Die Erfindung betrifft einen stabilen virussicheren Faktor VIII- Komplex, der insbesondere hochmolekulare vWF-Multimere mit hoher struktureller Integrität enthält und frei ist von niedermoleku¬ laren vWF-Molekülen und proteolytischen vWF-Abbauprodukten. Des¬ weiteren betrifft die Erfindung Verfahren zur Gewinnung und Her¬ stellung eines stabilen Faktor VIII-Komplexes sowie pharmazeuti¬ sche Präparationen davon.

Die Blutgerinnung ist ein komplexer Prozeß, der die sequentielle Interaktion einer Reihe von Komponenten, insbesondere von Fibri- nogen, Faktor II, Faktor V, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Faktor XI und Faktor XII einschließt. Der Verlust einer dieser Komponenten oder die Inhibierung ihrer Funktionali¬ tät führt zu einer verstärkten Blutgerinnungsneigung, die bei einigen Patienten lebensbedrohlich sein kann.

Von Willebrand-Faktor (vWF) zirkuliert im Plasma komplexiert mit Faktor VIII, wobei Faktor VIII die Blutgerinnung unterstützt und vWF im Komplex mit Faktor VIII diesen stabilisiert und vor pro- teolytischem Abbau schützt. Durch seine Funktion bei der Plätt¬ chenaggregation greift vWF auch direkt in die Blutgerinnung ein. Der vWF ist ein Glykoprotein, welches in verschiedenen Zellen von Säugern gebildet und anschließend in die Zirkulation frei¬ gesetzt wird. Dabei wird in den Zellen ausgehend von einer Poly- peptidkette mit einem Molekulargewicht von ca. 220 kD durch Aus¬ bildung von mehreren Schwefelbrücken ein vWF-Dimer mit einem Mo¬ lekulargewicht von 550 kD gebildet. Aus den vWF-Dimeren werden dann durch Verknüpfung weitere Polymere des vWF mit immer höhe¬ rem Molekulargewicht, bis zu 20 Millionen Dalton, hergestellt. vWF existiert daher im Plasma in einer Serie von multimeren For¬ men von einem Molekulargewicht von 1 x 10 ⁶ bis 20 x 10 ⁶ Dalton. Es wird vermutet, daß insbesondere den hochmolekularen vWF-Mul- timeren eine essentielle Bedeutung bei der Blutgerinnung zu¬ kommt.

Neben der Carrier-Funktion für Gerinnungsfaktor VIII besteht für den vWF die Funktion in der Brücken-Bildung zwischen Gefäßwand

und der Plättchen und Plättchenagglutination. Die Grundlage zur Plättchenagglutination ist durch die Bindung des vWF an Oberflä¬ chen-Rezeptoren (Glykoproteine Ib, Ilb/IIIa) gegeben. Die Bin¬ dungsstelle innerhalb des vWF zur Bindung an GP Ib befindet sich im Disulfid-Loop Cys( 509 )-Cys(695) . Es ist bekannt, daß die Plättchenagglutination mit einer Bindung des vWF an das Glyko- protein Ib beginnt. Nach einem Aktivierungssignal kommt es dann zur Bindung des vWF an den Glykoprotein Ilb/IIIa-Komplex und der Agglutination. Die Plättchenagglutination setzt somit die Bin¬ dung des vWF an die Oberflächenrezeptoren voraus; durch die Bin¬ dung mehrerer Plättchen durch ein vWF-Molekül kommt es in Folge zur Agglutination. vWF-Plättchenbindung stellt somit die mole¬ kulare Ursache für die Plättchenagglutination dar.

Bei der Hämophilie ist die Blutgerinnung durch Mangel an be¬ stimmten plasmatischen Blutgerinnungsfaktoren gestört. Bei der Hämophilie A beruht die Blutungsneigung auf einem Mangel an Fak¬ tor VIII bzw. einem Mangel an vWF, der ein wesentlicher Bestand¬ teil des Faktors VIII darstellt. Die Behandlung der Hämophilie A erfolgt in erster Linie durch Ersatz des fehlenden Gerinnungs- faktors durch Faktorenkonzentrate z.B. durch Infusion von Faktor VIII, Faktor VIII-Komplexes oder vWF.

Das vWF-Syndrom besitzt mehrere Krankheitsbilder, die auf eine Unter- oder Überproduktion des vWFs zurückzuführen sind. So führt z.B. eine Überproduktion von vWF zur vermehrten Neigung von Thrombosen, wohingegen eine Unterversorgung durch die Abwe¬ senheit oder eine Reduktion von hochmolekularen Formen des vWF begründet ist, die sich dadurch manifestiert, daß eine vermehrte Blutungsneigung und eine verlängerte Blutungszeit durch eine in¬ hibierte Plättchenaggregation auftritt. Der Mangel an vWF kann auch eine phänotypische Hämophilie A hervorrufen, da der vWF ein wesentlicher Bestandteil des funktioneilen Faktor VIII ist. In diesen Fällen ist die Halbwertszeit des Faktor VIII derart ver¬ ringert, daß seine Funktion in der Blutgerinnungskaskade beein¬ trächtigt ist. Patienten mit von Willebrand-Syndrom (vWD) weisen daher oftmals Faktor VIII-Defizienz auf. Bei diesen Patienten ist die reduzierte Faktor VIII-Aktivität nicht die Konsequenz eines Defekts des X-chromosomalen Genes, sondern ist eine indi-

rekte Folge der quantitativen und qualitativen Veränderung des vWF im Plasma. Die Unterscheidung zwischen Hämophile A und vWD kann normalerweise durch Messen des vWF-Antigens oder durch Be¬ stimmen der Ristocetin-Kofaktor-Aktivität erfolgen. Sowohl der vWF-Antigengehalt als auch die Ristocetin-Kofaktor-Aktivität ist bei den meisten vWD-Patienten erniedrigt, wogegen sie in Hämo¬ philie A-Patienten normal ist.

Konventionelle Methoden zur Therapie des von Willebrand-Syndroms erfolgen mit aus Plasma gewonnenem vWF, wobei es eine Reihe von Ansätzen gibt, vWD-Patienten mit gereinigtem vWF oder Faktor VIII/vWF-Komplex zu therapieren.

Die Reinigung von Faktor VIII oder Faktor VIII-Komplex aus Plas¬ ma oder Kryopräzipitat wird insbesondere dadurch erschwert, daß Faktor VIII nur in sehr geringen Mengen im Plasma vorkommt, ex¬ trem labil ist und die Assoziation von Faktor VIII mit vWF unter spezifischen Bedingungen reversibel ist. Faktor VIII wird durch Reinigung und Konzentrierung aus Plasma gewonnen, jedoch kann es abhängig vom Reinigungsverfahren zur Instabilität und Verlust der Faktor VIII-Aktivität aufgrund der Trennung von vWF und Fak¬ tor VIII während der Reinigung kommen. Das Endprodukt ist daher oft eine Mischung aus stabilem Faktor VIII-Komplex und instabi¬ lem Faktor VIII, sowie von kontamierenden Proteinen, wie z.B. Fibrinogen, Fibronektin oder Vitamin K-abhängigen Proteinen, die durch die Reinigung nicht entfernt werden konnten. Aufgrund der Instabilität des gereinigten Komplexes werden Stabilisatoren, wie Albumin oder Aminosäuren etc., zugesetzt. Die Anwesenheit von kontaminierenden Proteinen und/oder Stabilisatoren im gerei¬ nigten Produkt reduzierten jedoch die spezifische Aktivität des Faktor VIII-Komplexes.

Die EP 0 468 181 beschreibt ein Verfahren zur Reinigung von Fak- or VIII aus humanem Plasma durch Ionenaustauschchromatographie, Elution des Faktor VIII mit hoher Ionenstärke bei saurem pH und Sammeln des Eluats in Anwesenheit eines Stabilisators, wie Hepa- rin, Albumin und PEG und Lysin oder Histidin als Antiprotease. Die spezifische Aktivität nach Zugabe von Albumin sinkt jedoch von 300 bis 1200 U/mg Protein auf 18-24 U/mg Protein.

Madaras et al. (Haemostasis 7:321-331 (1978)) beschreiben ein Verfahren zur Reinigung von Faktor VIII an Heparin-Sepharose und Elution mit steigenden NaCl-Konzentrationen. Der so erhaltene Faktor VIII hatte jedoch nur geringe Aktivität.

Die US 5,252,709 beschreibt Verfahren zur Trennung von Faktor VIII, vWF, Fibronektin und Fibrinogen aus humanem Plasma, wobei zuerst Faktor VIII, vWF und Fibronektin an einen Ionentauscher von DEAE-Typ gebunden werden und anschließend durch steigende Salzkonzentrationen vom Ionenaustauscher getrennt eluiert wer¬ den.

Zimmerman et al. (US 4,361,509) beschreiben ein Verfahren zur Reinigung von Faktor VIII, wobei der Faktor VIII/vWF-Komplex an einen monoklonalen anti-vWF-Antikörper gebunden wird und Faktor VIII vom Komplex durch CaCl ₂ -Ionen dissoziiert wird. Der so er¬ haltene Faktor VIII wird anschließend über einen weiteren Chro¬ matographieschritt in reiner Form gewonnen, muß jedoch durch Zugabe von humanem Albumin stabilisiert werden.

