La sérotonine (5-hydroxytryptamine ou 5-HT) est un neurotransmetteur localisé dans le système nerveux central et périphérique des vertébrés où il exerce différents rôles physiologiques mendies par des sous-types distincts de récepteur (Saxena, 1995). Les récepteurs 5-HT4 représentent un membre de la famille des récepteurs à sept domaines transmembranaires (7TM) couplés à une protéine G qui est positivement couplée à l'adénylate cyclase (Hedge et Eglen, 1996). Les récepteurs 5-HT4 sont exprimés dans une large variété de tissus incluant le cerveau humain et le cerveau des rongeurs (Eglen et al., 1995), le tractus gastro-intestinal d'humain, de chien, de porc et de rongeur, le coeur de porc et d'humain (Hedge et Eglen, 1996). Dans le cerveau de mammifère, les récepteurs 5-HT4 contribuent à la sécrétion de dopamine (Bonhomme et al., 1995) et régulent l'apprentissage et la mémoire à long terme par le biais de la modulation de la libération d'acétylcholine (Marchetti-Gauthier et al., 1997). Dans les tissus périphériques, les récepteurs 5-HT4 se sont avérés réguler la motilité du tractus gastro-intestinal, la secretion electrolytique intestinale, la sécrétion surrénale de corticostéroïdes, la contraction de la vessie et la contractilité de l'oreillette (Edge et Eglen, 1996).

Les récepteurs 5-HT4 sont impliqués dans une large variété de désordres centraux et périphériques incluant les arythmies cardiaques (Kaumann, 1994) et les désordres neuro-dégénératifs (Reynolds et al., 1996 ; Wong et al., 1996). De plus, le développement d'agonistes et d'antagonistes des récepteurs 5-HT4 peut avoir des applications thérapeutiques dans le système nerveux central pour le traitement de désordres neuro-psychiatriques associés à un dysfonctionnement du système dopaminergique central tel que la maladie de Parkinson (Bonhomme et al., 1995) ou le traitement de

déficiences mnésiques tels que présentées chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer (Marchetti-Gauthier et al., 1997). De tels médicaments pourraient aussi être utiles dans le traitement de désordres périphériques tels que le syndrome du colon irritable, la gastroparésie, l'incontinence urinaire et les arythmies cardiaques (Hedge et Eglen, 1996).

Les récepteurs 5-HT4 présentent une pharmacologie unique qui est clairement différente de celle des autres membres de la famille des r6cepteurs 5-HT (Ford et Clarke, 1993). La plupart des études pharmacologiques et transductionnelles sur les récepteurs 5-HT4 ont été réalisées sur le système nerveux central et le tractus gastro-intestinal de rongeurs et chez les coeurs porcin et humain (Eglen et al., 1995 ; Hedge et Eglen, 1996). Bien que la pharmacologie des récepteurs 5-HT4 présents dans ces préparations soit très similaire, des différences inexpliquées existent.

Ainsi, les benzamides, tels le renzapride et le cisapride, se comportent comme des agonistes puissants et entiers des récepteurs 5-HT4 dans les neurones des colliculi de la souris mais sont des agonistes moins puissants et seulement partiels dans le coeur humain (Ford et Clarke, 1993 ; Hoyer et al., 1994) et le muscle detruseur isole a partir de la vessie humaine (Ford et Clarke, 1993 Hoyer et al., 1994, Candura et al., 1996). La 5- méthoxytryptamine (5-MeOT), agoniste 5-HT4, présente une action agoniste inhabituellement faible pour les récepteurs 5-HT4 du muscle détruseur humain (Candura et al., 1996). Le ML10302, agoniste du récepteur 5-HT4 qui imite l'effet de la 5-HT sur la relaxation de l'oesophage du rat ainsi que sur la contraction provoquée électriquement chez l'iléon du cobaye (Langlois et al., 1994), présente un effet agoniste faible combiné avec un net antagonisme de la 5-HT sur la réponse AMPc générée par le récepteur 5-HT4 (a) humain cloné à partir de l'oreillette humaine (Blondel et al., 1997) et un effet antagoniste dans les neurones du colliculus (Ansanay et al., 1996). De plus, les mécanismes de désensibilisation pour les récepteurs 5-HT4 sont aussi tissu-dépendants. En effet, une désensibilisation homologue rapide et entiere (AMPc independante) des récepteurs 5-HT4 est observée dans les neurones des colliculi de la souris (Ansanay et al, 1996) et l'oesophage de rat (Ronde et al., 1996) tandis que ce

type de récepteur est désensibilisé dans une moindre mesure dans l'oreillette humaine (Kaumann et al., 1991).

Le premier récepteur 5-HT4 a été cloné à partir du cerveau de rat (Gerald et al, 1995) et deux variants d'epissage (r5-HT4s et r5-HT4L) ont été identifiés. Ces variants diffèrent dans la longueur et la séquence de l'extrémité carboxy-terminale. La forme longue (r5-HT4E) qui a aussi été clonée dans les neurones de colliculi de souris (m5-HT4L), a des transcrits dans approximativement chaque partie du cerveau (Claeysen et al., 1996). Une observation intéressante vient de la distribution périphérique des transcrits de r5-HT4 et r5-HT4s chez le rat. Alors que les deux formes sont exprimées dans le tractus gastro-intestinal (iléon et colon), seul le transcrit r5-HT4s est trouvé dans le coeur (Gerald et al., 1995). De plus, r5-HT4s a été trouvé exclusivement dans l'oreillette (Gerald et al., 1995). Les homologues humains des récepteurs r5-HT4s et r5-HT4L, appelés ici h5-HT4(a) et h5-HT4(b), ont etc clones récemment. Le récepteur h5-HT4(a) a été cloné à partir de coeur humain (Blondel et al., 1997 ; Claeysen et al., 1997) ; le récepteur h5-HT4 (b, a été clone a partir d'une bibliothèque (Van de Wyngaert et al., 1997). Ces deux récepteurs h5-HT4(a) et h5-HT4(b) transitoirement exprimés dans les cellules COS-7 présentent un profil pharmacologique 5-HT4 classique. Cependant, les affinités du récepteur cloné h5-HT4(a) pour les agonistes tels que ML10302, BIMU1, renzapride et zacopride sont inférieures à celles trouvées dans le cerveau.

Les inventeurs ont à présent montré l'existence de deux nouveaux sous-types de récepteur à la sérotonine chez l'homme, appelés eth5-HT4(d).récepteursh5-HT4(c) L'analyse des homologies de séquences suggère que les formes h5-HT4 (a) et h5-HT4(b) sont respectivement les correspondants humains des formes r5-HT4s et r5-HT4L chez le rat, tandis que les formes h5-HT4 (c) et h5- HT4 (d) représentent deux-nouvelles isoformes du récepteur. L'isoforme h5-

HT4 (c) présente un nombre élevé de sites de phosphorylation putatifs (un pour la protéine kinase C, un pour la protéine kinase A/prot6ine kinase G, et deux pour la caséine kinase lui), tous contenus dans les derniers 25 résidus de la séquence d'acides aminés.

La phosphorylation de l'extrémité carboxy-terminale des récepteurs à sept domaines transmembranaires par la protéine kinase A régule la désensibilisation du récepteur et l'association du récepteur avec la protéine G en réponse à des concentrations croissantes d'AMPc (Dohlman et al., 1991).

De plus, la phosphorylation du récepteur par des protéines kinases non-AMPc dépendantes telles que les kinases du récepteur ß- adrenergique (iARK1 et ßARK2) ou la rhodopsine kinase permet la désensibilisation homologue activée par un substrat dans les récepteurs à sept domaines transmembranaires tels que les récepteurs ß1- et ß2- adrénergiques (Pei et al., 1994 ; Freedman et al., 1995) et le récepteur 5-HT2c (Westphal et al., 1995). Le nombre et la nature des sites de phosphorylation présents à l'extrémité C-terminale des variants d'épissage de récepteur 5-HT4 sont donc susceptibles d'influencer la régulation négative de la fonction récepteur.

Des différences de mécanismes de désensibilisation des récepteurs 5-HT4 tissu-dépendantes ont été reportées (Ford et Clarke, 1993), et pourraient être reliées aux profils restreints de l'expression des isoformes du récepteur 5-HT4 dans les différents tissus. Ainsi, le mécanisme de désensibilisation des récepteurs 5-HT4 dans les neurones de colliculi de souris ressemble à celui décrit pour les récepteurs ß-adrénergiques et apparaît être indépendant de la voie de I'AMPc. II a été proposé qu'une kinase"PARK-like,, médie la phosphorylation spécifique du récepteur 5-HT4 dans ces cellules neuronales (Ford et Clarke, 1993). La phosphorylation C-terminale de l'isoforme 5-HT4(c) par la caséine kinase li ou la PKC pourrait ainsi expliquer la desensibilisation AMPc-independante observee dans ces cellules.

La forme 5-HT4 (d) est caractérisée par une extrémité C-terminale très courte, avec une séquence codante finissant deux acides aminés après

Leu358. Des similarités de structure entre les extrémités C-terminales 5-HT4 et l'extrémité C-terminale 5-HT7 (même nombre de variants, incluant une isoforme riche en sites de phosphorylation et une isoforme tronquée près du site d'épissage), malgré l'absence d'une homologie de séquence claire, suggèrent des similarités dans la régulation de l'activité fonctionnelle parmi les récepteurs 5-HT couplés positivement à l'adénylate cyclase.

La présente invention a pour objet un polypeptide isolé constitutif de variants d'épissage du récepteur humain sérotoninergique dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi la séquence SEQ ID No 2 du polypeptide variant 5-HT4(c), ou la séquence SEQ ID no 4 du polypeptide variant 5-HT4d, ou tout fragment polypeptidique ou dérivé biologiquement actif de celui-ci.

La présente invention concerne donc plus particulièrement un polypeptide isolé constitutif du récepteur humain sérotoninergique de type 5- HT4 (c) Plus particulièrement, l'invention a pour objet un polypeptide h5-HT4 (c) ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID no 2, ou tout fragment polypeptidique ou dérivé de celui-ci biologiquement actif.

La présente invention a également pour objet un polypeptide isolé constitutif du récepteur humain sérotoninergique de type 5-HT4(d), Plus particulierement, I'invention a pour objet un polypeptide h5-HT4 (d) ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID no 4, ou tout fragment polypeptidique ou dérivé de celui-ci biologiquement actif.

La séquence SEQ ID n°2 représente la séquence d'acides aminés du polypeptide h5-HT4 (c) et la séquence SEQ ID n°4 represente la séquence d'acides aminés du polypeptide h5-HT4(d).

Par"dérivé", on entend tout polypeptide variant du polypeptide de séquence SEQ ID n° 2 ou n°4 ou toute molécule résultant d'une modification de nature génétique et/ou chimique de la séquence SEQ ID no 2 ou n°4, c'est-à-dire obtenue par mutation, délétion, addition, substitution et/ou

modification chimique d'un seul ou d'un nombre limité d'acides aminés, ainsi que toute séquence isoforme, c'est-a-dire une séquence identique à la séquence SEQ ID n° 2 ou n°4, à l'un de ses fragments ou séquences modifiées, contenant un ou plusieurs acides aminés sous la forme d'énantiomère D, lesdites séquences variantes, modifiées ou isoformes ayant conservé au moins l'une des propriétés les rendant biologiquement actives.

