SPEZIES-UNABHäNGIGE DNA-FINGERPRINT-ANALYSE MIT PRIMER ABGELEITET VON DER NOT I - ERKENNUNGS S EQUENZ

Die Erfindung betrifft ein Nukleinsäure-gestütztes Spezies-unabhängiges Nachweisverfahren für biologisches Material, das sowohl beim Menschen, als auch bei Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen Anwendung findet und insbesondere zur genomischen Fingerprint-Analyse und Aufklärung von Verwandtschaftsgraden bzw. -Verhältnissen von Individuen, Pflanzensorten, Tierrassen und Stämmen von Mikroorganismen geeignet ist. Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus Primer und Kits zur Verwendung in dem erfϊndungsgemäßen Verfahren.

Die DNA- bzw. Genom-Analyse stellt die modernste Methode zur Bestimmung der Identität und der Verwandtschaft verschiedener Individuen dar. Unter den genetischen Markern für die Genom-Analyse nehmen DNA-Polymorphismen eine wichtige Position ein. Insbesondere diejenigen genetischen Marker, für die gezeigt werden konnte, dass sie genetisch mit einem Merkmal von Interesse gekoppelt sind, können beispielsweise für das Klonieren von Genen, für medizinische Diagnostik sowie für die Introgression, d. h. die Einführung von Merkmalen bzw. Genen einer Population in den Genbestand einer anderen durch wiederholte Kreuzung und Rückkreuzungen, verwendet werden. Die am häufigsten verwendeten DNA-Marker sind Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen (RFLP). Der Nachweis von RFLPs durch Southern Blot Hybridisierungen ist allerdings arbeitsaufwändig und mit dem für viele Anwendungen erforderlichen hohen analytischen Durchsatz nicht vereinbar. Andere Polymorphismen-Assays, die auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basieren, setzen insbesondere für die Gestaltung der Amplifikationsprimer bestimmte Informationen über die Ziel-DNA-Sequenz voraus. Auch hier stehen die für die Gewinnung der Sequenzinformationen aufzuwendende Zeit sowie die dabei anfallenden Kosten einer Verwendung im Rahmen groß angelegter Hochdurchsatzstudien entgegen.

Unter den Fingerprint- Analysen wurden seit 1985 so genannte VNTRs (variable number of tandem repeats) zur Genomtypisierung menschlicher Individuen untersucht. Diese auch

Minisatelliten genannten Bereiche befinden sich an den Telomeren der Chromosomen und bestehen aus längeren Wiederholungseinheiten als die Mikrosatelliten. Sie treten bei jedem Individuum in einer unverwechselbaren Länge am untersuchten VNTR-Locus auf. Mit Hilfe der PCR-Technik werden VNTRs enthaltende DNA-Abschnitte vervielfältigt, durch Gelelektrophorese aufgetrennt und nach Anfärbung mit Ethidiumbromid unter UV -Licht sichtbar gemacht. Da die Sequenzwiederholungen in einer variablen Anzahl von Einheiten vorkommen, ergibt sich anhand der unterschiedlichen Länge der PCR-Amplifikate für jeden Menschen ein spezifisches Bandenmuster (Jeffreys et al., Nature 314 (1985), 67-73 und Jeffreys et al., Nature 316 (1985), 76-90). Etwa ab 1998 wurden die VNTRs fast vollständig durch die STR-Technik (short tandem repeat) (Edwards et al., Am. J. Hum. Genet. 49 (1991), 746-756) verdrängt. Als STR wird eine Abfolge von zwei bis sechs Basenpaaren bezeichnet, die sich mehrere Male hintereinander wiederholt. Dabei ist die gesamte Länge des STR kleiner als 100 bp. Die Analyse von STR-Regionen bietet sich vor allem in der Gerichtsmedizin an, da auch sehr niedrige DNA-Konzentrationen zu einem erfolgreichen Resultat führen (Ruitberg et al., Nucleic Acid Res. 29 (2001), 320-322).

Zur Aufklärung von Verwandtschaftsverhältnissen menschlicher Individuen wurde auch die Untersuchung von Punktmutationen herangezogen. Mit Hilfe der SNP-Methode lassen sich einzelne Basenaustausche bekannter Sequenzen genau analysieren. 90 % aller genetischen Variationen im menschlichen Genom sind SNPs. Sie sind ungleichmäßig stark über das Genom verteilt, hoch variabel und lassen sich relativ schnell und einfach bestimmen.

Ein Verfahren, das die Untersuchung genetischer Variation erlaubt, ohne dass es eine Kenntnis der Ziel-DNA-Sequenz erfordert, basiert auf dem Prinzip der Randomly Amplifϊed Polymorphie DNA-PCR (RAPD-PCR) (Williams et al., Nucleic Acids Res. 18 (1990), 6531- 6535). Die RAPD-PCR basiert auf der Amplifikation von genomischer DNA mit einzelnen Primern von willkürlicher Nukleotidsequenz. Diese Primer detektieren Polymorphismen in der Abwesenheit von spezifischer Nukleotidsequenzinformation, wobei die Polymorphismen als genetische Marker wirken und zur Konstruktion von genetischen Karten verwendet werden können. Die RAPD-PCR erlaubt gegenüber der vorstehend genannten RFLP und der zielgerichteten PCR automatisierte genomische Analysen sowie die Verwendung eines standardisierten Primersets für die genomische Analyse einer Auswahl verschiedener Spezies,

ohne dass Vorarbeiten wie Sequenzierungen erforderlich sind. Dennoch ist sie nicht universell anwendbar und erfordert zudem die Verwendung eines Sets aus mehreren verschiedenen Primern. Für die Durchführung genomischer Analysen durch RAPD-PCR kann grundsätzlich die Verwendung eines Sets von bis zu mehreren hundert Primern erforderlich sein, wobei die einzelnen Primer unterschiedliche Polymorphismen anzeigen und sich die Auswertung entsprechend aufwändig gestaltet. Zudem treten bei der RAPD-PCR neben unspezifischen PCR-Amplifikaten auch so genannte "Geisterbanden" auf, wodurch die Ergebnisse schlecht reproduzierbar sind. Aus diesem Grund wird die RAPD-PCR auch nicht für Abstammungsgutachten vor Gericht anerkannt.

Den vorbekannten Verfahren ist gemeinsam, dass sie arbeitsaufwändig sind und/oder keine zuverlässigen Aussagen zu Verwandtschaftsgraden und Abstammungen von Individuen mit geringer genetischer Distanz, beispielsweise von sehr ähnlichen Pflanzensorten erlauben. Es liegt auf der Hand, dass die Bereitstellung von Mitteln und Verfahren, die die Bestimmung der genetischen Distanz zwischen einzelnen Individuen und deren Verwandtschaftsgrad erlauben, in vielen Bereichen der modernen Biologie oder Medizin wesentliche Vorteile mit sich bringen wird.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher, die vorstehend beschriebenen Nachteile aus dem Stand der Technik zu überwinden.

Die Lösung dieser Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten und nachfolgend beschriebenen Ausführungsformen erreicht.

Demnach stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von Individuen zur Verfügung, und insbesondere zur Bestimmung des Verwandtschaftsgrades einzelner Individuen und zur Differenzierung von Individuen verschiedener Herkunft. Im Einzelnen betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäurespezies unter der Verwendung mindestens eines Primers, der eine Sequenz enthält, die von einer palindromischen, vorzugsweise GC -reichen Sequenz abgeleitet ist. Im Allgemeinen werden solche Verfahren unter dem Begriff "DNA-Fingerprint-Analyse" zusammengefasst. Dieser Begriff wird auch nachfolgend verwendet; jedoch schließt das

erfindungsgemäße Verfahren nicht nur den Nachweis von DNA-Spezies ein, sondern auch anderer Nukleinsäuren, wie RNA sowie genetischer Elemente und Viren.

überraschenderweise wurde gefunden, dass Primer, die eine Sequenz enthalten, welche von einer einzelnen 8 bp langen palindromischen Sequenz abgeleitet ist, für Spezies-unabhängige Fingerprint-Analysen von pro- und eukaryotischen Organismen eingesetzt werden können und wiederum überraschenderweise ein hohes Auflösungsvermögen und gute Reproduzierbarkeit vermitteln. Beispielsweise konnte die Identifizierung von Bakterien und Hefen bis auf Art- bzw. Stammniveau zuverlässig erzielt werden; siehe die Beispiele 3 - 5 und 9 sowie die Figuren 2 - 6 sowie 18 und 19. Ferner konnte das erfindungsgemäße Verfahren erfolgreich zur Aufklärung von Verwandtschaftsverhältnissen verschiedener Rebsorten eingesetzt werden; siehe Beispiel 6 sowie Figur 9 und 10. Hierbei konnte eine Differenzierung bis auf Klonniveau erreicht werden; siehe Figuren 11 und 12. Darüber hinaus konnte das erfindungsgemäße Verfahren erfolgreich bei der Bestimmung des Verwandtschaftsgrades bzw. der Unterscheidung von Tieren, hier Labormäusen, eingesetzt werden; siehe Beispiel 7 und Figuren 13 und 14. Schließlich konnte das erfindungsgemäße Verfahren auch erfolgreich zur Genomtypisierung menschlicher Individuen verwendet werden; siehe Beispiel 8 sowie Figuren 15, 16 und 17.

Die Beispiele zeigen, dass das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis und Identifizierung von Spezies anhand deren Nukleinsäure und zur der Verwendung eines Primers, der eine 8 bp lange palindromische Sequenz aufweist bzw. an eine solche im Genom der zu untersuchenden Individuen bindet, in der Lage ist, die genetische Verwandtschaft von beliebigen pro- und eukaryotischen Organismen zu bestimmen. Aufgrund der überraschenden Universalität und des hohen Auflösungsvermögens kann das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafterweise zur Identifizierung von biologischem Material in Proben und zur Unterscheidung von Mikroorganismen, beispielsweise Bakterien und Hefestämmen oder auch von Pflanzensorten bzw. Tierrassen herangezogen werden.

Der vorliegende Befund ist umso überraschender, als in der Regel im Stand der Technik davon ausgegangen wurde, dass Primer lediglich in taxonomisch eng gesteckten Grenzen eingesetzt werden können, wenn aussagekräftige Fingerprints erhalten werden sollen.

Im Allgemeinen betrifft die vorliegende Erfindung daher in einem ersten Aspekt die Verwendung mindestens eines ersten Primers zur DNA-Fingerprint-Analyse, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass der mindestens erste Primer eine Sequenz enthält, die von einer 8 bp langen, palindromischen und/oder vorzugsweise GC-reichen Sequenz abgeleitet ist.

Der Begriff "Primer" bzw. "Oligonukleotid" umfasst ein Oligomer aus Ribonukleinsäure (RNA) oder Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Mimetika davon. Hierzu gehören Oligonukleotide, die aus natürlich vorkommenden Nukleobasen, Zuckern und kovalenten Internukleosid-Verknüpfungen (Rückgrat) bestehen, genauso wie Oligonukleotide mit Strukturen, die in der Natur nicht vorkommen, deren Funktion aber den natürlich vorkommenden ähnlich ist.

Grundsätzlich umfasst der Begriff "Primer" im Sinne der vorliegenden Erfindung jedes Molekül, das eine Sequenz enthält, die von einer, vorzugsweise 8 bp langen, palindromischen Sequenz abgeleitet und in der Lage ist, eine Polymerase-Reaktion zu initiieren oder zu unterstützen. Dabei versteht sich, dass der erfindungsgemäße Primer vorzugsweise eine 8 bp lange palindromische Sequenz aufweist und/oder an eine solche, die in einem Zielnukleinsäuremolekül enthalten ist, unter Bedingungen hybridisiert, die die Initiierung einer Polymerase-Reaktion erlauben. Beispielhafte Hybridisierungsbedingungen können einschlägigen Standardwerken entnommen werden, wie Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Handbook", CSH Press, CoId Spring Harbour, 1989 oder Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1989 und neuere Auflagen). Bevorzugte Hybridisierungsbedingungen sind in den Beispielen beschrieben.

Prinzipiell umfasst sind die bekannten Polymerase-Reaktionen, die mit jedweder Polymerase durchgeführt werden können. Vorzugsweise sind thermostabile Polymerasen zu verwenden, wie zum Beispiel thermostabile DNA-Polymerasen für die PCR, die im Stand der Technik hinreichend bekannt sind. Geeignet sind beispielsweise die thermostabilen DNA-Polymerasen aus Thermus aquaticus, Thermus flavis oder Thermococcus litoralis. Die Polymerasen müssen nicht von Enzymisolierungen stammen, sondern können auch Monierten Ursprungs sein.

Diesbezüglich ist in bestimmten Ausfuhrungsformen der vorliegenden Erfindung bereits die Durchführung einer einzelnen Polymerase-Reaktion ausreichend. Vorzugsweise werden hierbei markierte Primer eingesetzt.