Durch die Expression von Faktor VIII in rekombinanten Zellen (Wood et al. (1984), Nature 312:330-337) konnte Faktor VIII gen¬ technisch hergestellt werden, jedoch konnte erst durch Zugabe oder Koexpression von vWF eine kommerziell einsetzbare Ausbeute an rekombinantem Faktor VIII erzielt werden. Zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates wird vWF jedoch während des Reinigungsprozesses bis auf eine unwesentliche Restmenge vom Faktor VIII abgetrennt und der gereinigte rekombinante Faktor VIII mit Albumin stabilisiert (Griffith et al. (1991), Ann. Hematol 63:166-171).

Für den Einsatz zur Therapie von Patienten mit Hämophilie A, aber auch mit von Willebrand-Syndrom ist ein gereinigter Faktor VIII, komplexiert mit vWF, wünschenswert (Berntorp (1994), Haemostasis 24:289-297). Insbesondere wird immer wieder betont, daß in Präparaten ohne oder nur einem geringen Gehalt an vWF, eine verlängerte Blutungszeit und eine geringe Faktor VIII:C- Halbwertszeit in vivo zu beobachten ist. Eine Normalisierung von vWF in vivo ist wichtig, um die Konzentration von Faktor VIII im

Plasma sowohl durch Reduktion der Faktor VIII-Eliminierungsrate als auch durch die Unterstützung der Freisetzung von endogenem Faktor VIII, aufrecht zu erhalten (Lethagen et al. (1992), Ann. Hematol. 65:253-259).

Die DE 3 504 385 beschreibt die Durchführung einer Ionenaus- tauschchromatographie zur Reinigung von Faktor VIII/vWF-Komplex, wobei der Faktor VIII-Komplex über Sulfatgruppen gebunden und mit Citratpuffer, Calciumchlorid und NaCl-Gradient eluiert wird. Der Faktor VIII-Komplex wird dabei mit einer Konzentration von 0,5 M NaCl vom Träger eluiert.

Die EP 0 416 983 beschreibt die Gewinnung von Faktor VIII/vWF- Komplex aus menschlichem Plasma durch Ausfällung mit einer Kom¬ bination aus Bariumchlorid und Aluminumhydroxid und anschließen¬ de Anionenaustauschchromatographie an DEAE-Fraktogel.

In der EP 0 411 810 erfolgt die Reinigung von Faktor VIII/vWF- Komplex aus Kryopräzipitat mittels Heparin-Affinitätschromato- graphie und anschließende Elution des Komplexes mit Calcium¬ chlorid. Eine Weiterentwicklung dieses Verfahrens wird in der WO 93/22337 beschrieben. Zur Entfernung von kontaminierenden Prote¬ inen, wie Fibrinogen und Fibronektin, wird im Anschluß an die Elution mit CaCl ₂ eine Glycin/NaCl-Fällung durchgeführt.

Zur Reinigung des Faktor VIII/vWF-Komplexes wurde ebenfalls vor¬ geschlagen, kontaminierende Proteine, wie etwa Fibrinogen, mit hohen Konzentrationen an Aminosäuren, insbesondere von Glycin, auszufällen, den in Lösung verbleibenden Faktor VIII/vWF-Komplex durch Zugabe eines calcium- und aminosäurehaltigen Puffers zu dissoziieren und anschließend Faktor VIII und vWF durch Anionen- austauschchromatographie getrennt voneinander zu gewinnen (WO 82/04395).

Die US 5,356,878 beschreibt die Herstellung von Faktor VIII- Komplex, bei dem kontaminierende Proteine (Fibrinogen, Vitamin- K-abhängige Faktoren oder Fibronektin) durch Fällung mit A1(0H) ₃ und PEG abgetrennt, Faktor VIII-Komplex in Gegenwart von Glycin und NaCl chemisch virusinaktiviert und anschließend die nicht

Faktor VIII-Komplex-spezifischen Proteine durch Gelfiltration entfernt werden.

Hornsey et al. (Thromb. Haemost. 57:102-105 (1987)) reinigten Faktor VIII/vWF mittels Immunaffinitätschromatographie und er¬ reichten eine spezifische Aktivität von 45 U Faktor VHI/mg Pro¬ tein und 60 U Ristocetin-Aktivität/mg Protein. Allerdings ist das Endprodukt mit 4% Fibrinogen und 2% Fibronektin und vom Trä¬ ger abgelösten Maus-Antikörpern verunreinigt.

Mejan et al. (Thromb. Haemost. 59: 364-371 (1988)) schlugen vor, Faktor VIII/vWF-Komplex mittels Immunaffinität direkt aus Plasma zu reinigen. Der gereinigte Komplex wurde mit humanem Serumalbu¬ min stabilisiert und anschließend lyophilisert. Mit den be¬ schriebenen Elutionsbedingungen wurde jedoch eine teilweise Freisetzung der Antikörper von der Säule beobachtet, was zu ei¬ ner Kontamination des Eluats mit monoklonalen Antikörpern führte und einen zweiten Reinigungsschritt zur Entfernung der Antikör¬ per erforderte. Mejan et al. erreichten mit ihrem Verfahren eine etwa 1400-fache Anreicherung des Faktor VIII/vWF-Komplexes mit einer spezifischen Faktor VIII:C-Aktivität und Ristocetin-Akti- vität von je 20 U/mg Protein, wobei das Produkt alle vWF-Multi- mere enthielt. Nach Stabilisierung des Komplexes mit 10 mg/ml Albumin wurde ein Stabilität von 3-4 Monaten bei -20°C beobach¬ tet. Es wird jedoch immer wieder betont, daß eine besondere Schwierigkeit bei der Reinigung des Komplexes darin besteht, die Assoziation der Proteine zu erhalten, da beide Komponenten im Komplex instabil sind.

Harrison et al. (Thromb. Res. 50:295-304 (1988)) beschreibt die Reinigung von Faktor VIII/vWF-Komplex durch Chromatographie an Dextransulfat-Agarose.

Die EP 0 600 480 beschreibt die Reinigung von Faktor VIII/vWF- Komplex mittels Anionenaustauschchromatographie, wobei das Elu- at, enthaltend Faktor VIII/vWF-Komplex, mit Heparin und Albumin stabilisiert und gegebenenfalls Lysin und Histidin als Antipro- teasen zugegeben werden.

Kommerziell erhältliche Faktor VIII/vWF-Präparate weisen zum Teil keinen oder nur einen geringen Anteil an hochmolekularen vWF-Multimeren (vWF/HMW) auf und zeigen insbesondere in Abhän¬ gigkeit der Infusionszeit in vivo eine Reduktion der hochmoleku¬ laren vWF-Multimeren (Lethagen et al. (1992), Ann. Hematol. 65:253-259).

Die im Stand der Technik beschriebenen Faktor VIII-Präparate enthalten zwar zum größten Teil das gesamte vWF-Multimerpattern, jedoch variieren sie im Anteil an HMW-vWF und LMW-vWF und weisen sog. Triplett-Strukturen auf, die auf einen proteolytischen Ab¬ bau von vWF-Multimeren, insbesondere von vWF/HMW, hinweisen (Scott et al. (1993), Sem. Thromb. Hemost. 19:37-47, Baillod et al. (1992), Thromb. Res. 66:745-755, Mannucci et al. (1992), Blood 79:3130-3137). Die Stabilität dieser Präparate ist dadurch begrenzt.

Um die Präparate zu stabilisieren, entweder vor der Virusinakti- vierung oder um ein lagerstabiles Präparat zu erhalten, wird immer wieder betont, daß die Zugabe eines Stabilisators, wie etwa Albumin, erforderlich ist.

Alle Faktor VIII-Konzentrate, die durch Reinigung des Proteins aus humanem Plasma erhalten werden, oder in Kontakt mit biolo¬ gischem Material aus Säugetieren getreten sind, sind außerdem potentiell mit dem Risiko behaftet, mikrobiologische oder mole¬ kulare Pathogene, wie z.B. Viren, zu enthalten. Zur Herstellung eines sicheren Präparates ist daher auch immer eine Inaktivie- rung von pathogenen Organismen notwendig. Effektive Inaktivie- rungsverfahren können jedoch leicht auch zu einem Verlust der biologischen Aktivität des Faktor VIII-Komplexes führen. So stellten Palmer et al. fest (Thromb. Haemost. 63:392-402 (1990)), daß bei einer Hitzebehandlung zur effektiven Virus- inaktivierung auch in Gegenwart eines Stabilisators mit einem Aktivitätsverlust zwischen 17% und 30% zu rechnen ist.