L'expression"biologiquement actif'signifie que le composé auquel elle se rapporte est capable de se lier à la sérotonine ou à des ligands apparentés à la sérotonine et/ou de participer à la transduction du signal induit par la sérotonine au niveau de la membrane cellulaire, en particulier à l'activation de l'adénylate cyclase, et/ou capable d'induire des anticorps qui reconnaissent le polypeptide h5-HT4 ou h5-HT4d selon l'invention. Des exemples de ligands apparentés à la sérotonine sont notamment la 5- méthoxytryptamine, le GR113808, le BIMU1,...

L'invention comprend donc égaiement tout polypeptide ayant une séquence d'acides aminés essentiellement identique à la séquence ID no 2 ou n°4 dans laquelle un ou plusieurs résidus ont été substitués de manière constitutive par un résidu fonctionnellement similaire et qui démontre son habilité à mimer le récepteur h5-HT4 ou h5HT4d comme décrit dans la présente invention. Des exemples de substitutions conservatives incluent la substitution d'un résidu hydrophobe tel que l'isoleucine, la valine, la leucine ou la méthionine par un autre résidu hydrophobe, la substitution d'un résidu hydrophile polaire tel que I'arginine par la lysine, ta glutamine par I'asparagine, la glycine par la serine, la substitution d'un résidu basique comme la lysine, I'arginine ou l'histidine par un autre résidu basique ou la substitution d'un résidu acide tel que l'acide aspartique et l'acide glutamique par un autre résidu acide.

De même, I'invention comprend tout polypeptide ayant un ou plusieurs résidus chimiquement dérivés par réaction d'un groupe fonctionnel.

Les polypeptides de la présente invention incluent aussi tout polypeptide ayant

une ou plusieurs additions et/ou suppressions de résidus par rapport à la séquence ID no 2 ou n°4 dans la mesure où l'activité biologique est maintenue.

Les polypeptides h5-HT4 et h5-HT4d de la présente invention peuvent être synthétisés par toutes les méthodes bien connues de l'homme du métier, y compris les techniques d'ADN recombinant. Les polypeptides h5- HT4 ou h5-HT4 (d) peuvent etre synthetises par les techniques de la chimie de synthèse, telles que la synthèse de type Merrifield qui est avantageuse pour des raisons de pureté, de spécificité antigénique, d'absence de produits secondaires non désirés et pour sa facilité de production.

L'invention a également pour objet la séquence nucléotidique isolée choisie parmi la séquence SEQ ID n°1, la séquence SEQ ID n°3, les séquences nucléotidiques dérivées de la séquence SEQ ID n°1 ou de la séquence SEQ ID n°3 du fait de la dégénérescence du code génétique, de mutation, de délétion, ou d'insertion, et les séquences nuciéotidiques capables de s'hybrider spécifiquement avec la séquence SEQ ID n°1 ou la séquence SEQ ID n°3. <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P> La séquence SEQ ID n°1 represente la séquence nucléotidique<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> du polypeptide h5-HT4 et la sequence SEQ ID n°3 represente la séquence nucléotidique du polypeptide h5-HT4(d).

Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. 11 peut s'agir de séquences d'ADN ou d'ARN, obtenues par criblage de banques de séquences au moyen de sondes <BR> <BR> <BR> <BR> 61abordes sur la base de la séquence SEQ ID no 1 ou n°3. De telles banques peuvent être préparées par des techniques classiques de biologie moléculaire, connues de l'homme de l'art.

Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage des banques.

Ces permettentlaréalisationdenucléotidiques sondes nucléotidiques, hybridant spécifiquement avec une séquence SEQ ID

n°1 ou n°3 selon l'invention. Les conditions d'hybridation appropriées correspondent aux conditions de température et de force ionique usuellement utilisées par l'homme du métier, de préférence à des conditions de température comprises entre (Tm moins 5°C) et (Tm moins 30°C) et de préférence encore, à des conditions de température comprises entre (Tm moins 5°C) et (Tm moins 10°C) (forte stringence), Tm étant la température théorique de fusion, définie comme étant la température à laquelle 50 % des brins appariés se séparent. De telles sondes font également partie de l'inven- tion. Elles peuvent être utilisées comme outil de diagnostic in vitro pour la détection, par des expériences d'hybridation, notamment d'hybridation"in situ", de transcrits spécifiques des polypeptides de l'invention dans des échantillor. s biologiques ou pour la mise en évidence de synthèses aberrantes ou d'anoma- lies génétiques résultant d'un polymorphisme, de mutations ou d'un mauvais 6plissage.

Les sondes de l'invention comportent au minimum 10 nucléotides, et de préférence au moins 14 nucléotides, préférentiellement au moins 20 nucléotides, préférentiellement encore au moins 50 nucléotides, et au maximum comportent la totalité de la sequence nucleotidique SEQ ID no 1 ou SEQ ID n°3 ou de leur brins complémentaires. Afin de s'hybrider spécifiquement avec les séquences SEQ ID no 1 ou SEQ ID n°3 codant pour les récepteurs h5-HT4C) ou h5-HT4d respectivement, et non avec les séquences nucléotidiques codant pour les récepteurs h5-HT4(a) ou h5-HT4(b), les sondes selon l'invention doivent contenir une séquence spécifique de l'extrémité 3'des séquences SEQ ID n°1 ou n°3 codant pour les extrémités C- terminales des ouh5-HT4(d).h5-HT4(c) Préférentiellement, les sondes de l'invention sont marquées, préalablement à leur utilisation. Pour cela, plusieurs techniques sont à la portée de l'homme du métier comme par exemple le marquage fluorescent, radioactif, chimioluminescent ou enzymatique.

Les méthodes de diagnostic in vitro dans lesquelles ces sondes nucléotidiques sont mises en oeuvre pour la détection de synthèses aberrantes ou d'anomalies génétiques, telles que la perte d'hétérozygotie et le

réarrangement génique, au niveau des séquences nucléiques codant pour un polypeptide h5-HT4 ou h5-HT4(d) ou un fragment biologiquement actif, sont incluses dans la présente invention.

L'invention a aussi pour objet un procédé de détection de l'expression du récepteur humain 5-HT4 ou 5-HT4d dans un échantillon cellulaire ou tissulaire, comprenant les étapes consistant à @ -preparer I'ARN dudit échantillon ; -mettre en contact ledit ARN obtenu avec une sonde ayant une séquence nucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement respectivement avec la séquence SEQ ID n°1 ou la séquence SEQ ID n°3, telle que définie précédemment; -détecter la présence d'ARNm hybridant avec cette sonde, indicatrice de l'expression du r6cepteur h5-HT4 (c) ou h5-HT4 (d).

L'invention a aussi pour objet un procédé de détection de l'expression du récepteur humain 5-HT4 ou 5-HT4d dans des cellules ou un tissu par hybridation in situ, comprenant les étapes consistant à : -mettre en contact lesdites cellules ou ledit tissu avec une sonde ayant une séquence nucléotidique capable de s'hybrider specifiquement respectivement avec la séquence SEQ ID n°1 ou la séquence SEQ ID n°3, telle que définie précédemment ; -détecter la présence d'ARNm hybridant avec cette sonde, indicatrice de l'expression du récepteur 5-HT4(c) ou 5-HT4(d).

Les sondes d'ADNc de l'invention sont en outre avantageusement utilisables pour la détection d'anomalies chromosomiques.

Les séquences nucléotidiques de l'invention sont également utiles pour la fabrication et l'utilisation d'amorces oligonucléotidiques sens eVou antisens pour des réactions de s6quengage ou d'amplification spécifique selon la technique dite de PCR (réaction de polymérisation en chaîne) ou toute autre variante de celle-ci.

Les séquences nucléotidiques selon l'invention ont par ailleurs des utilisations dans le domaine thérapeutique, pour la réalisation de séquences antisens, capables de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique, y compris un ARN messager, utilisables en thérapie génique. L'invention a ainsi pour objet des séquences antisens capables d'inhiber, au moins partiellement, la production de polypeptides 5- HT4 ou 5-HT4d) tels que définis précédemment. De telles séquences sont avantageusement constituées par celles qui constituent le cadre de lecture codant pour 5-HT4 ou 5-HTd au niveau du transcrit.

Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent par ailleurs être utilisées pour la production de polypeptides recombinants ayant une activité de récepteur 5-HT4 ou 5-HT4d tels que précédemment définis.

Ces polypeptides peuvent être produits à partir des séquences nucléotidiques définies ci-dessus, selon des techniques de production de produits recombinants connues de l'homme du métier.

Selon un mode de réalisation de l'invention, la séquence nucléotidique peut être insérée dans un vecteur d'expression, dans lequel elle est liée de manière opérante à des éléments permettant la régulation de son expression, tels que notamment des promoteurs et/ou terminateurs de transcription.

Les signaux contrôlant l'expression des séquences nucléotidiques (promoteurs, activateurs, séquences de terminaison...) sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilise. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple I'electroporation ou la précipitation au phosphate de calcium.

Les vecteurs de clonage et/ou d'expression tels que décrits ci- dessus, contenant une des séquences nucléotidiques définies selon l'invention font également partie de la présente invention. Un tel vecteur d'expression peut être notamment un plasmide (tel que pRc/CMV, disponible chez Invitrogen, Carlsbad, CA, ou pUC18, disponible chez Pharmacia, Piscataway, NJ), un cosmide, un phage (tel que le phage Lambda), ou tout type de virus recombinant L'invention vise en outre les cellules hôtes transfectées, de manière transitoire ou stable, par ces vecteurs d'expression. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes, procaryotes ou eucaryotes, d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.

Des exemples de cellules hôtes incluent notamment les cellules de mammifères telles que les cellules COS-7, CHO, NIH3T3, HeLa, LM (tk-), HEK293, etc. Les cellules hôtes peuvent être en particulier des lignées cellulaires telles que les cellules C6 de gliome.

L'invention a donc plus particulièrement pour objet les lignées cellulaires exprimant le polypeptide 5-HT4 ou 5-HT4d selon l'invention de manière stable.

De manière préférentielle, mais non exclusive, les cellules hôtes pour l'expression du récepteur 5-HT4(c) ou 5-HT4(d) recombinant fonctionnel expriment des protéines G et des adénylate cyclases, endogènes ou recombinantes.

Les cellules hôtes selon l'invention sont utilisables dans un procédé de production d'un polypeptide 5-HT4 (c) ou 5-HT4 (d), procédé dans lequel on cultive des cellules transfectées selon l'invention dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide de séquence SEQ ID no 2 ou n°4 ou tout fragment, ou dérivé biologiquement actif de celui-ci, et que l'on

récupère ledit polypeptide, fragment ou dérivé de celui-ci biologiquement actif, que l'on purifie.

Les procédés de purification utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant obtenu peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anti- corps mono-ou polyclonaux spécifiques, etc.