Der überraschende Befund der vorliegenden Erfindung wurde anhand der Verwendung eines Primers verifiziert, der von der 8 bp langen palindromischen Erkennungssequenz der Restriktionsendonuklease Notl (5'-GCGGCCGC-S') abgeleitet ist; siehe Tabellen 1 und 2. Hierbei wurde überraschenderweise festgestellt, dass sich Primer, die von der Notl- Erkennungssequenz abgeleitet sind ("NM-Primer"), besonders gut zur direkten Stamm- Identifizierung von Mikroorganismen- Stämmen verschiedener Arten eignen, die aus Weinen isoliert wurden. Beispielsweise wurden durch die erfindungsgemäße Verwendung des vorstehenden λfort-Primers Bakterien-Stämme der Arten Oenococcus oeni und Pediococcus parvulus analysiert; siehe Beispiel 3 bzw. Beispiel 4 sowie Figur 2 und 3 bzw. Figur 4 und 5. Mit dem iVotl-Primer konnte ebenfalls eine Verwandtschaftsanalyse mit mehreren Stämmen der Hefe Brettanomyces bruxellensis durchgeführt werden; siehe Beispiel 5 sowie Figuren 6 - 8. Daneben konnte die Abstammung verschiedener Rebsorten der Weinrebe Vitis vinifera vinifera aufgezeigt werden; siehe Beispiel 6 sowie Figuren 9 bis 12. Weiterhin gelang mit den Mtfl-Primern eine Verwandtschaftsanalyse von Labormäusen (Mus musculus); siehe Beispiel 7 sowie Figuren 13 und 14. Schließlich konnte das erfindungsgemäße Verfahren auch erfolgreich zur Genomtypisierung menschlicher Individuen (Homo sapiens sapiens) verwendet werden; siehe Beispiel 8 sowie Figuren 15, 16 und 17.

Demgemäß ist eine bevorzugte Ausführungsform des Primers dadurch gekennzeichnet, dass die im Primer enthaltene, von einer 8 bp langen palindromischen Sequenz abgeleitete Sequenz die Erkennungssequenz einer Restriktionsendonuklease ist. Besonders bevorzugt ist diese Erkennungssequenz einer Restriktionsendonuklease die Erkennungssequenz der Restriktionsendonuklease Notl; siehe auch die Beispiele. Die iVbrt-Erkennungssequenz (5'- GCGGCCGC-3') kommt im Genom verschiedener Organismen im Vergleich zu den Erkennungssequenzen anderer Restriktionsendonukleasen seltener vor. Die Sequenz eignet sich daher zur Verwendung als Primer, da erfindungsgemäß davon ausgegangen wird, dass dieser seltener mit der genomischen DNA hybridisieren wird. Besonders gut eignet sich die Sequenz zur Verwendung als PCR-Primer, da nicht zu viele Abschnitte auf der genomischen

DNA-Matrize amplifiziert werden, welche die Auswertung des Bandenmusters nach gelelektrophoretischer Auftrennung der PCR-Produkte erschweren würden. Dieser besonders bevorzugten Ausfuhrungsform entsprechend sind die erfindungs gemäßen Primer demnach vorzugsweise ausgewählt unter den in Tabelle 1 und 2 gezeigten Sequenzen. Wie zu erkennen, besteht die iVM-Erkennungssequenz ausschließlich aus den Nukleotiden G und C. Im Falle der Verwendung von Primern, die nicht die TVotl-Erkennungssequenz aufweisen, ist es daher bevorzugt, Primer zu verwenden, die ebenfalls einen hohen GC-Gehalt von mindestens 50 von bis zu 100 % aufweisen, vorzugsweise im Bereich von 70 - 95 %. In diesem Zusammenhang wurde in Untersuchungen im Rahmen der vorliegenden Erfindung überraschenderweise festgestellt, dass in bestimmten Ausführungsformen, insbesondere bei der DNA-Fingerprint-Analyse von biologischem Material mit geringerem genetischem Informationsgehalt wie beispielsweise des Genoms von Mikroorganismen, Organellen wie Mitochondrien oder Viren auch Primer vorzugsweise eingesetzt werden können, die eine GC- haltige Kernsequenz von weniger als 8 Nukleotiden aufweisen, beispielsweise 7 oder lediglich 6 Nukleotide, die dann vorzugsweise ausschließlich oder im Wesentlichen aus G und/oder C bestehen, gegebenenfalls aber wie vorstehend erläutert an ihrem 5'- und/oder 3'-Ende ein weiteres Nukleotid tragen. Die Verwendung solcher Primer bietet sich insbesondere bei der DNA-Fingerprint-Analyse von Bakterien wie den in den Beispielen beschriebenen Oenokokken oder Pediokokken an. Daher umfasst die vorliegende Erfindung auch DNA-Fingerprint-Analysen unter Verwendung eines ersten und/oder zweiten Primers, der eine GC-reiche Kernsequenz von 5 bis 7 Nukleotiden, vorzugsweise 6 Nukleotiden aufweist. Besonders bevorzugt sind auch diese Primer bzw. deren Kernsequenzen von der Notl-Erkennungssequenz abgeleitet. Dementsprechend wird auch ein solcher vorstehend beschriebener Primer mit einer GC-reichen Kernsequenz von beispielsweise nur 6 Nukleotiden als ein erster Primer im Sinne der vorliegenden Erfindung angesehen, der von einer palindromischen Sequenz abgeleitet ist, insbesondere vorzugsweise von der Erkennungssequenz der Restriktionsendonuklease Notl. In einer Ausführungsform der Erfindung wird für den ersten und/oder zweiten Primer ein Gemisch der vorstehend beschriebenen Primer eingesetzt, d. h. Primer, die 8 oder mehr Nukleotide aufweisen und von einer 8 bp langen palindromischen Sequenz abgeleitet sind, und Primer mit weniger als 8 Nukleotiden, deren Kernsequenz GC -reich ist wie vorstehend beschrieben. Im Einzelnen

können die erfϊndungsgemäßen Primer einen GC-Gehalt aufweisen, wie er für die beispielhaft dargestellten Primer in Tabelle 1 und 2 angegeben ist.

Zusätzlich zu der Sequenz, die von einer 8 bp langen palindromischen Sequenz abgeleitet ist, können die erfindungsgemäßen Sequenzen am 5 '-Ende und/oder 3 '-Ende weitere Verknüpfungen, beispielsweise mit Markermolekülen und/oder Nukleotiden aufweisen. Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Primers ist dadurch gekennzeichnet, dass 5' an der im Primer enthaltenen Sequenz mindestens ein weiteres Nukleotid angefügt ist. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung ist dadurch gekennzeichnet, dass gleichzeitig oder alternativ 3' an der im Primer enthaltenen Sequenz mindestens eine weiteres Nukleotid angefügt ist. Vorzugsweise ist das 5' an der Sequenz angefügte Nukleotid Adenosinmonophosphat (A). Das/die 3' an der Sequenz angefügte(n) Nukleotid(e) ist/sind Adenosinmonophosphat (A), Cytidinmonophosphat (C), Guanosinmonophosphat (G) und Thymidinmonophosphat (T); siehe auch die Beispiele.

Die erfindungsgemäßen Primer besitzen üblicherweise eine Länge von bis zu 50 Nukleotiden, vorzugsweise von bis 25 Nukleotiden, mehr bevorzugt von 9 bis 12 Nukleotiden und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform von 10 oder 11 Nukleotiden. Allerdings ist die Erfindung auch mit kürzeren, insbesondere 8 Nukleotide langen Primern durchführbar.

Zur Amplifikation einer Nukleinsäure- bzw. Polynukleotidsequenz kann jedwede Technik verwendet werden, bei der die Polynukleotidsequenz vervielfältigt bzw. reproduziert oder kopiert wird. Prinzipiell brauchbar sind die bekannten Amplifϊkationsverfahren, zu denen die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zählt, mitunter auch als nested PCR, asymmetrische PCR oder Multiplex-PCR durchgeführt, oder alternative Verfahren, wie die Ligase-Kettenreaktion (LCR), Nukleinsäuresequenz-basierende Amplifikation (NASBA), Transkriptions-vermittelte Amplifikation (TMA) bzw. das auf Transkription basierende Amplifikationssystem (abgekürzt TAS, siehe Kwo et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86 (1989), 1173 - 1177), das nach retroviralem Replikationsmuster ablaufende "Sequenz- Replikationssystem" (abgekürzt 3SR, siehe Guatelli et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87 (1990), 1874 - 1878) und das Q-beta Replicase-System (siehe Kramer und Lizadi, Nature 339 (1989), 401 - 402). Bestimmte Versionen dieser Techniken

und/oder Kombinationen mit anderen molekularbiologischen Methoden können zweckmäßig sein. Insbesondere geeignet ist jedoch die PCR, wie sie vorstehend genannt und in den Ausführungsbeispielen beschrieben ist.

Eine bevorzugte Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen Verwendung ist daher dadurch gekennzeichnet, dass die zu analysierende DNA mit dem mindestens ersten Primer durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert wird. Bevorzugt anzuwendende PCR- Bedingungen sind den Beispielen zu entnehmen.

Es können jegliche Arten von Nukleinsäure- bzw. Polynukleotidsequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung amplifiziert werden, wie doppelsträngige und einzelsträngige DNA und RNA. Die zu amplifizierende Polynukleotidsequenz kann selbst Teil einer längeren Polynukleotidsequenz sein, beispielsweise Teil eines Gens, einer regulatorischen Sequenz, einer viralen oder bakteriellen DNA- oder RNA-Sequenz, einer Boten-RNA (m-RNA) oder eines Plasmids.

In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die Primer vorzugsweise in einer neu entwickelten erfindungsgemäßen PCR-Methode, der specific amplification of Polymorphie DNA-PCR (SAPD-PCR), verwendet. Die SAPD-PCR ist insbesondere zur Ermittlung der genetischen Verwandtschaft von beliebigen Organismen geeignet, die derselben Art angehören. Die Methode kann daher zur Identifikation bzw. zur Unterscheidung von Stämmen oder teilweise auch Arten (Brettanomyces bruxellensis) herangezogen werden. Die SAPD-PCR ist eine erfindungsgemäße Weiterentwicklung des Prinzips der vorstehend genannten RAPD-PCR. Bei der SAPD-PCR werden zwar ebenfalls wie bei der RAPD-PCR unbekannte Bereiche auf der genomischen DNA der Organismen-Stämme amplifiziert, im Unterschied zur RAPD-PCR werden bei der SAPD-PCR jedoch speziell ausgewählte spezifische Primer verwendet, d. h. vorzugsweise die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Primer. Wie bei der RAPD-PCR wird auch bei der SAPD-PCR nur jeweils ein Primer pro PCR-Reaktion verwendet. Die Primer binden an komplementäre Stellen im Genom und bedingen die Amplifikation der Bereiche, die sie flankieren. Die im erfindungsgemäßen Primer enthaltenen und von palindromischen Sequenzen angeleiteten Sequenzen sind statistisch im Genom verteilt und kommen bei 50 % GC-Gehalt pro 4 ⁿ Nukleotide etwa einmal vor, wobei 4 für die Anzahl der Nukleotidbasen A, T, G und C in der

DNA und n für die Anzahl der Nukleotide in der Erkennungssequenz steht. Es kann erwartet werden, dass mit zunehmender Länge der Primer diese spezifische Nukleotidabfolge weniger häufig in einer DNA vorkommt. Für die erfindungsgemäße Verwendung eigenen sich insbesondere Primer, die im Genom verschiedener Organismen im Vergleich zu anderen Nukleotidabfolgen seltener vorkommen.

Die erfindungsgemäßen Primer, welche Sequenzen enthalten, die von palindromischen Sequenzen abgeleitet wurden (Tabelle 1), eignen sich daher besonders zur Verwendung bei der SAPD-PCR, da nicht zu viele Abschnitte auf der genomischen DNA-Matrize amplifiziert werden, die die Auswertung des Bandenmusters beispielsweise nach gelelektrophoretischer Auftrennung der PCR-Produkte erschweren würden.

Als vorteilhaft hat sich bei der Durchführung der SAPD-PCR die Einführung einer so genannten "Rampe" erwiesen. Dadurch kann insbesondere die Variabilität der PCR-Produkte reduziert werden. Die Rampe beschreibt den schrittweisen Temperaturanstieg zwischen Annealing (Hybridbildung) und Elongation (Verlängerung) des Primers. Die zeitliche Ausdehnung der Rampe gewährleistet eine reproduzierbarere Bindung des Primers an die DNA-Matrize. Ein erfindungsgemäßes Anwendungsbeispiel einer Rampe kann dem Beispiel 2, Ziffer 2.2 entnommen werden. Die Durchführung der Rampe im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen DNA-Fingerprint- Verfahren führt beispielsweise nach elektrophoretischer Auftrennung der DNA in Agarosegelen und anschließender Visualisierung im UV-Licht nach Färbung mit Ethidiumbromid zu besonders aussagekräftigen und stabilen Fingerprint-Bandenmustern; siehe Figuren 1, 2, 4, 7, 9, 13, 15 und 16.

Daher umfasst die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt der DNA-Fingerprint- Analyse die Einführung einer Rampe bei der Amplifikation, die bevorzugt als SAPD-PCR durchgeführt wird.