Es wird immer wieder betont, daß Faktor VIII/vWF-Konzentrate mit einer intakten Multimerstruktur möglicherweise einen guten Ein¬ fluß auf die Blutungszeit hätten, da sie die primäre Funktion

des vWF, die Plättchenagglutination, ausführen und eine höhere Affinität zu den Plättchenrezeptoren Glykoprotein Ib und Ilb/IIIa haben als niedermolekulare vWF-Multimere (LMW-vWF) (Mannucci et al. (1987), Americ. J. Hematology 25:55-65). Es besteht jedoch die Schwierigkeit, daß während des Herstellungs- prozesses von Faktor VIII-Konzentraten ein Abbau insbesondere der HMW-vWF-Moleküle erfolgt.

Es besteht daher ein Bedarf an einem Faktor VIII-Komplex mit einer ausreichenden spezifischen Aktivität an Faktor VIII:C und vWF-Aktivität, der eine verbesserte Stabilität aufweist und der auch ohne Zugabe eines nicht-Faktor VIII/vWF-Komplex-spezifi- schen Stabilisators über einen längeren Zeitraum stabil bleibt.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen Faktor VIII/ vWF-Komplex mit einer verbesserten Stabilität zur Verfügung zu stellen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch zur Verfügungstellen eines Faktor VIII/vWF-Komplexes, der insbesondere hochmolekulare vWF-Multimere enthält und frei ist von niedermolekularen vWF- Molekülen und proteolytischen vWF-Abbauprodukten, gelöst.

Die spezifische Plättchenagglutination gibt das Verhältnis von Ristocetin Co-Faktor-Aktivität und vWF-Antigengehalt wieder. Ei¬ ne hohe spezifische Plättchenagglutinationsaktivität gibt daher die spezifische Aktivität der Multimeren an. Im Rahmen der vor¬ liegenden Erfindung konnte sowohl für plasmatischen vWF (p-vWF) als auch rekombinanten vWF (r-vWF) bzw. Faktor VIII/vWF-Komplex gezeigt werden, daß bei einem hohen Multimerisierungsgrad des vWF die spezifische Plättchenagglutination (RistCoF / vWF:Ag) wesentlich erhöht ist im Vergleich zu niedermolekularen Multi¬ meren.

Niedermolekularer p-vWF (p-vWF/LMW) und niedermolekularer r-vWF (r-vWF/LMW) besitzen nur sehr geringe Plättchenagglutination.

Diese Situation kann dadurch verdeutlicht werden, daß durch die sehr kurze vWF-Kette es zu keiner stabilen Verbindung mehrerer

Plättchen kommt. Demgegenüber können hochmolekulare (lange) vWF- Multimere mehrere Plättchen miteinander stabil verbinden.

Es wurde gezeigt, daß sowohl hochmolekularer p-vWF (p-vWF/HMW) als auch hochmolekularer r-vWF (r-vWF/HMW) in konzentrationsab¬ hängiger Weise an Plättchen binden und eine höhere spezifische Plättchenagglutinationsaktivität aufweisen als niedermolekulare vWF-Multimere.

Der erfindungsgemäße stabile Faktor VIII/vWF-Komplex besitzt da¬ her eine spezifische vWF-Plättchenagglutinationsaktivität von mindestens 50 U/mg vWF:Ag.

Im Plasma kommt Faktor VIII/vWF im Komplex in einem molaren Ver¬ hältnis von ungefähr 1:50 vor. Es wurde festgestellt, daß dieses Verhältnis im Plasma notwendig ist, um einen guten Schutz gegen proteolytischen Abbau, insbesondere durch Protein C, zu gewähren (Vlot et al. (1995), Blood 85:3150-3157).

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung besitzt der erfindungsgemäße Faktor VIII/vWF-Komplex ein molares Ver¬ hältnis von Faktor VIII zu vWF zwischen 0,01 und 100. Dies be¬ deutet, daß der Komplex ein Verhältnis von Faktor VIII-Molekülen zu vWF-Molekülen zwischen 1:100 bzw. 100:1 aufweist. Vorzugswei¬ se liegt das molare Verhältnis von Faktor VIII zu vWF zwischen 1:30 und 1:70 beträgt, besonders bevorzugt bei 1:50, wobei durch den hohen Anteil an vWF/HMW im Komplex ein optimales Verhältnis zum Schutz gegen proteolytischen Abbau erhalten wird.

Erfindungsgemäß wird weiter ein stabiler Faktor VIII/vWF-Komplex zur Verfügung gestellt, der hochmolekulare plasmatische vWF- Multimere mit einer Duplett-Struktur enthält.

Es wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß aus Plasma oder Kryopräzipitat ein durch ein chromatographisches Verfahren gereinigter Faktor VIII-Komplex erhalten wird, der aus vWF-Multimermolekülen besteht, die eine Duplettstruktur aufwei¬ sen. Dies war insbesondere deshalb überraschend, da aus Plasma oder Kryopräzipitat gereinigter vWF oder Faktor VIII/vWF-Komplex

nur mit einer Triplettstruktur der vWF-Multimeren bekannt war. Diese Triplettstrukturen entstehen durch proteolytischen Abbau von vWF-Multimeren und weisen auf eine Instabilität der vWF- Multimere hin. Von Palmer et al. (Thromb. Haemost. 63:392-402 (1990)) wurde beschrieben, daß bei der Herstellung von Faktor VIII-Konzentrat aus heparinisiertem Plasma und anschließender Virusinaktivierung das normale Triplettmuster sich verändert, und die Intensität der Triplett-Bande mit dem niedrigsten Mole¬ kulargewicht stark zunimmt, was auf einen verstärkten proteoly¬ tischen Abbau der vWF-Multimere hinweist. Im Gegensatz dazu wird bei der vorliegenden Erfindung ein Faktor VIIl/vWF zur Verfügung gestellt, dem dieses vWF-Abbauprodukt vollkommen fehlt und der im wesentlichen die 2 Banden des ursprünglichen Tripletts mit dem höheren Molekulargewicht enthält.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein sta¬ biler Faktor VIII/vWF-Komplex zur Verfügung gestellt, der hoch¬ molekulare rekombinante vWF-Multimere mit einer Singulett-Struk- tur enthält. Es wurde durch Multimeranalyse festgestellt, daß die vWF-Multimeren von rekombinantem vWF lediglich eine Singu- lettbande aufweisen, eine hohe strukturelle Integrität besitzen und frei sind von jeglichen proteolytischen vWF-Abbauprodukten. Der erfindungsgemäße Faktor VIII-Komplex, enthaltend hochmoleku¬ lare rekombinante vWF-Moleküle mit einer hohen strukturellen Integrität, ist daher sehr stabil und frei von niedermolekularen vWF-Multimeren und vWF-Abbauprodukten.

Der erfindungsgemäße stabile Faktor VIII/vWF-Komplex ist vor¬ zugsweise frei von Plasmaproteinen, insbesondere von Plasmapro- teasen, und frei von Fibrinogen und Fibronektin. Da Plasmaprote- asen und Plasmaproteine, insbesondere aktivierte Plasmaproteine, wie Protein C, Faktor Ila oder Faktor IXa, vWF oder Faktor VIII proteolytisch degradieren und der erfindungsgemäße Komplex frei von Plasmaproteinen ist, besitzt er eine erhöhte Stabilität und Integrität der Proteine im Komplex.

Der erfindungsgemäße Komplex besitzt gegen proteolytischen Abbau eine erhöhte Resistenz, wodurch er beispielsweise bei Raumtempe¬ ratur, für mindestens 48 Stunden, vorzugsweise für mindestens 6

Tage stabil ist, und in lyophilisierter Form bei 4°C oder Raum¬ temperatur mehr als 2 Jahre lagerstabil ist.

Der erfindungsgemäße Faktor VIII/vWF-Komplex ist derart stabil, daß er als virussicherer Komplex zur Verfügung gestellt werden kann. Die Virussicherheit ist durch Verfahrensschritte zur Be¬ handlung des Komplexes zur Inaktivierung von Viren bzw. Abrei- cherung von Viren gewährleistet.

Zur Inaktivierung von Viren eignet sich insbesondere eine Hitze¬ behandlung in Lösung bzw. festem, vorzugsweise lyophilisiertem Zustand, welche sowohl lipidumhüllte als auch nicht-lipidumhüll- te Viren verläßlich inaktivieren kann. Beispielsweise wird der erfindungsgemäße Komplex gemäß der EP 0 159 311 in festem, nas¬ sen Zustand hitzebehandelt. Andere Verfahren zur Virusinaktivie- rung umfassen auch die Behandlung mit Detergenzien oder chaotro- pen Substanzen, beispielsweise gemäß der EP 0 519 901, WO 94/13329, DE 44 34 538 und EP 0 131 740.