L'invention a également pour objet des anticorps poly-ou monoclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugues.

Ces anticorps ou fragments sont caractérisés en ce qu'ils sont obtenus à partir d'un polypeptide récepteur tel que défini précédemment, dérivé, ou fragment polypeptidique de celui-ci, administré à un animal, et sont capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide 5-HT4 ou 5-HTd.

Des anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir du sérum d'un animal immunisé contre le récepteur 5-HT4 ou 5-HT4d selon les modes opératoires usuels.

Selon un mode de réalisation de l'invention, on peut utiliser comme antigène un fragment peptidique approprié, pouvant être couplé par l'intermédiaire d'un résidu réactif à une protéine ou un autre peptide, portant un épitope T dépendant. Des lapins sont immunisés avec l'équivalent de 1 mg de l'antigène peptidique selon la procédure décrite par Benoit et al (1982). A des intervalles de quatre semaines, les animaux sont traités par des injections de 200, ug d'antigène et saignés 10 à 14 jours plus tard. Après la troisième injection, I'anti-serum est examiné pour déterminer sa capacité à se lier au peptide antigène radiomarqué à l'iode, préparé par la méthode chloramine-T et est ensuite purifié par une chromatographie sur colonne échangeuse d'ion carboxyméthyl celluiose (CMC). Les molécules d'anticorps sont ensuite recueillies dans les mammifères et isolées jusqu'à la concentration souhaitée

par les méthodes bien connues de I'homme de l'art, par exemple, en utilisant DEAE Sephadex pour obtenir la fraction IgG.

Un autre protocole d'obtention d'anticorps polyclonaux est décrit dans l'exemple 8.

Afin d'augmenter la spécificité du sérum polyclonal, les anticorps peuvent être purifiés par une chromatographie d'immuno-affinité en utilisant des polypeptides immunisant en phase solide. L'anticorps est mis en contact avec le polypeptide immunisant en phase solide pendant une durée suffisante de façon à faire immuno-reagir le polypeptide avec la molécule d'anticorps afin de former un complexe immunologique en phase solide.

Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon Sa méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Köhler et Milstein (1975).

Les anticorps ou fragments d'anticorps de l'invention sont par exemple des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab et F (ab') 2. Ils peuvent également se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués. Par exemple, ils peuvent être associés à une toxine, telle la toxine diphtérique ou à un produit radioactif.

Ces immunotoxines peuvent dans ce cas constituer des agents thérapeutiques utilisables pour le traitement de certaines pathologies impliquant une surexpression du ou5-HT4(d).5-HT4(c) Les anticorps de l'invention, en particulier les anticorps monoclonaux, peuvent également être utilisés pour l'analyse par immunohistochimie des récepteurs 5-HT4(c) ou 5-HT4(d) sur des coupes de tissus spécifiques, par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immunoperoxydase...

Les anticorps anti-5-HT4(c) ou 5-HT4(d) peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où l'expression du récep- teur 5-HT4 (c) ou 5-HT4 (d) doit etre observée (surexpression anormale, suivie de la régulation de l'expression membranaire, etc.).

L'invention concerne également une méthode pour le diagnostic in vitro d'une expression ou d'une accumulation anormale de récepteur 5-HT4 (C) ou 5-HT4 (d) dans un prélèvement biologique et/ou pour la mesure du taux d'expression de celui-ci dans ledit prélèvement comprenant la mise en contact d'au moins un anticorps tel que défini précédemment avec ledit prélèvement biologique dans des conditions permettant la formation éventuelle de complexes immunologiques spécifiques entre un récepteur 5-HT4 ou 5-HT4(d) et le ou lesdits anticorps et la détection des complexes immunologiques spécifiques éventuellement formés.

L'invention a également pour objet un kit pour le diagnostic in vitro d'une expression anormale du récepteur 5-HT4 ou 5-HT4d dans un pr6l6vement biologique et/ou pour la mesure du taux d'expression du récepteur 5-HT4 ou 5-HT4d dans ledit prélèvement comprenant : -au moins un anticorps spécifique du récepteur 5-HT4 (c) ou 5- HT4 (d, eventuellement fixe sur un support ; -des moyens de révélation de la formation de complexes antigènes/anticorps spécifiques entre le récepteur 5-HT4 ou 5-HT4d et ledit anticorps et/ou des moyens de quantification de ces complexes.

L'invention a également pour objet l'utilisation du polypeptide 5- HT4 ou 5-HT4(d) selon l'invention pour détecter la présence d'autoanticorps anti-recepteur dans des pathologies associées au dysfonctionnement des récepteurs.

L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un polypeptide récepteur 5-HT4(c) ou 5-HT4(d), dérivé, ou fragment polypeptidique tel que défini précédemment, une séquence nucléotidique telle que définie précédemment, ou un anticorps tel que défini précédemment associé à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

L'invention a en particulier pour objet une composition pharmaceutique qui contient un anticorps dirigé contre le récepteur 5-HT4 ou 5-HT4 (d), en quantité efficace pour bloquer la liaison des substrats naturels au récepteur 5-HT4 ou 5-HT4d, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être notamment administrée par voie orale, parentérale, intraveineuse, intramusculaire sous-cutanée, percutanée ou par administration intra-nasale.

La préparation de compositions pharmaceutiques qui contiennent des principes actifs dissous ou dispersés dans ces dernières, est bien connue de l'homme du métier. Généralement, ces compositions sont préparées sous la forme de solutions ou de suspensions injectables. Cependant, elles peuvent aussi être sous des formes solides appropriées pour préparer des solutions, ou des suspensions extemporanément. Les préparations peuvent aussi être émulsifiées.

Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques des compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être déterminés seion les critères généralement pris en compte pour l'établissement d'un traitement thérapeutique adapté à un patient, comme par exemple i'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, et les effets secondaires constatés, etc.

L'invention a également pour objet une méthode de traitement thérapeutique chez un sujet atteint de troubles ou désordres qui sont attenués, voire éliminés, par la réduction de l'expression des récepteurs 5-HT4 (c) ou 5- HT4 (d), ladite méthode comprenant l'administration audit sujet d'une quantité efficace de la composition pharmaceutique telle que décrite ci-dessus. La liaison de l'anticorps au récepteur 5-HT4(c) ou 5-HT4(d) empêche en effet l'activation du récepteur, et neutralise ainsi les effets d'une surexpression anormale de ces récepteurs.

L'invention a également pour objet un procédé de criblage de composés susceptibles de se lier au polypeptide 5-HT4 ou 5-HT4d selon l'invention dans lequel on met en contact lesdits composés avec ledit polypeptide 5-HT4 ou 5-HT4d et on évalue le taux de liaison entre lesdits composés et ledit polypeptide 5-HT4 (c) ou 5-HT4 (d).

Un grand nombre de composés peut ainsi être criblé rapidement pour tester la capacité de ces composés à se lier au récepteur 5-HT4 (c) ou 5- HT4(d) selon l'invention.

Ces tests de liaison peuvent être également appliqués à la détermination de la présence ou de l'absence de sérotonine dans un échantillon biologique, ainsi qu'à l'isolement de nouveaux ligands endogènes.

L'invention a donc également pour objet un procédé d'identification de ligands du récepteur 5-HT4 ou 5-HT4d comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact un échantillon biologique susceptible de contenir des ligands du récepteur avec un polypeptide 5-HT4 ou 5-HT4(d) ou une cellule hôte exprimant ledit polypeptide, b) isoler les complexes ligand-récepteur formés, c) identifier les ligands du récepteur 5-HT4 ou 5-HTd.

L'invention a également pour objet une méthode de diagnostic in vitro d'une expression ou d'une accumulation anormale de la sérotonine ou de ses analogues dans un prélèvement biologique et/ou de mesure du taux d'expression de celle-ci/ceux-ci dans ledit prélèvement comprenant la mise en contact d'un polypeptide selon l'invention avec ledit prélèvement biologique dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques spécifiques entre un ledit polypeptide et la sérotonine ou ses analogues et la détection des complexes immunologiques spécifiques formés.

Les tests de liaison utilisés dans le cadre de la présente invention peuvent être réalisés selon des méthodes bien connues de l'homme

du métier. On peut notamment marquer préalablement les composés susceptibles de se lier au polypeptide récepteur, qui peuvent être utilisés seuls ou en compétition avec d'autres composés non marqués.

Plus particulièrement, on peut réaliser par exemple des tests de liaison compétitifs, des tests de type ELISA ou IRMA.

Dans le cadre de l'invention, on peut utiliser des moyens de marquage pour détecter le polypeptide récepteur 5-HT4 ou 5-HT4(d) selon l'invention, les anticorps anti-5-HT4 ou 5-HT4d et/ou les ligands du récepteur 5-HT4 ou 5-HT4d>.

Les moyens de marquage utilisés peuvent être notamment un agent de marquage fluorescent qui se lie chimiquement à des anticorps ou à des antigènes sans dénaturation pour former un fluorochrome colorant qui est un indicateur immunofluorescent utile. L'agent de marquage peut aussi être une enzyme, telle que la peroxydase (HRP) ou la glucose oxydase. Des éléments radioactifs peuvent être également utilisés comme agents de marquage.

Les inventeurs ont par ailleurs étudié la répartition tissulaire des quatre différents variants d'épissage du récepteur 5-HT4, à savoir 5-HT4(a), 5- et5-HT4(d).HT4(b),5-HT4(c) Le profil d'expression de chaque variant d'épissage de 5-HT4 n'est pas restreint à un tissu donné à l'exception de 5-HT4 (d) qui se trouve uniquement dans les intestins. Certains tissus (oreillette humaine, cerveau, intestin) expriment trois ou quatre isoformes 5-HT4, tandis que d'autres (vessie, rein) expriment seulement une isoforme. Ainsi, la vessie n'exprime spécifiquement que la forme 5-HT4 (a). Dans deux tissus (les ventricules du coeur et le foie) aucun transcrit codant pour un quelconque variant d'épissage 5-HT4 n'a pu être amplifié. La présence du récepteur h5-HT4 (d) exclusivement dans les intestins en fait une cible thérapeutique potentielle pour le traitement des troubles digestifs associés à ce récepteur, sans effet secondaire sur les organes exprimant les autres isoformes. La localisation cérébrale de l'isoforme

5-HT4, quoique non exclusive, permet d'envisager que cette isoforme participe aux effets neuronaux de la sérotonine. En effet, il a été montré que les récepteurs 5-HT4 des neurones de colliculi de souris, à l'inverse des récepteurs 5-HT4 de l'oreillette humaine (Kaumann et al., 1991), se désensibilisent rapidement en présence de sérotonine (Ansanay et al, 1996).

Or, l'isoforme h5-HT4 est seule à posséder des sites de phosphorylation sur son extrémité C-terminale, la rendant plus sensible à la désensibiiisation homologue.

L'invention a ainsi plus particulièrement pour objet l'utilisation d'un polypeptide récepteur 5-HT4 (c) selon l'invention pour le criblage de molécules utiles pour la fabrication de médicament destiné à traiter les troubles du système nerveux central associés à l'expression anormale du récepteur 5-HT4 (c).