Als besonders vorteilhaft hat sich bei der SAPD-PCR die Durchführung einer zweiten Amplifikation erwiesen. Dadurch kann die Produktspezifität erhöht werden. Hierbei wird das Amplifikationsprodukt der ersten Amplifikation eingesetzt. Dieses wird, vorzugsweise unter

Verwendung von spezifischen Primern, in der zweiten Amplifikation, der so genannten nested SAPD-PCR, amplifiziert. Ein entsprechendes erfindungsgemäßes Anwendungsbeispiel einer nested SAPD-PCR kann dem Beispiel 2, Ziffer 2.3 entnommen werden. Auf diese Weise wird das Auftreten von unspezifischen PCR-Produkten minimiert (Puig et al., Appl. Environ. Microbiol. 60 (1994), 2963-2970). Der Vorteil der nested PCR liegt darin, dass lineare und proteinfreie DNA-Fragmente für die Amplifikation eingesetzt werden, da genomische DNA sich teilweise nicht 100 % denaturieren lässt und selbst nach mehreren Reinigungsschritten noch mit Histonen assoziiert sein kann. Ebenfalls werden geringe Mengen an DNA amplifiziert, so dass sie im Agarosegel erkennbar werden. Da bei der (nested) SAPD-PCR mehrere Bereiche gleichzeitig amplifiziert werden, zählt die Methode zu den Multilocus- Verfahren. Durch die gleichzeitige Amplifikation mehrerer Genorte entsteht nach elektrophoretischer Auftrennung der PCR-Produkte in Agarosegelen und anschließender Visualisierung im UV-Licht nach Färbung mit Ethidiumbromid ein aussagekräftiges Fingerprint-Bandenmuster; siehe Figuren 1, 2, 4, 6, 7, 9, 13, 15 und 16.

Daher wird in einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung der erfindungsgemäße Primer bevorzugt bei einer nested SAPD-PCR eingesetzt. Der zweite Primer weist hierbei gegenüber dem ersten Primer eine längere Nukleotidsequenz auf. Vorzugsweise ist 3' an der Sequenz des zweiten Primers gegenüber dem ersten Primer ein zusätzliches Nukleotid angefügt. Dieses kann Adenosinmonophosphat (A), Cytidinmonophosphat (C), Guanosinmonophosphat (G) oder Thymidinmonophosphat (T) sein (Tabelle 2).

Wie in den Beispielen gezeigt, hat es sich hierbei als besonders vorteilhaft erwiesen, bei der zweiten Amplifikation, der nested SAPD-PCR, keine Rampe durchzufuhren. In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen DNA-Fingerprint-Analyse umfasst diese eine Amplifikation der zu analysierenden DNA durch PCR, wobei eine erste Amplifikation mit einem ersten Primer und eine zweite Amplifikation mit einem zweiten Primer durchgeführt wird. In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen DNA-Fingerprint-Analyse wird die erste Amplifikation mit Rampe und die zweite Amplifikation ohne Rampe durchgeführt.

In einem eigenständigen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die vorstehend beschriebene SAPD-PCR und nested SAPD-PCR, die nicht auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Primer beschränkt ist, wobei diese allerdings bevorzugt sind.

Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens hat sich weiterhin gezeigt, dass insbesondere Primerkonzentrationen im Bereich von 0,1 - 10 μM, vorzugsweise im Bereich von 0,5 - 5 μM und besonders bevorzugt von 2 ± 1 μM geeignet sind. Hinsichtlich der Template-DNA haben sich bei Durchführung der SAPD-PCR Konzentrationen im Bereich von 50 - 500 ng als besonders vorteilhaft erwiesen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden für die Amplifikationsreaktion 50 - 500 nM Template-DNA und 1 - 2 μM Primer eingesetzt; siehe Beispiel 2, Ziffern 2.2 und 2.3.

Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen nested SAPD-PCR wurde überraschenderweise festgestellt, dass diese ganz allgemein dazu geeignet ist, die schlechte Reproduzierbarkeit der RAPD-PCR zu verbessern, bei der häufig das zufällige Auftreten oder Verschwinden von PCR-Amplifikaten, bei Wiederholung der gleichen Reaktion, beobachtet werden kann (Newton und Graham, PCR (Labor im Fokus) 2. Aufl. (Ed. Newton und Graham), Spektrum Akad. Verl., Heidelberg (1994)). Die erste PCR-Runde (SAPD-PCR) im erfϊndungsgemäßen Verfahren basiert auf der Methode der RAPD-PCR, daher können auch weniger spezifische Primer-Bindungen entstehen. Diese Bindungen sind jedoch notwendig um auf Stamm-Ebene differenzieren zu können.

Um Stamm-relevante schwächere Banden an die Intensität anderer Amplifikate anzugleichen, wird im erfindungsgemäßen Verfahren in der nested PCR-Reaktion (zweite Amplifikation) vorzugsweise ein PCR-Beschleuniger (Enhancer-Solution P, Peqlab; Q-Solution, Qiagen) verwendet und die Reaktion ohne Rampe durchgeführt. Das Weglassen der Rampe ist vorteilhaft, da Stamm-relevante Unterschiede besser zum Ausdruck kommen. Durch die Anwendung eines nested Primers, also z. B. die Verwendung des Primers A-Not (5 ' AGCGGCCGC-A 3 ') in der ersten Reaktion und beispielsweise A-Not-A (5αGCGGCCGC-AA 3 ') bei der nested PCR wird der Einfluss nicht-reproduzierbarer Banden gemindert. Mit der Auswertung mehrerer Gelbilder (i. d. R. 4), die durch nested SAPD-PCR mit verschiedenen Primern zuvor produziert wurden, kann so der fehlerhafte Einfluss durch Auftreten oder Verschwinden einzelner Gelbanden minimiert werden.

Gegenüber anderen Fingerprint- Verfahren, wie z. B. RFLP- (Zavaleta et al., Appl. Environ. Microbiol. 63 (1997), 1261-1267) bzw. RAPD- (Lechiancole et al., Syst. Appl. Microbiol. (2005), Elektronische Veröffentlichung vor dem Druck) Analyse überzeugt die nested SAPD- PCR durch ein höheres Auflösungsvermögen.

Der größte Vorteil der nested SAPD-PCR gegenüber bisher verwendeten molekularbiologischen Methoden zur Verwandtschaftsanalyse ist, dass sie bei allen bisher untersuchten Organismen-Gruppen, selbst bei Organismen mit sehr konserviertem Genom {Oenococcus oeni), angewandt werden kann, ohne eine Vielzahl von zufällig gewählten Primern auszuprobieren (vgl. handelsübliche RAPD-Primer Kits mit bis zu über 500 Primern). Das Kit für die nested SAPD-PCR kommt vergleichsweise mit nur 5 bis 20 Primern aus und konnte bisher bei Bakterien, Hefen, Pflanzen, Tieren und Menschen, also bei pro- und eukaryotischen Organismen erfolgreich eingesetzt werden. Für die Analyse sind üblicherweise 6 Primer ausreichend.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren neben der SAPD-PCR auch die Technik der Sequence Characterized Amplified Region-PCR (SCAR-PCR). Diese wird im Anschluss an die erfindungsgemäße SAPD-PCR durchgeführt; siehe Beispiel 9. Die Sequence Characterized Amplified Region (SCAR)-Analyse wurde erstmals von Paran und Michelmore eingesetzt (Paran und Michelmore, Theor. Appl. Genet. 85 (1993), 985-993). Bei der SCAR-PCR wird eine spezifische Bande aus dem SAPD-GeI ausgeschnitten und die Sequenz bestimmt. Im Anschluss daran werden die die Sequenz flankierenden spezifischen Primer synthetisiert, mit der sich nun wiederum in einer SCAR- PCR der entsprechende Klon oder eine bestimmte Spezies identifizieren lässt.

Ein weiterer großer Vorteil der erfindungsgemäßen DNA-Fingerprint-Analyse, insbesondere der nested SAPD-PCR ist, dass sie im Gegensatz zu bisher verwendeten molekularbiologischen Verfahren sowohl zum Nachweis und der Identifizierung von Nukleinsäurespezies in bzw. von jedwedem biologischem Material geeignet ist, als auch zur Verwandtschaftsanalyse bei beliebigen unterschiedlichen Organismen-Gruppen angewandt werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren wurde bisher an Bakterien, Hefen, Pflanzen, Tieren und Menschen, also pro- und eukaryotischen Organismen, erfolgreich eingesetzt. Daneben ist auch der Einsatz bei der Bestimmung verschiedener Tumorarten möglich.

In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen DNA-Fingerprint-Analyse ist der zweite Primer ein nested Primer. Der zweite Primer weist hierbei gegenüber dem ersten Primer eine längere Nukleotidsequenz auf. Vorzugsweise ist 3' an der Sequenz des zweiten Primers gegenüber dem ersten Primer ein zusätzliches Nukleotid angefügt. Dieses kann Adenosinmonophosphat (A), Cytidinmonophosphat (C), Guanosinmonophosphat (G) oder Thymidinmonophosphat (T) sein.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist der erste Primer eine der in Tabelle 1 angegebenen Sequenzen auf. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung weist der erste oder zweite Primer eine der in Tabelle 2 angegebenen Sequenzen auf.

üblicherweise wird in der erfindungsgemäßen DNA-Fingerprint-Analyse die DNA der Größe nach auf einem Gel aufgetrennt. Fingerprints vergleichbarer Auflösung und Sensitivität können hierbei mit DIG-markierten PCR-Produkten direkt im Gel ohne die generell in bekannter Weise vorgenommene übertragung der DNA-Fragmente auf Membranen (Southern Blot) sichtbar gemacht werden. Damit ist die Erstellung derartiger Fingerprints in einfachster Weise ohne die Verwendung von Radioaktivität möglich. Vorzugsweise werden hierzu die Amplifikationsprodukte in Elektrophoresegelen, wie Agarose- oder Polyacrylamidgelen, aufgetrennt. Diese werden im Gel, beispielsweise durch Verwendung von interkalierenden Substanzen sichtbar gemacht, und die Daten durch direktes Einscannen der Gele unter Verwendung von Computer-unterstützter Datenanalyse ausgewertet. Verfahren zur Computer-unterstützten Datenanalyse sind dem Fachmann bekannt und dem Stand der Technik zu entnehmen, beispielsweise in Doldi et al., Plant Breeding 116 (1997), 331-335; Karp et al., Molecular tools for Screening biodiversity (1998), Chapman und Hall, London; Lebeda und Jendrulek, Theor. Appl. Genet. 75 (1987), 194-199; Nei und Li, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76 (1979), 5269-5273; Ruckenbauer, Cluster- Analysen und ihre Möglichkeiten zur Erfassung von Komplexeigenschaften in der Getreidezüchtung, Arbeitstagung, Arbeitsgemeinschaft Saatzuchtleiter Gumpenstein (1976), 157-168, Stachel et al., Theor. Appl. Genet. 100 (2000), 242-248 und Veronesi und Falcinelli, Euphytica 38 (1988), 211- 220.

Verfahren zur Herstellung von Agarose- oder Polyacrylamidgelen zur Elektrophorese bzw. zur Auftrennung von Nukleinsäuren, beispielsweise von PCR-Produkten auf einem Elektrophoresegel sind im Stand der Technik bekannt und beispielsweise beschrieben in Beispiel 1, Ziffer 1.13 sowie in Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Handbook", CSH Press, CoId Spring Harbour, 1989. Exemplarische Anwendungen für die Computer-unterstützte Datenanalyse sind im Beispiel 1 unter Ziffern 1.14, 1.15 beschrieben sowie in den Figuren 1, 3, 5, 8, 10, 14 und 17 dargestellt.

Im Zuge der Experimente zum Nachweis der durch die erfindungsgemäße PCR erhaltenen Amplifikationsprodukte nach elektrophoretischer Auftrennung in Agarosegelen wurde überraschend festgestellt, dass die Auflösung der Gele durch Zugabe von wässriger Natriumsilicatlösung (Natronwasserglas) wesentlich verbessert werden kann; siehe auch Ziffer 1.13 in den Beispielen. In einem eigenständigen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung daher auch Gelelektrophoresemittel und -verfahren, in denen Sauerstoffsäuren des Siliziums, d. h. Kieselsäure bzw. Salze davon wie Natriumsilicat oder wässrige Lösungen davon der Gelzusammensetzung zugesetzt werden. Bei der Verwendung des Begriffs "Kieselsäure" wird vorzugsweise darunter auch das Salz der Kieselsäure bzw. besonders bevorzugt eine wässrige Lösung davon, wie Natronwasserglas verstanden sowie Silikagel, das auch unter dem Namen "Kieselgel" bekannt ist. Besonders bevorzugt sind Alkalisalze der Kieselsäure, insbesondere Natriumsilicat. Grundsätzlich ist die Verwendung von wässriger Natriumsilicatlösung bevorzugt, jedoch sind auch andere Silicate wie Kalziumsilicat bekannt, die gegebenenfalls erfindungsgemäß verwendet werden können. Weitere Salze der Kieselsäure sind bekannt, wie Olivin, Zirkon, Granate, Thortveitit, Kieselgalmei und andere die vorzugsweise in wässriger Lösung verwendet werden. Grundsätzlich kommt auch die Verwendung der Monokieselsäure und deren Kondensationsprodukten in Betracht. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung jedweder Kieselsäure bzw. Salze und wässrige Lösungen davon in der Gelelektrophorese, insbesondere in Agarosegelen zur Auftrennung von Nukleinsäuren.

