Werkzeug zur Verfügungs zu stellen, welches verwendet werden kann, um in einem Hochdurchsatzscreening, beispielsweise mittels FACS, aus einer Zellsupension in möglichst einfacher Art und Weise diejenigen Zellen isolieren zu können, welche gegebenenfalls neue NADP(H)-abhängige Enzyme exprimieren. Insbesondere soll das Isolieren dieser Zellen keinen Zellaufschluss und insbesondere auch keine analytische Bestimmung der Konzentration von bestimmten Edukten, Produkten oder Co-Faktoren umfassen.

Darüberhinaus lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Zelle bereitzustellen, die, nachdem ein Gen für ein potentielles NADP(H)-abhängiges Enzym beispielsweise in Form eines Plasmids in die Zelle eingebracht worden ist, besonders leicht und insbesondere ohne die Notwendigkeit eines Zellaufschlusses dahingehend analysiert werden kann, ob das von dieser Zelle exprimierte Gen in der Tat für ein NADP(H)-abhängiges Enzym kodiert. Eine auf diese Art und Wei- se identifizierte Zelle sollte sich darüberhinaus möglichst in einem Hochdurchsatzscreening, beispielsweise mittels FACS, aus einer Vielzahl von Zellen, beispielsweise aus einer Zellsuspension, gezielt abtrennen lassen.

Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet ein NADP(H)- Nanosensor, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, an die ein Regulator zu binden vermag, wobei der Oxidationszustand des Regulators von der NADP(H)-Verfügbarkeit abhängig ist; ii) eine sich an die Nukleinsäuresequenz i) anschließende Promotorsequenz, an die eine RNA-Polymerase zu binden vermag, wobei die Affinität der RNA- Polymerase für die Promotorsequenz durch den Oxidationszustand des Regulators beinflusst wird; iii) eine sich unter der Kontrolle der Promotorsequenz ii) befindliche Nukleinsäuresequenz, die für ein Autofluoreszenzprotein kodiert.

Überraschend wurde festgestellt, dass sich unter Verwendung des erfindungsge- mäßen NADP(H)-Nanosensors in vivo die intrazelluläre NADP- bzw. NADP(H)- Konzentration und damit indirekt die Aktivität NADP(H)-abhängiger Enzyme in einer Zelle besonders leicht bestimmen lässt. Ist eine den erfindungsgemäßen NADP(H)-Nanosensor aufweisende Zelle durch eine hohe Aktivität NAPD(H)- abhängiger Enzyme gekennzeichnet, so ist die Konzentration an NADP entspre- chend hoch (und die NADP(H)-Konzentration entsprechende gering). In Abhängigkeit dieses Reduktionszustandes der Zelle vermag der Regulator die Affinität der RNA-Polymerase für den die Expression des Autofluoreszenzsproteins steuernden Promotor oder die Stabilität der für das Autofluoreszenzprotein kodierenden mRNA zu beeinflussen. In Abhägigkeit vom Reduktionszustand der Zelle wird somit die Expression des Autofluoreszensproteins gesteuert, die wiederum in einfacher Weise durch das Einstrahlen mit elektromagnetischer Strahlung, welche das Autofluoreszenzprotein zur Emission von Licht anregt, verfolgt werden kann. Die Lichtemission der Zellen ist somit ein Indikator für den Reduktionszustand der Zelle und mithin für das Ausmaß der Expression NADP(H)-abhängiger En- zyme.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen NADP(H)- Nanosensors handelt es sich bei dem Regulator um den Sox-Regulator (SoxR) und bei der Promotorsequenz um die so S-Promotorsequenz. Das Gen für SoxR aus E. coli K12 ist unter den Zugangsnummern b4063, ECK4055 im National Center for Biotechnology Information (NCBI) database of the National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) hinterlegt. SoxR enthält zwei [2Fe-2S] -Cluster, die essentiell für die Transkriptionsaktivität sind. Jedes SoxR-Polypeptid enthält einen [2Fe-2S]-Cluster, der den Reduktionszustand der Zelle detektiert. Sowohl Fe-SoxR als auch apo-SoxR binden an die Promoter-Region, aber nur Fe-SoxR trägt zur Promoteraktivierung in der oxidierten Form bei. Der Redoxzustand des Eisen-Schwefel Clusters reguliert die SoxR-Aktivität. Das Zielgen von SoxR ist das benachbarte soxS, dessen Sequenz unter den Nummern b4062, EC 4054 im National Center for Biotechnology Information (NCBI) database of the National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) hinterlegt ist. Der Reduktionszustand der Zelle kann gegebenfalls durch NADP(H)-abhängige Reduktasen, wie Rsx oder RseC, begünstigt werden.

In diesem Zusammenhang ist es weiterhin bevorzugt, dass die Komponenten i) und ii) durch den intergenischen Bereich aus E. coli, der zwischen soxR und soxS lokalisiert ist und der die SoxR-Bindesequenz, die sich an die SoxR-Bindesequenz anschließende sojeS-Promotorsequenz und eine sich an die soxS-Promotorsequenz anschließende Sequenz, die auf der Ebene der mRNA einer Ribosomenbindesstel- le entspricht, umfasst, oder durch eine hierzu homologe Nukleinsäuresequenz gebildet werden. Die Komponenten i) und ii) werden dabei vorzugsweise gebildet von einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ.-ID-Nr. 01, b) einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens 70 %, vor- zugsweie mindestens 80 %, noch mehr bevorzugt mindestens 85 %, noch mehr bevorzugt mindestens 90 %, noch mehr bevorzugt mindestens 91 %, noch mehr bevorzugt mindestens 92 %, noch mehr bevorzugt mindestens 93 %, noch mehr bevorzugt mindestens 94 %, noch mehr bevorzugt mindestens 95 %, noch mehr bevorzugt mindestens 96 %, noch mehr bevorzugt mindestens 97 %, noch mehr bevorzugt mindestens 98 % und am meisten bevorzugt mindestens 99 % zur Nukleinsäuresequenz von a) aufweist, wobei die Nukleinsäuresequenz in der Lage ist, SoxR dergestalt zu binden, dass die Affinität der RNA-Polymerase für den soXiS-Promotor vom Oxida- tionszustand von SoxR abhängig ist, und c) einer Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer komplementären Nukleinsäuresequenz nach a) oder b) zu hybridisieren vermag, wobei die Nukleinsäuresequenz in der Lage ist, SoxR dergestalt zu binden, dass die Affinität der RNA-Polymerase für den sOxS-Promotor vom Oxidationszustand von SoxR abhängig ist.

Gemäß einer ersten Variante dieser besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen NADP(H)-Nanosensors umfasst dieser

(al) das E. coli-Gen für SoxR (soxR) oder eine hierzu homologe Nukleinsäuresequenz;

(a2) den sich an (al) anschließenden intergenischen Bereich aus E. coli, der zwischen soxR und soxS lokalisiert ist und der die SoxR-Bindesequenz, die sich an die SoxR-Bindesequenz anschließende soxS-Promotorsequenz und eine sich an die soxS-Promotorsequenz anschließende Sequenz, die auf der Ebene der mRNA einer Ribosomenbindestelle entspricht, umfasst, oder eine hierzu homologe Nukleinsäuresequenz, wie vorstehend definiert, als Komponenten i) und ii);

(a3) gegebenenfalls eine sich an (a2) anschließende Teilsequenz des soxS-Gens aus E. coli oder eine hierzu homologe Nukleinsäuresequenz; eine sich an (a.2) oder (a3), vorzugsweise an (a.3) anschließende und unter der Kontrolle der .soxS-Promotorsequenz befindliche Nukleinsäuresequenz, welche für ein. Autofluoreszenzprotein kodiert, als Komponente iii). Die Formulierung„eine sich an eine Sequenz a) anschließende Sequenz b)", wie sie vorstehend und auch nachfolgend verwendet wird, ist erfindungsgemäß so zu verstehen, dass die Sequenz b) nicht zwingend unmittelbar mit der Sequenz a) verbunden sein muss, sondern dass auch eine Zwischensequenz zwischen der Sequenz a) und der Sequenz b) lokalisiert sein kann.

Als Komponente (al) umfasst der NADP(H)-Nanosensor gemäß dieser besonderen Ausgestaltung das E. coli-Gen für SoxR (soxR) oder eine hierzu homologe Nukleinsäuresequenz, wobei die Komponente (al) vorzugsweise ausgwählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ. -ID. -Nr. 02, einer Nukleinsäuresequenz, kodierend ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ.-ID.-Nr. 03, einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens 70 %, vor- zugsweie mindestens 80 %, noch mehr bevorzugt mindestens 85 %, noch mehr bevorzugt mindestens 90 %, noch mehr bevorzugt mindestens 91 %, noch mehr bevorzugt mindestens 92 %, noch mehr bevorzugt mindestens 93 %, noch mehr bevorzugt mindestens 94 %, noch mehr bevorzugt mindestens 95 %, noch mehr bevorzugt mindestens 96 %, noch mehr bevorzugt mindestens 97 %, noch mehr bevorzugt mindestens 98 % und am meisten bevorzugt mindestens 99 % zur Nukleinsäuresequenz von a) oder b) aufweist, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid kodiert, welches an die SoxR-Bindesequenz im intergenischen Bereich aus E. coli, der zwischen soxR und soxS lokalisiert ist, zu binden vermag und dessen Oxidationszu- stand die Affinität der R A-Polymerase für die ebenfalls im intergenischen Bereich aus E. coli lokalisierte Promotorsequenz zu beeinflussen vermag, einer Nukleinsäuresequenz, kodierend ein Polypeptid, das eine Homologie von mindestens 70 %, vorzugsweise mindestens 80 %, noch mehr bevorzugt mindestens 85 %, noch mehr bevorzugt mindestens 90 %, noch mehr bevorzugt mindestens 91 %, noch mehr bevorzugt mindestens 92 %, noch mehr bevorzugt mindestens 93 %, noch mehr bevorzugt mindestens 94 %, noch mehr bevorzugt mindestens 95 %, noch mehr bevorzugt mindestens 96 %, noch mehr bevorzugt mindestens 97 %, noch mehr bevorzugt mindestens 98 % und am meisten bevorzugt mindestens 99 % zur SEQ.-ID.-Nr. 03 aufweist, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid kodiert, welches an die SoxR-Bindesequenz im intergenischen Bereich aus E. coli, der zwischen soxR und soxS lokalisiert ist, zu binden vermag und dessen Oxidationszu- stand die Affinität der RNA-Polymerase für die ebenfalls im intergenischen Bereich aus E. coli lokalisierte Promotorsequenz zu beeinflussen vermag, und e) einer Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer komplenetären Nukleinsäuresequenz nach einer der Gruppen a) bis d) zu hybridisieren vermag, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid kodiert, welches an die SoxR-Bindesequenz im intergenischen Bereich aus E. coli, der zwischen soxR und soxS lokalisiert ist, zu binden vermag und des- sen Oxidationszustand die Affinität der RNA-Polymerase für die ebenfalls im intergenischen Bereich aus E. coli lokalisierte Promotorsequenz zu beeinflussen vermag.

