[0001] 本发明涉及一种人 CLOCK基因， 特别是涉及一种人 CLOCK基因的 shRNA (短发 夹 RNA)及应用。

背景技术

[0002] 生物节律是指在漫长的生物进化过程中,为了� �应自然界周而复始的周期变化， 生物体从单细胞到高等动植物以及人类的所有 生命活动均形成按照一定规律运 行的。 昼夜节律是生物节律的一种， 它是在外源性因素和内源性因素的共同作 用下所呈现出的节律。 它的内源性因素是由一组生物节律基因和其基 因产物相 互作用构成的一个闭环震荡系统。 其中生物节律基因是昼夜节律的重要内在固 定物质基础， 在维持机体的体温、 呼吸、 睡眠、 进食、 血压、 血糖、 内分泌等 诸多稳态中发挥着关键作用， 这些生物节律基因包括

CLOCK Per p _er 2、 Per3、 Cryl、 Cry2、 BMAL1、 Timless等。

技术问题

[0003] CLOCK基因在这个系统中起着核心作用。 因此， 对 CLOCK基因的研究十分重 要， 但现有技术中缺乏特异抑制 CLOCK基因表达的载体使得相关研究无法很好 地幵展。

问题的解决方案

技术解决方案

[0004] 本发明要解决的技术问题之一是提供一种人 CLOCK基因的 shRNA。

[0005] 本发明要解决的技术问题之二是提供一种人 CLOCK基因的 shRNA

在制备治疗 CLOCK基因表达异常相关疾病的药物。

[0006] 为解决上述技术问题， 本发明提供一种人 CLOCK基因的 shRNA, 包括： 由编 码 SEQ ID NO: 1所示序列和编码 SEQ ID NO:2所示序列构成的 CLOCK-RNAi。 发明的有益效果

有益效果 [0007] 本发明提供的 shRNA具有转导效率高， 可高效、 特异地抑制 C6细胞 CLOCK基 因表达的优点， 可作为有力工具应用于制备治疗 CLOCK基因表达异常相关疾病 的药物。

对附图的简要说明

附图说明

[0008] 图 1为转导 pLKO-CLOCK载体后 C6细胞的荧光定量 PCR检测结果 CLOCK基因表 达结果示意图。

实施该发明的最佳实施例

本发明的最佳实施方式

[0009] 下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步 的说明。

[0010] C6细胞购自 ATCC， Trizol购自 Invitrogen公司， Endo-free Plasmid Mini

Kit购自 Omega bio-tek。 下文所述完全培养基为加入了 10%胎牛血清的细胞培养 基。

[0011] 实施例一 CLOCK基因的 shRNA序列设计

[0012] (1) 根据人 CLOCK基因特征设计沉默序列， 设计的原则： 19bp的特异性结合 CLOCK序列的 GC含量为 45<¾-55<¾， 退火温度 45°C-65°C， 同吋要求序列起始的 第一个碱基为 G。 将选取的片段进行 BLAST与人基因组比对， 确保特异性。

[0013] (2) 以 Age I-GN18-TT-loop-81NC-EcoR I形式设计一段 59bp序列 CLOCK-RNAi ， 81NC为 NG18的反向序列， 5'端为 Age I酶切位点， 3'端为 EcoR I酶切位点， 其 正义链序列如 SEQ ID No: 1所示， 反义链序列如 SEQ ID No:

2所示。 CLOCK-RNAi寡核苷酸链由上海生工生物工程技术� �务有限公司合成。

[0014] 实施例二 pLKO-CLOCK载体的构建

[0015] 将合成的 shRNA寡核苷酸单链等量混合， 退火形成双链的 CLOCK-RNAi。

[0016] pLKO.l-puro载体 (Sigma Aldrich)全长 7086 bp, 选用限制性内切酶位点 Age

I和 EcoR I作为 DNA片段的插入位点， 应用不同 shRNA相对应 DNA片段的每种载 体构建具体步骤如下：

[0017] 1) Age l和 EcoR I双酶切 pLKO.l-puro载体， Fermentas公司限制性内切酶 Age I和 EcoR I双酶切， 50 反应体系如下： 5 μL 10x FastDigest Buffer, 2 μL Age I ， 2 L EcoR I， 2 g pLK0.1-puro质粒， ddH20补至 20ul， 37°C反应 30 min;

[0018] 2) 连接， 2 L退火的磷酸化双链 DNA oligos , 1 连接酶 buffer, 1 双酶切 处理的 pLKO. l-puro质粒， 1 连接酶， 5 L ddH20， 16°C反应 5h， 获得连接产 物 pLKO-CLOCK载体；

[0019] 3) 转化；

[0020] 4) 挑取阳性克隆培养并进行测序验证插入序列完 全正确， 然后用 Endo-free

Plasmid Mini Kit进行无内毒素的 pLKO-CLOCK载体提取。

[0021] 实施例三 pLKO-CLOCK载体转导 C6细胞。

[0022] 培养 C6细胞， 取生长状态良好的细胞 5000000个， 离心收集细胞， 然后重悬于 5 00 μL PBS中， 与 20 pLKO-CLOCK载体混匀后加入电击杯， 应用 Invitrogen Neon电转系统进行电转， 电转程序： 2.1 KV， 25 μΐΌ , 脉冲电击一次； 将细胞 转移至含5 mL DMEM完全培养基的6 cm皿中， 轻轻晃动皿使细胞混匀， 48 h后 检测 TL6基因表达情况。

[0023] 实施例四荧光定量 PCR检测 CLOCK基因表达量。

[0024] 分别接种 C6细胞和转导 pLKO-CLOCK载体的 C6细胞细胞至细胞培养瓶， 培养 2 4 h后， 用 Trizol提取各组细胞的总 RNA， 利用 PrimeScrip RT reagent Kit将 mRNA 逆转录为 cDNA， 加入 90 L的 RNase-Free dH20稀释 cDNA， -20°C保存。

[0025] 取各组细胞的 cDNA 1

为模板， 以 GAPDH为内参， 实吋荧光定量 PCR (QPCR) 检测 CLOCK相对表 达量， 设置反应条件： 95°C 10s， 1个循环； 95°C 5s， 54°C 30s， 共 40个循环， 利用 SYBR Primescript RT-PCR Kit检测各组细胞 CLOCK基因相对表达量， 结果 如图 1所示。 结果显示转导 pLKO-CLOCK载体的 C6细胞， CLOCK基因表达明显 受到抑制， 干扰片段对目的基因的抑制效率达 78.5%±3.9<¾， 从而证明本实验中 采用的 pLKO-CLOCK载体携带 shRNA能特异抑制 CLOCK基因的表达， 且抑制效 果非常显著。

[0026] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明 所作的进一步详细说明， 不能认 定本发明的具体实施只局限于这些说明。 对于本发明所属技术领域的普通技术 人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干简单推演或替换， 都应当视为属于本发明的保护范围。

工业实用性

本发明提供的 shRNA具有转导效率高， 可高效、 特异地抑制 C6细胞 CLOCK基 因表达的优点， 可作为有力工具应用于制备治疗 CLOCK基因表达异常相关疾病 的药物。