Die Kieselsäuren bzw. Silicate oder wässrige Lösungen davon werden vorteilhafterweise vor dem Aufkochen und erfindungsgemäß in einer Konzentration von 0,005 % bis 0,1 % dem Gel

zugegeben, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,01 % bis 0,05 % und besonders bevorzugt in einer Konzentration, die 0,035 % Natronwasserglas in einer 1,5 %igen Agarosegellösung entspricht; siehe auch die Beispiele in Ziffer 1.13. Aus den vorstehenden Ausfuhrungen und den Beispielen ergibt sich demnach, dass die vorliegende Erfindung auch Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in Gelen, insbesondere Agarosegelen unter Verwendung von Kieselsäure betrifft. Besonders bevorzugt sind natürlich Verwendungen, bei denen ein hohes Auflösungsvermögen der Gele von besonderem Interesse ist, wie Sequenziergele und insbesondere DNA oder RNA Fingerprintgele. Dabei ist dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung nicht auf die Verwendung der vorstehend gekennzeichneten Primer beschränkt, sondern findet ganz allgemein in der Nukleinsäure- Fingerprint-Analyse Anwendung. Demzufolge betreffen die in der vorliegenden Beschreibung erläuterten Ausführungsformen für die erfindungsgemäße DNA-Fingerprint- Analyse auch die erfindungsgemäße Verwendung von Kieselsäure in Gelen bzw. zur gelelektrophoretischen Auftrennung von Nukleinsäuren, ohne jedoch auf die Verwendung der im vorstehenden Aspekt der Erfindung beschriebenen Primer beschränkt zu sein, wobei diese natürlich bevorzugt sind. Daher betrifft die vorliegende Erfindung ganz allgemein Gelzusammensetzungen, vorzugsweise umfassend Agarose, die Kieselsäure in der vorstehend beschriebenen Form und vorzugsweise in der angegebenen Konzentration enthalten. Besonderns bevorzugt sind dabei 0,5 %igebis 2,5 %ige Agarosegelzusammensetzungen, vorteilhafterweise 1,5 %ige Agarosegelzusammensetzungen, die Alkalisilicate, vorzugsweise Natriumsilicat als wässrige Lösung wie Wasserglas in einer Konzentration von 0,01 % bis 0,05 %, vorzugsweise 0,035 % enthalten. Solche erfindungsgemäßen Gelzusammensetzungen sind auch unter dem Begriff Kit, wie er in der vorliegenden Anmeldung gebraucht wird, umfasst.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen DNA-Fingerprint- Analyse wird die DNA durch interkalierende Substanzen sichtbar gemacht. Vorzugsweise wird die DNA hierbei mit Ethidiumbromid angefärbt und unter UV-Licht sichtbar gemacht. Diese Färbemethode ist Stand der Technik und beispielsweise in Sambrook et al., a.a.O. beschrieben. Erfindungsgemäße Anwendungsbeispiele der Visualisierung eines DNA- Fingerprint-Bandenmusters im UV-Licht nach Färbung mit Ethidiumbromid sind dem Beispiel 1, Ziffer 1.13 sowie den Figuren 1, 2, 4, 6, 7, 9, 13, 15 und 16 zu entnehmen. Für die

Anfärbung von den Amplifikationsprodukten in Polyacrylamidgelen bietet sich beispielsweise die Silberfärbung an; siehe beispielsweise Schumacher et al., EMBO J. 2 (1983), 1549-1555.

In einer weiteren Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als weiterer oder alternativer Schritt das Amplifikationsprodukt auf eine Membran übertragen und durch Hybridisierung mit einer Sonde sichtbar gemacht. Hierzu kann beispielsweise ein Dot Blot oder Southern Blot durchgeführt und die auf die Membran übertragene DNA durch Hybridisierung mit einer Sonde sichtbar gemacht werden. Da die Primer Bestandteil der amplifizierten DNA sind, ist durch sie in einfacher Weise auch ein Nachweis der Banden auf der für den Southern Blot verwendeten Membran möglich. Somit umfasst die Sonde vorzugsweise den erfindungsgemäßen Primer. Die Durchführung von Southern Blots sowie die Hybridisierungen mit einer geeigneten Sonde sind ebenfalls Stand der Technik und beispielsweise in Sambrook et al., a.a.O. beschrieben.

In einer bevorzugten Ausführungsform trägt der Primer eine Markierung. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Markierung eine nicht-radioaktive Markierung, insbesondere Digoxigenin, Biotin, ein Fluoreszenzfarbstoff, ein Farbstoff oder eine radioaktive Markierung, insbesondere ³² P oder ³⁵ S. Dem Fachmann ist eine Vielzahl geeigneter Markierungen samt dazugehöriger Detektionssysteme bekannt. Fluoreszierende und chemi- oder biolumineszierende Markierungen werden aus Gründen der Sensitivität und praktischen Handhabung bevorzugt.

Die erfindungsgemäße Fingerprint- Analyse kann vorteilhafterweise für Biodiversitätsstudien, Studien zur genetischen Verwandtschaft, taxonomische Studien, oder insbesondere in der Rechtsmedizin, der Züchtung, im Sortenschutz, im Genbank-Management, in der Diagnostik (z. Bsp. Tumore, Mutationen, Mikroorganismen), in der Populationsgenetik oder für Evolutionsstudien eingesetzt werden. Das Fingerprint-Muster ist für jeden Stamm einer Art spezifisch. Die Fingerprints können daher zur Verwandtschaftsanalyse nahe verwandter Organismen/Stämme herangezogen werden und hierbei insbesondere für die Durchführung von Vaterschaftstests. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit der erfindungsgemäßen Verwendung betrifft das Gebiet der Partnerschaftsanalysen, und findet beispielsweise bei der Partnerschaftsvermittlung Anwendung. Vorzugsweise werden hierbei Polymorphismen

analysiert, die mit bestimmten Merkmalen eines Subjekts korrelieren und ähnlich wie bei morphologischen Merkmalen betreffend die Gesichtsphysiognomie etc. Aussagen über die Kompatibilität von Partnern bzw. Eltern erlauben (ähnlichkeits-Attraktivitäts-Hypothese). Die hierbei generierten Bandenmuster werden anschließend mit Phylogenie-Programmen ausgewertet. Erfindungsgemäße Anwendungsbeispiele der Auswertung sind in Beispiel 1 unter Ziffer 1.14, 1.15 beschrieben sowie in den Figuren 1, 3, 5, 8, 10, 14 und 17 dargestellt.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen der vorstehend definierten Primer, der vorzugsweise zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet ist. Hierbei weist der erfindungsgemäße Primer besonders bevorzugt eine der in Tabelle 1 oder Tabelle 2 angegebenen Sequenzen auf; siehe auch SEQ ID NOs: 1-20. Diese Primer sind bevorzugte Beispiele der in den bisherigen DNA-Fingerprint-Analysen angewandten Primer. In bestimmten Ausführungformen können ein oder mehrere erfindungsgemäße Primer auch auf feste Träger oder Membranen aufgebracht sein, beispielsweise auf einen Chip oder Microarray. Typische Trägermaterialien sind dabei Glas, Nylonmembranen und Plastikfilme. Solche Produkte werden gewöhnlich unter den Begriffen "Chips" und "Arrays" bzw. "Microarrays" zusammengefasst. Verfahren zur Herstellung solcher Chips und (Micro)arrays sind dem Fachmann bekannt; siehe beispielsweise die übersicht in Dufva, Biomol. Eng. 22 (2005), 173-184 oder Soper et al., Methods 37 (2005), 103-113. Ferner bieten kommerzielle Anbieter die Anfertigung von "Chips nach Maß", d. h. so genannte "Custom-made DNA Arrays" und "Oligo-Sets", siehe beispielsweise Affymetrix, USA, BioCat, Deutschland, GeneScan Europe, Deutschland, Sigma-Aldrich Chemie, Deutschland. Daher umfasst der Begriff "Primer" auch Mittel wie Chips und (Micro)arrays, an denen ein oder mehrere erfindungsgemäße Primer immobilisiert sind.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit zur DNA- Fingerprint-Analyse. Dieses umfasst vorzugsweise die erfindungsgemäßen Primer und/oder eine erfindungsgemäße Gelzusammensetzung und gegebenenfalls weitere Mittel zur Durchführung einer erfindungsgemäßen DNA-Fingerprint-Analyse, beispielsweise die erforderlichen Puffer und andere Reagenzien zur Durchführung der Amplifikationsreaktion. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits ist dieses zur Durchführung der erfindungsgemäßen SAPD-PCR und vorzugsweise zur Durchführung der

erfindungsgemäßen nested SAPD-PCR, wie vorstehend beschrieben und in Beispiel 2 erläutert, geeignet. Vorteilhafterweise umfasst das erfindungsgemäße Kit daher mindestens einen ersten Primer bzw. ein erstes Primer- S et zur Durchführung einer ersten Amplifϊkation und einen zweiten, so genannten nested Primer bzw. ein Set solcher nested Primer zur Durchführung der zweiten Amplifikation wie vorstehend erläutert. Ferner umfasst das erfindungsgemäße Kit vorzugsweise ein Manual zur Durchführung der erfindungsgemäßen DNA-Fingerprint-Analyse bzw. der erfindungsgemäßen SAPD- bzw. nested SAPD-PCR. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Kit weiterhin eine Polymerase für die Amplifikation der zu analysierenden DNA sowie vorteilhafterweise eine Enhancer- Lösung für die nested PCR. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Kit weiterhin einen bekannten Standard. Dieser Standard kann beispielsweise als Referenz für den Nachweis und/oder die Diagnostik unbekannter Spezies verwendet werden. Das erfindungsgemäße Kit ist in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich eine Vorrichtung zur Durchführung der Amplifikation umfasst, beispielsweise eine PCR-Maschine. Dafür geeignete Vorrichtungen sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Kit weiterhin Mittel zur Auswertung einer DNA-Fingerprint- Analyse, vorzugsweise ein Computer-unterstütztes Auswertungssystem. Beispiele Computerunterstützter Auswertungssysteme sind in Beispiel 1 unter Ziffer 1.14, 1.15 beschrieben sowie in den Figuren 1, 3, 5, 8, 10, 14 und 17 dargestellt.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur DNA-Fingerprint-Analyse von biologischem Material, beispielsweise von Menschen, Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen oder Viren, wobei das Verfahren die Verwendung des erfindungsgemäßen Primers bzw. des erfindungsgemäßen Kits umfasst und/oder gemäß der erfindungsgemäßen SAPD-PCR bzw. nested SAPD-PCR durchgeführt wird. Vorzugsweise umfasst das Verfahren die Amplifikation der zu analysierenden DNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Das erfindungsgemäße Verfahren kann grundsätzlich zur Identifizierung und zum Nachweis von biologischem Material verwendet werden. "Biologisches Material" ist jedes Material, das genetische Informationen enthält und/oder sich selbst reproduzieren oder in einem biologischen System reproduziert werden kann. Anwendungsmöglichkeiten der erfindungsgemäßen DNA-Fingerprint-Analyse, Primer und Kits ergeben sich im Grunde von

selbst. Neben den bereits vorstehend beschriebenen Anwendungsmöglichkeiten kommt beispielsweise auch deren Einsatz in der Lebens- und Futtermittelindustrie in Betracht. Beispielsweise ist es bekannt, dass viele Lebensmittel Spuren von Nukleinsäuren enthalten, die auf die Ursprungspflanze oder das Ursprungstier zur Herstellung des Lebensmittels schließen lassen. Mittels der vorliegenden Erfindung können nun gesicherte Aussagen über den tatsächlichen Ursprung der Lebensmittel bzw. der Zutaten getroffen werden. Ferner können gegebenenfalls Verunreinigungen festgestellt werden wie Kontamination durch Bakterien und Viren. Wie insbesondere durch die Beispiele nahegelegt, ist der Einsatz der erfindungsgemäßen DNA-Fingerprint- Analyse, Primer und Kits natürlich insbesondere in den Bereichen vorteilhaft, in denen Fragen zur Ermittlung der genetischen Distanz bzw. ähnlichkeit von Nukleinsäurespezies eine Rolle spielen, wie Biodiversitätsstudien, Studien zur genetischen Verwandtschaft, taxonomische Studien oder Studien aus dem Bereich Rechtsmedizin, Züchtung, Sortenschutz, Genbank-Management, Diagnostik, Populationsgenetik oder Evolution.

Weitere Ausführungsformen und Anwendungen der vorliegenden Erfindung sind den Beispielen und den Figuren zu entnehmen, die zu einem besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung und ihrer vielen Vorteile beitragen, jedoch nicht als Einschränkung verstanden werden sollen.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1: Gelbild- Auswertung und Cluster- Analyse bei der nested SAPD-PCR.

Das Verfahren wurde mit 5 Stämmen von B. bruxellensis durchgeführt. Ml = λ-ONA/EcoRl+Hindlll Marker, 3. M2 = GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder.

(1) Ergebnis der SAPD-PCR (Primer: A-Not).

(2) Ergebnis der nested SAPD-PCR (Primer: A-Not-G).

(3) Erstellen von Helligkeitsprofilen aus den einzelnen Gelspuren. Entfernen der Hintergrundsignale.

(4) übereinanderlegen der einzelnen Datenreihen.

(5) Erstellen eines 3-stelligen, dualen Zahlencodes, der das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer Gelbande und die Intensität des Signals beschreibt.

(6) Erstellen eines Stammbaums anhand der Datenmatrix.