Der Ausdruck„Homologie" (oder„Identität"), wie hierin verwendet, kann durch die Gleichung H (%) = [1-V/X]x 100, definiert werden, worin H Homologie be- deutet, X die Gesamtzahl an Nukleobasen/ Aminosäuren der Vergleichssequenz ist und V die Anzahl an unterschiedlichen Nukleobasen/Aminosäuren der zu betrachtenden Sequenz bezogen auf die Vergleichssequenz ist. Auf jeden Fall sind mit dem Begriff Nukleinsäuresequenzen, welche für Polypeptide kodieren, alle Se- quenzen umfasst, die nach Maßgabe der Degeneration des genetischen Codes möglich erscheinen.

Die Identität von Nukleinsäuresequenzen läßt sich unter Anwendung eines Sequenz-Vergleichs-Programms (BLAST, Altschul et al. J. Mol. Biol. 1990, 215, 403-410) identifizieren. Die prozentuale Homologie zwischen zwei Aminosäuresequenzen kann ebenfalls mit aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren vom Fachmann ohne weiteres ermittelt werden. Ein geeignetes Programm, das erfindungsgemäß eingesetzt werden kann, ist BLASTp (Altschul et al.. 1997; "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402).

Anleitungen zur Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch „The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (Internati- onal Journal of Systematic Bacteriology 41 : 255-260 (1991)). Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das heißt, es werden nur Hybride gebildet, bei denen Sonde, beispielsweise die zu soxR oder soxS oder dem intergeni- schen Bereich von soxRS aus E. coli komplementäre Nukleotidsequenz, und Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 70 % identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst bzw. bestimmt wird. Die Hyb- ridisierungsreaktion wird im Allgemeinen bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996). Für die Hybridisierungsreaktion kann beispiels- weise ein Puffer entsprechend 5 * SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 50°C - 68°C eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70 % Identität zur Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedin- gungen entfernt. Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf 2 SSC und gegebenenfalls nachfolgend 0,5 x SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 50°C - 68°C, ca. 52°C - 68°C, ca. 54°C - 68°C, ca. 56°C - 68°C, ca. 58°C - 68°C, ca. 60°C - 68°C, ca. 62°C - 68°C, ca. 64°C - 68°C, ca. 66°C - 68°C. eingestellt wird. Vorzugsweise werden die Waschschritte bei Temperaturen von ca. 62°C - 68°C, bevorzugt von 64°C - 68°C oder ca. 66°C - 68°C, besonders bevorzugt von ca. 66°C - 68°C durchgeführt. Es ist gegebenenfalls möglich die Salzkonzentration bis auf eine Konzentration entsprechend 0,2 x SSC oder 0,1 ^χ SSC zu senken. Durch schritt- weise Erhöhung der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1 - 2°C von 50°C bis 68°C können Polynukleotidfragmente, die für soxR oder soxS oder dem intergenischen Bereich von soxRS kodieren, isoliert werden, die beispielsweise mindestens 70 % oder mindestens 80 % oder mindestens 90 % bis 95 % oder mindestens 96 % bis 98 % oder mindestens 99 % Identität zur Sequenz der einge- setzten Sonde besitzen. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z. B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No. 1603558).

Als Komponente (a4) umfasst der NADP(H)-Nanosensor gemäß dieser besonde- ren Ausgestaltung eine sich an (a2) oder (a3), vorzugsweise an das Ziel gen soxS (a3), insbesondere an die ersten 5 bis 200 Nukleotide des Zielgens soxS anschließende und unter der Kontrolle der soxS-Promotorsequenz befindliche Nukleinsäuresequenz, welche für ein Autofluoreszenzprotein kodiert, als Komponente iii). Die für das Autofluoreszenzprotein kodierende Gensequenz gemäß der Komponente iii) befindet sich erfindungsgemäß unter der Kontrolle der Promotorsequenz ii) (gemäß der vorstehend beschriebenen ersten Variante der besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen NADP(H)-Nanosensor befindet sich die für das Autofluoreszenzprotein kodierende Gensequenz (a4) unter der Kontrolle der •sOxS-Promotorsequenz). Der Begriff„unter der Kontrolle der Promotorsequenz" ist dabei vorzugsweise so zu verstehen, dass die für das Autofluoreszenzprotein kodierende Gensequenz mit dem Promotor funktionell verknüpft ist. Funktionell verknüpft sind der Promotor und die für das Autofluoreszenzprotein kodierende Gensequenz, wenn diese beiden Sequenzen sowie gegebenenfalls weitere regulative Elemente, wie zum Beispiel ein Terminator oder eine Ribosomenbindestelle, derart sequentiell angeordnet sind, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforder- lieh. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die für das Autofluoreszenzprotein kodierende Gensequenz hinter (d. h. am 3 '-Ende) der Promotorsequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der für das Autofluoreszenzprotein kodierenden Gensequenz und der Promotorsequenz kleiner als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare. Auch ist es möglich, dass die für das Autofluoreszenzprotein kodierende Gensequenz und der Promotor der- art funktionell miteinander verknüpft sind, dass zwischen diesen beiden Gensequenzen noch eine Teilsequenz des homologen Gens (also desjenigen Gens, dessen Expression in der Wildtyp-Zelle durch den Promotor reguliert wird) befinden (gemäß der vorstehend beschriebenen besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen NADP(H)-Nanosensor können sich demnach Teile des soxS-Gens gemäß der Komponente (ct3) zwischen der soxS -Promotorsequenz und der für das Autofluoreszenzprotein kodierende Nukleinsäuresequenz (a4) befinden). Bei der Expression eines solchen DNA-Konstruktes wird ein Fusionsprotein aus dem Autofluoreszenzprotein und der Aminosäuresequenz, welche von der entsprechenden Teilsequenz des homologen Gens kodiert wird, erhalten (= translationale Fusion). Die Länge solcher Teilsequenzen des homologen Gens sind unkritisch, solange die Funktionsfähigkeit des Autofluoreszenzproteins, also seine Eigenschaft, bei Anregung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge zu fluoreszieren, nicht nennenswert beeinträchtigt wird. Im Falle der vorstehend beschriebenen besonderen Ausführungsform des erfmdungsgemäßen NADP(H)-Nanosensors umfasst die soxS-Teilsequenz (a3) vorzugsweise mindestens die ersten 5 Nukleotide, noch mehr bevorzugt mindestens die ersten 10 Nukleotide und noch mehr bevorzugt mindestens die erstens 20 Nukleotide, vorzugsweise jedoch höchstens die ersten 200 Nukleotide, noch mehr bevorzugt höchstens die ersten 150 Nukleotide und noch mehr bevorzugt höchstens die ersten 100 Nukleotide des soxS-Gens.

Die für ein Autofluoreszenzprotein kodierende Nukleinsäuresequenz (iii) (bzw. (a4) und (ß4)) umfasst bevorzugt Gene kodierend für Fluoreszenzproteine, welche für fluoreszierende Proteine der Gattung Aequora kodieren, wie das Green Fluorescent Protein (GFP), und Varianten davon, die in einem anderen Wellen- längenbereich fluoreszieren (z. B. Yellow Fluorescent Protein (YFP), Blue Fluorescent Protein (BFP), Cyan Fluorescent Protein (CFP)) oder deren Fluoreszenz verstärkt ist (z. B. enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP), enhanced Yellow Fluorescent Protein (EYFP), enhanced Blue Fluorescent Protein (EBFP) oder enhanced Cyan Fluorescent Protein (ECFP). Ferner können erfindungsgemäß auch Gensequenzen verwendet werden, welche für andere autofluoreszierende Proteine, z. B. DsRed, HcRed, AsRed, AmCyan, ZsGreen, AcGFP, ZsYellow, wie sie von BD Biosciences, Franclin Lakes, USA, bekannt sind, kodieren. Ebenso kann ein Photoreceptorprotein benutzt werden, das eine sogenannte LOV Domäne enthält. Das besonders bevorzugte Autofluoreszenzprotein ist dabei EYFP. Gemäß einer zweiten Variante der besonders bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen NADP(H)-Nanosensors umfasst dieser

(ßl) das E. coli-Gen für SoxR (soxR) oder eine hierzu homologe Nukleinsäuresequenz;

(ß2) den sich an (ßl) anschließenden intergenischen Bereich aus E. coli, der zwischen soxR und soxS lokalisiert ist und der die SoxR-Bindesequenz, die sich an die SoxR-Bindesequenz anschließende so S-Promotorsequenz und eine sich an die soxS-Promotorsequenz anschließende Sequenz, die auf der Ebene der mRNA einer Ribosomenbindestelle entspricht umfasst, oder eine hierzu homologe Nukleinsäuresequenz, wie vorstehend definiert, als Komponenten i) und ii);

(ß3) die sich an (ß2) anschließende und unter der Kontrolle der soxS- Promotorsequenz befindliche Sequenz des soxS-Gens aus E. coli, eine Teilsequenz dieses Gens oder einer hierzu homologe Nukleinsäuresequenz;

(β3') eine weitere, sich an (ß3) anschließende Sequenz, die auf mRNA-Ebene einer Ribosomenbindestelle entspricht;

(ß4) eine sich an (β3') anschließende und unter der Kontrolle der soxS- Promotorsequenz befindliche Nukleinsäuresequenz, welche für ein Autofluoreszenzprotein kodiert, als Komponente iii).

Als Komponenten (ßl), (ß2), (ß3) und (ß4) sind diejenigen Komponenten bevorzugt, die bereits vorstehend im Zusammenhang mit der ersten Variante der besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen NADP(H)- Nanosensors als bevorzugte Komponenten (al), (a2), (a3) und (a4) genannt wurden. Bei der Expression eines solchen DNA-Konstruktes wird SoxS oder ein Fragment dieses Proteins und, getrennt davon, das Autofluoreszenzprotein gebildet (= transkriptionelle Fusion).

Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch eine Zel- le, umfassend einen erfndungsgemäßen NADP(H)-Nanosensor. Der erfindungsgemäße NADPH-Nanosensor kann dabei in episomaler oder chromosomaler Form in der Zelle vorliegen.