L'invention a également pour objet l'utilisation d'un polypeptide récepteur 5-HT4 (d) selon l'invention pour le criblage de molécules utiles pour la fabrication de médicament destiné à traiter les troubles du tractus gastro- intestinal associés à l'expression anormale du récepteur 5-HT4 (d).

Les inventeurs ont en outre étudié le profil pharmacologique des r6cepteurs 5-HT4 (, selon l'invention. Tandis que les sous-types 5- HT4(a), 5-HT4(b) et 5-HT4(d) exprimés dans les cellules COS-7 présentent une capacité similaire au couplage avec I'adenytate cyclase quant elles sont exposées à 5-HT, 1'expression de l'isoforme 5-HT4(c) donne une activation constitutive de I'adenylate cyclase qui résulte dans I'augmentation du niveau basal d'AMPc. Le degré de couplage constitutif est en outre augmenté par la surexpression de l'isoforme 5-HT4 (c) en utilisant plus d'ADN plasmidique pour la transcription. Un tel couplage constitutif a été décrit dans plusieurs autres situations, par exemple 1) dans la famille du récepteur métabotropique au glutamate, certains variants d'épissage étant couplés spontanément aux protéines G (Prezeau et al., 1996) ; 2) dans des mutations pathologiques ou expérimentales spécifiques conduisant à une activité constitutive dans certains récepteurs (Coughlin, 1994) ; 3) dans la surexpression des récepteurs à 7

domaines transmembranaires (Kenakin, 1996) tel que le recepteur m5-HT4L (Claeysen et al., 1996) conduisant à une activation constitutive de Gs.

Tous les sous-types des récepteurs h5-HT4 exprimés dans les cellules COS-7 présentent un profil de récepteur 5-HT4 classique en termes d'ordre de puissance de divers ligands sérotoninergiques testés (Hoyer et al., 1994). Aucune différence majeure n'a pu être trouvée entre les isoformes (a), (b) et (c) en ce qui concerne les constantes d'affinité des agonistes et antagonistes 5-HT4. Cependant, I'isoforme (d) présente toujours une affinité supérieure pour n'importe quel ligand 5-HT4 testé en comparaison avec les autres isoformes (tableau 1). Puisque le récepteur 5-HT4 (d) est le plus court des quatre isoformes du récepteur, ce résultat suggère que les modifications de la séquence protéique C-terminale des récepteurs 5-HT4 peuvent induire des changements dans les propriétés de liaison. La question se pose de savoir si ces modifications participent à la variabilité des constantes d'affinité pour les différents ligands 5-HT4 observés dans les différents tissus des espèces animales (Blondel et al., 1997). Des mécanismes alternatifs pour ces variabilités peuvent inclure des différences d'espèces pour les isoformes du récepteur 5-HT4 ou l'existence de variants d'épissage internes (Ullmer et al., 1995) qui pourraient affecter plus directement le site de liaison au ligand.

L'invention a également pour objet un procédé d'évaluation des propriétés pharmacologiques des composés capables de se lier au polypeptide récepteur 5-HT4(c) ou 5-HT4(d), appelés ligands du récepteur 5- HT4 ou 5-HT4d, comprenant les étapes consistant 6 : a) cultiver des cellules exprimant le polypeptide 5-HT4 (c) et/ou 5-HT4(d), en présence d'au moins un ligand du r6cepteur 5-HT4 (c) et/ou 5- HT4 (d) ; et b) évaluer la capacité du ligand à moduler la transduction du signal.

Plus particulièrement, on peut 6valuer la capacité d'un ligand à moduler la transduction du signal en déterminant la concentration en

AMPcyclique (AMPc) intracellulaire formé par l'activation de l'adénylate cyclase, ou l'activité de l'adénylate cyclase.

Selon une variante de ce mode de réalisation, on peut de manière avantageuse cultiver lesdites cellules en présence : -soit de concentrations accrues d'au moins un ligand du récepteur 5-HT4 ou 5-HT4d dont la capacité à moduler la transduction du signal est recherchée et d'une concentratier¢. déterminée d'au moins un agoniste connu de 5-HT4 ou 5-HT4(d); -soit de concentrations accrues d'au moins un agoniste connu de 5-HT4 ou 5-HT4d et d'une concentration déterminée d'au moins un ligand du récepteur 5-HT4 ou 5-HT4d dont la capacité à moduler la transduction du signal est recherchée.

La capacité dudit ligand à moduler la transduction du signal est alors évaluée en déterminant de manière quantitative l'expression dudit gène rapporteur, en fonction de la concentration dudit ligand.

Les tests biologiques selon l'invention tels que décrits ci-dessus permettent ainsi d'évaluer le profil pharmacologique des composés testés, notamment de déterminer si les composés testés sont capables d'agir comme agonistes ou antagonistes du récepteur 5-HT4 ou 5-HTd selon I'invention.

Les présents inventeurs ont ainsi montré que, de manière surprenante, ML10375, tout en antagonisant la réponse AMPc induite par la 5- HT médiée par toutes les isoformes 5-HT4, réduit l'activité adénylate cyclase basale seulement dans les cellules transfectées par le récepteur 5-HT4 et HT4 (d). Ce phénomène est mendie par un effet agoniste inverse de ML10375.

Ce phénomène représente le premier de ce genre dans la famille des récepteurs 5-HT4, et il suggère que la structure de l'extrémité C-terminale du récepteur à 7TM peut participer au développement d'un effet agoniste inverse d'un antagoniste donné. Le composé ML10375 de formule 4-amino-5-chloro-2- méthoxybenzoate de 2- (cis-3, 5-dimethylpiperidino) ethyl est particulièrement utile pour la préparation de médicaments à action agoniste inverse envers le

récepteur 5-HT4 ou 5-HT4(d). Cette propriété agoniste inverse est différente de la propriété d'antagoniste sélectif des recepteurs 5-HT4 deja connue pour le composé ML10375 (demande de brevet EP 683 161). En effet, un antagoniste simple n'agit que par compétition avec le ligand naturel (la sérotonine) en empêchant l'action de ce dernier. L'agoniste inverse peut, quant à lui, abaisser une activité trop élevée des récepteurs en l'absence de ligand naturel. Ainsi, dans le cas d'une surexpression pathologique de récepteurs 5-HT4 ou 5- HT4 (d) dans le cerveau (pour 5-HT4(c)), le coeur (pour 5-HT4(c)) ou la sphère digestive (pour les 5-HT4 et 5-HT4d), le ML10375 peut normaliser la réponse en réduisant l'activité intrinsèque des récepteurs. Un tel effet ne peut être obtenu par une autre molécule qui agirait comme un simple antagoniste sélectif de ces récepteurs.

Les exemples et les figures dont les légendes suivent illustrent l'invention sans la limiter : LEGENDE DES FIGURES -La figure 1A représente les séquences d'acides aminés de l'extrémité C-terminale déduites des variants d'épissage de récepteur 5-HT4 chez le rat et l'homme. Dans les deux espèces, la séquence diverge après Leu358. Les différences d'acides aminés entre le rat et l'homme sont encadrés.

Les cercles blancs correspondent au site consensus protéine kinase, les cercles noirs au site consensus caséine kinase II et le triangle noir à un site consensus protéine kinase A/protéine kinase G. L'astérisque correspond au codon stop terminal.

-La figure 1B représente les séquences comparées d'acides aminés des variants 5-HT4 et 5-HT4d>.

Les sept domaines transmembranaires potentiels (TM1 à TM7) des protéines sont soulignés, et les sites de phosphorylation putatifs sont indiqués par des symboles appropriés.

-La figure 2 représente l'analyse par RT-PCR réalisée avec 50 ng d'ARNm à partir de divers tissus humains. Les produits de PCR ont été séparés sur un gel d'agarose à 1,5 % et analysés par Southern Blot en utilisant une sonde oligonucléotidique interne spécifique marquée au 32p, amorce commune à 5-HT4 (a), 5-HT4 (b), 5-HT4 et 5-HT4d. Une exposition de 8 heures de I'autoradiogramme est présentée. Un contrôle positif a été réalisé en utilisant des amorces d'actine de rat sur des échantillons d'ARNm traités avec (+ RT) ou sans (-RT) transcriptase inverse. Les produits de PCR de I'experience de contrôle ont été analysés sur un gel d'agarose à 1,5 % et une photographie du gel coloré au bromure d'éthidium est présentée. Les amorces de PCR utilisées pour cette analyse sont décrites dans les exemples 1 et 2.

(O : oreillette, V : ventricule, C : cerveau, G : tractus gastro-intestinal, P : poumon, R : rein, v : vessie).

-La figure 3 représente l'analyse par saturation de la liaison de [3H]GR113808 sur des préparations membranaires de cellules COS-7 exprimant des isoformes 5-HT4 (a) (A), 5-HT4(b) (B), 5-HT4 (C) et 5-HT4 (d) (D).

Les membranes recueillies à partir des cellules COS-7 transfectées de manière transitoire ont été incubées avec 8 concentrations de [3H]GR113808 (0,02-3,5 nM) pendant 30 minutes à 25°C. La liaison non spécifique a été définie par 10 µM de ML10375. Les résultats sont issus d'expérience unique mais sont représentatives de trois expériences identiques. Les valeurs de Kd et Bmax sont déterminées par analyse de régression non linéaire assistée par ordinateur (GraphPad, Prism software).

-La figure 4 représente l'inhibition de la liaison spécifique de récepteurs5-HT4(a)(figure4A),5-HT4(b)(figure4B),5-[3H]GR113 808aux HT4 (figure 4C) et 5-HT4 (d) (figure 4D) clones par 5-HT. Les membranes des cellules COS-7 transfectées de manière transitoire ont été incubées avec une concentration de [3H]GR113808 égale à 50 % de la valeur de Kd de chaque isoforme du récepteur. La liaison non spécifique a été définie par 10 pM de ML10375. Les résultats sont présentés comme un pourcentage de liaison spécifique en l'absence de 5-HT : les données ont été analysées par analyse de régression non linéaire assistée par ordinateur (GraphPad, Prism software).

-La figure 5 représente les réponses d'AMPc à divers agonistes et antagonistes du récepteur 5-HT4 en utilisant les récepteurs 5-HT4 (a), 5- HT4(b), 5-HT4 et 5-HT4d exprimes transitoirement dans les cellules COS-7 ou dans les cellules transfectées"à blanc". Les cellules ont été préincubées avec 5 mM de théophylline et 10 µM de pargyline pendant 15 minutes, puis incubées avec 1 µM d'agonistes (5-HT : A, C, D et E ; ML10302 : B et C ; renzapride : B et D) et/ou antagonistes (ML10375 : B et E), ou 10 pM de forskoiine (A) pendant 15 minutes. L'effet de l'agoniste ou de l'antagoniste sur l'accumulation d'AMPc induite par 5-HT a été testé par addition de l'agoniste ou de l'antagoniste pendant la période de 15 minutes de préincubation, suivi par l'addition de 5-HT pendant 15 minutes. Les valeurs sont des valeurs moyennes SEM de 7 à 12 expériences. NS : non significatif : *, p< 0,05 et 0,01.p< -La figure 6 représente les réponses d'AMPc de 5-HT (1, uM), de forskoline (10, uM) et d'antagoniste 5-HT4 ML10375 (1 µM) en utilisant le récepteur 5-HT4(c) exprimé transitoirement dans les cellules COS-7 ou dans les cellules transfect6es"6 blanc"comme contr6le. Les cellules sont transfectees <BR> <BR> <BR> <BR> en utilisant 4 à 8 µg par puits (A et B), ou 6 pg par puits (C et D) d'ADN plasmidique. Les conditions d'incubation sont identiques à celle décrite aux figures 5C et D : les réponses sont étudiées en présence ou en l'absence d'une préincubation de 16 heures avec PTX (100 ng/ml). Les valeurs sont des valeurs moyennes SEM de 6 à 11 expériences. NS : non significatif : *, p< 0,05 et **, p < 0,01.