Fig. 2: Ergebnis der nested SAPD-PCR mit den verwendeten O. oe«/-Stämmen mit C-

Not PCR-Produkt nach gelelektrophoreti scher Auftrennung. Primer: C-Not-C. 'Marker: λ-DNA / EcoRI+Hindlll, ² Marker: GeneRuler™ lOO bp DNA-Ladder.

Fig. 3: Cluster-Analyse der Oenokokken-Stämme anhand der nested SAPD-PCR mit den Primern C-Not-A, C-Not-C und C-Not-T.

Fig. 4: Ergebnis der nested SAPD-PCR mit Stämmen von P. parvulus mit C-Not

PCR-Produkt nach gelelektrophoretischer Auftrennung. Primer: C-Not-C. 'Marker: GeneRuler™ 100 bp DNA-Ladder Plus.

Fig. 5: Cluster-Analyse der P. parvulus-Stämme anhand der nested SAPD-PCR mit den Primern C-Not-A und C-Not-G.

Fig. 6: Ergebnis der SAPD-PCR zur Artunterscheidung von Brettanomyces sp. nach gelelektrophoretischer Auftrennung der PCR-Produkte.

Es sind 3 verschiedene Stämme der Art Brettanomyces bruxellensis verwendet worden sowie Typstämme der anderen Brettanomyces-Piiten. Primer: A-Not. Ml = Marker: λ-DNA / EcoW+HindlU.

Fig. 7: Ergebnis der nested SAPD-PCR mit den B. bruxellensis-Stämmen mit C-Not

PCR-Produkt nach gelelektrophoretischer Auftrennung.

Primer: C-Not-C. 'Marker: λ-DNA / EcόBl+HindUL. ² Marker: GeneRuler™ lOO bp DNA-Ladder.

Fig. 8: Cluster-Analyse der Brettanomyces bruxellensis-Stämme anhand der nested

SAPD-PCR mit den Primern A-Not-A, A-Not-C, A-Not-G, A-Not-T, C-Not-C, C-Not-G und C-Not-T.

Fig. 9: Ergebnis der nested SAPD-PCR mit Vitis vinifera mit C-Not PCR-Produkt nach gelelektrophoretischer Auftrennung. Primer: C-Not-G. 'Marker: GeneRuler™ 100 bp DNA-Ladder Plus.

Fig. 10: Cluster- Analyse mit Weinreben {Vitis vinifera) anhand der nested SAPD-PCR mit den Primern G-Not-A, G-Not-G und G-Not-T.

Fig. 11: Ergebnis der SAPD-PCR verschiedener SO 4-, Spätburgunder- und Bionova-

Klone mit G-Not PCR-Produkte nach gelelektrophoretischer Auftrennung. Marker: GeneRuler™ 100 bp DNA-Ladder

Fig. 12: Ergebnis der nested SAPD-PCR verschiedener SO 4-, Spätburgunder- und

Bionova-Klone mit G-Not-T PCR-Produkten nach gelelektrophoretischer Auftrennung. Marker: GeneRuler™ 100 bp DNA-Ladder

Fig. 13: Beispiel zur Unterscheidung verschiedener Labormäuse mittels nested SAPD-

PCR. A: Ergebnis der nested SAPD-PCR.

Primer: C-Not- A. 'Marker: λ-DNA / EcoRI+HindUI Marker, 3. B: Ergebnis der nested SAPD-PCR.

Primer: C-Not-C. 'Marker: GeneRuler™ 100 bp DNA-Ladder. C: Ergebnis der nested SAPD-PCR.

Primer: C-Not-G. 'Marker: λ-DNA / EcoKL+Hindlll Marker, 3. D: Ergebnis der nested SAPD-PCR.

Primer: C-Not-T. ² Marker: GeneRuler™ 100 bp DNA-Ladder.

Fig. 14: Cluster-Analyse mit Labormäusen (Mus musculus) anhand der nested SAPD-

PCR mit den Primern C-Not-A, C-Not-C, C-Not-G, C-Not-T.

Fig. 15: Ergebnis der nested SAPD-PCR mit DNA aus menschlichen Blutzellen mit A-

Not PCR-Produkt nach gelelektrophoretischer Auftrennung.

Primer: A-Not-C. 'Marker: GeneRuler™ 100 bp DNA-Ladder Plus. K=Kind, A=Außengruppe, E=Elter, Z=Zwilling, Familien=I, II

Fig. 16: Ergebnis der nested SAPD-PCR mit DNA aus menschlichen Blutzellen mit A-

Not PCR-Produkt nach gelelektrophoretischer Auftrennung. Primer: A-Not-G. 'Marker: GeneRuler™ 100 bp DNA-Ladder Plus. K=Kind, A= Außengruppe, E=Elter, Z=Zwilling, Familien=I, II

Fig. 17: Cluster- Analyse mit DNA aus menschlichen Blutzellen anhand der nested

SAPD-PCR mit den Primern A-Not-A, A-Not-G, C-Not-A und C-Not-G.

Fig. 18: Nested SAPD-PCR mit verschiedenen Arten der Gattung Pediococcus nach gelelektrophoretischer Auftrennung. Die nested SAPD-PCR wurde mit Primer G-Not-T durchgeführt. Die zu analysierenden Amplifϊkate wurden mit einem sterilen Skalpell ausgeschnitten. Abkürzungen: PDA = P. damnosus, PPA = P. parvulus, PAC = P. acidilactici, PPE = P. pentosaceus, PIN = P. inopinatus, PCE = P. cellicola, PCL = P. claussenii, PST = P. stiksii, PDE = P. dextrinicus. Zur Stammbezeichnung siehe Tabelle 3 in Beispiel 9.

Fig. 19: SCAR-PCR zur spezifischen Identifizierung von P. acidilactici nach gelelektrophoretischer Auftrennung (Kontrolle mit verwandten Arten). Zur Stammbezeichnung siehe Tabelle 3 in Beispiel 9. Abkürzungen: M = Marker (DNA Ladder Mix, Fermentas), PAC = P. acidilactici, PDA = Pediococcus damnosus, PPA = P. parvulus, PIN = P. inopinatus, PDE = P. dextrinicus, PPE = Pediococcus pentosaceus, PCL = P. claussenii, PCE = P. cellicola, PST = P. stilesii, La = Lactobacillus acidophilus, Ld = Lactobacillus delbrückii, Lc = Lactobacillus casei, Lf = Lactobacillus fermentum, Lp = Lactobacillus plantarum, Lh = Lactobacillus hilgardii, Lb = Lactobacillus buchneri, E. = Enterococcus, Ef = Enterococcus faecalis, Lei = Lactococcus lactis, Sm = Streptococcus mutans, Lm = Leuconostoc mesenteroides, Oo = Oenococcus oeni.

Der Offenbarungsgehalt der vor- und nachstehend zitierten Dokumente aus dem Stand der Technik ist hiermit durch Bezugnahme in dieser Anmeldung enthalten, insbesondere betreffend die Herstellung von erfindungsgemäßen Primern, damit beladene Chips und Arrays, etc. Diese und andere Ausführungsformen sind dem Fachmann offenbart und offensichtlich und umfasst durch die Beschreibung und die Beispiele der vorliegenden Erfindung. Weiterführende Literatur zu einer der oben angeführten Werkstoffen und elektronischen Hilfsmitteln, die im Sinne der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können dem Stand der Technik entnommen werden, z.B. aus öffentlichen Bibliotheken unter z.B. der Benutzung elektronischer Hilfsmittel. Zudem bieten sich andere öffentliche Datenbanken an wie die "Medline", die über das Internet zur Verfügung stehen.

Techniken zur Ausführung der Erfindung sind dem Fachmann bekannt und können der einschlägigen Literatur entnommen werden, siehe beispielsweise Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (CoId Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harnes & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Harnes & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbai, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, CoId Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, VoIs. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Extracting information from cDNA arrays, Herzel et al., CHAOS 11, (2001), 98-107. Die nachfolgenden Beispiele illustrieren die Erfindung, ohne sie einzuschränken.

BEISPIELE

Beispiel 1: Material und Methoden

1.1 Kultivierung bzw. Herkunft der Oenococcus oeni- Stämme

Alle 15 untersuchten Oenokokken-Stämme kamen aus der Kulturensammlung des Institutes für Mikrobiologie und Weinforschung der Universität Mainz. Die Stämme wurden einerseits aus verschiedenen Weinen aus unterschiedlichen Regionen Deutschlands (Stämme: B70, B241, B325, B358, B359, B367, B377, B378) und andererseits aus kommerziell erhältlichen Starterkulturen (SKl, SK2, SK3 (Lallemand, Erbslöh), B350 ("Viniflora oenos", Hansen), B352 ("Leuconostoc oenos", Lallemand), B353 ("Siha Viniflora oenos", Begerow), B354 ("Ana-Start", Deutsche Weinanalytiker) isoliert. Die Oenokokken-Stämme B358, B359, B367, B377, B378 waren alle von demselben Weingut. Die Oenokokken-Stämme wurden in 250 ml Tomatensaft-Medium (2 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % Pepton, 0,5 % Glucose, 0,005 % Tween 80 in 1 :4 verdünntem Tomatensaft lösen, auf pH 5,2-5,5 einstellen und 15 min autoklavieren) bei RT inkubiert und die Zellen für die Isolation der genomischen DNA in der späten log-Phase geerntet.

1.2 Kultivierung bzw. Herkunft der Pediococcus parvulus-Stämme

Alle 8 verwendeten Pediococcus parvulus-Stämme (9, 30, 34, 35, 115, 128, 21 6, 36_6) stammten aus der Kulturensammlung des Institutes für Mikrobiologie und Weinforschung der Universität Mainz. Die Stämme wurden ursprünglich aus rheinhessischen Weinen isoliert. Die Pediokokken- Stämme wurden in 10 ml MRS-Medium (1 % Pepton, tryptisch verdaut, 1 % Fleischextrakt, 0,5 % Hefeextrakt, 2 % Glucose, 0,1 % Tween 80, 0,2 % K ₂ HPO ₄ , 0,5 % Natriumacetat, 0,2 % (NH ₄ ) ₂ -Citrat, 0,02 % MgSO ₄ -7H ₂ O, 0,005 % MnSO ₄ -7H ₂ O in demineralisiertem (d) H ₂ O lösen, auf pH 5,2 einstellen und 15 min autoklavieren) bei RT kultiviert und die Zellen in der späten log-Phase geerntet.

1.3 Kultivierung bzw. Herkunft der Brettαnomyces- Stämme

Die Brettαnomyces-Stämme stammten alle aus der Kulturensammlung des Institutes für Mikrobiologie und Weinforschung der Universität Mainz. Von den verwendeten Brettαnomyces bruxellensis-Stämmen (9, 30, 34A, 34B, 35, 75A, 75B, 76A, 76B, 374, 566, 567, 568, 573, 575, 579) wurden die Stämme 9, 30, 34A, 34B, 35, 75A, 75B, 76A, 76B alle

aus dem gleichen Weinanbaugebiet isoliert. Die restlichen Stämme stammten aus weiter entfernten Regionen. Außerdem wurden die Typstämme der Brettanomyces-Arten B. anomalus (574), B. custersianus (576), B. nanus (577) und B. naardenensis (578) mit in die Verwandtschaftsanalyse einbezogen. Die Hefestämme wurden in 250 ml YPG-Medium (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 1 % Glucose in dH ₂ O lösen, auf pH 6,5 einstellen und für 15 min autoklavieren. Nach dem Abkühlen 0,002 % Cycloheximid und 0,01 % Ampicillin zugeben) bei 30 °C mit 130 UpM auf einem Schüttler inkubiert. Die Zellen wurden in der späten log- Phase geerntet.

1.4 Herkunft von Vitis vinifera vinifera

Für die Cluster- Analyse der Weinreben wurden die Rebsorten Riesling, Silvaner, Madeleine Royale, Müller-Thurgau, Rieslaner, Spätburgunder, Frühburgunder, Grauer Burgunder, Weißburgunder, Trollinger und Kerner verwendet.

1.5 Zellernte der Mikroorganismen

250 ml Zellkultur wurden nach der jeweiligen Inkubationszeit für 25 min bei 12.000 g abzentrifugiert und der überstand verworfen. Das Zellpellet wurde in 125 ml Waschpuffer resuspendiert und die Zeil-Suspension zentrifugiert (12.000 g, 20 min). Dieser Waschschritt wurde einmal wiederholt. Anschließend wurde der überstand dekantiert und evtl. verbleibender überstand abpipettiert. Die Zellen wurden dann in 10 ml Zell-Suspensions- Puffer aufgenommen.

1.6 Zellaufschluss und DNA-Isolierung der Mikroorganismen

Der Zellaufschluss von Oenococcus oeni und Pediococcus parvulus erfolgte durch Inkubation mit Lysozym. Nach Zugabe von 25 mg (2,5 mg/ml) Lysozym zu der Zeil-Suspension wurde die Mischung für 2-3 h bei RT inkubiert. Anschließend wurden 15 ml des warmen Lyse- Puffers zugegeben und die Zellen 2 h bei 55 °C aufgeschlossen. Nach der Inkubation mit Lysozym wurde die Zeil-Suspension mit Proteinase K (100 μg/ml), RNase A (12,5 μg/ml) und RNase Tl (25 U/ml) versetzt und für 2 h bei 55 °C inkubiert.