Als Beispiele geeigneter Zellen seien insbesondere Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis oder ein anderes Eu- bakterium, oder auch Saccharomyces cerevisiae oder eine andere Hefe genannt.

Die erfindungsgemäßen Zellen eignen sich, um festzustellen, ob bestimmte Gensequenzen für ein NADP(H)-abhängiges Enzym kodieren. Dazu wird das für ein potentielles NADP(H)-abhängiges Enzym kodierende Gen in die Zelle eingebracht und exprimiert. Wie eingangs beschrieben, ist die Lichtemission der Zellen ein Indikator für den Reduktionszustand der Zelle und mithin für das Ausmaß der Expression NADP(H)-abhängiger Enzyme. Unter einem„NADP(H)-abhängigen Enzym" wird dabei erfindungsgemäß jedes Enzym verstanden, welches bei zumindest einem Teilschritt der Umsetzung eines Substrates in ein von diesem Substrat chemisch verschiedendes Reaktionsprodukt beteiligt ist, wobei in zumindest einem Teilschritt dieser Umsetzung NADP(H) als Co-Faktor beteiligt ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Zelle umfasst diese demnach neben dem erfindungsgemäßen NADP(H)-Nanosensor weiterhin ein Plasmid mit einem gegebenenfalls mutierten Gen, welches für ein NADP(H)- abhängiges Enzym kodiert. Das NADP(H)-abhängige Enzym ist dabei vorzugs- weise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkoholdehydrogenasen, Alde- hyddehydrogenasen, Laktatdehydrogenasen, Enoatreduktasen Epoxidreduktasen, Diaminopimelatdehydrogenasen, Aminosäuredehydrogenasen, Aldehydoxidore- duktasen, Alkanreduktasen, Aminreduktasen, Epoxiddehydrogenasen, Carboxyl- säuredehydrogenasen, Hydroxysäureketoreduktasen und Hydroxysäuredehalo- genasen.

Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch eine re- kombinante Zelle umfassend eine für ein Autofluoreszenzprotein kodierende Nukleinsäuresequenz, wobei das Ausmaß der Expression des Autofluoreszenzproteins in der Zelle von der intrazellulären NADP(H)- Verfügbarkeit abhängt. In diesem Zusammenhang besonders bevorzugte Zellen sind die vorstehend beschriebenen Zellen, insbesondere Zellen umfassend den erfindungsgemäßen NADP(H)- Sensor. Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch ein Verfahren zum Isolieren von Genen, welche für NADP(H)-abhängige Enzyme kodieren, umfassend die Verfahrensschritte:

(I) Bereitstellung eines erfindungsgemäßen NADP(H)-Nanosensors;

(II) Einbringen des NADP(H)-Nanosensors in eine Zelle;

(III) Einbringen eines Gens, welches gegebenenfalls für ein NADP(H)- abhängiges Enzym kodiert, in einzelne Zellen einer Zellsuspension aus den im Verfahrensschritt (II) erhaltenen Zellen;

(IV) Inkubieren der Zellen mit einem Substrat für das NADP(H)-anhängige zym; (V) Identifizieren einzelner Zellen in der Zellsuspension mit erhöhter Aktivität NADP(H)-abhängiger Enzyme durch Detektion der intrazellulären Fluoreszenzaktivität; (VI) Abtrennen der identifizierten Zellen aus der Zellsuspension;

(VII) Isolierung der für ein NADP(H)-abhängiges Enzym kodierenden Gene in den identifizierten Zellen. Mit Hilfe dieses Verfahrens können neue NADP(H)-abhängige Enzyme und mutierte NADP(H)-abhängige Enzyme mit erhöhter oder veränderter Substraterkennung isoliert werden.

Als NADP(H)-Sensor und als Zelle sind diejenigen Sensoren bzw. Zellen bevor- zugt, die bereits eingangs im Zusammenhang mit dem erfmdungsgemäßen Sensor bzw. der erfindungsgemäßen Zelle als bevorzugte Sensoren bzw. Zellen beschrieben wurden.

In den Verfahrensschritten I) und II) wird zunächst eine erfindungsgemäße Zelle hergestellt, indem der erfindunsgemäße NADP(H)-Nanosensor in eine Zelle eingebracht wird, wobei dieses Einbringen in episomaler oder chromosomaler Form erfolgen kann.

Im Verfahrensschritt III) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird sodann ein Gen, welches gegebenenfalls für ein NADP(H)-abhängiges Enzym kodiert, in einzelne Zellen einer Zell Suspension aus den im Verfahrensschritt (II) erhaltenen Zellen eingebracht, wobei es sich bei dem Gen insbesondere um ein mutiertes, plasmidkodiertes Gen eines NADP(H)-abhängigen Enzyms handeln kann. Zur Einführung der ortsunspezifischen Mutationen in die plasmidkodierten Gene der NADP(H)-abhängigen Enzyme zur Erhöhung der Diversität wird bevorzugt eine in vitro Mutagenese unter Zuhilfenahme einer fehlerhaften Polymeraseketenreak- tion (PCR) und einer Amplifikationstechnik durchgeführt. Dabei wird das zu mutierende Gen einer PCR unter Verwendung einer Polymerase unterzogen, die abhängig von den Bedingungen der Reaktion einzelne Basen falsch in die syntheti- sierten Gene einbaut (Tindall, .R. and T.A. Kunkel:„Fidelity of DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA Polymerase"; Biochemistry, 1988. 27 (16), Seiten 6008-13). Eine häufige Variante dieser Methode beinhaltet die Verwendung von Mangan(II)-Ionen oder von NukJeotidanaloga im PCR Ansatz (Cadwell R. C et al. (1992); PCR Methods Appl. (2), Seiten 28-33./Leung D. W. et al. (1989) Techniques (1), Seiten 1 1-15). Diese Techniken zur Mutationseinführung werden als„Error-Prone-PCR (epPCR)" bezeichnet (Labrou NE:„Random mutagenesis methods for in vitro directed enzyme evolution"; Curr Protein Pept Sei. 2010 (11), Seiten :91-100). Die Mutationen können beispielsweise Punktmutationen sein, es können z.B. Substitutionen, Deletionen oder Insertionen durch die Polymerase erzeugt werden. Die Mutationsrate beträgt zwischen 1-40 Mutationen pro 1 kb, bevorzugt 1-5 Mutationen pro 1 kb. Mutationen können aber auch mit Hilfe der Sättigungsmutagenese unter Verwendung des Stratagene QuikChange Kit (La Jolla, Kalifornien, USA) hergestellt werden, oder auch mit einer als Sesam bezeichneten Methode (EP 1670914 Bl), mit der jedes vorhandene Nukleotid sätti- gend in jedes mögliche Nukleotid überführt wird.

Als NADP(H)-abhängige Enzyme, deren Aktivität sich mit dem Nanosensor- tragenden Wirt im Hochdurchsatz analysieren lassen, kommen beispielsweise in Frage 1,2-Dehydroreticulin-Reduktasen (1.5.1.27), 2-Enoyl-CoA-Reduktase (1.3.1.10), 2-Enoyl-CoA-Reduktasen (1.3.1.39), Alkenal/on-Oxidoreduktasen (1.3.1.74) Cytochrom-P450-Reduktase (1.6.2.4), NADP(H)-Dehydrogenasen (1.6.99.1), NADP(H)-Dehydrogenasen (Flavin) (1.6.8.2), NADP(H)- Dehydrogenasen (Quinon) (1.6.5.10), NADP(H)-abhängige 1,5-anhydro-D- Fruktose-Reduktasen (1.1.1.263), NADP(H)-abhängige Cytochrom-P450- Reduktasen (1.6.2.4), Diaphorasen (1.6.99.1), DT-Diaphorasen (1.6.5.5), Ferredo- xin-Reduktasen (1.18.1.2), NADP(H)-Oxidasen (1.6.3.1, 1.6.5.10, 1.6.3.1, 1.6.3.1, 1.6.3.1), P450-Oxidoreduktase (1.6.2.4), P450-Reduktase (1.6.2.4), Peroxidase (1.11.1.2), Quinon-Acceptor-Oxidoreduktase (1.6.5.5), Quinon-Oxidoreduktase (1.6.5.10), NADP(H)-spezifische FMN-Reduktase (1.5.1.38), Thioredoxin- Reduktase (1.8.1.9), Transhydrogenase (1.6.1.2), NADP(H)-Aldehyd-Reduktase (1.1.1.2), Aldopentose-Reduktase (1.1.1.21), NADP(H)-Aldose-Reduktase (1.1.1.21), NADP(H)-Carbonyl-Reduktase (1.1.1.184), NADP(H)-CYP- Reduktase (1.6.2.4), NADP(H)-Cytochrom-c-Oxidoreduktase (1.6.2.4), NADP(H)-Cytochrome-c-Reduktase (1.1.1.2), NADP(H)-Cytochrome-f- Reduktase (1.6.2.5), NADP(H)-Cytochrom-P450-Reduktase (1.6.2.4) und die NADP(H)-Cytochrom-P450-Reduktase (1.14.13.68).

Die Plasmide, die Mutationen in Genen der NADP(H)-abhängigen Enzyme enthalten, werden anschließend durch Transformation in den Mikroorganismus, wie beispielsweise E. coli oder C. glutamicum, eingebracht. Der Begriff„Transformation" umfasst dabei sämtliche Methoden zur Übertragung von Polynukleotiden, insbesondere DNA, in ein gewünschtes Bakterium. Hierzu gehören unter anderem die Verwendung von isolierter DNA bei der Transformation, Elektrotransformati- on bzw. Elektroporation, die Übertragung durch Zellkontakt wie bei der Konjuga- tion oder die Übertragung von DNA mittels Partikelbeschuss.

Nachdem im Verfahrensschritt (III) ein Gen, welches gegebenenfalls für ein NADP(H)-abhängiges Enzym kodiert, in einzelne Zellen einer Zellsuspension aus den im Verfahrensschritt (II) erhaltenen Zellen eingebracht (und exprimiert) wor- den ist, werden die Zellen dann im Verfahrensschritt (IV) mit einem Substrat für ein NADP(H)-anhängiges Enzym inkubiert und im Verfahrensschritt V) werden dann einzelne Zellen in der Zellsuspension mit erhöhter Aktivität NADP(H)- abhängiger Enzyme durch Detektion der intrazellulären Fluoreszenzaktivität identifiziert. Dazu wird die Zellsuspension elektromagnetischer Strahlung in derjeni- gen Frequenz ausgesetzt, welche das Autofluoreszenzprotein des NADP(H)- Nanosensors zur Emission von Licht anregt.