Gemäß einen weiteren Aspekt der Erfindung wird ein stabiles, vi¬ russicheres Faktor VIII-Komplex-Konzentrat, enthaltend insbeson¬ dere hochmolekulare vWF-Multimere mit hoher struktureller Inte¬ grität, zur Verfügung gestellt. Die hochmolekularen vWF-Multime- ren bestehen vorzugsweise aus einer Singulett- oder einer Dup- lett-Struktur und sind frei von niedermolekularen vWF-Multimeren und proteolytischen Abbauprodukten des vWF. Es hat sich überra¬ schenderweise gezeigt, daß das erfindungsgemäße Faktor VIII- Komplex-Konzentrat derart stabil ist, daß eine Behandlung zur Virusinaktivierung, wie etwa oben beschrieben, die Stabilität der Proteine, insbesondere der hochmolekularen vWF-Multimere im Komplex nur unwesentlich beeinträchtigt und daß dadurch die spe¬ zifische Aktivität von Faktor VIII:C und vWF-Ristocetin-Aktivi- tät im Faktor VIII-Komplex oder Faktor VIII-/Komplex-Konzentrat bei einem Virusinaktivierungsschritt nur bis zu maximal 10% her¬ abgesetzt ist. Bei bisher bekannten Faktor VIII-Komplex-Konzen¬ traten war bei der Virusinaktivierung mit einem Verlust der Aktivität zwischen 20 und 30 % zu rechnen. Der erfindungsgemäße Faktor VIII/vWF-Komplex zeigte im Neoantigentest keine Verände¬ rungen der Antigenstruktur nach dem Virusinaktivierungsschritt,

was die Stabilität der Proteine im Komplex bestätigt. Aufgrund der hohen Stabilität der hochmolekularen vWF-Multimeren ist auch eine hohe spezifische Plättchenagglutinationsaktivität von min¬ destens 50 U/mg vWF:Ag im erfindungsgemäßen Faktor VIII-Komplex- Konzentrat gewährleistet.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform enthält das erfindungsge¬ mäße stabile, virussichere Faktor VIII-Komplex-Konzentrat Faktor VIII und vwF in einem molaren Verhältnis von Faktor VIII zu vWF zwischen 0,01 und 100, vorzugsweise zwischen 0,05 und 1. Das Faktor VIII-Komplex-Konzentrat ist insbesondere frei von Plasma¬ proteinen, insbesondere von Plasmaproteasen, und frei von mikro¬ biologischen und molekularbiologischen Pathogenen.

Zur Verbesserung der Stabilität von gereinigten Proteinen werden gewöhnlicherweise Stabilisatoren, wie etwa Albumin, zugesetzt. Dabei wird jedoch durch die Zugabe des Fremdproteins die spezi¬ fische Aktivität des gereinigten Proteins herabgesetzt. vWF ist ein natürlicher Bestandteil des Faktor VIII-Komplexes. Es wurde gefunden, daß durch Zugabe von hochmolekularen vWF-Multimeren (vWF/HMW) zu einer gereinigten Faktor VIII-Fraktion aus Plasma oder aus rekombinanten Zellkulturen die Stabilität von Faktor VIII erhöht wird. Ebenso wurde gefunden, daß durch Zugabe von vWF/HMW zu einem gereinigten Faktor VIII-Komplex die Stabilität des Komplexes verbessert werden kann. Auf den Zusatz von übli¬ cherweise verwendeten Stabilisatoren kann daher verzichtet wer¬ den. In Ausnahmefällen kann gegebenenfalls auch während der Ge¬ winnung ein Proteaseinhibitor zugesetzt werden, um die intakte Struktur, insbesondere der vWF/HMW zu erhalten.

Erfindungsgemäß wird weiter eine pharmazeutische Zusammenset¬ zung, enthaltend einen erfindungsgemäßen stabilen Faktor VIII/vWF-Komplex oder ein erfindungsgemäßes virussicheres, sta¬ biles Faktor VIII-Komplex-Konzentrat, zur Verfügung gestellt.

In einer besonderen Ausführungsform enthält die pharmazeutische Zusammensetzung einen physiologisch akzeptablen Träger oder Puf¬ fer. Die Formulierung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparation kann in an sich bekannter und üblicher Weise erfol-

gen, z.B. mit Hilfe von Salzen und gegebenenfalls Aminosäuren, aber auch in Gegenwart von Tensiden vorgenommen werden. Aufgrund der oben beschriebenen hohen Stabilität des Komplexes kann auf die üblicherweise verwendeten Stabilisatoren oder Protease-Inhi- bitoren in der pharmazeutischen Zusammensetzung gegebenenfalls auch verzichtet werden.

Der erfindungsgemäße stabile Faktor VIII/vWF-Komplex wird vor¬ zugsweise als hochreines Produkt erhalten, welches durch chroma¬ tographische Reinigungsverfahren erhalten wird. Die chromatogra¬ phische Reinigung erfolgt insbesondere durch Ionenaustauschchro- matographie und/oder Affinitätschromatographie. Dafür können u.a. Materialien zum Anionenaustausch, wie synthetische Träger¬ materialien oder Träger auf Kohlehydratbasis, mit Liganden, wie DEAE, TMAE-, QAE-, Q-, oder Aminoalkylgruppen herangezogen wer¬ den, bzw. für die Affinitätschromatographie Träger mit immobili¬ sierten Substanzen, die eine spezifische Affinität für vWF auf¬ weisen. Geeignete Affinitätsmaterialien enthalten beispielsweise Heparin.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird da¬ her ein Verfahren zur Gewinnung von stabilem Faktor VIII/vWF- Komplex zur Verfügung gestellt. Dabei wird Faktor VIII/vWF-Kom¬ plex aus einer Proteinlösung bei einer niedrigen Salzkonzentra¬ tion an einen Affinitätsträger, vorzugsweise einen Heparin-Affi- nitätsträger, gebunden und stabiler Faktor VIII/vWF-Komplex bei einer hohen Salzkonzentration gewonnen. Der Komplex wird dabei vorzugsweise an immobilisiertes Heparin bei einer Salzkonzentra¬ tion von ≤ 150 mM gebunden und bei einer Salzkonzentration von > 200 mM und < 300 mM eluiert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Faktor VIII/vWF- Komplex in einem CaCl ₂ -freien Puffersystem durchgeführt. Auf diese Weise lassen sich Faktor VIIl/vWF-Komplexe, enthaltend niedermolekulare vWF-Moleküle bzw. hochmolekulare vWF-Moleküle, selektiv voneinander trennen und Faktor VIII/vWF-Komplex, ent¬ haltend insbesondere hochmolekulare vWF-Moleküle, kann bei einer höheren Salzkonzentration gewonnen werden. Für die Elution sind lösliche ein- und zweiwertige Salze verwendbar. Vorzugsweise wird NaCl verwendet. Calciumsalze sind für die Elution nicht

geeignet .

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise an einer Hepa- rin-Affinitätschromatographie-Säule durchgeführt. Für die Affi¬ nitätschromatographie kann jeder Träger, an den Heparin gebunden werden kann, verwendet werden. Als gut geeignet erwiesen sich zum Beispiel AF-Heparin Toyopearl ^® (ein synthetisches, großpori¬ ges, hydrophiles Polymer auf der Basis von Methacrylat) (Tosohaas), Heparin EMD Fraktogel ^® (ein synthetisches, hydrophi¬ les Polymer auf der Basis von Ethylenglykol, Methacrylat und Dimethylacrylat) (Merck) oder Heparin Sepharose Fast Flow® (ent¬ haltend natürliche Dextran-bzw. Agarosederivate) (Pharmacia).

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird als Puffersystem eine Puf¬ ferlösung bestehend aus Puffersubstanzen, insbesondere Tris/HCl, Phosphatpuffer oder Citratpuffer, und gegebenenfalls Salz ver¬ wendet, die vorzugsweise frei von Stabilisatoren, Aminosäuren oder anderen Zusätzen ist.

Die Affinitätschromatographie wird vorzugsweise in einem pH-Be¬ reich von 6,0 bis 8,5, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7,4 durchgeführt.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Proteinlösung, ent¬ haltend Faktor VIII/vWF-Komplex, wie etwa eine Plasmafraktion, ein Kryopräzipitat oder ein zellfreier Kulturüberstand von transformierten Zellen, eingesetzt. Die Lösung kann auch eine angereicherte Proteinfraktion eines chromatographischen Ver¬ fahrens sein.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Gewinnung des Faktor VIII/vWF-Komplexes läßt sich auf effiziente und einfache Weise ein Faktor VIII/vWF-Komplex, im wesentlichen enthaltend hoch¬ molekulare vWF-Multimere, erhalten. Nach diesem Verfahren läßt sich deshalb ein physiologisch besonders aktiver Faktor VIII/ vWF-Komplex mit guten Ausbeuten und in hoher Reinheit herstel¬ len. Der so gewonnene Faktor VIII/vWF-Komplex zeichnet sich ins¬ besondere durch eine spezifische Aktivität von Faktor VIII:C von mindestens 50 U/mg Faktor VIII:Ag und eine spezifische vWF-

Plättchenagglutinationsaktivität von mindestens 50 U/mg vWF aus und ist insbesondere frei von niedermolekularen vWF-Multimeren und vWF-Abbauprodukten.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Gewinnung von stabilem Faktor VIII/vWF-Komplex zur Verfügung gestellt, bei dem Faktor VIII/vWF-Komplex aus einer unreinen Proteinlösung an einen Anionenaustauscher gebunden und kontaminierende Plasmaproteine bei einer Salzkonzentration von < 200 mM in Anwesenheit von Calciumsalz selektiv eluiert werden. Anschließend wird Faktor VIII/vWF-Komplex vom Anionenaustauscher mit einer Salzkonzentration zwischen < 200 und < 400 mM erhal¬ ten. Dabei wird ein Faktor VIII/vWF-Komplex, im wesentlichen enthaltend hochmolekulare vWF-Multimere, gewonnen.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann als un¬ reine Proteinlösung, enthaltend Faktor VIII/vWF-Komplex, z.B. eine Plasmafraktion, ein Kryopräzipitat oder ein zellfreier Kulturüberstand von transformierten Zellen eingesetzt werden.