Die Brettanomyces bncxellensis-Stämme wurden mit Zymolyase aufgeschlossen (Kitamura und Yamamoto, Arch. Biochem. Biophys. 1 (1972), 403-406). 10 ml Zeil-Suspension wurden mit 15 ml warmem Lyse-Puffer versetzt und nach Zugabe von 1 ml Zymolyase-Lösung (15

mg/ml) 2 h bei 37 ⁰ C inkubiert. Nach der Inkubation der Zellen mit Zymolyase wurden Proteinase K (100 μg/ml), RNase A (12,5 μg/ml) und RNase Tl (25 U/ml) zu der Zeil- Suspension gegeben und für 2 h bei 55 °C inkubiert.

1.7 Isolation genomischer DNA aus Mikroorganismen

Zur Isolation der genomischen DNA wurde die Technik von Marmur (1961) angewandt (Marmur, J. Mol. Biol. 3 (1961), 208). Alternativ kann die DNA-Isolierung aus Grampositiven Bakterien und Hefen auch mit einem Kit DNeasy ^® Tissue Kit (Qiagen, Hilden) durchgeführt werden.

1.8 DNA-Isolierung aus Vitis vinifera

Die DNA-Isolierung erfolgte nach der Methode von Lodhi et al. (1994) (Lodhi et al., Plant Mol. Biol. Rep. 12 (1994), 6-13).

1.9 DNA-Isolierung aus Mus musculus

Ca. 2 cm der Mausschwänze wurden dekapitiert. Die DNA wurde mit dem DNeasy ^® Tissue Kit (Qiagen, Hilden) nach dem Protokoll "Purification of Total DNA from Rodent Tails" isoliert.

1.10 DNA-Isolierung aus menschlichen Blutzellen

Das Blut der Probanden wurde intravenös entnommen. Die DNA-Isolierung aus Blutzellen erfolgte nach dem Protokoll "Isolation of Genomic DNA from Whole Nucleated or Non- Nucleated Animal Blood" mit Hilfe des DNeasy ^® Tissue Kit (Qiagen, Hilden).

1.11 Lagerung der DNA

Die Lagerung der isolierten DNA mit 0,lxSSC-Puffer ist nur für kurze Zeiträume geeignet und bereitet bei längerer Aufbewahrung (> 0,5 a) Schwierigkeiten (Hintergrund, Mangel an Reproduzierbarkeit) bei der nested SAPD-PCR. Die Aufbewahrung in einer Suspension bestehend aus 70 %igem Ethanol und 0,lxSSC-Puffer verlängert die Lagerfristen um Jahre.

1.12 Bestimmung der DNA-Konzentration und -Reinheit

Konzentration und Reinheit der isolierten DNA wurden photometrisch bei 260 nm bestimmt. Die Konzentration der DNA-Probe berechnete sich unter Berücksichtigung des

Verdünnungsfaktors (V) sowie des Multiplikationsfaktors (F), der für doppelsträngige DNA (dsDNA) 50 beträgt, wie folgt: c [ng/μl] = (OD bei 260 nm) _* V _* F.

1.13 Durchführung der Agarose-Gelelektrophorese

Die Analyse der PCR-Fragmente erfolgte in einem 1,5 %igen Agarose-Gel in einer Horizontalelektrophorese-Kammer. Zur Verbesserung der Auflösung der Gele wurden (0,035 %) Natron Wasserglas vor dem Aufkochen zugegeben. Vor dem Giessen des Gels wurde Ethidiumbromid-Lösung (Endkonzentration 500 ng/ml) zugegeben. Je 5 μl PCR- Produkt wurden mit 1 μl Ladepuffer (6x) vermischt und auf das Gel aufgetragen. Die Trennung der Fragmente erfolgte zunächst für 20 min bei einer Spannung von 60 V und anschließend für 130 min bei 75 V. Nach der Elektrophorese wurde das Bandenmuster auf einem Transilluminator durch UV-Licht sichtbar gemacht.

1.14 Computergestützte Fingerprint-Analyse Gelbildauswertung

Die Gele wurden im Anschluss an die Elektrophorese mithilfe einer Geldokumentationseinheit (Polaroid, Offenbach) fotografiert und im TIF-Datenformat gespeichert. Im Programm TINA (Raytest Isotopenmessgeräte, Straubenhardt) wurden aus den einzelnen Spuren der Gelbilder Helligkeitsprofile generiert. Anschließend wurden die einzelnen Profile aligniert.

1.15 Cluster- Analyse (alternativ mit GelComparll ^® , Applied Maths)

Die alignierten Helligkeitsprofile werden entsprechend dem Vorhandensein einer Bande in eine duale Datenmatrix umgewandelt. Die Intensität der Banden wurde durch Auswahl von 3 Intensitätskategorien berücksichtigt. Für die duale Darstellung werden daher pro Signal 3 Matrizenpositionen belegt. Mehrere Datenmatrices, die durch die Auswertung der Gelbilder gleicher Stämme mit verschiedenen SAPD-Primern erstellt wurden, werden hintereinander gereiht. Diese Datenmatrix wurde mit dem Programm ClustalX 1.83 (Thompson et al., Nucleic Acids Res. 25 (1997), 4876-4882) in ein Dendrogramm umgewandelt. Die prinzipielle Durchführung der Gelbild-Auswertung und Cluster-Analyse ist in Figur 1 dargestellt.

Beispiel 2: Erfindungsgemäße SAPD-PCR

Wenn nicht anders angegeben, können Techniken zur Ausführung der Erfindung der einschlägigen Literatur entnommen werden, siehe beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Handbook", CSH Press, CoId Spring Harbour, 1989; DNA Cloning, Bd. I and II (D. N. Glover Hrsg., 1985) und Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait Hrsg., 1984).

2.1 Oligonukleotide

Zur SAPD-PCR wurden die vier Decamere A-, C-, G- und T-Not verwendet. Diese bestanden aus dem Nukleotid (Base) Adeninmonophosphat, an der die Erkennungssequenz der NM- Restriktionsendonuklease und jeweils ein weiteres Nukleotid (A, C, G oder T) angefügt wurden; siehe Tabelle 1. Für die nested SAPD-PCR wurden Undecamere konstruiert, indem an die Sequenz der S APD-Primer jeweils eine weitere Base angefügt wurde; siehe Tabelle 2.

2.2 Durchführung der SAPD-PCR

Zur SAPD-PCR wurden Reaktionsansätze mit einem Gesamtvolumen von 25 μl hergestellt. Die PCR wurde in 200 μl-Reaktionsgefäßen durchgeführt. Die Gehaltsangaben der einzelnen Reagenzien eines 25 μl Reaktionsansatzes lauten wie folgt:

(Die Gesamtkonzentration an MgCl ₂ im Reaktionsansatz betrug 4 mM).

Nachfolgend ist das Thermocycler Programm zur SAPD-PCR mit den Primern A-, C-, G-, T- Not dargestellt. Die Annealing-Temperatur betrug 35 °C. Im Anschluss an den Annealing- Schritt folgte eine sog. "Rampe". Die Temperaturerhöhung bis zur Elongation dauerte 8 min

pro PCR-Zyklus. Das gesamte PCR-Programm mit 35 Zyklen dauerte ca. 15,5 h.

2.3 Durchführung der nested SAPD-PCR

Als Template-DNA diente bei der nested PCR ein Mikroliter PCR-Produkt der ersten PCR- Reaktion. Durch die Zugabe von Enhancer Solution P (Peqlab) kam es zu einer verstärkten Amplifikation spezifischer PCR-Produkte (Tab. 4). Die Annealing-Temperatur betrug bei der nested PCR mit den A- und T-Not Primern 39 °C und mit den C- und G-Not Primern 41 ⁰ C. Es wurde keine Rampe verwendet. Die gesamte PCR-Reaktion dauerte ca. 5 h. Nachfolgend ist die Zusammensetzung eines Reaktionsansatzes zur nested SAPD-PCR dargestellt.

(Die Gesamtkonzentration an MgCl ₂ im Reaktionsansatz betrug 4 mM).

Nachfolgend ist das Thermocycler-Programm einer nested SAPD-PCR dargestellt.

(Pro Reaktionsansatz wurde nur 1 Primer verwendet).

Tabelle 1 : Beispiele verwendeter Oligonukleotide (Primer) für die SAPD-PCR

Tabelle 2: Beispiele verwendeter Oligonukleotide (Primer) für die nested SAPD-PCR

Beispiel 3: Anwendung der nested SAPD-PCR bei Oenococcus oeni

Oenokokken eignen sich für den biologischen Säureabbau im Wein und werden in Form von Starterkulturen eingesetzt (Davis et al., Appl. Environ. Microbiol. 51 (1986), 539-545). Oenokokken sind heterofermentative Milchsäurebakterien. Die Spezies Oenococcus oeni ist genotypisch sehr homogen. Die bisher untersuchten Stämme zeigten bei der DNA-DNA- Hybridisierung stets eine Homologie über 70 % (Garvie, J. Syst. Bacteriol. 26 (1976), 116- 122 und Dicks et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 40 (1990), 83-91) und weisen bei der für die Bakterienidentifizierung üblichen Analyse der 16S-rDNA nahezu keine Sequenzunterschiede auf 1500 bp auf. Somit besteht die Gattung Oenococcus weltweit aus nur einer Art. Die Sequenzanalyse der Region zwischen den 16S- und 23SrRNA-Genen (Le Jeune und Lonvaud-Funel et al., Res. Microbiol. 148 (1997), 79-86) erwies sich ebenfalls als ungeeignet für eine direkte Stammidentifizierung. Die Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) genomischer Makrorestriktionsfragmente (Kelly et al., Appl. Environ. Microbiol. 59 (1993), 3969-3972 und Sato et al., FEMS Microbiol. Lett. 202 (2001) 109-114) und die RAPD-PCR (Zavaleta, et al., Appl. Environ. Microbiol. 63 (1997), 1261-1267 und Zapparoli et al., FEMS Microbiol. Lett. 166 (1998), 325-332) sind molekularbiologische Methoden, die zur Stamm- Identifizierung bei Oenococcus oeni bereits erfolgreich eingesetzt werden konnten. Durch PFGE konnte das Stamm-Niveau jedoch nicht immer erreicht werden (Zavaleta et al., Appl. Environ. Microbiol. 63 (1997) 1261-1267). Die Unregelmäßigkeit der spontan auftretenden malolaktischen Gärung im Wein hat zum Einsatz von Oenococcus oeni in Form von Starterkulturen geführt. Für eine kommerzielle Nutzung von geeigneten Oenococcus oeni- Stämmen ist es wichtig, ein Verfahren zur Stamm-Identifizierung zur Hand zu haben, das die Identität ausgewählter Kulturen gewährleistet. Für Winzer, die auf den Einsatz von kommerziellen Starterkulturen verzichten und natürlich vorkommende Oenokokken- Stämme aus dem eigenen Wein verwenden, ist es außerdem wichtig, diese von unerwünschten Milchsäurebakterien zu unterscheiden, um gezielt die Stämme anzureichern, die einen positiven Einfluss auf das Aroma ausüben.

Eine aussagekräftige und reproduzierbare Stamm-Identifizierung gelang allerdings erst durch die Verwendung der erfindungsgemäßen nested SAPD-PCR gemäß Beispiel 2. Am Beispiel von 15 untersuchten Oenokokken-Stämmen konnte dabei deren Auflösung auf Stamm-Niveau gezeigt werden; siehe Figuren 2 und 3.

Beispiel 4: Anwendung der nested SAPD-PCR bei Pediococcus parvulus

Pediokokken sind fakultativ anaerobe, homofermentative, coccoide Milchsäurebakterien. Die Gattung Pediococcus (P.) setzt sich aus etwa zehn Spezies zusammen. Bekannte Vertreter der Gattung sind P. damnosus, P. parvulus, P. inopinatus, P. dextrinicus, P. pentosaceus, P. acidilactici, P. urinaeequi, P. claussenii, P. cellicola und P. soyae. Pediokokken kommen überwiegend auf Pflanzen und fermentierten Nahrungsmitteln (Getreideprodukte, Fleisch, Fisch, Gemüse, Bier und Wein) vor.

P. acidilactici und P. pentosaceus gehören zu den meist verwendeten Arten, die bei der Fermentierung von Wurstprodukten eingesetzt werden. Einige Arten wurden aus dem Gastrointestinaltrakt und dem Urogenitaltrakt von Tieren und Menschen isoliert. Manche Pediokokken- Stämme können wie Oenokokken ebenfalls den biologischen Säureabbau im Wein durchführen, bilden aber im Unterschied zu den Oenokokken störende Nebenprodukte wie Diacetyl und Acetoin (Wibowo et al., Am. J. Enol. Vitic. 36 (1985), 302-313). Ihr Wachstum ist daher im Wein unerwünscht. Bei der Weinbereitung gelangen die Pediokokken über die Weintrauben oder über unsterile Kellergeräte in den Wein (Costello et al., Food Techno. Aust. 35 (1983), 14-18). Am häufigsten wurden die Arten P. damnosus, P. pentosaceus und P. parvulus aus Weinen isoliert. Diese Arten können durch die Bildung von Exopolysacchariden zum "Zäh-" oder "Lindwerden" von Weinen führen. Vor allem Stämme von P. dammosus sind bei pH- Werten über 3,5 fähig ein Exopolysaccharid zu synthetisieren, das bei einem Zelltiter von 10 ⁵ Zellen/ml bereits für eine starke Zunahme der Viskosität sorgt (Sponholz, In: Wine Microbiology and Biotechnology (Fleet, G.H., Ed.). Hardwood Academic Publisher, Chur. (1993), 395-420).