Im Verfahrensschritt VI) werden dann die identifizierten Zellen aus der Zellsus- pension abgetrennt, wobei dieses Abtrennen vorzugsweise mittels Durchflusszy- tometrie (FACS = fluorescence activated cell sorting), ganz besonders bevorzugt mittels Hochdurchflusszytometrie (HT-FACS = high througput fluorescence activated cell sorting) erfolgt. Einzelheiten zur Analyse von Zellsuspensionen mittels Durchflusszytometrie können beispielsweise Sack U, Tarnok A, Rothe G (Hrsg): Zelluläre Diagnostik. Grundlagen, Methoden und klinische Anwendungen der Durchflusszytometrie, Basel, Karger, 2007, Seiten 27 - 70 entnommen werden.

Im Verfahrensschritt VII) werden dann die für ein NADP(H)-abhängiges Enzym kodierenden Gene in den identifizierten Zellen isoliert und gegebenenfalls analy- siert, in dem beispielsweise die Enzyme-tragenden Plasmide aus den abgetrennten Zellen isoliert und deren Mutationen, die zu veränderter Fluoreszenz führen, durch Sequenzierung identifiziert und verifiziert werden.

Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch die Ver- wendung des erfindungsgemäßen NADP(H)-Nanosensors zum Identifizieren von Genen, welche für ein NADP(H)-abhängiges Enzym kodieren, in vivo.

Die Erfindung wird nun anhand von Figuren und nicht limitierenden Beispielen näher erläutert.

Es zeigt die Figur 1 die Funktionsweise des erfindungsgemäßen NADP(H)- Nanosensors am Beispiel der eingangs beschriebenen besonders besvorzugten Ausführungsform. Es zeigt die Figur 2 die spezifische Fluoreszenz der im Beispiel 3 hergestellten E. coli BL21(DE3)-Zellen mit dem erfindungsgemäßen NADP(H)-Nanosensor (pSensox) und exprimierter Alkoholdehydrogenase (Lbadh) (geschlossene Quadrate). Die Fluoreszenz des Nanosensors pSennegK mit inaktiver Alkoholdehydro- genäse ist als Kontrolle gezeigt (offene Quadrate).

Es zeigt die Figur 3 schematisch die Bildung des Autofluoreszenzsproteins als transkriptionale (oben) und translationale (unten) Fusion. Gemäß der Figur 1 kann der NADP(H)-Nanosensor das E. coli-Gen für SoxR (soxR), den sich daran anschließenden intergenischen Bereich aus E. coli, der zwischen soxR und soxS lokalisiert ist und der die SoxR-Bindesequenz und die sich an die SoxR-Bindesequenz anschließende soxS-Promotorsequenz umfasst, eine sich daran anschließende Teilsequenz des soxS-Gens aus E. coli (soxS') so- wie ein sich daran anschließendes, unter der Kontrolle der soxS-Promotorsequenz befindliche Nukleinsäuresequenz, welche für ein Autofluoreszenzprotein kodiert (AFP), umfassen. Bei hoher cytosolischer NADP(H)-Konzentration (links oben in Figur 1) liegen die [2Fe-2S]-Cluster (Raute) von am Promoter gebundenen SoxR reduziert vor. Bei niedriger NADPH Verfügbarkeit (rechts oben in Figur 1) sind die [2Fe-2S]-Cluster oxidiert, und die resultierende Verwindung der soxS- Promoterregion ermöglicht der RNA-Polymerase die Transkriptionsinitiation des Zielgens. Das native Zielgen soxS ist erfmdungsgemäß mit einem Autofluoreszenzprotein (AFP) fusioniert. NADP(H)-abhängige Enzyme bewirken durch Verbrauch von NADP(H) verstärkte Expression von soxS'-AFP und damit verstärkte Fluoreszenz von Zellen in Folge verstärkten NADP(H)- Verbrauchs.

Figur 3 zeigt oben die transkriptionale und unten die translationale Fusion. In beiden Fällen wird ein Transkript durch den Promoter PI gebildet, der beispielsweise der durch SoxR kontrollierte soxS-Promoter ist. Während bei der transkriptiona- len Fusion durch eine zweite Ribosomenbindestelle (RBS) zwei getrennte Peptide gebildet werden, wird bei der translationalen Fusion ein einziges Peptid gebildet, das Fusionsprotein, bei dem das Autofluoreszenzprotein zusätzliche Aminosäuresequenzen enthält. Beispiele

Beispiel 1

Konstruktion des NADPH-Nanosensors (transkriptionale Fusion)

Mit den Primerpaaren SoxS_for_SphI (SEQ.-ID.-Nr. 04) und SoxR rev Sall (SEQ.-ID.-Nr. 05) sowie chromosomaler DNA von E. coli DH5a als Template wurde das Gen soxR zusammen mir der intergenischen Region von soxR-soxS und den ersten 63 Nukleotiden von soxS amplifiziert.

SoxS for SphI:

ATCTGCATGCTTACGGCTGGTCAATATGCTCGTC

SoxR_rev_SalI:

GCTAGTCGACCAAACTAAAGCGCCCTTGTG

Mit den Primerpaaren EYFP for SphI (SEQ.-ID.-Nr. 06) und EYFP rev Clal (SEQ.-ID.-Nr. 07) sowie dem Vektor pSenLys als Template wurde das Gen eyfp zusammen mit einer Ribosomenbindestelle amplifiziert. Der Vektor pSenLys ist in der Patentanmeldung WO-A-2011/138006 beschrieben.

EYFP for SphI:

AGAGGCATGCAAGGAGAATTACATGGTGAGCAAGGGCGAGG EYFP rev Clal: GCGCATCGATTTATTACTTGTACAGCTCGTCCATG

Der Vektor pBtacLbadh kodiert für die NADPH-abhängige Alkoholdehydrogena- se aus Lactobacillus brevis (Lbadh). Er ist bei Ernst et al. beschrieben (Ernst M, Kaup B, Müller M, Bringer-Meyer S, Sahm H, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 66(6), Seiten 629-34). Der Vektor pBtacLbadh wurde mit den Restriktionsenzymen Sali und Clal behandelt, und das ~ 5,0 kb große Vektorfragment aus dem Agarosegel isoliert und mit alkalischer Phosphatase behandelt und mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Cat.-Nr. 28704) der Firma Quiagen (Hilden, Deutschland) aufgereinigt. Anschließend wurden die beiden PCR-Produkte und der Vektor mit mittels T4-DNA-Ligase von New England BioLabs ligiert (New England Biolabs, 240 County Road, Ipswich, MA 01938-2723). Der Ligationsan- satz wurde in den E. coli-Stamm DH5a transformiert. Die Selektion von Plasmid- tragenden Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al.:„Molecular cloning: a laboratory manual", 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), der mit 50 mg/1 Ampicillin supplementiert worden war. Plasmid-DNA wurde aus einer Transfor- mante isoliert, durch Behandlung mit dem Restriktionsenzym BamHI mit anschließender Agarosegel-Elektrophorese überprüft. Das Plasmid wurde pSenSox genannt, und ist als Sequenz SEQ.-ID.-Nr. 08 hinterlegt.

Als Derivat mit veränderter Alkoholdehydrogenase, Lbadh, wurde pSennegK geschaffen. Dazu wurde mit den Primern ADH negK for (SEQ.-ID.-Nr. 09) und ADH negK rev (SEQ.-ID.-Nr. 10) und wiederum pBtacLbadh als Template eine inaktive Lbadh mit einer um 221 bp deletierter Alkoholdehydrogenase amplifi- ziert. Das resultierende Fragment wurde wie mit dem ~ 5,7 kb großen Vektorfragment das Gen eyfp zusammen mit einer Ribosomenbindestelle enthielt, ligiert. Die Sequenz des resultierenden Vektors ist als SEQ.-ID.-Nr. 11 hinterlegt. ADH negK for:

ACAAGAATTCGCTAAGAGTGTCGGCACTCC

ADH negK rev:

GGCCAAGCTTCCGAAGAAGACACCATCAAG

Als weiteres Derivat mit veränderter Alkoholdehydrogenase, Lbadh, wurde pSen- L194S geschaffen. Dazu wurde mit den Primem L194S_for (SEQ.-ID.-Nr. 12) und L194S_rev (SEQ.-ID.-Nr. 13) pSenSox als Template zur gerichteten Einfüh- rung der Mutation amplifiziert. Das erzeugte Plasmid wurde mittels Sequenzierung verifiziert. Die Sequenz des resultierenden Vektors ist als SEQ.-ID.-Nr. 14 hinterlegt.

L194S_for:

CTGGCTACATCAAGACACCATCTGTTGATG L194S_rev:

CGGCCCCTGGTAGGTCATCAACAGATGGTG Als weiteres Derivat mit veränderter Alkoholdehydrogenase, Lbadh, wurde pSen- L194A geschaffen. Dazu wurde mit den Primern L194A_for (SEQ.-ID.-Nr. 15) und L194A_rev (SEQ.-ID.-Nr. 16) pSenSox als Template zur gerichteten Einführung der Mutation amplifiziert. Das erzeugte Plasmid wurde mittels Sequenzierung verifiziert. Die Sequenz des resultierenden Vektors ist als SEQ.-ID.-Nr. 17 hinterlegt.

L194A_for:

CTGGCTACATCAAGACACCAGCGGTTGATG L194A_rev:

CGGCCCCTGGTAGGTCATCAACCGCTGGTG Beispiel 2

Nutzung des NADP(H)-Nanosensors zum Verfolgen Alkoholdehydrogenase- abhängiger Produktbildung

Mit dem Plasmid pSenSox wurde E. coli BL21(DE3) (Life Technologies GmbH, Frankfurter Straße 129B, 64293 Darmstadt) transformiert. Mit einer Einzelkolonie wurden 5 ml 2 ^χ YT Medium (16 g/L Trypton, 10 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl) beimpft und die Kultur über Nacht bei 37°C und 130 UpM inkubiert. Mit dieser Vorkultur wurde die Hauptkultur zu einer OD von 0.05 in 50 mL 2 x TY angeimpft, die bei 37°C und 130 UpM inkubiert wurde. Bei der OD von 0.3 wurde 1 mM IPTG zugefügt und die Kultur für weitere 3 Stunden bis zu einer OD von 5- 6 inkubiert.