-La figure 7 représente l'analyse par saturation de la liaison de [3H]GR113808 sur des préparations membranaires de cellules CHO exprimant des isoformes 5-HT4 (A) et 5-HT4 (d) (B). Les membranes recueillies à partir des cellules CHO transfectees de manière stable ont été incubées avec 8 concentrations de [3H]GR113808 (0,01-2,5 nM) pendant 30 minutes a 25°C. La liaison non spécifique a été définie par 10 pM de ML10375. Les résultats sont issus d'expérience unique mais sont représentatives de trois expériences <BR> <BR> <BR> identiques. Les valeurs de Kd et Bmax (fig. 7 C et 7D) sont déterminées par

analyse de régression non linéaire assistée par ordinateur (GraphPad, Prism software).

- La figure 8 représente les réponses d'AMPc à la sérotonine en utilisant les récepteurs 5-HT4 et 5-HT4d exprimes de manière stable dans les cellules CHO ou dans les cellules transfectées "à blanc". Les cellules ont été préincubées avec 5 mM de théophylline et 10 µ M de pargyline pendant 15 minutes, puis incubées avec 1 pM de 5-HT. Les résultats sont issus d'expérience unique mais sont représentatives de trois expériences identiques.

-La figure 9 représente un test ELISA sur des sérums de lapins immunisés avec les peptides correspondant à différentes séquences dérivées des isoformes du récepteur 5-HT4. Les séquences de ces peptides sont données dans l'exemple 8.

La figure 9 donne les valeurs en densité optique d'un essai immunoenzymatique sur les peptides respectifs adsorbés (5 pg/ml dans un tampon carbonate à pH=9.5) sur des plaques MAXlsorb (Nunc, Danemark).

Les antisérums ont été incubés une heure à 37°C et révélés par un conjugat anticorps anti-IgG de lapin de chèvre couplé à la peroxydase (dilution 1/10000) et le substrat H202-ABTS (indicateur colorimétrique d'oxydoréduction pour la peroxydase).

-La figure 10 met en évidence par Western blot la présence du récepteur 5-HT4 dans les cellules CHO exprimant de manière stable les isoformes 5-HT4a (ligne 2) et 5-HT4 (ligne 3). Les cellules CHO ont été transfectées avec les vecteurs d'expression codant pour les formes (a) et (c) du récepteur 5-HT4 et sélectionnées pour leur résistance à la néomycine.

Cinquante ug de protéines provenant d'extraits membranaires sont séparés sur un gel de polyacrylamide à 10% puis transférés sur membrane de nitrocellulose. Après 16 h d'incubation en présence de 60 pg d'anticorps anti- 5-HT4 (G21V), le blot est révélé par chimioluminescence (ECL, Amersham) et canne. La ligne 1 indique le résultat obtenu sur les cellules CHO contrôles, ou aucun marquage n'est détecté ; les lignes 2 et 3 proviennent de clones de

cellules CHO surexprimant respectivement les récepteur 5-HT4 (a) et 5-HT4 (c.

Une bande migrant approximativement à la taille de 60 kDa est visuaiisée.

-La figure 11 met en évidence par Western blot la présence des récepteurs h5-HT4 dans les cellules CHO exprimant de manière stable les isoformes h5-HT4 (c) (figure 11 a) et 5-HT4 (d) (figure 11 b). Les cellules CHO ont été transfectées avec les vecteurs d'expression codant pour les formes (c) et (d) du récepteur h5-HT4 et sélectionnées pour leur résistance à la néomycine. Seize µg de protéines venant de cellules CHO sont séparés sur un gel de polyacrylamide à 10% puis transférés sur membrane de cellulose.

Après 16h d'incubation en présence de 16 µg d'anticorps anti-h5HT4 (asti- C21S, figure 11a) ou anti-5HT4D (anti-C7F, figure lob), en absence (1erse ligne) ou en présence (2nde ligne) de 50 pg des peptides correspondants, les blots sont révélés par chimioluminescence (ECL, Amersham) et scanners. La seconde ligne indique les bandes non-spécifiques du récepteur, puisque non- inhibées par les peptides correspondants. L'anticorps anti-C21S reconnait deux bandes spécifiques à 44 et 60 kDa. L'anticorps anti-C7F reconnaît une bande spécifique à 40 kDa. La bande à 60 kDa correspond au récepteur glycosylé, les bandes à 44 et 40 kDa au récepteur non-glycosylé.

EXEMPLE 1 : Structure primaire des variants d'épissage du récepteur 5- <BR> <BR> <BR> HT4 humain<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Matériels : Les PCR ont été réalisées sur un appareil GeneAmp 2400 (Perkin Elmer). L'ADN polymérase HiTaq et le tampon associé ont été obtenus chez Bioprobe Systems. Dans toutes les réactions de PCR, les dNTps et les amorces spécifiques étaient à une concentration finale de 200 pM et 1 µM, respectivement. L'ADN double brin a été séquencé avec un kit de séquençage d'ADN polymérase T7 (Pharmacia) selon les instructions du fabricant.

1. Amplification rapide et clonage des extrémités de l'ADNc La séquence du récepteur humain 5-HT4 (a) caractérisé par Blondel et al. 1997 a été utilisée pour synthétiser les deux amorces HHT45 [5'- <BR> <BR> <BR> CGGTGCTTATTTCCTGTAATG-3'] et HTS3 [5'-ATGGTCAACAAGCCCTAC-3'] correspondant au début de la séquence du récepteur et au cinquième domaine transmembranaire respectivement. Pour obtenir les ADNc à partir des extrémités 5'générées par le gêne 5-HT4, la technique d'extension par RACE "amarrée" (anchored-RACE) a été appliquée comme décrit dans Newton et Graham, 1994.50 ng d'ARN total de cerveau humain et d'ileon ont subi une transcription inverse en utilisant une amorce oligo (dt) contenant deux séquences d'ancrage et la transcriptase inverse Superscript (GIBCO/BRL).

Les produits de réaction de ces deux tissus ont été ensuite recueillis et utilisés comme matrice pour une réaction RACE utilisant l'amorce HHT45 avec la première ancre. Le produit de la première réaction PCR a été utilisé comme matrice pour la reaction de RACE"nichee" (nested-RACE) utilisant l'amorce HTS3 (modifiée pour inclure une séquence de restriction HindIII) avec la seconde"ancre" (contenant une séquence de restriction EcoRI). Ces deux réactions PCR ont été réalisées au moyen de 25 cycles d'amplification dans les conditions suivantes : dénaturation pendant 1 minute à 94°C, hybridation pendant 1 minute à 54°C et extension pendant 2 minutes a 72°C avec une extension finale pendant 8 minutes. Les températures d'hybridation étaient de 52°C pour la réaction RACE et de 54°C pour la réaction nested-RACE. Les fragments d'ADN ont été séparés sur un gel d'agarose à 1,5 %, clonus dans pGEM-7Z (coupé par HindIII/EcoRI) et séquences.

2. Clonage des ADNc de pleine lonqueu L'ADNc total correspondant aux variants d'épissage 5-HT4 (b), 5- HT4 et 5-HT4(d) a été amplifié en utilisant le pool original de transcription inverse de cerveau humain et dileon, et une stratégie de nested-PCR.

L'amorce HHT45 (modifiée pour inclure un site de restriction HindIII) a été utilisée comme amorce sens dans toutes les réactions PCR. Les amorces

inverses pour le premier cycle d'amplification était F81 [5'- GCCTCAGGTGAAGAGAAT-3'], F61 [5'-TGGCATTAGGATGGTTTGGTCA-3'] et F71 5-HT4(b),5-HT4(c)et5-HT4(d)pour respectivement. Les amorces inverses pour le second cycle d'amplification, qui contiennent toutes un site de restriction EcoRI à leur extrémité 5'étaient F82 [5'-GTCTTCTGGGTCATTGTC-3'], F62 [5'-TTAGGATGGTTTGGTCA-3'] et F72 [5'-CTCAAGGAGCTCAAAATC-3'] pour 5-HT4(b), 5-HT4 et 5-HTd respectivement. Les conditions de PCR étaient les mêmes que celles utilisées pour les deux cycles d'amplification de RACE-PCR. Les fragments correspondants aux ADNc de pleine longueur ont été purifiés sur un gel d'agarose à 1,5 %, sous-clone dans pGEM-7Z (coupé par HindIII/EcoRI) et séquences pour confirmer l'intégrité de la séquence codant.

3. Structure primaire des variants d'epissage du récepteur 5-HT4 humain.

La séquence d'acides aminés déduite des différents variants d'épissage est illustrée figure 1 à partir du site d'épissage Leu358. A l'intérieur de cette région du récepteur, 5-HT4 (a) partage 93 % d'identité protéique avec la forme courte du récepteur du rat 5-HT4s (Blondel et al., 1997). La région comprise entre Leu358 et le dernier acide aminé de 5-HT4 (b) présente 74 % d'identité protéique avec la région correspondante de la forme longue du récepteur du rat 5-HT4L. Cependant, l'extrémité carboxy de 5-HT4 (b) s'est avérée présenter 18 acides aminés de moins que son correspondant chez le rat, et le site consensus de phosphorylation par la PKC décrit du côté C- terminal chez le recepteur 5-HT4L du rat manque (Gérald et al., 1995).

Les variants d'épissage 5-HT4 et 5-HT4d n'ont jamais été décrits chez aucune espèce. il est intéressant de noter que I'extremite carboxy du récepteur 5-HT4 (c) présente un nombre inhabituellement élevé de sites de phosphorylation putatifs : deux sites caséine kinase II et un site protéique kinase C et une séquence consensus pour la phosphorylation par la protéine kinase A/protéine kinase G. L'isoforme 5-HT4d) correspond à une forme

ultracourte du récepteur, avec une troncature d'extrémité carboxy seulement deux acides aminés après le site d'épissage sur la Leu358.