Die durch die Calciumsalze entfernten kontaminierenden Proteine sind insbesondere Plasmaproteine, darunter Vitamin K-abhängige Faktoren, wie z.B. Faktor II, Faktor IX, Protein C, Protein S, Plasmaproteasen wie Plasminogen, Fibronektin oder Fibrinogen. Das Entfernen der unspezifischen Proteine erfolgt insbesondere mit CaCl ₂ als Calciumsalz im Elutionsmittel in einer Konzentra¬ tion zwischen 1 mM und 15 mM, vorzugsweise von 10 mM.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß das bisher eingesetzte Verfahren der Aluminiumhydroxid-Behandlung zur Abtrennung von Vitamin K-abhängigen Proteinen, Fibrinogen oder Fibronektin nicht ausreichend ist, um diese Proteine voll¬ ständig zu entfernen. Durch die Elution in Anwesenheit von Cal- ciumchlorid wurde jedoch gewährleistet, daß diese Plasmaproteine im wesentlichen eliminiert werden und ein Plasmaprotein-freier Faktor VIII/vWF-Komplex gewonnen wird.

Die Anionenaustauschchromatographie wird vorzugsweise in einem pH-Bereich von 6,0 bis 8,5, vorzugsweise bei einem pH-Wert von

7,4, vorgenommen.

Die Elution des bei der Anionenaustauschchromatographie an den Anionenaustauscher gebundenen Faktor VIII/vWF-Komplexes erfolgt vorzugsweise durch Erhöhung der Salzkonzentration.

Als Anionenaustauscher wird vorzugsweise ein Anionenaustauscher vom quaternären Aminotyp, insbesondere ein Fraktogel mit Tenta¬ kelstruktur und insbesondere EMD-TMAE-Fraktogel verwendet.

Vorzugswelse wird Faktor VIII/vWF-Komplex an den Anionenaustau¬ scher bei einer Salzkonzentration von ≤ 200 mM gebunden und bei einer Salzkonzentration von > 270 mM, vorzugsweise bei > 350 mM, Faktor VIII/vWF-Komplex, im wesentlichen enthaltend vWF/HMW, eluiert. Als Salze sind lösliche ein- und zweiwertige Salze ein¬ setzbar, wobei NaCl bevorzugt ist.

Vorzugsweise wird der durch die Anionenaustauschchromatographie gereinigte Faktor VIII-Komplex weiterhin durch eine Affinitäts¬ chromatographie, vorzugsweise an immobilisertem Heparin, in einer Pufferlösung, bestehend aus Puffersubstanzen und gegebe¬ nenfalls Salz, chromatographisch gereinigt.

In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver¬ fahrens wird zuerst eine aus Kryopräzipitat gewonnene Faktor VIII/vWF-Komplex-haltige Fraktion an einen Anionenaustauscher gebunden und nach Abtrennen der Begleitproteine, insbesondere der Plasmaproteine, in angereicherter Form Faktor VIII/vWF-Kom¬ plex, enthaltend im wesentlichen hochmolekulare vWF-Multimere, eluiert. In einem weiteren Reinigungsschritt wird das Faktor VIII/vWF-Komplex-haltige Eluat mit einem Affinitätsträger mit kovalent gebundenem Heparin in Kontakt gebracht, wobei der Kom¬ plex an den Träger bindet. Nach Entfernen von Fremdsubstanzen und Fremdproteinen durch ein geeignetes Elutionsmittel wird der Faktor VIII-Komplex vom Affinitätsträger mittels einem ein- oder zweiwertigen Salz, vorzugsweise NaCl, in einem Puffersystem eluiert.

In einer weiteren besonderen Ausführungsform erfolgt die Durch-

führung des Verfahrens mit aus rekombinanten Zellen gewonnenem Faktor VIII/vWF-Komplex. Dazu kann ein zellfreier Kulturüber¬ stand von Zellen, die Faktor VIII und vWF koexprimieren, oder von kokultivierten Zellen, die mit Faktor VIII einerseits und mit vWF andererseits transformiert sind, verwendet werden.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung eines hoch¬ reinen stabilen Faktor VIII-Komplexes läßt sich auf einfache und effiziente Weise ein hochreiner Faktor VIII/vWF-Komplex, der frei ist von Antikörpern, frei von Plasmaproteinen, physiolo¬ gisch aktiv und frei von mikrobiologisch und molekularbiologi¬ schen Pathogenen ist, erhalten.

Der aus Plasma oder aus rekombinanten Zellen gewonnene Faktor VIII/vWF-Komplex enthält gemäß der vorliegenden Erfindung ins¬ besondere hochmolekulare vWF-Multimere, und ist frei von nieder¬ molekularen vWF-Molekülen und vWF-Abbauprodukten. Wird der Fak¬ tor VIII/vWF-Komplex aus Plasma oder Kryopräzipitat gewonnen, so bestehen die vWF/HMW insbesondere aus Duplettstrukturen mit ho¬ her Stabiliät. Aus rekombinanten Zellen gewonnener Faktor VIII/ vWF-Komplex enthält hochmolekulare vWF-Moleküle mit einer Singu- lettstruktur, hoher Stabilität und struktureller Integrität.

Mittels definierter Chromatographieschritte ist es daher gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, FVIII/vWF, frei von anderen Gerinnungsfaktoren und weiteren Plasma-Proteasen, zu gewinnen. Dies wirkt sich insbesondere auf die Reinheit und Stabilität des Präparates günstig aus. Der erfindungsgemäß erhaltene Faktor VIII/vWF-Komplex liegt daher in einer besonders reinen Form vor. Die Reinheit des Komplexes ist vorzugsweise mindestens 90%, be¬ sonders bevorzugt 95%.

Dadurch, daß der gewonnene Faktor VIII/vWF-Komplex durch den hohen Gehalt an hochmolekularen vWF-Multimeren und die Abwesen¬ heit von niedermolekularen Multimeren, vWF-Abbauprodukten, Fremdproteinen, wie z.B. Plasmaproteinen, besonders stabil ist, ist es nicht unbedingt erforderlich, Stabilisatoren zum gerei¬ nigten Produkt zuzugeben. Dadurch wird die spezifische Aktiviät des reinen Produkts z.B. bei der Formulierung der pharmazeuti-

sehen Zusammensetzung, nicht herabgesetzt und es wird vermieden, daß durch die Zugabe von Fremdproteinen gegebenenfalls Verunrei¬ nigungen oder infektiöse Partikel in das Produkt eingebracht werden.

In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen Faktor VIII/vWF-Komplexes zur Verfü¬ gung gestellt. Dabei wird einem über ein chromatographisches Verfahren gereinigten Faktor VIII oder Faktor VIII-Komplex eine gereinigte hochmolekulare Fraktion von vWF-Molekülen zugesetzt, wodurch ein Faktor VIII/vWF-Komplex mit einem molaren Verhältnis von Faktor VIII zu vWF/HMW zwischen 0,01 (entspricht 1 Faktor VIII:100 vWF) und 100 (entspricht 100 Faktor VIII:1 vWF), vor¬ zugsweise zwischen 0,03 (1:30) und 0,07 (1:70), besonders bevor¬ zugt von 0,05 (1:50) erhalten wird.

Der über ein chromatographisches Verfahren gereinigte Faktor VIII oder Faktor VIII-Komplex kann dabei aus einer Plasmafrak¬ tion, einem Kryopräzipitat oder aus einem zellfreien Zellkultur- überstand von transformierten Zellen stammen.

Die für das Verfahren zur Herstellung des stabilen Komplexes eingesetzte hochmolekulare Fraktion von vWF-Molekülen kann so¬ wohl aus Plasma, einer Plasmafraktion, einem Kryopräzipitat oder einem zellfreien Kulturüberstand von transformierten Zellen stammen. Die gereinigte hochmolekulare Fraktion von vWF-Molekü- len enthält vorzugsweise eine spezifische Plättchenagglutina- tionsaktivtät von mindestens 50 U/mg vWF:Ag, besonders bevorzugt von mindestens 80 U/mg vWF:Ag.