Anschließend wurden je 0,9 mL der Zellsuspension in ein Reaktionsgefäß der Mikrotiterplatte Flowerplate (48-well) des BioLector Kultivierungssystems gege- ben (m2plabs GmbH, Aachen, Germany). Zur Zellsuspension wurde Methylace- toacetat (MAA) in steigender Konzentration in einem konstanten Volumen von 0,1 mL zugefügt. Anschließend wurde die Mikrotiterplatte Flowerplate bei 30°C, 1200 UpM, Schüttelradius 3 mm inkubiert. In dem BioLector Kultivierungssystem wurde online das Wachstum als Streulicht bei 620 nm aufgezeichnet, sowie die Fluoreszenz der Kultur bei einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 520 nm kontinuierlich aufgezeichnet. Die spezifische Fluoreszenz nach 10 Stunden wurde gegenüber der Menge an zugegebenem MAA aufgetragen, und ist in Figur 2 dargestellt (es wurden 0 - 70 mM Methylace- toacetat zu einzelnen Ansätzen gegeben und nach 10 Stunden die spezifische Flu- oreszenz bestimmt, die als schwarz gefüllte Quadrate angegeben sind; als Nega- tivkontrolle (leere Quadrate) diente E. coli BL21(DE3) pSennegK mit inaktiver Lbadh.) Figur 2 zeigt eine Zunahme der Fluoreszenz bei zunehmender MAA- Konzentration. Diese Zunahme ist pSenSox bedingt, da eine Kontrollreaktion mit dem Plasmid pSennegK mit inaktiver Alkoholdehydrogenase, der aber sonst iden- tisch ist zu pSenSox ist, keine Fluoreszenzzunahme bewirkt.

Beispiel 3

Nutzung des NADP(H)-Nanosensors zur Bestimmung unterschiedlicher Alkohol- dehydrogenase Aktivitäten

Der Stamm E. coli BL21(DE3) (Life Technologies GmbH, Frankfurter Straße 129B, 64293 Darmstadt) wurde jeweils mit pSennegK, pSen-L194S, und pSen- L194A transformiert. Zusätzlich wurde der in Beispiel 2 beschriebene Stamm E. coli BL21(DE3) pSenSox mit pET28a als zweitem Plasmid transformiert. Der letztgenannte Vektor wurde von Novagen (Life Technologies GmbH, Frankfurter Straße 129B, 64293 Darmstadt) bezogen. Mit einer Einzelkolonie des jeweiligen Stammes wurden 5 ml 2 ^χ YT Medium (16 g/L Trypton, lO g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl) beimpft und die Kultur über Nacht bei 37°C und 130 UpM inkubiert. Mit dieser Vorkultur wurde die Hauptkultur zu einer OD von 0.05 in 50 mL 2xTY angeimpft, die bei 37°C und 130 UpM inkubiert wurde. Bei der OD von 0.3 wurde kein IPTG, bezw. dem Stamm E. coli BL21(DE3) pSenSox 1 mM IPTG zugefügt und die Kultur für weitere 3 Stunden bis zu einer OD von 5-6 inkubiert. Anschließend wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, je 0,9 mL der Zellen in je ein Reaktionsgefäß der Mikrotiterplatte Flowerplate (48-well) des BioLector Kultivierungssystems gegeben (m2plabs GmbH, Aachen, Germany). Zur Zellsuspension wurde jeweils, in 0,1 mL, Methylacetoacetat (MAA) zu einer Endkonzentration von 40 mM zugefügt. Anschließend wurde die Mikrotiterplatte Flowerplate bei 30°C, 1200 UpM, Schüttelradius 3 mm inkubiert, und die spezifische Fluores- zenz bestimmt. Die nach 19 Stunden erhaltene spezifische Fluoreszenz ist in Tabelle 1 angegeben.

Zusätzlich wurde die Alkoholdehydrogenaseaktivität der rekombinanten E. coli- Zellen in den einzelnen Ansätzen bestimmt. Dazu wurden die Zellen bei 10.000 x g, 4°C, 5 min geerntet und in lOO mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5, 1 mM Dithiothreitol, 1 mM MgCl ₂ aufgenommen. Die Zellen wurden mittels des Silamat S5 (Ivoclar Vivadent GmbH, Germany) unter Zuhilfenahme von Glaskugeln mit 0,1 mm Durchmesser aufgeschlossen. Der Rohextrakt der nach Zentrifu- gation bei 16.000 ^χ g, 4°C, 20 min erhalten wurde, wurde im Enzymtest zur Quantifizierung der Alkoholdehydrogenase Aktivität eingesetzt. Der Test enthielt 5 mM Methylacetoacetat, 0,25 mM NADPH, and 1 mM MgCl ₂ in 100 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5, und 0,01-0,1 mL Rohextrakt. Die Reduktion von NADP(H) wurde bei 340 nm und 30°C verfolgt. Eine Enzymeinheit (U) ist als diejenige Rohextraktmenge angegeben, die 0,001 mmol NADP(H) pro Minute reduziert. Sie ist ebenfalls in Tabelle 1 angeführt.

Beispiel 4 Isolation mutierter Alkoholdehydrogenase mit veränderter Substraterkennung

Die Alkoholdehydrogenase Lbadh aus Lactococcus lactis hat hohe Aktivität mit Methylacetoacetat, aber nur eine geringe Aktivität von etwa 0 % mit 4-Methyl-2- pentanon als Substrat. Um eine Lbadh mit höherer Aktivität zu evolvieren, wur- den in pSenSox zufällige Mutationen durch error-prone PCR (epPCR) eingefügt. Zur Einführung der Mutationen wurden 10 ng pSenSox als Template pro Reaktion eingesetzt, sowie 0,1 - 0,8 mM Mn , wobei bei den niedrigeren Konzentrationen von unter < 0,2 mM Mn ²⁺ mit Mg ²⁺ , eine Gesamtkonzentration von mindestens 0,2 mM eingestellt wurde. Pro Reaktion wurden 0,5 μΐ Taq-Polymerase von Fer- mentas (Katalog Nr. EP0401) zugesetzt. Als primer wurden die Polynukleotide SEQ.-ID.-Nr. 18:

ACAAGAATTCGCTAAGAGTGTCGGCACTCC

SEQ.-ID.-Nr. 19:

GGCCAAGCTTCCGAAGAAGACACCATCAAG benutzt. Die Reaktionen wurden 30 Minuten inkubiert. Anschließend wurden die Reaktionsprodukte mit BamHI und Sali behandelt, und mit dem zuvor ebenso behandelten Vektor pSenSox ligiert.

Mit den Ligationsprodukten wurde E. coli DH5amcr transformiert (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 87, Seiten 4645-4649). Nach Inkubation für 30 h wurden Transformanten mit 10 mL 2 * YT von den Platten abgeschwemmt, und zehnfach in frisches 2 ^χ YT Medium verdünnt. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C wurde 20 mM 4-Methyl-2-pentanon als Substrat zugesetzt und nach weiterer dreistündiger Inkubation der FACS Analyse und Sortierung zugeführt. Zur FACS Analyse und Sortierung der Zellen mit hoher Fluoreszenz wurde die Zell Suspension in 2 x YT Medium auf eine optische Dichte unter 0.1 eingestellt, und unmittelbar dem FACS ARIA II high-speed cell sorter (Becton Dickinson GmbH, Tullastr. 8-12, 69126 Heidelberg) zugeführt. Die Analyse erfolgte mit den Anregungswellenlängen von 488 und 633 nm und die Detektion bei den Emissi- onswellenlängen von 530 ± 15 nm und 660 ± 10 nm bei einem Probendruck von 70 psi. Die Daten wurden mit der zum Gerät gehörenden Software- Version BD DIVA 6.1.3 analysiert. Als Mantelfiüssigkeit wurde BD F ACSflow verwendet. Das elektronische gating wurde anhand des forward und backward scatters eingestellt, um nicht-bakterielle Partikel auszuschließen. Um EYFP-positive Zel- len zu sortieren, wurde die nächste Stufe des elektronischen gatings gewählt, um nicht-fluoreszierende Zellen auszuschließen. Auf diese Weise wurden 123 fluoreszierende Zellen auf Petrischalen, die 2 ^χ YT Medium enthielten, aussortiert. Mit den nach Inkubation für 30 Stunden bei 37°C erhaltenen Kolonien wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, Reaktionsgefäße der Mikrotiterplatte Flowerplate (48-well) des BioLector Kultivierungssystems beimpft (m2plabs GmbH, Aachen, Germany). Als Substrat wurde aber nicht Methylacetoacetat, sondern 20 mM 4- Methyl-2-pentanon benutzt. Nach 120 Minuten wurde die spezifische Fluoreszenz quantifiziert, und ein Klon ausgewählt, dessen Alkoholdehydrogenaseaktivität im Enzymtest, wie in Beispiel 3 beschrieben, bestimmt wurde. Als Substrat wurde dabei 20 mM 4-Methyl-2-pentanon benutzt.

Die so erhaltene Mutante mit dem Plasmid pSen-A93M hat eine um 26 % gestei- gerte spezifische Aktivität gegenüber dem Ausgangsstamm (Tabelle 2), sowie eine um 37 % erhöhte Umsatzgeschwindigkeit mit 4-Methyl-2-pentanon als Substrat. Die Sequenz des Plasmids pSen-A93M ist als SEQ.-ID.-Nr. 20 hinterlegt.

Tabelle 1: Korrelation der Alkoholdehydrogenaseaktivität ganzer Zellen mit der spezifischen Fluoreszenz.

Tabelle 2: Steigerung der Aktivität und Umsatzrate der mittels NADP(H)- Nanosensor und FACS isolierten Alkoholdehydrogenase mit 4-Methyl-2- pentanon als Substrat.

Beispiel 5

Konstruktion des NADPH-Nanosensors (translationale Fusion) Mit den Primerpaaren SoxS for Sphl tl (SEQ.-ID.-Nr. 21 ) und SoxR rev Sall tl (SEQ.-ID.-Nr. 22) sowie chromosomaler DNA von E. coli DH5a als Template wurde das Gen soxR zusammen mit der intergenischen Region von soxR-soxS und den ersten 63 Nukleotiden von soxS amplifiziert. SoxS for Sphl tl:

ATCTGCATGCCGGCTGGTCAATATGCTCGTC

SoxR_rev_SalI_tl:

GCTAGTCGACCAAACTAAAGCGCCCTTGTG

Mit den Primerpaaren EYFP for Sphl tl (SEQ.-ID.-Nr. 23) und EYFP_rev_ClaI_tl (SEQ.-ID.-Nr. 24) sowie dem Vektor pSenLys als Template wurde das Gen eyfp amplifiziert. Der Vektor pSenLys ist in der Patentanmeldung WO-A-2011/138006 beschrieben.

