Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft substituierte Adenosin-3' ,5'-phosphorsäurebenzyl- triester, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen ent¬ haltende Arzneimittel.

Stand der Technik

Bekannt sind Adenosin-3' ,5'-phosphorsäurebenzyTester (cAMP-Benzylester, Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 310, 103-111 [1979]) und 8-sub- stituierte cAMP-Derivate (J.Med.Chem. 1980, 23 242-251). Bekannt sind auch deren positiv inotrope Wirkungen an iso iertem Meerschweinchen- Myokard. Es hat sich jedoch bei diesen Verbindungen gezeigt, daß sie ihre Wirkungen erst bei relativ hohen Konzentrationen zeigen, d.h. im milli olaren Bereich, was für die systemische Anwendung häufig beVeits uninteressant ist. In einigen Fällen zeigten sich auch negative Neben- Wirkungen, so wurden beispielsweise beim Dibutyryl-cAMP anfangs ne¬ gativ inotrope Wirkungen festgestellt.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, neue Stoffe zu finden, die in gerin¬ gerer Konzentration die erwünschte Wirkung zeigen und möglichst frei von Neberw rkimgen sind.

Beschreibung der Erfindung

Gegenstand der Erfindung sind substituierte Adenosin-3 ¹ ,5'-phosphorsäure- benzyltriester der allgemeinen Formel

wobei

1 3 3

R die Bedeutung Halogen, SR , worin R einen geradkettigen oder ver¬ Hydroxy oder oder Nitro substituiert sein kann, substituiert sein können, einen C ₄ -Cy-Cyclo- alkylrest, Phenyl oder Naphthyl , die mit Halogen, Methyl, Ethyl, i Methoxy oder Ethoxy ringsubstituiert sein können, bedeutet, SeR , worin R einen geradkettigen oder verzweigten C.-Cς-Alkylrest, oder

Benzyl , das mit Halogen, Methyl, Ethyl, Methoxy, Ethoxy oder Nitro ringsubstituiert sein kann, bedeutet, oder NR R , worin R und R ,

3 die gleich oder verschieden sind, Wasserstoff oder R bedeuten, oder zusammen mit dem Stickstoffatom einen Piperidino- oder Morpholino- rest darstellen, und "i> R" die Bedeutung Phenyl, das durch elektronenl efernde oder elektro- πεnzieha-τde Gruppen substituiert sein kann, haben.

Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind substituierte Adenosin-3' ,5'' ρi-ιüsphcrsäurebenzyltriester der allgemeinen Formel I ¹

wobei ! R ¹ ' die Bedeutung Chlor, Brom, Iod, Methylthio, Ethylthio, t-Butylthio, Cyclohexylthio, Benzylthio, wobei die Phenylgruppe durch Halogen, Methyl oder Ethyl onosubstituiert sein kann, Phenylthio, wobei die Phenylgruppe durch Halogen, Methyl oder Ethyl monosubstituiert sein kann, Benzylseieno, wobei die Phenylgruppe durch Halogen, Methyl

C I c t e t C I oder Ethyl monosubstituiert sein kann, NR R , wobei R , R gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Benzyl be¬ deuten, und R die Bedeutung Phenyl, wobei die Phenylgruppe durch Halogen,

haben .

Ein besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind substituierte Adenosin-3 ¹ ,5'-phosphorsäurebenzyltriester der allgemeinen Formel I"

wobei «1" die Bedeutung BroiT Methylthio, t-Butylthio, Cyclohexylthio, Benzyl- thio, p-C orphenylthio, Benzylseleno, Benzylamino, Benzylmethylami- no, und

2"

R die Bedeutung Phenyl, p-Cyanophenyl und p-Methylphenyl haben.