EXEMPLE 2 : Expression tissulaire spécifique des variants d'épissage de récepteur 5-HT4 Les expressions des différents transcrits 5-HT4 ont été analysées par amplification d'ADNc dérivé d'ARN isolé à partir de divers tissus humains en utilisant une technique de nested RT-PCR. La distribution tissulaire a été examinée en utilisant deux paires d'amorces spécifiques de chaque type de variants et deux cycles successifs d'amplification de PCR, conformément aux conditions décrites dans l'exemple 1. Les produits amplifiés ont été identifiés en utilisant une sonde oligonucléotidique interne spécifique (figure 2). Les isoformes 5-HT4(a), 5-HT4(b), et 5-HT4 sont tous exprimés dans l'oreillette, le cerveau et les intestins. La vessie et le foie expriment chacun des niveaux détectables de seulement un sous-type de récepteur (5-HT4 (a) et 5-HT4 (b) respectivement). L'expression de 5-HT4 (d) a été détectée uniquement dans les intestins. Enfin, les ventricules et les poumons n'expriment pas de quantités détectables d'un quelconque isoforme 5-HT4.11 a été également démontré la présence dans tous les tissus d'ADNc correspondant au gène de ß-actine exprimé de manière constitutive, ainsi que l'absence de produits de PCR de ß- actine dans des expériences de contrôle sans transcriptase inverse (figure 2).

EXEMPLE 3 : Caractérisation pharmacologique des variants d'epissage des récepteurs 5-HT4 exprimés de manière transitoire dans les cellules <BR> <BR> <BR> COS-7<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Matériels :

Le PEI (polyethyleneimine MW 800 KD) a été obtenu chez Fluka (L'Isle d'Abeau Chesnes, France). ML 10302 (4-amino-5-chloro-2- méthoxybenzoate de 2- (1-piperidinyl) ethyl) et ML 10375 (4-amino-5-chloro-2- méthoxybenzoate de 2- (cis-3, 5-dimethylpiperidino) ethyl) ont été synthétisés selon Langlois et al., 1994 ; Yang et al., 1997. GR113808 (1-methyl-1 H-indole- 3-carboxylate de ([1-[2-(méthylsulfonyl)amino]éthyl]4-pipéridinyl]méthyl a été obtenu grâce au groupe de recherche Glaxo (Ware, Hertfordshire, U. K. ) et [3H]GR113808 a été obtenu auprès d'Amersham (Arlington, Heights, IL).

1. Transfection de l'ADN La région codante entière des ADNc de 5-HT4(a), 5-HT4(b), 5-HT4(c) et 5-HT4 (d) a ete sous-clonee dans un vecteur d'expression de mammifère pRC/CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA). Les transfections ont été réalisées en utilisant le polyethylenimine (PEI) tel que décrit dans Boussif et al. (1995). Les cellules ont ete transfectees en utilisant un mélange d'ADN et de PEI dans un rapport de 20 pmol de PEI/mg d'ADN dans 0,9 % de NaCI. Pour les tests de liaison aux radioligands, les cellules COS-7 ont été ensemencées un jour avant la transfection dans des flacons de culture de 1,5 x 104 mm2 à une densité de 1 x 107 cellules/flacon, incubées pendant six heures avec de l'ADN plasmidique (150 pg/flacon) et recueillies 48 heures après transfection. Pour la mesure de la formation d'AMPc, les cellules COS-7 ont été ensemencées un jour avant la transfection sur des plaques à douze puits à une densité de 5 x 105 cellules/puits, incubées pendant six heures avec de l'ADN plasmidique (4 a 8 Ng/puits selon les expériences), et testées 24 heures après la transfection.

Les cellules transfectées avec les constructions d'ADNc du récepteur 5-HT4 ont été comparées avec les cellules transfectees"a blanc"qui ont été exposées au plasmide pRC/CMV non modifié.

2. Préparation membranaire Chaque flacon de cellules destinées aux tests de liaison avec un radioligand a été lavé deux fois avec un tampon phosphate (PBS). Les cellules ont été grattées, recueillies et centrifugées à 300 g pendant cinq minutes. Le

culot a été resuspendu dans 2,5 mi de tampon HEPES glacé (50 mM, pH 7,4) et homogénéisé avec un broyeur de tissus Ultraturax. Le lysat a été ensuite <BR> <BR> <BR> <BR> centrifugé à 40 000 g pendant 20 minutes à 4°C. Le culot résultant a été resuspendu dans 15 volumes de tampon HEPES (50 mM, pH 7,4). Les préparations membranaires ont été conservées dans de la glace et utilisées dans les deux heures pour des tests de liaison avec radioligands. Les concentrations protéiques ont été déterminées par la méthode de Lowry et al., 1951 en utilisant de la sérum albumine bovine comme standard.

3. Tests de liaison du radioliaand Les études de liaison du radioligand ont été réalisées dans 50. 0 pl de tampon (HEPES 50 mM, pH 7,4) contenant 20 NI d'un agent compétiteur (pour les études de compétition de drogues), ou de ML 10375, pour donner une concentration finale de 10 pM (pour la détermination de la liaison non spécifique) ou d'un tampon (pour la détermination de la liaison totale) et 20 pi de [3H] GR113808 pour donner une concentration finale de 50 % de valeurs de Kd et 50 pl (100-200 pg) de préparation membranaire. Les études de saturation ont été conduites en utilisant [3H] GR113808 à 9 concentrations différentes allant de 0,01 à 3,5 nM. Les tubes ont été incubés à 25°C pendant 30 minutes. La réaction a été stoppée par filtration rapide sous vide à travers un papier filtre Whatman GF/B en utilisant le récolteur de cellules 48R Brande. Les filtres ont été prétrempés dans une solution de PEI (0,1 %) pour réduire la liaison aux filtres. Les filtres ont été ensuite lavés avec un tampon glacé (50 mM Tris-HCI, pH 7,4) et placés une nuit dans 4 ml de cocktail de scintillation"ready safe" (Beckman, Fullerton, CA). La radioactivité a été mesurée en utilisant un compteur de scintillation liquide Beckman LS 6500 C.

Les données de liaison ont été analysées par analyse de régression non linéaire assistée par ordinateur (Graph Pad Prism Program, Graph Pad Software, Inc., San Diego, CA).

4. Résultats des tests de liaison

L'analyse de saturation utilisant [3H]GR113808 a révélé des sites de haute affinité saturables, uniques pour les quatre variants d'épissage du récepteur (figure 3). Les valeurs similaires de Kd pour [3H]GR113808 ont été trouvées entre les quatre isoformes (5-HT4 (a), 0,23 0,06 ; 5-HT4 (b, 0,62 0,05 ; 5-HT4 (c) 0,30 0,08 ; 5-HT4(d) 0,14 0,05 nM). Cependant, la densité des récepteurs exprimés transitoirement dans les cellules COS-7 (Bm) varie largement entre les tests de transfection (5-HT4(a), 214 10 ; 5-HT4(b) 1411 ~ 55 ; 5-HT4(c), 77, 5 5,8 ; 5-HT4(d) 31,4 2,8 fmol/mg de protéine). La liaison non spécifique augmente non linéairement avec l'augmentation de la concentration en ligand (figure 3). Une série d'agonistes et d'antagonistes 5- HT4 inhibe complètement la liaison spécifique de [3H] GR113808 à tous les isoformes clones du récepteur 5-HT4. Toutes les courbes de déplacement sont monophasiques, donnant un coefficient de Hill de 0,6 à 1,1. Les données résumées au tableau I démontrent que les profils pharmacologiques de toutes les isoformes clonies des récepteurs 5-HT4, en terme d'ordre des puissances des ligands testés, sont très similaires à ceux trouvés pour les récepteurs 5- HT4 étudiés in situ dans l'oreillette de l'homme (Kaumann et al., 1996) et l'oreillette du porcelet (Kaumann et al., 1995) ; le stratum humain (Reynolds et al., 1995) et le noyau caudé humain (Waeber et al., 1993), le stratum de rat (Langlois et al., 1994 ; Yang et al., 1997) et le stratum de cochon d'Inde (Ansanay et al., 1996) ; les colliculi de souris (Ansanay et al., 1996) ou après expression des isoformes clonies dans des fibroblastes cultivés (r5-HT4L (Gérald et al., 1995 ; Adham et al., 1996) ; m5-HT4v (Claeysen et al., 1996). On peut par ailleurs noter que, alors que chacun des composés testés se liait aux isoformes a, b et c du récepteur 5-HT4 avec une affinité similaire, I'affinité pour l'isoforme 5-HT4 (d) était le plus souvent supérieure d'un facteur de 2 à 4 (tableau 1).

EXEMPLE 4 : Stimulation de la production d'AMPc par les variants d'épissage 5-HT4 exprimés de manière transitoire dans les cellules COS-7

Matériels : DMEM a été obtenu chez GIBCO-BRL. La toxine pertussique (PTX) a été obtenue chez Calbiochem. BIMU1 (endo-N-8-méthyl-8- azabicyclo [3.2.1] oct-3-yl)-2, 3-dihydro-3-éthyl-2-oxo-1 H-benzimidazole-1- carboxamide) et le zacopride (4-amino-5-chloro-2-methoxy-N- (1- azabicyclo [2,2,2] octo-3-yl) benzamide, HCI), ont été synthétisés en laboratoire par les auteurs de la présente invention. Le renzapride (BRL 24924) () endo- 4-amino-5-chloro-2-methoxy-N- (1-azabicyclo [3.3.1] non-4-yl) benzamide, HCI) a été obtenu chez SmithKline Beecham. La 5-hydroxytryptamine (5-HT), la 5- méthoxytryptamine (5-MeOT) ont été obtenus chez Aldrich (L'lsle d'Abeau Chesnes, France) et toutes les autres drogues ont été obtenues chez Sigma (L'lsle d'Abeau Chesnes, France).

1. Mesure de la formation d'AMPc Pour la mesure de l'accumulation d'AMPc intracellulaire, les cellules COS-7 transfectées de manière transitoire sont incubées 24 heures après transfection dans du milieu de Eagle modifié par Dulbelcco (DMEM) contenant 5 mM de théophylline, 10 mM de HEPES et 10 pM de pargyline pendant 15 minutes à 37°C en présence de 5 % de C02. La 5-HT (1 pM), ou d'autres agents s6rotoninergiques (1 pM) ou la forskoline (10, uM) ont été ajoutés et incubés pendant 15 minutes supplémentaires à 37°C en présence de 5 % de C02. La réaction a été stoppée par aspiration du milieu et addition de 500, ul d'éthanol refroidi dans de la glace. Après une heure à température ambiante, les cellules ont été grattées et l'ensemble a été recueilli et lyophilise. Le culot a été resuspendu dans 350 NI de PBS et centrifugé pendant 5 min à 300 g. L'AMPc a été quantifié dans le surnageant en utilisant un test radioimmunologique (E. R. I. A. kit de dosage de Pasteur Diagnostics 79830). Les tests t de Student ont été réalisés en utilisant le logiciel Quick TTEst.