EYFP for Sphl tl:

AGAGGCATGCGTGAGCAAGGGCGAGG EYFP rev Clal tl:

GCGCATCGATTTATTACTTGTACAGCTCGTCCATG Der Vektor pBtacLbadh kodiert für die NADPH-abhängige Alkoholdehydrogena- se aus Lactobacillus brevis (Lbadh). Er ist bei Ernst et al. beschrieben (Ernst M, Kaup B, Müller M, Bringer-Meyer S, Sahm H, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 66(6), Seiten 629-34). Der Vektor pBtacLbadh wurde mit den Restriktionsenzymen Sali und Clal behandelt, und das ~ 5,0 kb große Vektorfragment aus dem Agarosegel isoliert und mit alkalischer Phosphatase behandelt und mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Cat.-Nr. 28704) der Firma Quiagen (Hilden, Deutschland) aufgereinigt. Anschließend wurden die beiden PCR-Produkte und der Vektor mit mittels T4-DNA-Ligase von New England BioLabs ligiert (New England Biolabs, 240 County Road, Ipswich, MA 01938-2723). Der Ligationsan- satz wurde in den E. coli-Stamm DH5a transformiert. Die Selektion von Plasmid- tragenden Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al.:„Molecular cloning: a laboratory manual", 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), der mit 50 mg/1 Ampicillin supplementiert worden war. Plasmid-DNA wurde aus einer Transfor- mante isoliert, durch Behandlung mit dem Restriktionsenzym BamHI mit anschließender Agarosegel-Elektrophorese überprüft. Das Plasmid wurde pSenS- ox tl genannt, und ist als Sequenz SEQ.-ID.-Nr. 25 hinterlegt.

SEQUENZEN

SEQ.-ID.-NR. Ol

aaatctgcct cttttcagtg ttcagttcgt taattcatct gttggggagt ataattcctc aagttaactt gaggtaaagc gattt

SEQ.-ID.-NR. 02

atggaaaaga aattaccccg cattaaagcg ctgctaaccc ccggcgaagt ggcgaaacgc 60 agcggtgtgg cggtatcggc gctgcatttc tatgaaagta aagggttgat taccagtatc 120 cgtaacagcg gcaatcagcg gcgatataaa cgtgatgtgt tgcgatatgt tgcaattatc 180 aaaattgctc agcgtattgg cattccgctg gcgaccattg gtgaagcgtt tggcgtgttg 240 cccgaagggc atacgttaag tgcgaaagag tggaaacagc tttcgtccca atggcgagaa 300 gagttggatc ggcgcattca taccttagtg gcgctgcgtg acgaactgga cggatgtatt 360 ggttgtggct gcctttcgcg cagtgattgc ccgttgcgta acccgggcga ccgcttagga 420 gaagaaggta ccggcgcacg cttgctggaa gatgaacaaa actaa 465

SEQ.-ID.-NR. 03

MEKKLPRIKA LLTPGEVA R SGVAVSALHF YESKGLITSI RNSGNQRRYK RDVLRYVAII 60 KIAQRIGIPL ATIGEAFGVL PEGHTLSAKE WKQLSSQWRE ELDRRIHTLV ALRDELDGCI 120

GCGCLSRSDC PLRNPGDRLG EEGTGARLLE DEQN 154

SEQ.-ID.-NR. 04

atctgcatgc ttacggctgg tcaatatgct cgtc 34

SEQ.-ID.-NR. 05

gctagtcgac caaactaaag cgcccttgtg 30

SEQ.-ID.-NR. 06

agaggcatgc aaggagaatt acatggtgag caagggcgag g 41

SEQ.-ID.-NR. 07

gcgcatcgat ttattacttg tacagctcgt ccatg 35 SEQ.-ID.-NR. 08

ttcatgtcta accgtttgga tggtaaggta gcaatcatta caggtggtac gttgggtatc 60 ggtttagcta tcgccacgaa gttcgttgaa gaaggggcta aggtcatgat taccggccgg 120 cacagcgatg ttggtgaaaa agcagctaag agtgtcggca ctcctgatca gattcaattt 180 ttccaacatg attcttccga tgaagacggc tggacgaaat tattcgatgc aacggaaaaa 240 gcctttggcc cagtttctac attagttaat aacgctggga tcgcggttaa caagagtgtc 300 gaagaaacca cgactgctga atggcgtaaa ttattagccg tcaaccttga tggtgtcttc 360 ttcggtaccc gattagggat tcaacggatg aagaacaaag gcttaggggc ttccatcatc 420 aacatgtctt cgatcgaagg ctttgtgggt gatcctagct taggggctta caacgcatct 480 aaaggggccg tacggattat gtccaagtca gctgccttag attgtgccct aaaggactac 540 gatgttcggg taaacactgt tcaccctggc tacatcaaga caccattggt tgatgaccta 600 ccaggggccg aagaagcgat gtcacaacgg accaagacgc caatgggcca tatcggtgaa 660 cctaacgata ttgcctacat ctgtgtttac ttggcttcta acgaatctaa atttgcaacg 720 ggttctgaat ttgtagttga cggtggctac actgctcaat agtaagcttc tgttttggcg 780 gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa 840 aacagaattt gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag 900 aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga _. gtagggaact 960 gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt 1020 tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt 1080 gcgaagcaac ggcccggagg gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa 1140 attaagcaga aggccatcct gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tcttttgttt 1200 atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 1260 tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 1320 cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 1380 agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 1440 taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 1500 tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 1560 catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 1620 ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 1680 ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 1740 catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 1800 aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 1860 aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga 1920 taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 1980 atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 2040 gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 2100 tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 2160 ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 2220 gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 2280 agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 2340 aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 2400 agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 2460 tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 2520 atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 2580 taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 2640 gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 2700 gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 2760 aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 2820 tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 2880 gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 2940 cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa 3000 ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag 3060 cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct 3120 gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata 3180 gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac 3240 ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga 3300 caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa 3360 cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct 3420 gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg 3480 ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg tcacttgatg cctccgtgta 3540 agggggaatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa acgagagagg atgctcacga 3600 tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg ttgtgagggt aaacaactgg 3660 cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg tcaatgccag cgcttcgtta 3720 atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc tgcgatgcag atccggaaca 3780 taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta cgaaacacgg aaaccgaaga 3840 ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca gcagtcgctt cacgttcgct 3900 cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc ccgccagcct agccgggtcc 3960 tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggccagga cccaacgctg cccgagatgc 4020 gccgcgtgcg gctgctggag atggcggacg cgatggatat gttctgccaa gggttggttt 4080 gcgcattcac agttctccgc aagaattgat tggctccaat tcttggagtg gtgaatccgt 4140 tagcgaggtg ccgccggctt ccattcaggt cgaggtggcc cggctccatg caccgcgacg 4200 caacgcgggg aggcagacaa ggtatagggc ggcgcctaca atccatgcca acccgttcca 4260 tgtgctcgcc gaggcggcat aaatcgccgt gacgatcagc ggtccagtga tcgaagttag 4320 gctggtaaga gccgcgagcg atccttgaag ctgtccctga tggtcgtcat ctacctgcct 4380 ggacagcatg gcctgcaacg cgggcatccc gatgccgccg gaagcgagaa gaatcataat 4440 ggggaaggcc atccagcctc gcgtcgcgaa cgccagcaag acgtagccca gcgcgtcggc 4500 cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg gaccagtgac 4560 gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc cgatcatcgt 4620 cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg gcacctgtcc 4680 tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca tgccccgcgc 4740 ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgac caaactaaag 4800 cgcccttgtg gcgctttagt tttgttcatc ttccagcaag cgtgcgccgg taccttcttc 4860 tcctaagcgg tcgcccgggt tacgcaacgg gcaatcactg cgcgaaaggc agccacaacc 4920 aatacatccg tccagttcgt cacgcagcgc cactaaggta tgaatgcgcc gatccaactc 4980 ttctcgccat tgggacgaaa gctgtttcca ctctttcgca cttaacgtat gcccttcggg 5040 caacacgcca aacgcttcac caatggtcgc cagcggaatg ccaatacgct gagcaatttt 5100 gataattgca acatatcgca acacatcacg tttatatcgc cgctgattgc cgctgttacg 5160 gatactggta atcaaccctt tactttcata gaaatgcagc gccgataccg ccacaccgct 5220 gcgtttcgcc acttcgccgg gggttagcag cgctttaatg cggggtaatt tcttttccat 5280 aaatcgcttt acctcaagtt aacttgagga attatactcc ccaacagatg aattaacgaa 5340 ctgaacactg aaaagaggca gatttatgtc ccatcagaaa attattcagg atcttatcgc 5400 atggattgac gagcatattg accagccgta agcatgcaag gagaattaca tggtgagcaa 5460 gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 5520 cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 5580 cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 5640 cttcggctac ggcctgcagt gcttcgcccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 5700 cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga 5760 cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 5820 cgagctgaag ggcatcaact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 5880 caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 5940 gaacttcaag atccgccaca acatcgaggg cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 6000 gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcta 6060 ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 6120 cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaat aaatcgatcc 6180 ggagcttatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg 6240 tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc 6300 gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga 6360 gctgttgaca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 6420 cacacaggaa acagaa 6436

