La presente invención se encuadra en el campo de la medicina, en concreto, dentro de las variantes estructurales de la hemoglobina que interfieren en los métodos de determinación de los niveles de hemoglobina glicosilada en una muestra biológica y por tanto, de los métodos de obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de hemoglobina glicosilada, concretamente de la diabetes mellitus.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La hemoglobina glicosilada o HbAic es una hemoglobina en la cual la glucosa se une específicamente a la valina N-terminal de la cadena β de la hemoglobina, en un proceso no enzimático e irreversible. Esta hemoglobina es un marcador bioquímico empleado de manera rutinaria para la evaluación y control de individuos que presentan diabetes mellitus, ya que el valor obtenido tras su cuantificación se encuentra directamente relacionado con los niveles de glucemia del paciente de los últimos 3-4 meses, por lo que es de utilidad para la predicción de posibles complicaciones relacionadas con esta enfermedad, para el seguimiento del tratamiento del paciente e incluso para su diagnóstico. Sin embargo, la exactitud de los métodos de determinación del nivel de la HbAic se puede ver afectada por la presencia de variantes de la hemoglobina en el paciente estudiado.

Así, en aquellos individuos que presentan algún tipo de hemoglobinopatía, las técnicas analíticas utilizadas para la cuantificación de la HbAic suelen detectar, junto con ésta, las otras variantes de la hemoglobina (Hb) presentes en ellos cuyos valores alteran los resultados ofrecidos para la hemoglobina glicosilada. En el año 2000, se estimó que 12 millones de individuos con diabetes mellitus en todo el mundo presentaban también otras enfermedades asociadas a alteraciones en la hemoglobina.

Son muchas las variantes estructurales de la Hb que se han identificado hasta la fecha (Globin Gene Sever. HbVar: a datábase of human hemoglobin variants and thalassemias. http://globin.cse.psu.edu/cgi-bin/hbvar/counter). Entre las más comunes se encuentran la HbF y las HbS, HbE, HbC y HbD, las cuales son codificadas por la sustitución de un solo aminoácido en la cadena β (Little R. R. and Roberts W. L, 2009, Journal of Diabetes Science and Technology, 3(3): 446-451 ). Otros ejemplos de variantes de este tipo son la denominada Hb Baylor, codificada por la sustitución de una Leu por una Arg en el residuo 81 (EF5) de la β globina, o la Hb La Roche-sur- Yon, codificada por la sustitución de una Leu por una His en esa misma posición. Las técnicas empleadas en la determinación de los valores de la HbAic se han ido optimizado de manera que son capaces de detectar y corregir la interferencia que provocan los valores de estas otras variantes conocidas de la Hb con los valores obtenidos para la HbAic, lo que permite, por tanto, obtener unos valores de esta última normalizados y útiles para el diagnóstico y/o seguimiento de la diabetes mellitus. No obstante, el efecto que cada variante de la Hb produce sobre los resultados obtenidos en los métodos de determinación de la HbAic varía en función del método empleado y de la variante de la Hb, de manera que los valores de cuantificación de la HbAic resultantes pueden ser falsamente incrementados o disminuidos dependiendo de la técnica analítica empleada y del tipo de hemoglobinopatía presente en el paciente (Bry L. et al., 2001 , Clinical Chemistry, 47(2): 153-163). De entre todos los métodos usados para medir los niveles de la HbAic, los comúnmente empleados son cuatro, a saber, inmunoensayo, HPLC (de sus siglas en inglés High-Performance Liquid Chromatography), afinidad de boronato y ensayos enzimáticos. La identificación de nuevas variantes de la Hb es complicada, a no ser que éstas se manifiesten en una patología clínica, ya que la mayoría de ellas se deben a mutaciones que únicamente originan cambios en la estructura de la molécula que no conllevan manifestaciones fenotípicas. No obstante, las interferencias que las variantes de la Hb producen en los métodos de determinación de la HbAic por HPLC pueden estudiarse en el cromatograma obtenido, por lo que es importante que los usuarios de estos métodos de medida sean capaces de identificarlas para valorar si el resultado ofrecido es o no aceptable. Así, mediante la observación de los resultados ofrecidos por los métodos de medida de la HbAic, los expertos han identificado nuevas variantes de la Hb (Sacks D. B., 2003, Clinical Chemistry, 49(8): 1245-1247).