2. Stimulation de la production d'AMPc.

Pour examiner et comparer la capacité des récepteurs 5-HT4 à etre couples a I'adenylate cyclase, la synthèse d'AMPc a été testée dans des cellules COS-7 transfectees transitoirement avec les ADNc de 5-HT4(a), 5- HT4(b), 5-HT4(c), et 5-HT4(d). Les valeurs d'AMPc basales n'étaient pas significativement différentes dans ies cellules transfectées"à blanc"et les cellules exprimant les récepteurs 5-HT4 (a), 5-HT4 (b) et 5-HT4 (d), indiquant que ces isoformes exprimées du récepteur n'avaient pas d'activité intrinsèque quant à la formation d'AMPc dans des cellules transfectees transitoirement en l'absence d'agonistes (figure 5a). Cependant, 1'expression transitoire de l'isoforme 5-HT4 (c) a conduit à une augmentation significative du niveau d'activité basal de I'adenylate cyclase en l'absence d'agonistes 5-HT4 (figure 5a). Le dernier résultat indique que l'expression de 5-HT4 dans le système décrit génère un état de récepteur spontanément actif. La 5-HT (1 pM) n'a pas d'effet sur I'activite basale d'adenylate cyclase dans les cellules COS-7 transfect6es"6 blanc" (figure 5a), indiquant que les récepteurs serotoninergiques couples a I'adenylnate cyclase endogènes ne sont pas présents dans ces cellules. Dans les cellules exprimant 5-HT4(a), 5-HT4(b), 5- HT4(c), et 5-HT4(d), I'addition de 5-HT (1 µM) augmente significativement la concentration d'AMPc de 82 %, 85 %, 64 % et 77 % respectivement (figure 5a). La forskoline (10 µM), un activateur direct de I'adenylate cyclase, induit des augmentations similaires des concentrations d'AMPc dans les cellules exprimant les isoformes du récepteur 5-HT4 et dans les cellules COS-7 transfectees"a blanc" (figure 5A) indiquant que le potentiel d'activation maximale de I'adenylate cyclase n'a pas été affecté dans les cellules exprimant les récepteurs 5-HT4. Les agonistes des récepteurs 5-HT4 ML10302 et renzapride, et l'antagoniste des récepteurs 5-HT4, ML10375 n'a pas d'effet significatif sur les niveaux d'AMPc basals dans les cellules COS-7 transfect6es"6 blanc" (figure 5B). Dans les cellules exprimant les isoformes du récepteur 5-HT4, ML10302 se conduit comme un agoniste 5-HT4 faible, et présente seulement 28 à 34 % de l'effet stimulateur de 5-HT (figure 5C), en dépit d'une haute affinité pour le récepteur (tableau 1). En outre, la

preincubation des cellules avec 1 µM de ML10302 préalablement à l'addition de 5-HT (1 µM) antagonise significativement la capacité de 5-HT à augmenter les niveaux d'AMPc basais (figure 5C). Comme décrit par Blondel et al. (1997), le renzapride se conduit aussi comme un agoniste 5-HT4 faible dans les cellules exprimant l'isoforme du récepteur 5-HT4 (a) et augmente la formation d'AMPc par seulement 56 % dans ces cellules (figure 5D), en dépit d'une affinité pour le récepteur 5-HT4 (a) similaire à celle de 5-HT (tableau 1).

Cependant, le renzapride se comporte comme un agoniste total dans les cellules exprimant les isoformes 5-HT4 (b), 5-HT4 et 5-HT4d, dans la mesure où la formation d'AMPc induite par le renzapride médiée par ces variants d'épissage du récepteur, n'était pas significativement différente de la formation d'AMPc induite par la 5-HT (figure 5D). L'antagoniste 5-HT4, ML10375, (Yang et al., 1997) à une concentration de 1 pM n'avait pas d'effet significatif sur les niveaux basals d'AMPc dans les cellules exprimant les isoformes de récepteurs 5-HT4 (a) et 5-HT4 (b) mais a réduit significativement les niveaux basals d'AMPc dans les cellules exprimant les isoformes des récepteurs 5- HT4 et 5-HT4d (par respectivement 21 % et 24 %, figure 5E). De plus, la préincubation des cellules exprimant les isoformes de récepteur 5-HT4 avec 1 pM de ML10375 préalablement à l'addition de 5-HT (1 µM) antagonise la capacité de 5-HT d'augmenter significativement les niveaux d'AMPc basals (figure 5E).

TABLEAU 1 : Comparaison des affinités de liaisons de divers agonistes et antagonistes des récepteurs 5-HT4 sur les récepteurs 5-HT4(a), 5-HT4(b), 5- 5-HT4(d).HT4(c)et

K ;(nM) 5-HT4(c)5-HT4(d)5-HT4(a)5-HT4(b) 5-HT 772 278 1151 ~ 170 481,9 ~ 112 330 ~113 5-MeOT 2080 + 508 2443 510 1020 ~ 236 553 149 ML10302 8,4 1,5 10,72 2,9 7,98 ~2, 77 3,69 ~ 1,25 ~119123,4~9,066~8,3738,85~12BIMU1373 Renzapride 635 1179~142636~91173~40148 Zacopride 7750 1615 11490 950 10630 2160 3599 ~ 1835 GR113808 0,33 0, 033 0,53 ~ 0,10 0,41 ~ 0,13 0,078 ~ 0, 24 ML10375 0,56 ~ 0, 11 1,62 ~ 0,82 0,61 ~ 0,08 0,41 ~ 0, 10 Les expériences correspondent à la compétition de divers composés pour la liaison de [3H] GR113808 à des membranes de cellules COS-7 transfectées de manière transitoire. Pour chaque isoforme du récepteur 5-HT4 humain, la concentration de [3H]GR113808 a été ajustée à 50 % de la valeur du Kd. Les estimations d'affinité sont données comme des valeur de K,. en nM et sont déterminées à partir de valeur IC50 obtenues par analyse de courbe non linéaire assistée par ordinateur (GraphPad, Prism Software). Les valeurs de K ; sont représentatives d'au moins deux déterminations. L'ordre des puissances des drogues testées est identique pour les quatre isoformes 5-HT4 et sont : ML10375>ML10302>BIMU1>Renzapride=5-HT>5-> MeOT>Zacopride.

EXEMPLE 5 : ML10375 : Agoniste inverse du récepteur 5-HT4 ML10375 est capable de réduire les niveaux d'AMPc dans les cellules exprimant les isoformes 5-HT4 et 5-HT4d en l'absence d'une quelconque simulation du récepteur par des agonistes 5-HT4. Pour tester l'hypothèse que ML10375 puisse constituer un agoniste inverse pour le récepteur 5-HT4 humain, l'isoforme 5-HT4(c) a été surexprimée dans des cellules COS-7 afin d'augmenter la fréquence de l'état du récepteur spontanément actif. Les cellules COS-7 ont ete transfectees avec 4 à 8 µg d'ADN plasmidique par puits afin d'obtenir une augmentation des niveaux d'expression du récepteur 5-HT4(c). La transfection des cellules COS-7 en utilisant 4 p9 et 8 pg d'ADN plasmidique a augmenté le niveau basal d'AMPc de 59 % et de 235 % respectivement (figure 6A). La 5-HT (1 µM) a induit une augmentation de 64 % du niveau basal d'AMPc dans les cellules transfectées avec 4 pg d'ADN plasmidique mais n'a pas augmenté significativement le niveau basal d'AMPc dans les cellules transfectées avec 8 µg d'ADN plasmidique (figure 6A). Ce dernier résultat indique que dans les cellules surexprimant l'isoforme du récepteur 5-HT4 (c) la fréquence du récepteur spontanément actif empêche l'effet stimulateur de la 5-HT sur l'activité adenylate cyclase. La forskoline (10 µM) a induit des augmentations similaires des concentrations en AMPc dans les cellules transfectees par soit 4 µg soit 8 pg d'ADN plasmidique et dans les cellules transfect6es"6 blanc" (figure 6A), indiquant que le potentiel d'activation maximal de l'adénylate cyclase n'a pas été affecté dans les cellules surexprimant l'isoforme 5-HT4(c). Dans les cellules COS-7 transfectees avec 4 pg et 8 µg d'ADN plasmidique, ML10375 (1 µM) a diminué les valeurs basales d'AMPc de 24 % et 62 %, respectivement (figure 6B). Dans les cellules transfectées avec 4 pg d'ADN plasmidique, la ML10375(1µM)aantagonisél'effetstimulateurde5-HT(1préincub ationavec zuM) sur l'AMPc basal (figure 6B). Dans les cellules transfectees avec 8 p9 d'ADN plasmidique, la préincubation avec ML10375 (1, uM) a induit une

diminution de 47 % du niveau d'AMPc basal même en présence de 1 µM de 5- HT (figure 6B).

Pour tester si 1'effet de ML10375 sur le niveau d'AMPc correspond à une activation des récepteurs 5-HT4 spontanément actifs ou à une inhibition de I'activite adenylate cyclase par la voie régulatrice médiée par la protéine Gi, 1'effet de ML10375 a été examiné dans les cellules COS-7 transfectees avec 6 µg d'ADN plasmidique 5-HT4 (c) en présence ou en l'absence de PTX (100 ng/ml). Le traitement par PTX n'a modifié ni le niveau basal d'AMPc ni la stimulation d'AMPc induite par la 5-HT et la forskoline dans les cellules transfectees (figure 6C). De plus, le traitement par PTX n'a pas modifié significativement la réduction d'AMPc basal induite par ML 10375 dans les cellules transfectees (figure 6D).

EXEMPLE 6 : Caractérisation pharmacologique des variants d'épissage des récepteurs 5-HT4 exprimés de manière stable dans les cellules CHO Matériels : Le milieu HAM-F12 a été obtenu chez Gibco-BRL. ML 10375 (4- amino-5-chloro-2-méthoxybenzoate de 2- (cis-3, 5-dimethylpiperidino) ethyl) a été synthétisé selon Langlois et al., 1994 ; Yang et al., 1997. GR113808 (1- methyl-1 H-indole-3-carboxylate de ( [l- [2- (m6thylsulfonyl) amino] éthyl] 4- pipédidinyl]méthyl) a été obtenu grâce au groupe de recherche Glaxo (Ware, Hertfordshire, U. K.) et [3H] GR113808 a été obtenu auprès d'Amersham (Arlington, Heights, IL). L'électroporateur utilisé était un Gene Pusler obtenu auprès de Biorad.

1. Transfection de l'ADN La région codante entière des ADNc de 5-HT4(c) et 5-HT4(d) a été sous-clonee dans un vecteur d'expression de mammifère pRC/CMV (invitrogen, Carlsbad, CA). Les cellules CHO sont transfectées de façon

stables par électroporation (250 V, 960 pF) avec le plasmide PRc/CMV contenant le clone h5-HT4 ou h5-HT4d coupe par l'enzyme de restriction Kpn1 (10µg de plasmide pour 107 cellules). Les cellules sont cultivées dans du milieu HAM-F12 complémenté avec 10% de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur. Après 48 heures, la généticine (1.25 mg/ml) est ajoutée dans le milieu. Douze jours plus tard, les clones sont individualisés et cultivés dans des plaques 12 puits. La sélection des clones s'effectue en étudiant la stimulation de l'AMPc formé en présence de 1 µM de sérotonine. Pour les tests de liaison aux radioligands ou pour la mesure de la formation d'AMPc, les cellules transfectées avec les constructions d'ADNc des récepteur 5-HT4 ont été comparées avec les cellules transfectées "à blanc"qui ont été exposées au plasmide pRC/CMV non modifié.