Ein weiterer negativer Einfluss auf die Weinqualität ist die Fähigkeit einiger Pediokokken- Stämme zur Bildung von biogenen Aminen, wie z. B. Histamin, die gesundheitsschädlich für den Mensch sein können (Landete et al., J Appl. Microbiol. 99 (2005), 580-586). Es wurden bereits mehrere molekularbiologische Verfahren zur Identifizierung von Stämmen der Gattung Pediococcus beschrieben. Die am häufigsten verwendeten Methoden sind Fingerprint- Verfahren wie die RAPD-PCR und die PFGE. Eine RAPD-PCR Methode mit einem 9-mer Primer wurde von Nigatu et al. (Lett. Appl. Microbiol. 26 (1998), 412-416) zur Art-Unterscheidung verschiedener Isolate der Gattung Pediococcus aus fermentiertem Getreide eingesetzt. In dieser Studie konnte mittels RAPD-PCR mehr als 40 % der Isolate nicht zu der richtigen Art zugeordnet werden. Durch eine vergleichende 16S-rDNA-

Sequenzierung wurde festgestellt, dass die Isolate neben einigen Arten der Gattung Pediococcus zu fünf weiteren Gattungen gehören. Zur Unterscheidung verschiedener Stämme der Spezies P. acidilactici wurde von Mora et al. (2000a,b) neben einer RFLP-Analyse und der Analyse einzelner Haushaltsgene, ein 18-mer Primer zur RAPD-PCR verwendet (Mora et al., Microbiology 146 (2000a), 2027-2038 und Mora et al., Syst. Appl. Microbiol. 23 (2000b), 400-408). Mit dem generierten 18-mer Primer konnten nur Stämme der Art P. acidilactici unterschieden werden. Mit Hilfe der PFGE wurden die Verwandtschaftsverhältnisse von Stämmen der Spezies P. acidilactici und P. pentosaceus analysiert (Barros et al., J. Clin. Microbiol. 39 (2001), 1241-1246). Die PFGE wurde von Luchansky et al. (1992) verwendet, um Pediocin-produzierende von Pediocin-negativen Stämmen der Spezies P. acidilactici zu unterscheiden (Luchansky et al., Appl. Environ. Microbiol. 58 (1992), 3053-3059). Simpson et al. (2002) untersuchten die Verwandtschaft von 33 Stämmen unterschiedlicher Herkunft, die sechs verschiedenen Spezies der Gattung Pediococcus angehörten mittels RAPD-PCR und PFGE. (Simpson et al., Appl. Environ. Microbiol. 68 (2002), 765-771). Es konnten fast alle Stämme mit der einen oder anderen Methode unterschieden werden. Bei der RAPD-PCR wurde durch die Kombination der Ergebnisse zweier Primer eine bessere Möglichkeit der Stammdifferenzierung erreicht, als mit jeweils nur einem Primer. Mit Hilfe der PFGE konnten aber insgesamt mehr Stämme unterschieden werden.

Eine gegenüber den vorstehend genannten Fingerprint-Methoden verbesserte Reproduzierbarkeit und ein höheres Auflösungsvermögen konnte durch die erfindungsgemäße nested SAPD-PCR gemäß Beispiel 2 erzielt werden. ähnlich der Analyse mit den Oenokokken (siehe Beispiel 3) konnte auch bei der Untersuchung der Pediokokken anhand von 8 untersuchten Pediococcus parvulus-Stämmen eine gute Reproduzierbarkeit sowie ein hohes Auflösungsvermögen bestätigt werden; siehe Figuren 4 und 5.

Beispiel 5: Anwendung der nested SAPD-PCR bei Brettαnomyces bruxellensis

Hefen der Gattung Brettαnomyces können für Fehltöne in Wein verantwortlich sein (Chatonnet et al., J. Sei. Food Agric. 60 (1992), 165-178) und werden auch bei der Herstellung spezieller Biersorten verwendet (Gilliland J. Inst. Brew. 67 (1961), 257-261). Sie treten im Wein meist nach der alkoholischen und der malolaktischen Gärung, während der Lagerung des Weins im Fass oder in der Flasche auf (Chatonnet et al., Am. J. Enol. Vitic. 46 (1995), 463-468). Trotz der überwiegend negativen Bezeichnung des "Brett"-Charakters

wurde beobachtet, dass die Hefen in niedrigen Zellzahlen in einigen Fällen Rotweinen einen positiven Charakter und mehr Komplexität geben (Fugelsang, Wine Microbiology (Ed. KC Fugelsang), Chapman and Hall, New York (1997), 72-80). Oft werden diese Aromen aber als Fehltöne beurteilt. Das Auftreten von Brettanomyces-Hefen wurde in nahezu allen Weinanbaugebieten der Welt beobachtet. Die sortentypischen und regionalen Aromamerkmale eines Weines können vollkommen von Fehltönen überdeckt werden und der Wein kann unangenehm bitter schmecken (Fugelsang, Wine Microbiology (Ed. KC Fugelsang), Chapman and Hall, New York (1997), 72-80). Brettanomyces-Hefen können die charakteristischen "Brett" -Aromen schon in niedrigen Zelldichten von 100 bis 1000 Zellen/ml erzeugen. Die Tatsache, dass diese Hefen oft in niedrigen Zellzahlen vorhanden sind und dass sie langsam wachsen, erschwert ihre Identifizierung. Um dem Verderben des Weines vorzubeugen brauchen die Weinhersteller eine zuverlässige Methode zur Identifikation von Brettanomyces-Stämmen, damit Gegenmaßnahmen eingeleitet werden können bevor die Weinqualität sich verschlechtert. Ibeas et al. (1996) benutzten eine nested PCR-Methode, um Brettanomyces- Stämme in Sherrywein nachzuweisen (Ibeas et al., Appl. Environ. Microbiol. 62 (1996), 998-1003). Mitrakul et al. (1999) verwendeten die RAPD-PCR um Hefe-Stämme innerhalb der Spezies B. bruxellensis zu unterscheiden (Mitrakul et al., Food Microbiology 16 (1999), 3-14). Obwohl die Stammdifferenzierung gut durch die RAPD-PCR in dieser Studie funktionierte, waren die Ergebnisse dieser Methode nur schwer reproduzierbar. Auch hier war die nested SAPD-PCR überlegen. Die klassischen Methoden für die Identifizierung und Zellzahlbestimmung der Brettanomyces-Reün dauern 1 bis 2 Wochen und beruhen auf Kultivierung auf semiselektivem Medium mit anschließender Charakterisierung durch biochemische und physiologische Analyse sowie durch mikroskopische Prüfung (Fugelsang, Wine Microbiology (Ed. KC Fugelsang), Chapman and Hall, New York (1997), 72-80). Um die hohe Diversität verschiedener Brettanomyces brnxellensis-Stämme nachweisen zu können, fehlt es aber immer noch an geeigneten Methoden zur Stamm-Unterscheidung. Aussagekräftige und reproduzierbare Ergebnisse zur Stamm-Unterscheidung konnten erst durch die erfindungsgemäße SAPD-PCR erzielt werden. Hierbei gelang die Unterscheidung auf Art-Niveau bereits nach der ersten PCR, wie am Beispiel von 6 verschiedenen Arten der Gattung Brettanomyces gezeigt werden konnte; siehe Figur 6. Mittels der nested SAPD-PCR und anschließender Cluster-Analyse konnte darüber hinaus eine starke Regionsbezogenheit der aus der Region Wonnegau isolierten Brettanomyces bruxellensis-Stämme gezeigt werden.

Die topographische Herkunft der Stämme ließ sich mit hoher Kongruenz auf den dargestellten Stammbaum abbilden. Dieser Befund unterstützt die Annahme, dass auch Mikroorganismen einen Beitrag zum Terroir einer Weinregion leisten und die Qualität des Weines nicht nur allein durch Klima, Rebe und Boden geprägt wird. Als "Außengruppe" bei der Analyse wurden Stämme (374, 566-568) aus der Institutsstammsammlung verwendet; siehe hierzu Beispiel 1 sowie Figuren 7 und 8.

Beispiel 6: Anwendung der nested SAPD-PCR bei Vitis vinifera subsp. Vinifera

6.1 Sortenabgrenzung

Zur Weinherstellung wird die Weinrebe Vitis vinifera subsp. vinifera kultiviert. Wegen der langen Geschichte der Kultivierung von Weinreben und dem nahezu weltweiten Anbau in den unterschiedlichsten Klimaten und Standorten entstand eine Vielzahl an verschiedenen Sorten. Diese wurden oft falsch identifiziert oder die gleiche Sorte wurde an verschiedenen Orten unterschiedlich bezeichnet. Dies führte dazu, dass die Abstammung vieler Kreuzungen bis heute unklar ist. Es ist bisher nur wenig über Unterschiede im Genom der verschiedenen Rebsorten bekannt. Außerdem wurden bisher nur wenige Gensequenzen in Datenbanken hinterlegt. Zur Verwandtschaftsanalyse von Weinreben wurden bereits einige Fingerprint- Methoden angewandt. RFLP-Analysen wurden von Bowers et al. an einigen in Kalifornien kultivierten Weinreben durchgeführt (Bowers et al., Am. J. Enol. Vitic. 44 (1993), 266-270). Die Ergebnisse zeigten, dass bei zwei unterschiedlich bezeichneten Rebsorten "Zinfandel" und "Primitivo" das gleiche Bandenmuster auftrat. Daraufhin wurde angenommen, dass es sich bei den beiden Rebsorten um ein und dieselbe Sorte handelte. Andererseits war in dieser Studie aber auch das Fingerprintmuster des Spätburgunders mit dem des Grauen Burgunders identisch. Die Unterschiede zwischen den zwei genetisch nahe verwandten, aber morphologisch unterschiedlichen Rebsorten konnten mit dieser Methode also nicht aufgelöst werden. Die Analyse von kurzen, nicht kodierenden DNA-Sequenzwiederholungen (SSR- Analyse) führte ebenfalls zu keiner Differenzierung zwischen den Burgundersorten (Bowers et al., Genome 39 (1996), 628-633). Ye et al. (1998) führten eine RAPD-PCR zur Aufklärung der Verwandtschaftsverhältnisse verschiedener Reben durch und konnten mit dieser Methode auch keine Unterschiede zwischen Spätburgunder und dem Grauen Burgunder auflösen. Darüber hinaus lieferte der Vergleich anderer unterschiedlicher Rebsorten ein gleiches Bandenmuster (Ye et al., Vitis 37 (1998), 33-38). Im Jahr 2000 konnte durch SSR- Analyse

bewiesen werden, dass Müller-Thurgau eine Kreuzung von Riesling mit Madeleine Royale ist und nicht wie lange Zeit angenommen wurde aus der Kreuzung zwischen Riesling und Silvaner entstand (Dettweiler et al., Vitis 39 (2000), 63-65).

Zur näheren Bestimmung der Verwandtschaftsverhältnisse verschiedener Reben mittels nested SAPD-PCR gemäß Beispiel 2 wurden Weinreben der Rebsorten Riesling, Silvaner, Madeleine Royale, Müller-Thurgau, Rieslaner, Spätburgunder, Frühburgunder, Grauer Burgunder, Weißburgunder, Trollinger und Kerner verwendet. Hierbei konnte mit hoher Auflösung die Herkunft des Müller-Thurgau als Kreuzung zwischen Madeleine Royale und Riesling bestätigt werden. Außerdem konnte die Verwandtschaft der Rebsorte Rieslaner zu der Gruppe der Burgunder-Sorten aufgeklärt werden. Dieses Ergebnis überrascht, da eine nahe Beziehung zur Riesling-Sorte besteht. Der Umstand erklärt sich durch die Tatsache, dass sowohl die Burgunder-, als auch die Silvanersorten aus Kreuzungen mit der Rebe Traminer hervorgegangen sind; siehe Figuren 9 und 10.

6.2 Klonunterscheidung

Das erfindungsgemäße Verfahren mit unterschiedlichen Empfindlichkeitsstufen ermöglicht Artentrennung, Sortenabgrenzung bis hin zu Klonunterscheidung. Es ist dabei möglich die Verwandtschaftsverhältnisse selbst sehr naheverwandter Rebsorten aufzuklären und durch die hohe Reproduzierbarkeit des Verfahrens die erhaltenen Resultate in einer Datenbank für zukünftige Vergleiche bereitzustellen. Es lassen sich nun praxisrelevante Fragestellungen wie die Synonyme alter, autochthoner Rebsorten klären und Klonunterscheidungen der Unterlagen, Burgundersorten und -varianzen sowie die genetische Stabilität von Sorten untersuchen. Ferner kann das Verfahren auch zur Untersuchung und Genotypisierung einzelner alter Rebstöcke angewandt werden. Darüber hinaus lassen sich Farbmutationen, Variationen der Aromatypen und der "Beerigkeit" der Reben untersuchen. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen nested SAPD-PCR können Klone auf ihre Unterscheidbarkeit hin untersucht werden, und es wird somit eine Möglichkeit des Klonschutzes bereitgestellt. Die Figuren 11 und 12 zeigen Ergebnisse zur "Beerigkeit" von Spätburgundersorten und der Verwandtschaft der Unterlagen SO 4 und Binova. Die bisher nicht differenzierbaren Unterlagen SO 4 und Binova sind bereits nach der ersten SAPD-PCR Runde schon unterscheidbar. Sowohl die SO 4- als auch die Burgunder-Klone sind identisch und als jeweils

eine Sorte zu erkennen, gemäß der Auflösungsgrenze bzw. Empfindlichkeitsstufe für die erste PCR-Runde; siehe Figur 11. Nach der verschachtelten (nested) SAPD PCR (zweite Runde) kann man nun auch deutlich die SO 4-Klone und die Burgunder-Klone (kleinbeerig: 164, kompakt: 166, aufrecht: 167, lockerbeerig: 168) voneinander unterscheiden; siehe Figur 12.