Bevorrϊi'gte Verbindungen sind:

8-Brom-adenosin-3' ,5'-monophosphorsäurebenzylester; 8-Methylthio-adenosin-3' ,5'-monophosphorsäurebenzylester; 8-(4-Chlor-phenylthio)-adenosin-3' ,5'-monophosphorsäurebenzylester 8-Cyclohexylthio-adenosin-3' _s 5'-monophosphorsäurebenzylester 8-t-Butylthio-adenosin-3 ^l ,5'-monophosphorsäurebenzylester; 8-Benzylaraino-adenosin-3' ,5'-monophosphorsäurebenzylester; 8-N-Benzyl-N-methylamino-adenosin~3' ,5'-monophosphorsäurebenzylester und 8-Benzylseleno-adenosin-3' ,5'-monophosphorsäurebenzylester;

Die erfindungsgemäßεn Verbindungen werden hergestellt, indem die entspre¬ chenden in 8-Stellung substituierten Adenosin-3 ¹ ,5'-monophosphorsäuren nach dem in J.Med.Che . 1977, 20, 907-911 angegebenen Verfahren mit den entsprechenden Diazomethanen vεrestert werden. Die in 8-Stellung substi- tuierten Adenosin-3' ,5'-monophosphorsäuren werden durch Halogenierung, vorzugsweise Bromierung, von Adenosin-3' ,5'-monophosphorsäure zu 8-Halo- gen-, vorzugsweise δ-Brom-adenosin-3' ,5'-monophosphorsäure hergestellt

und gegebenenfalls durch nucleophile Substitution des Halogenatoms ana¬ log zu dem in Bioche istry J_0, 2390 (1971) angegebenen Verfahren in die erfindungsgemäßen Verbindungen überführt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß

1 1 ' eine Verbindung der allgemeinen Formel 8-R -cAMP, 8-R -cAMP bzw.

1" 1 1' 1"

8-R -cAMP, worin R , R bzw. R die oben angegebenen Bedeutungen haben und cAMP Adenosin-3' ,5'-monophosphorsäure bedeutet, mit einem Diazome- thanderivat der allgemeinen Formel R ² CHN ₂ ,, RR ² 'CCHHNN ₂ bbzzww.. RR ² "CCHHNN ₂ ,, worin

2 2' 2" R , R bzw. R die oben angegebenen Bedeutungen haben, verestert wird.

Als besonders vorteilhaft hat es sich dabei erwiesen, die Veresterung ^• in Hexamethylphosphorsäuretriamid (HMPT) durchzuführen, zum einen wegen einer guten Löslichkeit in diesem Lösungsmittel, zum anderen, weil da¬ rin das eingesetzte Diazomethan besonders stabil ist, und schließlich, weil in diesem System gute Ausbeuten erzielt werden. Die Veresterung in HMPT ist daher bevorzugt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen fallen dabei als Gemische an, deren beide Komponenten sich dadurch unterscheiden, daß die Estergruppe im Dioxaphosphorinanring einmal axial und einmal equatorial ausgerichtet ist. Um dies anzudeuten, ist in den allgemeinen Formeln 1, 1' und I" die Bindung zwischen dem Phosphoratom und dem Sauerstoffatom der Benzyl- oxygruppe als Wellenlinie dargestellt. Die Trennung der Diasterecmeren ist auf chromatographischerπ Weg ohne weiteres möglich. Da sich die Dia- stereomeren in ihrer pharmakologisehen Wirksamkeit nicht merklich unter¬ scheiden, ist eine Auftrennung für die Verwendung als Arzneimittel nicht erforderlich.

Schließlich sind Gegenstand der Erfindung Arzneimittel, die sich durch einen Gehalt an einer oder mehreren der erfindungsgemäßen Verbindungen auszeichnen sowie die Anwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen in der Behandlung von Erkrankungen des Herzens und/oder des Respirations¬ traktes ^, überraschenderweise wurde ferner gefunden, daß Arzneimittel,

die außerdem eine Phosphodiesterase hemmende Substanz enthalten, eine potenzierte Wirkung zeigen, die etwa beim 30- bis 40-fachen der Arz¬ neimittel ohne diese zusätzliche Substanz liegt. Vorzugsweise wird als solche Substanz 1-Methyl-3-isobutylxanthin, Theophyllin und/oder Papaverin eingesetzt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher Arzneimittel, die ne¬ ben einer oder mehreren erfindungsgemäßen Verbindungen eine die Phospho¬ diesterase nehmende Substanz, vorzugsweise 1-Methyl-3-isobutylxanthin, Theophyllin und/oder Papaverin enthalten.