2. PréParation membranaire Chaque flacon de cellules destinées aux tests de liaison avec un radioligand a été lavé deux fois avec un tampon phosphate (PBS). Les cellules ont été grattées, recueillies et centrifugées à 300 g pendant cinq minutes. Le culot a été resuspendu dans 2,5 mi de tampon HEPES glacé (50 mM, pH 7,4) et homogénéisé avec un broyeur de tissus Ultraturax. Le lysat a été ensuite centrifugé à 40 000 g pendant 20 minutes a 4°C. Le culot résultant a été resuspendu dans 15 volumes de tampon HEPES (50 mM, pH 7,4). Les préparations membranaires ont été conservées dans de la glace et utilisées dans les deux heures pour des tests de liaison avec radioligands. Les concentrations protéiques ont été déterminées par la méthode de Lowry et al., 1951 en utilisant de la sérum albumine bovine comme standard.

3. Tests de liaison du radioliaand Les études de liaison du radioligand ont été réalisées dans 500 pu de tampon (HEPES 50 mM, pH 7,4) 20 pl de ML 10375, pour donner une concentration finale de 10 pM (pour la détermination de la liaison non spécifique) ou d'un tampon (pour la détermination de la liaison totale) et 20 NI de [3H] GR113808 pour donner une concentration finale de 50 % de valeurs de

Kd et 50 µl (100-200 µg) de préparation membranaire. Les études de saturation ont été conduites en utilisant [3H] GR113808 à 9 concentrations différentes allant de 0,01 à 3,5 nM. Les tubes ont été incubés à 25°C pendant 30 minutes. La réaction a été stoppée par filtration rapide sous vide à travers un papier filtre Whatman GF/B en utilisant le récolteur de cellules 48R Brande. Les filtres ont été prétrempés dans une solution de PEI (0,1 %) pour réduire la liaison aux filtres. Les filtres ont été ensuite lavés avec un tampon glacé (50 mM Tris-HCI, pH 7,4) et placés une nuit dans 4 ml de cocktail de scintillation"ready safe" (Beckman, Fullerton, CA). La radioactivité a été mesurée en utilisant un compteur de scintillation liquide Beckman LS 6500 C.

Les données de liaison ont été analysées par analyse de régression non linéaire assistée par ordinateur (Graph Pad Prism Program, Graph Pad Software, Inc., San Diego, CA).

4. Résultats des tests de liaison L'analyse de saturation utilisant [3H]GR113808 a révélé des sites de haute affinité saturables, uniques pour les deux variants d'épissage du récepteur (figure 7). Les valeurs similaires de Kd pour [3H] GR113808 ont été trouvées entre, es deux isoformes (5-HT4c)} 0,42 0,04 nM ; 5-HT4d), 0,23 0,03 nM). La densité des récepteurs exprimés dans les cellules CHO (Bmx) est de 568.1 ~ 17.4 fmol/mg de protéine pour 5-HT4, et 179.9 ~ 5.8 fmol/mg de protéine pour 5-HT4 (d). La liaison non spécifique augmente non linéairement avec l'augmentation de la concentration en ligand (figure 7).

EXEMPLE 7 : Stimulation de la production d'AMPc par les variants d'épissage 5-HT4 exprimes de manière stable dans les cellules CHO Matériels: Les milieux DMEM et HAM-F13 ont été obtenus chez GIBCO- BRL. La 5-hydroxytryptamine (5-HT) a été obtenue chez Aldrich (L'Isle

d'Abeau Chesnes, France) et toutes les autres drogues ont été obtenues chez Sigma (L'Isie d'Abeau Chesnes, France).

1. Mesure de la formation d'AMPc Pour la mesure de l'accumulation d'AMPc intracellulaire, les cellules CHO transfectees de manière stable sont incubées dans le milieu HAM-F12 contenant 5 mM de théophylline, 10 mM de HEPES et 10 pM de pargyline pendant 15 minutes a 37°C en présence de 5 % de C02. La 5-HT (1 , uM) a été ajoutée et les cellules incubées pendant 15 minutes supplementaires a 37°C en présence de 5 % de C02. La réaction a été stoppée par aspiration du milieu et addition de 500 µl d'éthanol refroidi dans de la glace. Après une heure à température ambiante, les cellules ont été grattées et l'ensemble a été recueilli et lyophilise. Le culot a été resuspendu dans 350 NI de PBS et centrifugé pendant 5 min à 300 g. L'AMPc a été quantifié dans le surnageant en utilisant un test radioimmunologique (E. R. I. A. kit de dosage de Immunotech, Marseille). Les tests t de Student ont été réalisés en utilisant le logiciel Quick TEst.

2. Stimulation de la production d'AMPc.

Pour examiner et comparer la capacité des récepteurs 5-HT4 à etre couples a I'adenylate cyclase, la synthèse d'AMPc a été testée dans des cellules CHO transfectees de manière stable avec les ADNc de h5-HT4 et h5-HT4(d). Les valeurs d'AMPc basales étaient supérieures dans les cellules exprimant les récepteurs h5-HT4 (9,8 1,6 pmoles/puits) et h5-HT4 (d) (12,1 0,9 pmoles/puits) que dans les cellules transfect6es"6 blanc" (3,6 0,4 pmol/puits), indiquant que ces isoformes exprimées du récepteur possèdent une activité intrinsèque quant à la formation d'AMPc dans des cellules transfectees de manière stable, en l'absence d'agoniste. Dans les cellules exprimant h5-HT4 et h5-HTd, I'addition de 5-HT (1 pM) augmente significativement la concentration d'AMPc (respectivement de 91% pour h5- HT4 et de 118% pour h5-HT4 (d), figure 8) alors que la 5-HT n'a pas d'effet sur les cellules CHO transfect6es"6 blanc" (figure 8).

EXEMPLE 8 : Obtention d'anticorps polyclonaux de lapin anti-peptides synthétiques dérivés des séquences des isoformes du recepteur h5-HT4.

Le tableau ci-après présente la séquence des peptides synthétiques préparés à partir des isoformes du récepteur 5-HT4 : SEQ Désignation Séquence Domaine ID du peptide correspondant 5 F26V FGAIELVQDIWIYGEVFCLVRTSLDV boucle I extracel- lulaire (G21V GIICLIEKRKFNQNSNSTYCV Boucle 11 extracel- lulaire 7 GQWESQBHPPATSPLVAAQPSDTPartieC-terminaleC isoforme a g Y23F YGHHQELEKLPIHNDPESLESCF PartieC-terminale isoforme b 9 C21S CGTETDRRNFGIRKRRLTKPS PartieC-terminale isoformec 10 C7F C-Ahx-T H V L R F Partie C-terminale isoformed AhxAhx= acide aminohexanoique Des lapins ont été immunisés avec 250 µg des peptides F26V et G21V, correspondant à la première et la seconde boucle extracellulaire du récepteur h5-HT4 et avec 250 pg de peptides C24T et C21 S, correspondant respectivement à la partie C-terminale des isoformes h5-HT4 (a) et h5-HT4 (c).

Ces peptides ont été injectés tels quels en présence de 3 mg de sérum albumine bovine méthylée et 1 ml d'adjuvant complet de Freund. Trois semaines après, les lapins ont reçu les mêmes immunogènes en présence d'adjuvant de Freund incomplet et suivi de la même immunisation un mois après. Les antisérums ont été prélevés une semaine après la dernière injection.

Les peptides Y23F, correspondant à la partie C-terminale de l'isoforme 5-hHT4 (b) et C7F, correspondant à la partie C-terminale de l'isoforme h5-HT4 (d) ont été couplés à la sérum albumine bromoacetylee avant immunisation avec 2.3 moles de peptides couplées à 3.4 mg d'albumine sérique bovine modifiée. La première immunisation en adjuvant complet de Freund est suivie de deux autres injections en adjuvant incomplet de Freund comme décrit dans le paragraphe précédent. Les antisérums ont été prélevés une semaine après la dernière injection.

La figure 9 donne les valeurs en densité optique d'un essai immunoenzymatique de type ELISA sur les peptides respectifs adsorbés (5 pg/ml dans un tampon carbonate à pH=9.5) sur des plaques MAXIsorb (Nunc, Danemark). Les antisérums ont été incubés une heure a 37°C et révélés par un conjugat anticorps anti-IgG de lapin de chèvre couplé à la peroxydase (dilution 1/10000) et le substrat H202-ABTS.

EXEMPLE 9 : Mise en évidence à l'aide de l'anticorps anti-G21V de la présence du récepteur 5-HT4 dans les cellules CHO transfectées de manière stable La présence du récepteur 5-HT4 dans les cellules CHO exprimant de manière stable cette isoforme du récepteur a été mise en évidence en Western blot grâce à l'anticorps commun G21V développé dans le cadre de cette étude. les isoformes 5-HT4(a) (figure 10, ligne 2) et 5-HT4 (c) (figure 10, ligne 3). Les cellules CHO ont ete transfectees avec le vecteur d'expression codant pour la forme (c) du récepteur 5-HT4 et sélectionnées pour leur résistance à la néomycine. Pour comparaison, d'autres cellules CHO ont ete transfectees avec le vecteur d'expression codant pour la forme (a) du r6cepteur 5-HT4-Cinquante pg de protéines provenant d'extraits membranaires sont séparés sur un gel de polyacrylamide à 10% puis transférés sur membrane de nitrocellulose. Après 16 h d'incubation en

présence de 60 pg d'anticorps anti-5-HT4 (G21V), le blot est révélé par chimioluminescence (ECL, Amersham, Arlington, Heights, IL) et canne. La ligne 1 de la figure 10 indique le résultat obtenu sur les cellules CHO contrôles, ou aucun marquage n'est détecté ; les lignes 2 et 3 proviennent de clones de cellules CHO surexprimant respectivement les récepteur 5-HT4 (a) et 5-HT4(c). Une bande migrant approximativement à la taille de 60 kDa est visualisée.

EXEMPLE 10 : Mise en évidence à l'aide des anticorps anti-C21S et anti-C7F de la présence respectivement du récepteur h5-HT4 (c) et h5-HT4 (d) dans les cellules CHO transfectees de manière stable.

Utilisant des anticorps dirigés contre la séquence C-terminale spécifique du récepteur h5-HT4 (anti-C21S) et du récepteur h5-HT4 (d) (anti-C7F), la présence de ces récepteurs respectifs sur des homogenats de cellules exprimant les deux isoformes a pu être démontrée. La spécificité des bandes protéiques reconnues a été déterminée par l'extinction de la réponse en immunoblot en présence des peptides inhibiteurs (Figure 11 a et 11 b, secondes lignes). L'isoforme h5-HT4 (c) est reconnue sous sa forme glycosylee et non glycosylee (correspondant à des poids moléculaires de 60 et 44 kDa) ; l'isoforme h5-HT4(d) est reconnue sous sa forme non-glycosylee (correspondant à un poids moléculaire de 40 kDa) (Figure 11 a et 11 b, premières lignes).

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