Beispiel 7: Anwendung der nested SAPD-PCR bei Labormäusen (Mus musculus)

Die meisten Labormaus- Stämme sind ursprünglich aus Kreuzungen von Mus musculus domesticus mit Mus musculus musculus entstanden. Fast alle Labormaus- Stämme gehen aus Inzuchtlinien hervor und sind daher genetisch nahezu identisch. Mäuse sind für die Aufklärung von Genfunktionen ideale Modellorganismen und das nicht nur, weil sie sich rasch vermehren, sondern auch, weil über ihre Gene vieles bekannt ist. Das Mausgenom mit seinen ca. 25.000 Genen ist vollständig sequenziert, zudem gleicht sich das Erbgut von Mensch und Maus zu etwa 95 Prozent (Mouse genome sequencing consortium: Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature 420 (2002), 520-562). Für menschliche Krankheiten wie Diabetes, Parkinson, Bluthochdruck und Krebs sind fehlerhafte Gene zumindest mitverantwortlich. Viele Gene entsprechen einander bei Maus und Mensch und können dieselben Krankheiten auslösen. Gelingt es, die entsprechenden Gene zu identifizieren und ihre Funktion zu entschlüsseln, können Krankheitsursachen besser erkannt und neue Therapien entwickelt werden. Zur Unterscheidung von Labormäusen wird am häufigsten die SSR-Analyse angewandt. Die als SSR (simple sequence repeat) oder Mikrosatelliten bezeichneten Sequenzwiederholungen von Dinukleotiden (TG-oder CA- repeats) sind über das komplette Genom von Säugern verteilt. Die Mikrosatelliten unterscheiden sich nur in der Anzahl ihrer Wiederholungseinheiten. Das Mausgenom enthält etwa doppelt so viele Mikrosatelliten wie das menschliche Genom. Hinzu kommt, dass die Differenz zwischen den Allelen verschiedener Inzuchtstämme beträchtlich ist (Newton und Graham, PCR (Labor im Fokus) 2. Aufl. (Ed. Newton und Graham), Spektrum Akad. Verl., Heidelberg (1994), 145.). Zur Untersuchung von Unterschieden im Genom von Labormäusen wurde auch die SNP- Analyse (single nucleotide polymorphism) verwendet (Wade et al., Nature 420 (2002), 574-578). Bei dieser Methode werden Punktmutationen, also Variationen von einzelnen Basenpaaren in einem DNA-Strang, untersucht, die bei mindestens 1 % der jeweiligen Population vorkommen (Li et al., Electrophoresis 20 (1999), 1258-1265). Die SNP -Methode setzt voraus, dass die Wildtyp DNA-Sequenz und die Art der mutierten Form

sehr genau bekannt ist. Durch das Aufspüren von Punktmutationen können die Angehörigen einer Population unterschieden und Verwandtschaftsverhältnisse aufgeklärt werden.

Die erfindungsgemäße nested SAPD-PCR erlaubt hingegen die Unterscheidung verschiedener Labormäuse auf einfache und gut reproduzierbare Weise, ohne Kenntnis bestimmter Ziel- DNA-Sequenzen. Hierzu wurden die Schwanzspitzen von 7 Labormäusen (A, B, 2, 3, 5, 6, 8) zur DNA-Isolierung verwendet. Davon waren die Mäuse A und B Wurfgeschwister. Von den restlichen Mäusen war nur Maus 2 näher mit den Mäusen A und B verwandt. Mittels der nested SAPD-PCR gemäß Beispiel 2 konnte die Maus 2 als nächster Verwandter zu dem Mäusepaar A und B bestätigt werden; Figuren 13 und 14.

Beispiel 8: Genomtypisierung menschlicher Individuen {Homo sapiens sapiens)

Die DNA-Analyse stellt die modernste Methode zur Bestimmung der Identität und der Verwandtschaft menschlicher Individuen dar. Die Genomtypisierung menschlicher Individuen findet vor allem beim Abstammungsgutachten, in der Gerichtsmedizin und in der klinischen Medizin/Diagnostik Verwendung. Ein unanfechtbares Ergebnis ist eine Voraussetzung für die Beweiskraft der Ergebnisse. Da bei der Methode der RAPD-PCR immer wieder so genannte "Geisterbanden" auftreten oder verschwinden können, und die Ergebnisse dadurch schlecht reproduzierbar sind, wird die RAPD-PCR nicht für Abstammungsgutachten vor Gericht anerkannt. Unter den Fingerprint-Analysen wurden seit 1985 so genannte VNTRs (variable number of tandem repeats) zur Genomtypisierung menschlicher Individuen untersucht. Diese auch Minisatelliten genannten Bereiche befinden sich an den Telomeren der Chromosomen und bestehen aus längeren Widerholungseinheiten als die Mikrosatelliten. Sie treten bei jedem Individuum in einer unverwechselbaren Länge am untersuchten VNTR-Locus auf. Mit Hilfe der PCR-Technik werden VNTRs enthaltende DNA- Abschnitte vervielfältigt, durch Gelelektrophorese aufgetrennt und nach Anfärbung mit Ethidiumbromid unter UV-Licht sichtbar gemacht. Da die Sequenzwiederholungen in einer variablen Anzahl von Einheiten vorkommen, ergibt sich anhand der unterschiedlichen Länge der PCR-Amplifikate für jeden Menschen ein spezifisches Bandenmuster (Jeffreys et al., Nature 314 (1985), 67-73 und Jeffreys et al., Nature 316 (1985), 76-90). Etwa ab 1998 wurden die VNTRs fast vollständig durch die STR-Technik (short tandem repeat) (Edwards et al., Am. J. Hum. Genet. 49 (1991), 746-756) verdrängt. Als STR wird eine Abfolge von zwei

bis sechs Basenpaaren, die sich mehrere Male hintereinander wiederholt, bezeichnet. Dabei ist die gesamte Länge des STR kleiner als 100 bp. Die Analyse von STR-Regionen bietet sich vor allem in der Gerichtsmedizin an, da auch sehr niedrige DNA-Konzentrationen zu einem erfolgreichen Resultat fuhren (Ruitberg et al., Nucleic Acid Res. 29 (2001), 320-322). Zur Aufklärung von Verwandtschaftsverhältnissen menschlicher Individuen wurde auch die Untersuchung von Punktmutationen herangezogen. Mit Hilfe der SNP-Methode (siehe oben) lassen sich einzelne Basenaustausche bekannter Sequenzen genau analysieren. 90 % aller genetischen Variationen im menschlichen Genom sind SNPs. Sie sind ungleichmäßig stark über das Genom verteilt, hoch variabel und lassen sich relativ schnell und einfach bestimmen. Die vorstehend genannten Analyseverfahren, wie die SNP-Methode sind allerdings ohne Kenntnis bestimmter Ziel-DNA-Sequenzen nicht durchführbar.

Hingegen eröffnet die erfindungsgemäße nested SAPD-PCR die Unterscheidung verschiedener und verwandter Menschen, ohne dass es im Vorfeld der Beschaffung von Sequenzinformationen bedarf. Beispielsweise wurde mithilfe der erfindungsgemäßen nested SAPD-PCR und anschließender Cluster-Analyse mit DNA aus menschlichen Blutzellen die Verwandtschaft von 13 Personen zueinander ermittelt. Hierbei konnten die Verwandtschaftsverhältnisse der beiden untersuchten Familien (I, II) bestätigt werden; siehe Figuren 15, 16 und 17. Dabei war die Person E I (S) der Vater (Elter S) von Kind Kl I (S) und K2 I ($) und der Bruder von Person E II ($) (Elter $). Person E I ($) war die Mutter von Kl I (S) und K2 I ($). Person E II (S) war der Vater von den Personen Kl II ($) und K2 II ($). Person E II (?) die Mutter von Kl II (?) und K2 II (?) und die Schwester von Person E I (S)- Daneben wurden die im Folgenden genannten außenstehenden Personen mit in die Verwandtschaftsanalyse einbezogen. Die Zwillinge Zl ($) und Z2 (?) und die Personen der Außengruppe Al (S), A2 (S) und A3 ($).

Beispiel 9: Anwendung der nested SAPD-PCR und SCAR-PCR zur Identifizierung von Arten der Gattung Pediococcus

In einer bevorzugten Ausfuhrungsform beinhaltet das erfindungsgemäße Verfahren neben der unter Beispiel 2 beschriebenen SAPD-PCR auch die Technik der Sequence Characterized Amplified Region PCR (SCAR PCR). Es handelt sich hierbei um eine PCR-Technik, die der erfindungsgemäßen SAPD-PCR bzw. nested SAPD-PCR nachgeschaltetet wird. Bei der SCAR-PCR wird eine spezifische Bande aus dem SAPD-GeI ausgeschnitten und die Sequenz

bestimmt. Im Anschluss daran werden die die Sequenz flankierenden spezifischen Primer synthetisiert, mit der sich nun wiederum in einer SCAR-PCR der entsprechende Klon oder eine bestimmte Spezies identifizieren lässt.

Zur Art-Identifizierung von Stämmen der Gattung Pediococcus wurden spezifische Primer konstruiert. Hierzu wurde zunächst die nested SAPD-PCR gemäß Beispiel 2 mit dem Primer G-No t-T durchgeführt; siehe Figur 18. Die für die SCAR-PCR untersuchten Stämme sind in Tabelle 3 angegeben. Falls vorhanden wurden von jeder Art mehrere Stämme untersucht, um Amplifikationsprodukte zu finden, die bei allen Stämmen innerhalb einer Art vorkommen, aber bei allen anderen Arten nicht vorhanden sind. Nach gel-elektrophoretischer Auftrennung der Amplifikationsprodukte und Färben mit einer Ethidiumbromidlösung wurde das Agarosegel unter UV-Licht visualisiert.

Art-spezifische Gelbanden wurden mit einem sterilen Skalpell ausgeschnitten und mit dem Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) rückgelöst; siehe Figur 18. Die eluierten Amplifikate wurden mit Hilfe des TOPO TA Cloning Kit for Sequencing (Invitrogen) in das pCR4-T0P0 Plasmid kloniert und in einen kompetenten E. co/z-Stamm (E. coli TOPlO) transformiert. Die transformierten Klone wurden selektioniert und in LB-Medium über Nacht kultiviert. Anschließend wurden die Plasmide der transformierten Zellen mit dem Qiagen Miniprep Kit isoliert. Zur Kontrolle, ob sich das gewünschte Insert im Plasmid befindet, wurde eine PCR mit den Primern M13-Forward und M 13 -Reverse (Invitrogen) durchgeführt. Die Plasmide, die das gewünschte Insert enthielten, wurden mit den Primern M13-Forward und M13-Reverse von beiden Seiten sequenziert (MWG-Biotech, Ebersberg). Anhand der ermittelten Sequenzen wurden Primer konstruiert, die an Sequenzen binden, die sich innerhalb des Inserts befinden.

Mit diesen Primern wurde eine Touchdown PCR durchgeführt. Zur Touchdown PCR wurden 25 μl Reaktionsansätze erstellt. Diese Ansätze bestanden aus jeweils 10 μM Primer (Forward und Reverse), 200 μM je NTP, Ix Reaktionspuffer (incl. 1,5 mM MgCl ₂ ) (Peqlab), 20 ng template-DNA, 1 Unit Taq DNA-Polymerase (Peqlab). Die Initial-Denaturierung wurde für 5 min bei 95 °C durchgeführt. Anschließend wurden 6 Zyklen für 30 Sekunden bei 94 °C, 30 Sekunden bei 69 °C (wobei die Temperatur bei jedem Zyklus um 1 °C erniedrigt wurde) und 30 Sekunden bei 72 °C durchgeführt. Schließlich wurden noch 22 Zyklen für 30 Sekunden bei 94 °C, für 30 Sekunden bei 62 °C und für 30 Sekunden bei 72 ⁰ C durchgeführt. Die abschließende Elongation erfolgte für 5 min bei 72 °C. Zur Untersuchung der Spezifität der

ausgewählten Primer wurden jeweils mehrere Stämme der gleichen Art, die Typstämme der anderen Pedikokken Arten und einige Stämme verwandter Milchsäurebakterien getestet. Das Ergebnis einer SCAR-PCR mit Art-spezifischen Primern ist in Figur 19 am Beispiel von Pediococcus acidilactici dargestellt.

Tabelle 3 : Zur SCAR-PCR verwendete Bakterienstämme

Kulturensammlungen: DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig; IMW: Stammsammlung des Instituts für Mikrobiologie und Weinforschung, Universität Mainz; P. = Pediococcus. ^τ = Typstamm