SEQ.-ID.-NR. 09

acaagaattc gctaagagtg tcggcactcc 30

SEQ.-ID.-NR. 10

ggccaagctt ccgaagaaga caccatcaag 30

SEQ.-ID.-NR. 11

agcttctgtt ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc 60 agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac 120 cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat 180 gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc 240 ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg 300 agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata 360 aactgccagg catcaaatta agcagaaggc catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct 420 acaaactctt ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat 480 aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc 540 gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa 600 cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac 660 tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga 720 tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtgttgac gccgggcaag 780 agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca 840 cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca 900 tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa 960 ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc 1020 tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa 1080 cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag 1140 actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct 1200 ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac 1260 tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa 1320 ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt 1380 aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat 1440 ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg 1500 agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc 1560 ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg 1620 tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag 1680 cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact 1740 ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg 1800 gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc 1860 ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg 1920 aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg 1980 cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag 2040 ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc 2100 gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct 2160 ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc 2220 ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc 2280 gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgcctg atgcggtatt 2340 ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc agtacaatct 2400 gctctgatgc cgcatagtta agccagtata cactccgcta tcgctacgtg actgggtcat 2460 ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc 2520 ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc 2580 accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagct gcggtaaagc tcatcagcgt ggtcgtgaag 2640 cgattcacag atgtctgcct gttcatccgc gtccagctcg ttgagtttct ccagaagcgt 2700 taatgtctgg cttctgataa agcgggccat gttaagggcg gttttttcct gtttggtcac 2760 ttgatgcctc cgtgtaaggg ggaatttctg ttcatggggg taatgatacc gatgaaacga 2820 gagaggatgc tcacgatacg ggttactgat gatgaacatg cccggttact ggaacgttgt 2880 gagggtaaac aactggcggt atggatgcgg cgggaccaga gaaaaatcac tcagggtcaa 2940 tgccagcgct tcgttaatac agatgtaggt gttccacagg gtagccagca gcatcctgcg 3000 atgcagatcc ggaacataat ggtgcagggc gctgacttcc gcgtttccag actttacgaa 3060 acacggaaac cgaagaccat tcatgttgtt gctcaggtcg cagacgtttt gcagcagcag 3120 tcgcttcacg ttcgctcgcg tatcggtgat tcattctgct aaccagtaag gcaaccccgc 3180 cagcctagcc gggtcctcaa cgacaggagc acgatcatgc gcacccgtgg ccaggaccca 3240 acgctgcccg agatgcgccg cgtgcggctg ctggagatgg cggacgcgat ggatatgttc 3300 tgccaagggt tggtttgcgc attcacagtt ctccgcaaga attgattggc tccaattctt 3360 ggagtggtga atccgttagc gaggtgccgc cggcttccat tcaggtcgag gtggcccggc 3420 tccatgcacc gcgacgcaac gcggggaggc agacaaggta tagggcggcg cctacaatcc 3480 atgccaaccc gttccatgtg ctcgccgagg cggcataaat cgccgtgacg atcagcggtc 3540 cagtgatcga agttaggctg gtaagagccg cgagcgatcc ttgaagctgt ccctgatggt 3600 cgtcatctac ctgcctggac agcatggcct gcaacgcggg catcccgatg ccgccggaag 3660 cgagaagaat cataatgggg aaggccatcc agcctcgcgt cgcgaacgcc agcaagacgt 3720 agcccagcgc gtcggccgcc atgccggcga taatggcctg cttctcgccg aaacgtttgg 3780 tggcgggacc agtgacgaag gcttgagcga gggcgtgcaa gattccgaat accgcaagcg 3840 acaggccgat catcgtcgcg ctccagcgaa agcggtcctc gccgaaaatg acccagagcg 3900 ctgccggcac ctgtcctacg agttgcatga taaagaagac agtcataagt gcggcgacga 3960 tagtcatgcc ccgcgcccac cggaaggagc tgactgggtt gaaggctctc aagggcatcg 4020 gtcgaccaaa ctaaagcgcc cttgtggcgc tttagttttg ttcatcttcc agcaagcgtg 4080 cgccggtacc ttcttctcct aagcggtcgc ccgggttacg caacgggcaa tcactgcgcg 4140 aaaggcagcc acaaccaata catccgtcca gttcgtcacg cagcgccact aaggtatgaa 4200 tgcgccgatc caactcttct cgccattggg acgaaagctg tttccactct ttcgcactta 4260 acgtatgccc ttcgggcaac acgccaaacg cttcaccaat ggtcgccagc ggaatgccaa 4320 tacgctgagc aattttgata attgcaacat atcgcaacac atcacgttta tatcgccgct 4380 gattgccgct gttacggata ctggtaatca accctttact ttcatagaaa tgcagcgccg 4440 ataccgccac accgctgcgt ttcgccactt cgccgggggt tagcagcgct ttaatgcggg 4500 gtaatttctt ttccataaat cgctttacct caagttaact tgaggaatta tactccccaa 4560 cagatgaatt aacgaactga acactgaaaa gaggcagatt tatgtcccat cagaaaatta 4620 ttcaggatct tatcgcatgg attgacgagc atattgacca gccgtaagca tgcaaggaga 4680 attacatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc 4740 tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca 4800 cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc 4860 ccaccctcgt gaccaccttc ggctacggcc tgcagtgctt cgcccgctac cccgaccaca 4920 tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca 4980 tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca 5040 ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcaacttcaa ggaggacggc aacatcctgg 5100 ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga 5160 agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgagggcggc agcgtgcagc 5220 tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca 5280 accactacct gagctaccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca 5340 tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca 5400 agtaataaat cgatccggag cttatcgact gcacggtgca ccaatgcttc tggcgtcagg 5460 cagccatcgg aagctgtggt atggctgtgc aggtcgtaaa tcactgcata attcgtgtcg 5520 ctcaaggcgc actcccgttc tggataatgt tttttgcgcc gacatcataa cggttctggc 5580 aaatattctg aaatgagctg ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggaattgt 5640 gagcggataa caatttcaca caggaaacag aattcgctaa gagtgtcggc actcctgatc 5700 agattcaatt tttccaacat gattcttccg atgaagacgg ctggacgaaa ttattcgatg 5760 caacggaaaa agcctttggc ccagtttcta cattagttaa taacgctggg atcgcggtta 5820 acaagagtgt cgaagaaacc acgactgctg aatggcgtaa attattagcc gtcaaccttg 5880 atggtgtctt cttcgga 5897

SEQ.-ID.-NR. 12

ctggctacat caagacacca tctgttgatg

SEQ.-ID.-NR. 13

cggcccctgg taggtcatca acagatggtg

SEQ.-ID.-I IR. 14

ttcatgtcta accgtttgga tggtaaggta gcaatcatta caggtggtac gttgggtatc ggtttagcta tcgccacgaa gttcgttgaa gaaggggcta aggtcatgat taccggccgg cacagcgatg ttggtgaaaa agcagctaag agtgtcggca ctcctgatca gattcaattt ttccaacatg attcttccga tgaagacggc tggacgaaat tattcgatgc aacggaaaaa gcctttggcc cagtttctac attagttaat aacgctggga tcgcggttaa caagagtgtc gaagaaacca cgactgctga atggcgtaaa ttattagccg tcaaccttga tggtgtcttc ttcggtaccc gattagggat tcaacggatg aagaacaaag gcttaggggc ttccatcatc aacatgtctt cgatcgaagg ctttgtgggt gatcctagct taggggctta caacgcatct aaaggggccg tacggattat gtccaagtca gctgccttag attgtgccct aaaggactac gatgttcggg taaacactgt tcaccctggc tacatcaaga caccatctgt tgatgaccta ccaggggccg aagaagcgat gtcacaacgg accaagacgc caatgggcca tatcggtgaa cctaacgata ttgcctacat ctgtgtttac ttggcttcta acgaatctaa atttgcaacg ggttctgaat ttgtagttga cggtggctac actgctcaat agtaagcttc tgttttggcg gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa aacagaattt gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt gcgaagcaac ggcccggagg gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa attaagcaga aggccatcct gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tcttttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 1980 atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 2040 gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 2100 tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 2160 ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 2220 gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 2280 agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 2340 aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 2400 agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 2460 tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 2520 atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 2580 taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 2640 gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 2700 gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 2760 aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 2820 tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 2880 gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 2940 cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa 3000 ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag 3060 cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct 3120 gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata 3180 gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac 3240 ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga 3300 caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa 3360 cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct 3420 gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg 3480 ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg tcacttgatg cctccgtgta 3540 agggggaatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa acgagagagg atgctcacga 3600 tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg ttgtgagggt aaacaactgg 3660 cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg tcaatgccag cgcttcgtta 3720 atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc tgcgatgcag atccggaaca 3780 taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta cgaaacacgg aaaccgaaga 3840 ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca gcagtcgctt cacgttcgct 3900 cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc ccgccagcct agccgggtcc 3960 tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggccagga cccaacgctg cccgagatgc 4020 gccgcgtgcg gctgctggag atggcggacg cgatggatat gttctgccaa gggttggttt 4080 gcgcattcac agttctccgc aagaattgat tggctccaat tcttggagtg gtgaatccgt 4140 tagcgaggtg ccgccggctt ccattcaggt cgaggtggcc cggctccatg caccgcgacg 4200 caacgcgggg aggcagacaa ggtatagggc ggcgcctaca atccatgcca acccgttcca 4260 tgtgctcgcc gaggcggcat aaatcgccgt gacgatcagc ggtccagtga tcgaagttag 4320 gctggtaaga gccgcgagcg atccttgaag ctgtccctga tggtcgtcat ctacctgcct 4380 ggacagcatg gcctgcaacg cgggcatccc gatgccgccg gaagcgagaa gaatcataat 4440 ggggaaggcc atccagcctc gcgtcgcgaa cgccagcaag acgtagccca gcgcgtcggc 4500 cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg gaccagtgac 4560 gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc cgatcatcgt 4620 cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg gcacctgtcc 4680 tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca tgccccgcgc 4740 ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgac caaactaaag 4800 cgcccttgtg gcgctttagt tttgttcatc ttccagcaag cgtgcgccgg taccttcttc 4860 tcctaagcgg tcgcccgggt tacgcaacgg gcaatcactg cgcgaaaggc agccacaacc 4920 aatacatccg tccagttcgt cacgcagcgc cactaaggta tgaatgcgcc gatccaactc 4980 ttctcgccat tgggacgaaa gctgtttcca ctctttcgca cttaacgtat gcccttcggg 5040 caacacgcca aacgcttcac caatggtcgc cagcggaatg ccaatacgct gagcaatttt 5100 gataattgca acatatcgca acacatcacg tttatatcgc cgctgattgc cgctgttacg 5160 gatactggta atcaaccctt tactttcata gaaatgcagc gccgataccg ccacaccgct 5220 gcgtttcgcc acttcgccgg gggttagcag cgctttaatg cggggtaatt tcttttccat 5280 aaatcgcttt acctcaagtt aacttgagga attatactcc ccaacagatg aattaacgaa 5340 ctgaacactg aaaagaggca gatttatgtc ccatcagaaa attattcagg atcttatcgc 5400 atggattgac gagcatattg accagccgta agcatgcaag gagaattaca tggtgagcaa 5460 gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 5520 cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 5580 cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 5640 cttcggctac ggcctgcagt gcttcgcccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 5700 cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga 5760 cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 5820 cgagctgaag ggcatcaact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 5880 caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 5940 gaacttcaag atccgccaca acatcgaggg cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 6000 gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcta 6060 ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 6120 cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaat aaatcgatcc 6180 ggagcttatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg 6240 tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc 6300 gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga 6360 gctgttgaca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 6420 cacacaggaa acagaa 6436