Zur Herstellung des stabilen Faktor VIII-Komplexes wird eine ge¬ reinigte Fraktion, enthaltend Faktor VIII oder Faktor VIlI/vWF- Komplex, mit einer gereinigten hochmolekularen Fraktion von vWF- Molekülen in einem gewünschten molaren Verhältnis gemischt. Dazu wird in den jeweiligen Fraktionen der Gehalt an vWF, Faktor VIII, die Faktor VIII-Aktivität und spezifische vWF-Aktivität bestimmt und durch Zugabe der entsprechende Menge an vWF/HMW das gewünschte Mischungsverhältnis eingestellt. Vorzugsweise erfolgt die Mischung derart, daß ein Faktor VIII/vWF-Komplex entsteht,

der ein molares Verhältnis von Faktor VIII zu vWF zwischen 1:100 und 100:1, vorzugsweise von 1:50 aufweist.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann jedoch auch ein Faktor VIII/vWF-Komplex hergestellt werden, der ein bestimmtes Verhält¬ nis von spezifischer Faktor VIII:C-Aktivität zu spezifischer vWF-Plättchenagglutinationsaktivität aufweist. Besonders bevor¬ zugt ist dabei ein Komplex, der ein Verhältnis der spezifischen Aktivitäten von 1:1 aufweist. Das gewünschte Mischungsverhältnis herzustellen, liegt dabei im allgemeinen Wissensstand eines Fachmannes.

Der gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellte stabile virussichere Faktor VIII-Komplex sowie das Faktor VIII- Komplex-Konzentrat können sowohl für die Behandlung von Hämophi¬ lie A als auch zur Behandlung des von Willebrand-Syndroms einge¬ setzt werden. Da das erfindungsgemäße Faktor VIII-Komplex-Prä¬ parat im wesentlichen hochmolekulare vWF-Moleküle enthält, eig¬ net es sich insbesondere für die Behandlung von vWD Typ II.

Aufgrund des hohen Anteils von hochmolekularen vWF-Multimeren besitzt der erfindungsgemäße Komplex auch eine sehr gute Pharmo- kinetik, da die vWF/HWM eine höhere spezifische Plättchenagglu¬ tination und Stabilität in vitro und in vivo besitzen und sowohl in vitro als auch in vivo Faktor VIII stabilisieren. Durch die Stabilität und strukturelle Integrität der vWF-Multimere im Kom¬ plex ist eine verbesserte Halbwertszeit des vWF und insbesondere auch von Faktor VIII gegeben, wodurch gegebenenfalls die Inter¬ valle einer Verabreichung des erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparates reduziert werden können. Damit wird insbesondere das Auftreten von inhibitorischen Antikörpern gegen Faktor VIII bei Hämophilie A-Patienten, z.B. durch häufige Gaben von Faktor VIII-Konzentraten, verhindert.

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele sowie der Zeichnungsfiguren näher erläutert, wobei sie jedoch nicht auf diese beschränkt ist.

Es zeigen:

Figur 1: SDS-PAGE-Analyse des vWF-Multimermusters der einzelnen Fraktionen vor und nach Anionenaustauschchromatographie.

Figur 2: Nachweis von Faktor II in einzelnen Fraktionen vor und nach Anionenaustauschchromatographie und nach Entfernen von Faktor II durch Calciumchlorid-Elution.

Figur 3: Nachweis von Protein S in einzelnen Fraktionen vor und nach Anionenaustauschchromatographie und nach Entfernen von Protein S durch Calciumchlorid-Elution.

Figur 4: Nachweis von Faktor IX in einzelnen Fraktionen vor und nach Anionenaustauschchromatographie und Entfernen von Faktor IX durch Calciumchlorid-Elution.

Figur 5: Nachweis von Plasminogen in einzelnen Fraktionen vor und nach Anionenaustauschchromatographie und Entfernen von Plasminogen durch vorangegangene Lysin-Sepharose.

Figur 6: SDS-PAGE-Analyse des vWF-Multimermusters der einzelnen Fraktionen vor und nach Heparin-Affinitätschromatographie.

Figur 7: Multimeranalyse von p-vWF und r-vWF vor und nach Hepa- rin-Affinitätschromatographie.

Figur 8: Vergleich der Bindung von r-vWF/HMW und p-vWF/HMW an Plättchen und graphische Darstellung der zugegebenen Menge an vWF und Plättchen-gebundener Menge an vWF.

Figur 9: Bindung von p-vWF/HMW und r-vWF/HMW an Plättchen und Multimeranalyse.

B e i s p i e l 1:

Reinigung von Faktor VIII/vWF-Komplex durch Anionenaustausch- chromatographie

10 g Kryopräzipitat wurden mit 70 ml Na-Acetat, pH 7,0, 160 mM NaCl und 50 U/ml Heparin bei 30°C für 10 min gelöst und bis zum vollständigen Auslösen bei Raumtemperatur für weitere 30 min in-

kubiert. Die Lösung wurde auf 15°C abgekühlt und bis zur Entfer¬ nung ungelöster Bestandteile zentrifugiert und der Überstand mit Aluminiumhydroxidgel behandelt. Die Lösung wurde an einen Frac- togel-EMD-TMAE-Anionenaustauscher gebunden und zur Entfernung von Fremdproteinen der Anionenaustauscher mit 180 mM NaCl und 200 mM NaCl gewaschen. vWF und FVIII wurden als Komplex an¬ schließend mit 400 mM NaCl eluiert. Die Faktor VIII:C- und vWF: RistoCoF-Aktivität des Ausgangsmaterials und der einzelnen Frak¬ tionen wurden bestimmt und sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.

Tabelle 1: Faktor VIII:C und vWF:RistoCoF-Aktivität des Alumi¬ niumhydroxid-Überstandes und der Fraktionen der Anionenaus- tauschchromatographie

Durch die Anionenaustauschchromatographie konnte Faktor VIII/ vWF-Komplex mit einer erhöhten vWF:RistoCoF-Aktivität erhalten werden. Zur Untersuchung des vWF-Polymermusters wurden die ein¬ zelnen Fraktionen der Anionenaustauschchromatographie über SDS- PAGE (Laemmli (1970), Nature 227:680-685) analysiert (Figur 1 B). Das Polymermuster des vWF im gereinigten Faktor VIII/vWF- Komplex zeigt ein identes Bandenmuster und damit die gleiche vWF-Polymerzusammensetzung wie im Kryopräzipitat. Die Reinigung führte daher nicht zu einem proteolytischen Abbau von hochmole¬ kularen vWF-Multimeren im Komplex.

B e i s p i e l 2:

Entfernen von Vitamin K-abhängigen Proteinen und Gewinnung von hochreinem Faktor VIII/vWF-Komplex

Ziel der Untersuchungen war es, einen FVIII/vWF-Komplex zu ge-

winnen, frei von Proteasen und anderen Gerinnungsfaktoren. Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde aufgelöstes Kryopräzipitat mit Aluminium-Hydroxid behandelt, und anschließend durch Anionen- Austauschchromatographie gereinigt. Zum Entfernen von nicht Fak¬ tor VIII/vWF-Komplex-spezifischen Proteinen wurden bei der Elu _¬ tion mit 180 mM NaCl 10 mM CaCl ₂ zugesetzt. Die Faktor VIII:C- und vWF:RistoCoF-Aktivität des Ausgangsmaterials und der einzel¬ nen Fraktionen wurden bestimmt und sind in Tabelle 2 zusammen _¬ gefaßt.

Tabelle 2 : Faktor VIII:C- und vWF:RistoCoF-Aktivität des Aus- gangsmaterials und der einzelnen Fraktionen der Anionenaus- tauschchromatographie

Die Eluate wurden mittels SDS-PAGE auf ihr vWF-Multimer-Muster untersucht (Figur IA) .

Aus der Multimer-Analyse geht hervor, daß das 400 mM-Eluat die hochmolekularen vWF-Multimere enthält, und ausgehend vom Kryo¬ präzipitat kein Verlust, insbesondere an hochmolekularen vWF- Multimeren, auftritt. Durch den Zusatz von CaCl ₂ -Ionen wird nie¬ dermolekularer vWF abgetrennt und ein Faktor VIII-Komplex, ent¬ haltend einen höheren Anteil an hochmolekularen vWF-Molekülen, erhalten (Fig. IA). Damit ist gezeigt, daß durch das Reinigungs¬ verfahren ein proteolytischer Abbau der hochmolekularen vWF-Mul- timere vermieden wird und durch Zugabe von CaCl ₂ -Ionen selektiv niedermolekulare vWF-Moleküle, wie etwa Dimere oder Tetramere, entfernt werden können, wodurch ein Faktor VIII-Komplex, im we¬ sentlichen enthaltend hochmolekulare vWF-Multimere, gewonnen wird.

Die einzelnen Reinigungsstufen, enthaltend Faktor VIII/vWF-Kom¬ plex, wurden auf die Anwesenheit von Vitamin K-abhängigen Pro¬ teinen vor und während der Anionen-Austauschchromatographie ana¬ lysiert. Dazu wurden einzelne Reinigungsstufen und die einzelnen Fraktionen über ein SDS-PAGE aufgetrennt, die Proteine auf eine Membran transferiert und mittels Westernblot-Analyse die Vitamin K-abhängigen Proteine detektiert.

a. Nachweis von Faktor II in den einzelnen Reinigungsstufen

Zum Nachweis von Faktor II in den einzelnen Fraktionen wurde polyklonales Serum gegen Faktor II (Assera Faktor II, Stago) als 1. Antikörper eingesetzt und mit alkalischer Phosphatase konju¬ giertem polyklonalen Ziegen-anti-Kaninchen-IgG-HRP-Konjugat (Fa. Bio-Rad) als 2. Antikörper und anschließendem chromogenen Test detektiert.