Sin embargo, existen variantes de la Hb aun desconocidas que interfieren en la exactitud de estos métodos, por lo que es necesaria su identificación para optimizar los métodos de obtención de datos útiles para determinar los valores de expresión de la HbAic en los individuos que las expresan, con el fin de mejorar así los métodos de diagnóstico y/o seguimiento de la diabetes mellitus en estos pacientes.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona una nueva variante estructural de la hemoglobina, de SEQ ID NO: 1 , de ahora en adelante "péptido de la invención", así como un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de hemoglobina glicosilada o HbAic, y más concretamente de la diabetes mellitus, en un individuo que expresa el péptido de la invención. Dicho método comprende normalizar el valor obtenido para el nivel de expresión de la hemoglobina, preferiblemente de la HbAic, en una muestra biológica aislada de un individuo en función del valor obtenido para el nivel de expresión del péptido de la invención en esa misma muestra biológica. En la presente invención, se ha aislado y caracterizado una nueva variante estructural de la Hb que es codificada por el cambio de un aminoácido apolar hidrofóbico, la Leu, por otro de las mismas características, la Phe, en la posición 81 de la β globina. Este cambio responde a una mutación (sustitución de CTC por TTC) en el codon 81 (EF5) del gen de la β globina. Así, la secuencia de aminoácidos de dicha Hb o péptido de la invención es la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de nucleótidos codificante para la SEQ ID NO: 1 es, preferiblemente, la SEQ ID NO: 2. Esta modificación no afecta a la función ni a la estabilidad del péptido de la invención con respecto a la HbA o Hb normal, aunque origina cambios estructurales que le confieren características que permiten su detección por métodos electroforéticos y cromatográficos.

Como muestran los ejemplos de la presente invención, los métodos de determinación de los niveles de la Hb (o métodos de cuantificación de la Hb), preferiblemente de la HbAic, detectan no solo ésta sino también el péptido de la invención en aquellas muestras biológicas aisladas de individuos que lo expresan. Así, los valores de expresión de este último interfieren en los valores de expresión de la primera, ofreciendo unos resultados de cuantificación de la Hb, preferiblemente de la HbAic, alterados que no se corresponden con los reales. Por ello, la presente invención proporciona un método de obtención de datos útiles, de ahora en adelante "método de la invención", para el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de Hb, preferiblemente de la HbAic, que comprende cuantificar la cantidad de péptido de la invención en una muestra biológica aislada de un individuo en la que también se ha cuantificado la cantidad de la Hb de interés, preferiblemente de la HbA^, cuyo valor se desea conocer por ser relevante para el diagnóstico y/o seguimiento de la enfermedad a estudiar. A continuación, en dicho método se normalizan los valores de expresión de esta última Hb en función de los valores de expresión del péptido de la invención. De este modo, se elimina la interferencia producida por los valores de expresión del péptido de la invención en los valores de expresión de la Hb de interés, preferiblemente la HbAic, obteniéndose así datos útiles para el correcto diagnóstico y/o seguimiento de estas enfermedades, preferiblemente de la diabetes mellitus, en los pacientes que expresan el péptido de la invención.

Por todo ello, un aspecto de la invención se refiere a un péptido aislado, o "péptido de la invención", que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 . Otro aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica para la SEQ ID NO: 1 , o a una secuencia nucleotídica complementaria a dicho polinucleótido aislado. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el polinucleótido aislado que codifica para la SEQ ID NO: 1 comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 2.