SEQ.-ID.-NR. 15

ctggctacat caagacacca gcggttgatg

SEQ.-ID.-NR. 16

cggcccctgg taggtcatca accgctggtg

SEQ.-ID.-NR. 17

ttcatgtcta accgtttgga tggtaaggta gcaatcatta caggtggtac gttgggtatc 60 ggtttagcta tcgccacgaa gttcgttgaa gaaggggcta aggtcatgat taccggccgg 120 cacagcgatg ttggtgaaaa agcagctaag agtgtcggca ctcctgatca gattcaattt 180 ttccaacatg attcttccga tgaagacggc tggacgaaat tattcgatgc aacggaaaaa 240 gcctttggcc cagtttctac attagttaat aacgctggga tcgcggttaa caagagtgtc 300 gaagaaacca cgactgctga atggcgtaaa ttattagccg tcaaccttga tggtgtcttc 360 ttcggtaccc gattagggat tcaacggatg aagaacaaag gcttaggggc ttccatcatc 420 aacatgtctt cgatcgaagg ctttgtgggt gatcctagct taggggctta caacgcatct 480 aaaggggccg tacggattat gtccaagtca gctgccttag attgtgccct aaaggactac 540 gatgttcggg taaacactgt tcaccctggc tacatcaaga caccagcggt tgatgaccta 600 ccaggggccg aagaagcgat gtcacaacgg accaagacgc caatgggcca tatcggtgaa 660 cctaacgata ttgcctacat ctgtgtttac ttggcttcta acgaatctaa atttgcaacg 720 ggttctgaat ttgtagttga cggtggctac actgctcaat agtaagcttc tgttttggcg 780 gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa 840 aacagaattt gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag 900 aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact 960 gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt 1020 tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt 1080 gcgaagcaac ggcccggagg gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa 1140 attaagcaga aggccatcct gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tcttttgttt 1200 atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 1260 tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 1320 cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 1380 agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 1440 taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 1500 tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 1560 catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 1620 ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 1680 ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 1740 catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 1800 aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 1860 aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga 1920 taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 1980 atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 2040 gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 2100 tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 2160 ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 2220 gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 2280 agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 2340 aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 2400 agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 2460 tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 2520 atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 2580 taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 2640 gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 2700 gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 2760 aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 2820 tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 2880 gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 2940 cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa 3000 ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag 3060 cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct 3120 gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata 3180 gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac 3240 ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga 3300 caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa 3360 cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct 3420 gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg 3480 ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg tcacttgatg cctccgtgta 3540 agggggaatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa acgagagagg atgctcacga 3600 tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg ttgtgagggt aaacaactgg 3660 cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg tcaatgccag cgcttcgtta 3720 atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc tgcgatgcag atccggaaca 3780 taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta cgaaacacgg aaaccgaaga 3840 ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca gcagtcgctt cacgttcgct 3900 cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc ccgccagcct agccgggtcc 3960 tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggccagga cccaacgctg cccgagatgc 4020 gccgcgtgcg gctgctggag atggcggacg cgatggatat gttctgccaa gggttggttt 4080 gcgcattcac agttctccgc aagaattgat tggctccaat tcttggagtg gtgaatccgt 4140 tagcgaggtg ccgccggctt ccattcaggt cgaggtggcc cggctccatg caccgcgacg 4200 caacgcgggg aggcagacaa ggtatagggc ggcgcctaca atccatgcca acccgttcca 4260 tgtgctcgcc gaggcggcat aaatcgccgt gacgatcagc ggtccagtga tcgaagttag 4320 gctggtaaga gccgcgagcg atccttgaag ctgtccctga tggtcgtcat ctacctgcct 4380 ggacagcatg gcctgcaacg cgggcatccc gatgccgccg gaagcgagaa gaatcataat 4440 ggggaaggcc atccagcctc gcgtcgcgaa cgccagcaag acgtagccca gcgcgtcggc 4500 cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg gaccagtgac 4560 gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc cgatcatcgt 4620 cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg gcacctgtcc 4680 tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca tgccccgcgc 4740 ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgac caaactaaag 4800 cgcccttgtg gcgctttagt tttgttcatc ttccagcaag cgtgcgccgg taccttcttc 4860 tcctaagcgg tcgcccgggt tacgcaacgg gcaatcactg cgcgaaaggc agccacaacc 4920 aatacatccg tccagttcgt cacgcagcgc cactaaggta tgaatgcgcc gatccaactc 4980 ttctcgccat tgggacgaaa gctgtttcca ctctttcgca cttaacgtat gcccttcggg 5040 caacacgcca aacgcttcac caatggtcgc cagcggaatg ccaatacgct gagcaatttt 5100 gataattgca acatatcgca acacatcacg tttatatcgc cgctgattgc cgctgttacg 5160 gatactggta atcaaccctt tactttcata gaaatgcagc gccgataccg ccacaccgct 5220 gcgtttcgcc acttcgccgg gggttagcag cgctttaatg cggggtaatt tcttttccat 5280 aaatcgcttt acctcaagtt aacttgagga attatactcc ccaacagatg aattaacgaa 5340 ctgaacactg aaaagaggca gatttatgtc ccatcagaaa attattcagg atcttatcgc 5400 atggattgac gagcatattg accagccgta agcatgcaag gagaattaca tggtgagcaa 5460 gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 5520 cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 5580 cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 5640 cttcggctac ggcctgcagt gcttcgcccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 5700 cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga 5760 cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 5820 cgagctgaag ggcatcaact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 5880 caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 5940 gaacttcaag atccgccaca acatcgaggg cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 6000 gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcta 6060 ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 6120 cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaat aaatcgatcc 6180 ggagcttatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg 6240 tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc 6300 gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga 6360 gctgttgaca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 6420 cacacaggaa acagaa 6436

SEQ.-ID.-NR. 18

acaagaattc gctaagagtg tcggcactcc

SEQ.-ID.-N . 19

ggccaagctt ccgaagaaga caccatcaag

SEQ.-ID.-NR. 20

ttcatgtcta accgtttgga tggtaaggta gcaatcatta caggtggtac gttgggtatc 60 ggtttagcta tcgccacgaa gttcgttgaa gaaggggcta aggtcatgat taccggccgg 120 cacagcgatg ttggtgaaaa agcagctaag agtgtcggca ctcctgatca gattcaattt 180 ttccaacatg attcttccga tgaagacggc tggacgaaat tattcgatgc aacggaaaaa 240 gcctttggcc cagtttctac attagttaat aacgctggga tcatggttaa caagagtgtc 300 gaagaaacca cgactgctga atggcgtaaa ttattagccg tcaaccttga tggtgtcttc 360 ttcggtaccc gattagggat tcaacggatg aagaacaaag gcttaggggc ttccatcatc 420 aacatgtctt cgatcgaagg ctttgtgggt gatcctagct taggggctta caacgcatct 480 aaaggggccg tacggattat gtccaagtca gctgccttag attgtgccct aaaggactac 540 gatgttcggg taaacactgt tcaccctggc tacatcaaga caccattggt tgatgaccta 600 ccaggggccg aagaagcgat gtcacaacgg accaagacgc caatgggcca tatcggtgaa 660 cctaacgata ttgcctacat ctgtgtttac ttggcttcta acgaatctaa atttgcaacg 720 ggttctgaat ttgtagttga cggtggctac actgctcaat agtaagcttc tgttttggcg 780 gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa 840 aacagaattt gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag 900 aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact 960 gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt 1020 tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt 1080 gcgaagcaac ggcccggagg gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa 1140 attaagcaga aggccatcct gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tcttttgttt 1200 atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 1260 tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 1320 cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 1380 agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 1440 taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 1500 tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 1560 catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 1620 ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 1680 ggccaactta cttctgacaa 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caatggtcgc cagcggaatg ccaatacgct gagcaatttt 5100 gataattgca acatatcgca acacatcacg tttatatcgc cgctgattgc cgctgttacg 5160 gatactggta atcaaccctt tactttcata gaaatgcagc gccgataccg ccacaccgct 5220 gcgtttcgcc acttcgccgg gggttagcag cgctttaatg cggggtaatt tcttttccat 5280 aaatcgcttt acctcaagtt aacttgagga attatactcc ccaacagatg aattaacgaa 5340 ctgaacactg aaaagaggca gatttatgtc ccatcagaaa attattcagg atcttatcgc 5400 atggattgac gagcatattg accagccgta agcatgcaag gagaattaca tggtgagcaa 5460 gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 5520 cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 5580 cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 5640 cttcggctac ggcctgcagt gcttcgcccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 5700 cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga 5760 cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 5820 cgagctgaag ggcatcaact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 5880 caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 5940 gaacttcaag atccgccaca acatcgaggg cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 6000 gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcta 6060 ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 6120 cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaat aaatcgatcc 6180 ggagcttatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg 6240 tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc 6300 gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga 6360 gctgttgaca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 6420 cacacaggaa acagaa 6436 SEQ.-ID.-NR. 21

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SEQ.-ID.-NR. 22

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SEQ.-ID.-NR. 23

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SEQ.-ID.-NR. 25

ttcatgtcta accgtttgga tggtaaggta gcaatcatta caggtggtac gttgggtatc 60 ggtttagcta tcgccacgaa gttcgttgaa gaaggggcta aggtcatgat taccggccgg 120 cacagcgatg ttggtgaaaa agcagctaag agtgtcggca ctcctgatca gattcaattt 180 ttccaacatg attcttccga tgaagacggc tggacgaaat tattcgatgc aacggaaaaa 240 gcctttggcc cagtttctac attagttaat aacgctggga tcgcggttaa caagagtgtc 300 gaagaaacca cgactgctga atggcgtaaa ttattagccg tcaaccttga tggtgtcttc 360 ttcggtaccc gattagggat tcaacggatg aagaacaaag gcttaggggc ttccatcatc 420 aacatgtctt cgatcgaagg ctttgtgggt gatcctagct taggggctta caacgcatct 480 aaaggggccg tacggattat gtccaagtca gctgccttag attgtgccct aaaggactac 540 gatgttcggg taaacactgt tcaccctggc tacatcaaga caccattggt tgatgaccta 600 ccaggggccg aagaagcgat gtcacaacgg accaagacgc caatgggcca tatcggtgaa 660 cctaacgata ttgcctacat ctgtgtttac ttggcttcta acgaatctaa atttgcaacg 720 ggttctgaat ttgtagttga cggtggctac actgctcaat agtaagcttc tgttttggcg 780 gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa 840 aacagaattt gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag 900 aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact 960 gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt 1020 tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt 1080 gcgaagcaac ggcccggagg gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa ^' 1140 attaagcaga aggccatcct gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tcttttgttt 1200 atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 1260 tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 1320 cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 1380 agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 1440 taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 1500 tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 1560 catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 1620 ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 1680 ggccaactta cttctgacaa 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