Aus der Figur 2 ist ersichtlich, daß Kryopräzipitat Faktor II enthält. Dieser wird trotz vorangegangener Aluminiumhydroxid- Fällung als Verunreinigung bei 400 mM NaCl (zusammen mit FVIII/ vWF) vom Anionenaustauscher eluiert (Spur E). Faktor II kann jedoch durch 10 mM CaCl ₂ selektiv eluiert werden (Spur F), und vWF/FVIII bei nachfolgender Elution mit 400 mM NaCl frei von Faktor II gewonnen werden (Spur G) .

b. Nachweis von Protein S in den einzelnen Reinigungsstufen

Zum Nachweis von Protein S in den Reinigungsstufen wurde poly¬ klonales Kaninchen-anti-Protein S-Serum (Assera Protein S, Stago) als 1. Antikörper eingesetzt und mit Ziegen-anti-Kanin¬ chen-IgG-HRP-Konjugat (Fa. Bio-Rad) als 2. Antikörper und an¬ schließendem chromogenen Test detektiert.

Figur 3 zeigt den Nachweis von Protein S in einzelnen Reini¬ gungsstufen vor und nach der Anionenaustauschchromatographie und nach Entfernen von Protein S durch Calciumchlorid-Elution.

Aus der Figur 3 ist ersichtlich, daß Protein S aus Kryopräzipi¬ tat trotz vorheriger Aluminiumhydroxid-Fällung als Verunreini-

gung bei 400 mM NaCl (zusammen mit FVIII/vWF) vom Anionenaustau¬ scher eluiert (Spur E). Protein S kann jedoch durch 10 mM CaCl ₂ selektiv eluiert werden (Spur F), und FVIII/vWF bei nachfolgen¬ der Elution mit 400 mM NaCl frei von Protein S gewonnen werden (Spur G) .

c. Nachweis von Faktor IX in den einzelnen Reinigungsstufen

Zum Nachweis von Faktor IX in den Reinigungsstufen wurde poly- klonales Kaninchen-anti-Faktor IX-Serum (Assera Faktor XI, Stago) als 1. Antikörper eingesetzt und mit Ziegen-anti-Kanin¬ chen-IgG-HRP-Konjugat (Fa. Bio-Rad) als 2. Antikörper und an¬ schließendem chromogenen Test detektiert.

Figur 4 zeigt den Nachweis von Faktor IX in einzelnen Reini¬ gungsstufen vor und nach der Anionenaustauschchromatographie und selektivem Entfernen von Faktor IX durch Calciumchlorid.

Aus der Figur 4 ist ersichtlich, daß Faktor IX trotz vorheriger Aluminiumhydroxid-Fällung als Verunreinigung bei 400 mM NaCl (zusammen mit Faktor VIII-Komplex) vom Anionenaustauscher elu¬ iert. Durch Zugabe von 10 mM CaCl ₂ wird Faktor IX jedoch selek¬ tiv eluiert (Spur D) und FVIII/vWF bei nachfolgender Elution mit 400 mM NaCl frei von Faktor IX gewonnen (Spur E) .

Beispiel 3:

Entfernen von Plasmaproteasen und Gewinnung von hochreinem

Faktor VIII/vWF-Komplex

Ziel der Untersuchungen war es, ein vWF/FVIII-Präparat zu gewin¬ nen, frei von Proteasen und anderen Gerinnungsfaktoren. Eine we¬ sentliche Verunreinigung des Kryopräzipitates stellt die Prote¬ ase Plasminogen dar. Diese findet sich auch im FVIII/vWF-Eluat (400 mM Eluat) wieder.

Zur Entfernung von Plasminogen wurde Kryopräzipitat, wie oben beschrieben, aufgelöst und mit Aluminiumhydroxidgel behandelt. Anschließend wurde der Alu-Überstand durch ein Lysin-Sepharose- gel filtriert, und davon direkt auf den Anionenaustauscher

(Fractogel EMD TMAE) aufgetragen. FVIII/vWF wurde, wie beschrie¬ ben, vom Anionenaustauscher mit 400 mM NaCl eluiert. Die Eluate vor und nach der Anionenaustauschchromatographie wurden auf Plasminogen mittels Westernblot analysiert (Figur 5) . Dazu wur¬ den die Proteine mittels SDS-PAGE gelelektrophoretisch aufge¬ trennt, auf eine Membran geblottet und Plasminogen mit einem polyklonalen Kaninchen-anti-Plasminogen-Serum (Stago) als 1. Antikörper und anschließendem chromogenen Test detektiert.

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß durch Filtration an Lysin-Sepharose die Protease Plasminogen vom vWF/FVIII selektiv abgetrennt wird.

B e i s p i e l 4: (derzeit nach Ansicht der Anmelderin der beste Weg zur Ausführung der Erfindung)

Heparin-Affinitätschromatographie von FVIII/vWF-Komplex

Für die Heparin-Affinitätschromatographie wurde Fractogel AF EMD-Heparin verwendet. Als Ausgangsmaterial diente FVIII/vWF, der durch Anionenaustauschchromatographie gemäß Beispiel 2 ge¬ reinigt wurde (400 mM Eluat). Zur Reinigung von FVIII/vWF über Affinitätschromatographie wurden 27 ml des 400 mM NaCl-Fracto- gel-Eluats 4-fach mit 81 ml Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) verdünnt und auf die Heparin-Affinitätssäule aufgetragen. Die Säule wurde zuerst mit 100 mM NaCl und anschließend zum Entfernen unspezi¬ fisch gebundener Proteine mit 160 mM NaCl gewaschen. Der Faktor VIII/vWF-Komplex wurde anschließend durch Elution der Heparin- Säule mit 300 mM NaCl erhalten. Die Faktor VIII:C- und vWF:RistoCoF-Aktivität sowie der vWF:Ag-Gehalt im Ausgangsmate¬ rial und den einzelnen Fraktionen der Anionenaustauschchromato- graphie und der Heparin-Affinitätschromatographie wurden be¬ stimmt und sind in den Tabellen 4 A und 4 B zusammengefaßt.

Tabelle 4 A: Faktor VIII:C- und vWF:RistoCoF-Aktivität des Ausgangsmaterials und der einzelnen Fraktionen vor und nach Anionenaustauschchromatographie

Tabelle 4 B: Faktor VIII:C- und vWF:RistoCoF-Aktivität des Ausgangsmaterials und der einzelnen Fraktionen vor und nach Heparin-Affinitätschromatographie

Die Eluate der Heparin-Affinitätschromatographie wurden auf vWF- Polymerzusaπunensetzung untersucht (Figur 6) .

Aus der Figur 6 ist ersichtlich, daß der hochmolekulare Anteil des vWF in der 300 mM NaCl-Fraktion erhalten wird. Diese Frak _¬ tion besitzt auch die höchste Faktor VIII:C- und vWF-Ristocetin- Cofaktoraktivität (Tabelle 4 B).

Aus der Summe der Ergebnisse ist klar erkennbar, daß sich durch die Kombination aus Anionenaustauschchromatographie und Heparin- Affinitätschromatographie sowohl vWF, FVIII, als auch deren Kom¬ plex aus Kryopräzipitat isolieren und reinigen lassen. Insbeson¬ dere mittels Heparin-Affinitätschromatographie ist es möglich, niedermolekulare vWF-Multimere und Abbauprodukte des vWF aus Kryopräzipitat abzutrennen.

B e i s p i e l 5 :

Bestimmung der spezifischen Ristocetin-CoFaktor-Aktivität von gereinigtem vWF oder vWF-Komplex

Mittels chromatographischer Methoden wurde plasmatischer vWF (p- vWF) aus humanem Kryopräzipitat und rekombinanter vWF (rvWF) aus dem Fermentationsüberstand rekombinanter CHO-Zellen isoliert und gemäß Beispiel 2 gereinigt. Durch Heparin-Affinitätschromatogra¬ phie und Elution mit unterschiedlichen Salzkonzentrationen wur¬ den Fraktionen mit unterschiedlichem Polymerisationsgrad an vWF isoliert (gemäß Beispiel 4) . Insgesamt wurden für p-vWF- und r-vWF-Fraktionen mit low-molecular-weight vWF (vWF/LMW) bei 120 mM NaCl, mit medium molecular weight (vWF/MMW) bei 230 mM NaCl und high molecular weight (vWF/HMW) bei 300 mM NaCl erhalten. Diese Fraktionen wurden auf ihren Gehalt an vWF:Ag mittels ELISA (Asserachrom vWF®, Boehringer Mannheim), an Ristocetin-Cofactor- Aktivität (vWF Reagenz, Behringwerke) , ihre Multimerstruktur mittels SDS-PAGE und ihre Plättchenbindung untersucht.