El péptido de la invención eluye junto con otras hemoglobinas, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, la HbAiC, HbAia, HbAib, Hb F, HbLAiC, Hb P3, Hb P4, Hb A0, la HbA ₂ o la Hb X, en los métodos de determinación de los niveles de expresión de las mismas, como por ejemplo, en HPLC, como muestran los ejemplos de la presente invención. Por ello, aunque dichos ejemplos se centren en la cuantificación de la HbAic por ser un dato de valor diagnóstico y/o para el seguimiento de la diabetes mellitus, éstos no pretenden ser limitativos, ya que se entiende que cuando lo que se desee cuantificar sea la cantidad de otras hemoglobinas distintas de ésta para diagnosticar y/o realizar el seguimiento de otras enfermedades que cursen con alteraciones en los niveles de las mismas, el péptido de la invención eluirá con ellas en los métodos de cuantificación, por lo que dichos métodos determinarán los valores de expresión del péptido de la invención junto con los de las otras Hb. Así, estos valores interferirán en los valores de expresión de éstas, y por tanto, habrán de tenerse en cuenta en la normalización de los resultados de expresión obtenidos para estas otras Hb distintas de la HbAic.

Por ello, otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de la invención para la obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de hemoglobina. En el contexto de la presente invención el término "hemoglobina" o "Hb" se refiere tanto a la HbA o Hb normal, la cual es una heteroproteína de la sangre, de peso molecular 64.000 Daltons (64 kD), de color rojo, que transporta el oxígeno desde los órganos respiratorios hasta los tejidos, en vertebrados y algunos invertebrados, y que está formada por cuatro cadenas polipeptídicas (globinas) a cada una de las cuales se une un grupo hemo, cuyo átomo de hierro es capaz de unirse de forma reversible al oxígeno; como a cualquier variante estructural de la Hb o derivados de la misma modificados químicamente. Ejemplos de variantes estructurales de la hemoglobina o derivados de la misma modificados químicamente son, aunque sin limitarse, la Hb glicosilada o HbAi , incluyéndose dentro de ella todas sus variantes, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, la HbAia, HbAi b o HbAic; la HbF o Hb fetal, HbLAiC, Hb P3, Hb P4, Hb A0, Hb X, la carboxihemoglobina, carbaminohemoglobina, metahemoglobina, oxihemoglobina, Hb La Roche-sur- Yon, Hb Baylor, HbS, HbE, HbC, HbD, Hb D-Punjab, Hb O-Arab, Hb G- Philadelphia, Hb Hasharon, Hb Korle-Bu, Hb Lepore, Hb M o HbA _2. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la hemoglobina es la hemoglobina glicosilada o HbAic, la cual es una hemoglobina que presenta una glucosa unida específicamente a la valina N-terminal de la cadena β de la hemoglobina.

Tal y como aparece en la presente invención, el término "enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de hemoglobina" se refiere a cualquier situación patológica en la que los niveles de Hb se encuentren aumentados o disminuidos con respecto a unos valores control tomados de una muestra de referencia procedente de un individuo sano. Así, por ejemplo, aunque sin limitarnos, los valores control de la HbA tomados de una muestra de referencia procedente de un individuo sano se encuentran entre 13,8 y 17,2 g/dl en hombres y entre 12, 1 y 15, 1 g/dl en mujeres. Los valores control de la HbAiC tomados de una muestra de referencia procedente de un individuo sano se encuentran ente un 2,2 y un 4,8% en individuos adultos y entre un 1 ,8 y un 4% en niños. Ejemplos de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de hemoglobina son, aunque sin limitarnos, anemia o, en general, cualquier tipo de hemoglobinopatía, entendiéndose por "hemoglobinopatía" el grupo de trastornos hereditarios en los cuales hay una estructura y/o producción anormal de la molécula de la hemoglobina A. Ejemplos de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de HbAic son, aunque sin limitarnos, diabetes mellitus, anemia hemolítica, enfermedades renales o pérdidas de sangre crónicas. En una realización más preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad que cursa con alteraciones en los niveles de HbAic es la diabetes mellitus.