Figur 7 zeigt die vWF-Polymeranalyse von plasmatischem vWF und rekombinantem vWF.

Besonders auffällig ist, daß vor der Reinigung von plasmatischem vWF im Kryopäzipitat die vWF-Dimere, -Tetramere oder -Multimere als Triplett-Strukturen vorliegen. Diese Triplett-Strukturen sind Abbauprodukte von vWF-Multimeren und sind auf im Plasma vorkommende Protease zurückzuführen. Nach der Reinigung sind insbesondere bei der vWF-MMW und vWF-HMW-Fraktionen nur noch Multimere mit Duplett-Strukturen zu erkennen. Durch das chroma¬ tographische Verfahren werden so vWF-Multimere mit veränderter Zusammensetzung und Struktur im Vergleich zu im Plasma vorkom¬ menden vWF-Molekülen erhalten, was auf eine Abreicherung von Proteasen und niedermolekularen vWF-Abbauprodukten zurückzufüh¬ ren ist.

Gegenüber plasmatischen vWF-Multimeren ist bei rekombinantem vWF deutlich das Vorkommen nur einer Singulett-Bande in den vWF-Mul- timeren zu erkennen. Die rekombinanten vWF-Multimer-Moleküle weisen eine hohe strukturelle Integrität auf und enthalten keine

proteolytischen Abbauprodukte, im Vergleich zu den aus der Lite _¬ ratur bekannten vWF-Triplett-Strukturen des plasmatischen vWF.

Tabelle 5 und Tabelle 6 zeigen die spezifische Ristocetin-Co- factor-Aktivität (RistCoF/vWF:Ag) für p-vWF und r-vW.

Tabelle 5: Spezifische Ristocetin-Cofactor Aktivität für ver _¬ schiedene p-vWF-Fraktionen

Tabelle 6: Spezifische Ristocetin-Cofactor-Aktivität für ver¬ schiedene r-vWF-Fraktionen

Beispiel 6: Bindung von p-vWF und r-vWF an Plättchen

In einer weiteren Untersuchung wurde die Bindung von p-vWF und r-vWF an Plättchen untersucht. p-vWF/HMW bzw. r-vWF/HMW wurden mit konstanter Konzentration an Plättchen und Ristocetin inku¬ biert. Anschließend wurden die Plättchen durch Zentrifugation abgetrennt ⁽ Plättchensediment, gebundener vWF) und ein Überstand (nicht gebundener vWF) erhalten. Im Ausgangsmaterial und im Überstand wurde vWF:Ag und die Plättchen-gebundene Menge an vWF bestimmt. Als Kontrolle wurden idente Inkubationen ohne Ristoce¬ tin durchgeführt. Diese ergaben keine vWF-Plättchenbindungen. Das Verhältnis aus vWF-Konzentration im Inkubationsansatz und Plättchen-gebundenem vWF ist in Figur 8 dargestellt und zeigt im

direkten Vergleich das Bindungsverhalten von p-vWF/HMW und r- vWF/HMW. Anschließend an die Inkubationen wurden sowohl die Überstände (nicht gebundener vWF) als auch vWF im Plättchensedi¬ ment (gebundener vWF) auf Multimerzusammensetzung untersucht. Die Ergebnisse der Multimeranalyse sind in Figur 9 zusammenge¬ stellt.

B e i s p i e l 7 :

Bestimmung der Stabilität von gereinigtem Faktor VIII/vWF- Komplex

Durch Anionenaustausch- bzw. Heparin-Affiniätschromatographie erhaltene Fraktionen wurden auf die Stabilität der vWF-Multimere sowie der Faktor VIII-Aktivität untersucht. Dazu wurden die in den einzelnen Reinigungschritten erhaltenen Fraktionen bei -20°C, 4°C und Raumtemperatur für eine Zeitdauer bis zu 60 Tagen gelagert und jeweils nach 0, 1, 3, 5, 10, 15, 20, 30 und 60 Ta¬ gen Proben einer vWF-Multimeranalyse, einer Faktor VIII:C- und vWF-Ristocetin-Cofaktor-Aktivitätsbestimmung unterzogen. Die Eluate der Anionenaustauschchromatographie bzw. Heparin-Affini¬ tätschromatographie, bei denen durch Lysin-Sepharose die Plasma- protease bzw. durch Calciumchlorid-Elution die Vitamin K-abhän¬ gigen Faktoren selektiv entfernt worden waren, zeigten dabei die größte Stabilität. Das vWF-Multimermuster war in diesen Proben auch nach 30 Tagen unverändert, während in den Proben, die kei¬ ner Lysin-Sepharose-Chromatographie bzw. Calciumchlorid-Elution unterzogen worden waren, abhängig von der Zeitdauer ein Auftre¬ ten von proteolytischen vWF-Abbauprodukten zu erkennen war. Ins¬ besondere ist daher für die Erhaltung der Stabilität der hoch¬ molekularen vWF-Multimeren die Entfernung von im Ausgangsmate¬ rial vorhandenen Plasmaproteinen notwendig, da diese die Lager¬ stabilität stark beeinflußen bzw. herabsetzen.

B e i s p i e l 8:

Erhöhung der Stabilität des gereinigten Faktor VIII-Komplexes durch Zugabe von gereinigten hochmolekularen vWF-Multimeren

Zu verschiedenen durch chromatographische Reinigungsschritte erhaltenen Faktor VIII- bzw. Faktor VIII/vWF-Komplex-haltigen

Fraktionen wurden unterschiedliche Mengen an gereinigtem p-vWF/ HMW oder r-vWF/HMW zugegeben, die Mischungen bei 4°C und Raum¬ temperatur über einen Zeitraum bis zu 40 Tagen inkubiert und die vWF-Multimerzusammensetzung sowie die Faktor VIII:C- und vWF- Ristocetin-Cofaktor-Aktivität nach 0, 1, 5, 10, 20, 25, 30, 35 und 40 Tagen bestimmt. Die Stabilität der vWF-Multimere sowie die spezifische Ristocetin-CoFaktor-Aktivität war bei Eluaten, bei denen durch vorangegangene Chromatographie Plasmaproteine, insbesondere Plasmaproteasen, entfernt worden waren, am besten. Durch die Zugabe einer vWF/HMW-haltigen Fraktion zu den einzel¬ nen Faktor VIII- bzw. Faktor VIII/vWF-haltigen Fraktionen bzw. zum Ausgangsmaterial aus Kryopräzipitat konnte insbesondere in den Fraktionen, die gemäß Beispiel 7 eine geringere Stabilität aufwiesen, eine Verbesserung der Stabilität erreicht werden. Ab¬ hängig von der Zugabe der Menge an hochmolekularen vWF-Multime- ren konnte das Auftreten von proteolytischen Abbauprodukten so¬ wie eine Reduktion der spezifische Aktivität an Faktor VIII und vWF-Aktivität zeitlich hinausgezögert werden.

B e i s p i e l 9:

Virusinaktivierung von gereinigtem Faktor VIII/vWF-Komplex bzw. gereinigtem Faktor VIII/vWF-Komplex nach Zugabe von hoch¬ molekularen vWF-Multimeren und Bestimmung der Faktor VIII:C- und vWF-RistoCoF-Aktivität

Einzelne Fraktionen der chromatographischen Reinigungsschritte, sowie Fraktionen, zu denen gereinigte hochmolekulare vWF-Multi- mere bzw. Albumin zugegeben wurden, wurden einem Virusinaktivie- rungsverfahren unterzogen. Dazu wurden die Proben für 10 Stunden auf 60°C erhitzt und anschließend für 1 Stunde nochmals bei 80"C weiterinkubiert. Anschließend wurde eine vWF-Multimer-Analyse und eine Bestimmung der Aktivität der Faktor VIII:C- und spezi¬ fischen vWF-Plättchenagglutinationsaktivität durchgeführt. Es zeigte sich, daß insbesondere Proben, die nach Heparin-Affini¬ tätschromatographie einen besonders hohen Anteil an hochmoleku¬ laren vWF-Multimeren und keine niedermolekularen vWF-Abbaupro- dukte enthalten, sowie eine hohe spezifische Ristocetin-Cofak- tor-Aktivität aufwiesen, den geringsten Aktivitätsverlust an Faktor VIII und vWF zeigten. Auch bei Proben, denen zusätzlich

noch eine bestimmte Menge an gereinigten hochmolekularen vWF- Multimeren zugesetzt wurde, war der Aktivitätsverlust nach dem Inaktivierungsverfahren maximal 10%. Bei den Proben, denen Albu¬ min zugesetzt worden war, sank die spezifische Aktivität bei Zu¬ gabe des Stabilisators und dann nochmals nach dem Inaktivie¬ rungsverfahren. Dadurch konnte gezeigt werden, daß durch die An¬ wesenheit von ausschließlich vWF/HMW bzw. durch Zugabe von hoch¬ molekularen vWF-Multimeren die Stabilität der Proteine im Faktor VIII/vWF-Komplex wesentlich erhöht werden kann, ohne daß die spezifische Aktivität wesentlich reduziert wird.