El término "diabetes mellitus" se refiere al grupo de trastornos metabólicos que afecta a diferentes órganos y tejidos, dura toda la vida y se caracteriza por un aumento de los niveles de glucosa en la sangre (hiperglicemia) con respecto a unos valores control tomados de una muestra de referencia procedente de un individuo sano. Los valores control de los niveles de glucosa tomados de una muestra de referencia procedente de un individuo sano se encuentran entre 90 y 130 miligramos por decilitro (mg/dl) en situación de ayunas. Esta enfermedad está causada por varios trastornos, incluyendo la baja producción de la hormona insulina, secretada por las células beta pancreáticas, la ausencia o disminución significativa de la masa de células beta y/o por el aumento de la resistencia a la insulina. Los síntomas principales de la diabetes mellitus son, por ejemplo, aunque sin limitarnos, emisión excesiva de orina (poliuria), aumento anormal de la necesidad de comer (polifagia), incremento de la sed (polidipsia) o pérdida de peso sin razón aparente. Dentro de este término se incluyen los tipos de diabetes mellitus seleccionados de la lista que comprende: diabetes mellitus tipo I, diabetes mellitus tipo II, diabetes gestacional u otros tipos de diabetes mellitus. Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de hemoglobina en un individuo, o "método de la invención", que comprende: a. cuantificar la cantidad de hemoglobina en una muestra biológica aislada de un individuo,

b. cuantificar la cantidad de péptido de la invención en la muestra biológica aislada del paso (a), y

c. normalizar el valor de cuantificación obtenido en el paso (a) en función del valor de cuantificación obtenido en el paso (b).

Una "muestra biológica aislada" incluye, aunque sin limitarse, tejidos y/o fluidos biológicos de un individuo, preferiblemente humano, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin. Ejemplos de muestras biológicas aisladas que podrían ser empleadas en el método de la invención son, aunque sin limitarse, sangre, suero o plasma. Por ello, en una realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica aislada del paso (a) del método de la invención es sangre.

La cuantificación de los pasos (a) y (b) del método de la invención puede llevarse a cabo de manera simultánea o secuencial, aunque preferiblemente, se lleva a cabo de manera simultánea. Los métodos para cuantificar la cantidad de hemoglobina en el paso (a) y de péptido de la invención en el paso (b) del método de la invención en una muestra biológica aislada son conocidos en el estado de la técnica, incluyendo, por ejemplo, aunque sin limitarnos, ES-MS (de sus siglas en inglés Electrospray mass spectrometry), IEF (de sus siglas en inglés Isoelectric focusing), electroforesis o HPLC (de sus siglas en inglés High- Performance Liquid Chromatography). En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la cuantificación de los pasos (a) y (b) del método de la invención se realiza mediante HPLC.

En una realización más preferida, la normalización del paso (c) del método de la invención se realiza sumando, al valor de cuantificación obtenido en el paso (a), el valor de cuantificación obtenido en el paso (b). Así, se obtiene un valor correspondiente a la cantidad de hemoglobina del paso (a) que es útil para el diagnóstico y/o seguimiento de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de esta hemoglobina.

En otra realización preferida, la hemoglobina del paso (a) del método de la invención es la HbAic. En una realización más preferida, la enfermedad es la diabetes mellitus. La cantidad de HbAic en la muestra biológica aislada cuyo valor se obtiene con el método de la invención es de utilidad para el diagnóstico de, por ejemplo, aunque sin limitarnos, la diabetes mellitus. Por ello, cuando el valor obtenido en el paso (c) del método de la invención se encuentre entre un 2,2 y un 4,8%, se asignará al individuo del cual procede la muestra biológica aislada del paso (a) al grupo de pacientes sanos, que no presentan diabetes mellitus.

La cantidad de HbAic en la muestra biológica aislada cuyo valor se obtiene con el método de la invención es de utilidad para el seguimiento de un individuo previamente diagnosticado de, por ejemplo, aunque sin limitarnos, diabetes mellitus. Por ello, cuando el valor obtenido en el paso (c) del método de la invención se encuentre entre un 4% y un 7% se asignará al individuo previamente diagnosticado de diabetes mellitus del cual procede la muestra biológica del paso (a) al grupo de pacientes de diabetes mellitus bien controlados. Cuando el valor obtenido en el paso (c) del método de la invención se encuentre entre un 7% y un 8%, se asignará al individuo previamente diagnosticado de diabetes mellitus del cual procede la muestra biológica del paso (a) al grupo de pacientes de diabetes mellitus que requieren un mayor control. Cuando el valor obtenido en el paso (c) del método de la invención sea superior a un 8%, se asignará al individuo previamente diagnosticado de diabetes mellitus del cual procede la muestra biológica del paso (a) al grupo de pacientes de diabetes mellitus mal controlados. Se entiende por un "paciente de diabetes mellitus bien controlado" un individuo diabético que responde adecuadamente al tratamiento farmacológico y/o a la dieta a la que esta siendo sometido en el momento en el que se toma la muestra biológica empleada en el método de la invención. Por el contrario, un "paciente de diabetes mellitus mal controlado" es un individuo diabético que, o bien no esta siendo tratado para dicha patología en el momento en que se toma la muestra biológica empleada en el método de la invención, o bien no responde adecuadamente al tratamiento y/o a la dieta a la que esta siendo sometido en ese mismo momento, por lo que en ambos casos debe tomarse una decisión médica en cuanto al futuro tratamiento a administrar.

Los pasos del método de la invención pueden ser parcial o totalmente automatizados, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante un equipo bioquímico que realice la cuantificación de los pasos (a) y (b) y/o la normalización del paso (c). Además, el método de la invención puede comprender otros pasos adicionales, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, relacionados con la obtención y/o preparación de la muestra biológica aislada.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Fig. 1. Muestra el cromatograma de un paciente que expresa el péptido de la invención obtenido mediante HPLC. EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del método de la invención en la obtención de datos útiles para el diagnóstico y/o seguimiento de la diabetes mellitus en individuos que expresan el péptido de la invención. Estos ejemplos específicos que se proporcionan sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención y se incluyen solamente con fines ilustrativos, por lo que no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

EJEMPLO 1. Normalización de los valores de expresión de la HbAiC obtenidos por HPLC en presencia del péptido de la invención.

El sujeto de estudio fue un individuo varón de 61 años de edad diagnosticado de diabetes mellitus tipo I I con glucemia mal controlada. Se obtuvieron muestras de sangre de este paciente y se mezclaron con EDTA como anticoagulante. El índice de glóbulos rojos, así como las demás determinaciones hematológicas, se analizaron mediante un contador de células sanguíneas automático. Los resultados del hemograma y de la bioquímica fueron los que se muestran en las tablas 1 y 2, respectivamente.

Serie blanca Valores Unidades

Leucocitos 7,5 x10 ⁹ /l

Linfocitos 26,9 %

Linfocitos valor absoluto 2,0 x10 ⁹ /l

Monocitos 5,1 %

Monocitos valor absoluto 0,4 x10 ⁹ /l

Neutrófilos 63,7 %

Neutrófilos valor absoluto 4,8 x10 ⁹ /l

Reticulocitos 1 ,2 %

Tabla 1 . Resultados del hemograma del paciente diabético estudiado, fl:

fentolitros, pg: picogramos.

Prueba Valores Unidades Valores de

referencia

Glucosa 219 mg/dl 70-1 10

Urea 41 mg/dl 10-40

Creatinina 1 ,06 mg/dl 0,5-1 ,1

Proteasas 8,0 g/di 6,5-8

Totales

GOT 38 Ul/I 10-37

GPT 40 Ul/I 10-40

GGT 76 Ul/I 10-50

Fosfatasa 45 Ul/I 40-130 alcalina

Bilirrubina toral 0,59 mg/dl 0,10-1 ,20

Sodio 142 mEq/l 135-145

Potasio 4,3 mEq/l 3,5-4,5 Perfil Lipídico

Colesterol 138 mg/dl 150-200

Triglicéridos 105 mg/dl 70-170

Tabla 2. Resultados de la bioquímica del paciente diabético estudiado. Ul/I: unidades internacionales por litro. mEq/l: miliequivalentes por litro.

Este paciente fue también sometido a un control de hemoglobina glicosilada (HbAic) por HPLC (Turbo I I, BioRad, tiempo de elución 1 ,5 y 3 minutos). Así, en el análisis por HPLC (HPLC intercambio catiónico) de la primera muestra tomada de este paciente se midieron la HbA ₂ (2,4%) y la HbF (0%). En este mismo análisis se aisló y midió una Hb X (39,6%) que eluyó antes que la Hb A. Además, el cromatograma obtenido mostró picos anómalos: un pequeño pico después de la HbAic y un pequeño pico después de la Hb A0 que no se distinguía con claridad. Por ello, se analizó una nueva muestra procedente del mismo paciente para descartar que dichos picos se trataran de artefactos.

En el nuevo análisis que se realizó con la muestra recién extraída del paciente se observó un pico posterior a la HbA^ muy unido a ella, no conocido y que habitualmente no se observa, así como un pico delante de Hb AO que tuvo que ser ampliado para poder observarse bien. El pico desconocido no se identificaba con ninguna hemoglobinopatía conocida en los aparatos de BioRad y no se observaba mediante el diagnóstico realizado con la tecnología Menarini. Los resultados de las Hb detectadas en este análisis se muestran en la taba 3 y en la figura 1 .

Hb Area Area Tiempo Area pico correspondiente al calibrada (%) (%) retención

pico (min)

HbAia — 0,9 0,21 26.613

HbAib — 1 ,6 0,35 46.994

HbF — 0,3 0,59 9.334

HbLAiC — 1 ,2 0,77 36.882 HbAiC 6,4 — 1 ,01 1 17.391

Desconocida — 2,6 1 ,28 77.769

HbP3 — 2,0 1 ,53 59.741

HbP4 — 4,4 1 ,62 130.791

HbAO — 83,1 1 ,79 2.484.957

Area total: 2.990.472

Tabla 3. Resultados de las Hb detectadas mediante HPLC en el paciente diabético estudiado. La HbAic se analizó también por otras técnicas que se estaban evaluando por el Point of Care, es decir, por afinidad de boronato y por inmunoensayo, las cuales no presentaban este tipo de interferencias, lo que ofreció un resultado de un 8,1 % por afinidad de boronato (DCA, Siemens) y un 8,4% por inmunoensayo (Afinitiun, IZASA) para dicha hemoglobina. Sin embargo, por el método de HPLC 3 min, el resultado para la HbAiC era de un 6,4% (con una glucemia en el paciente de alrededor de 220 mg/dl), lo que se encontraba fuera de los rangos esperados. La suma del área de los dos picos mostrados en el cromatograma (el pico desconocido correspondiente al péptido de la invención y el pico correspondiente a la HbAic) resultaba en un valor muy similar al ofrecido por la determinación por afindad de boronato y por inmunoensayo (6,4% + 2,6% = 9%).

EJEMPLO 2. Caracterización estructural y funcional del péptido de la invención.

Un estudio de HPLC en fase reversa (Separations, Group, Hesperia, EEUU) reveló la presencia de una cadena β globina anormal que fluía por delante de la cadena β ^Α (β ^χ , β ^Α y α ^Α ). La estabilidad de la nueva hemoglobina, medida mediante un test de isopropanol, era normal y los estudios de unión de oxígeno (Hemox Analyzer) mostraron afinidad normal por el oxígeno de toda la sangre (P ₅₀ de 25 mmHg). Para la caracterización molecular de esta nueva variante de la hemoglobina, el ADN genómico de los leucocitos se extrajo automáticamente con Bio-Robot EZ1 (Quiagen). La amplificación selectiva del gen β se llevó a cabo por PCR mediante Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler. Posteriormente, se llevó a cabo la secuenciación de este gen en ambas direcciones en un secuenciador automático (3.77 ABI, Applied Biosystems, CA), lo que mostró una sustitución de CTC por 7TC en el codon 81 . Esta mutación producía un cambio de una Leu por una Phe en la posición 81 de la β globina.

Ni la función ni la estabilidad de esta nueva variante de la hemoglobina se encontraba alterada, ya que la mutación que la codifica consiste en el cambio de un aminoácido apolar hidrofóbico (Leu) por otro de las mismas características (Phe), en la posición 5 de la hélice EF (esta posición en 3D corresponde al sitio de unión del 2,3-DPG).