Oτe Arzneimittel werden nach an sich bekannten Verfahren hergestellt, wobei die neuen Verbindungen bzw. deren Kombinationen mit Phosphodi- esterasehemmern als solche oder gegebenenfalls in Kombination mit ge- eigneten pharmazeutischen Trägerstoffen eingesetzt werden. Enthalten die neuen pharmazeutischen Zubereitungen nebenden Wirkstoffen pharma¬ zeutische Trägerstoffe, beträgt der Wirkstoffgehalt dieser Mischungen 0,5 bis 95, vorzugsweise 15 bis 75 Gewischtsprozent der Gesamtmischung.

In Übereinstimmung mit der Erfindung werden die Wirkstoffein jeder ge¬ eigneten FαrauT erung angewandt unter der Voraussetzung, daß die Aus¬ bildung b . Aufrechterhaltung von ausreichenden Wirkstoffspiegeln ge- «ä-τrleistet ist. Das kann beispielsweise durch orale, rektale oder parente-rale. Gabe in geeigneten Dosen erreicht werden, üblicherweise liegt die pharmazeutische Zubereitung des Wirkstoffs in Form von Ein¬ heitsdosen vor, die auf die gewünschte Verabreichung abgestimmt sind. Eine Einheitsdosis kann zum Beispiel eine Tablette, ein Dragee, eine' Kapsel, ein Suppositorium oder eine gemessene Volumenmenge eines Pul¬ vers, eines Granulats, einer Lösung, einer Emulsion oder einer Suspension sein.

Unter "Einheitsdosis" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird eine phy¬ sikalisch bestimmte Einheit, die eine individuelle Menge des aktiven Be¬ standteils in Kombination mit einem pharmazeutischen Trägerstoff enthält, verstanden, deren Wirkstoffgehalt einem Bruchteil oder Vielfachen einer therapeutischen Einzeldosis entspricht. Eine Einzeldosis enthält vorzugs-

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weise die Menge Wirkstoff, die bei einer Applikation verabreicht wird und die gewöhnlich einer ganzen, einer halben, einer drittel oder einer viertel Tagesdosis entspricht. Wenn für eine einzelne therapeutische Verabreichung nur ein Bruchteil, wie die Hälfte oder ein Viertel, der Einheitsdosis benötigt wird, ist die Einheitsdosis vorteilhafterweise teilbar, z.B. in Form einer Tablette mit Bruchkerbe.

Die pharmazeutischen Zubereitungen gemäß der Erfindung können, wenn sie in Einheitsdosen vorliegen und für die App-l Ration z.B. am Men- sehen bestimmt sind, etwa 10 bis 500 mg, vorte lhafterweise 50 bis - 300 mg und insbesondere 100 bis 300 mg Wirkstoff enthalten. Parente- ra Zubereitungen können etwa 2 bis 40 mg, vortei hafterweise 4 bis. 30 mg und insbesondere 10 bis 25 mg Wirkstoff enthalten.

Im allgemeinen hat es sich in der Humanmedizin als vorteilhaft erwie¬ sen, den eder die Wirkstoffe bei oraler Gabe in einer Tagesdosis von 0,05 bis 5, vorzugsweise 0,5 bis 5, insbesondere 1 bis 3 mg/kg Körper¬ gewicht, gegebenenfalls in Form mehrerer, vorzugsweise 1 bis 3 Einzel¬ gaben zur Erzielung der gewünschten Ergebnisse zu verabreichen. Eine Einzelgabe enthält den oder die Wirkstoffe in Mengen von 0,05 bis 3, vorzugsweise 0,1 bis 3, insbesondere 0,5 bis 2 mg/kg Körpergewicht. Tür die bevorzugte inhalative Verabreichung hat es sich als vorteil¬ haft erwiesen, den oder die Wirkstoffe in einer Tagesdosis von 0,5 bis 10 mg, vorzugsweise 1 bis 8 mg, insbesondere 2 bis 5 mg, gegebenen- falls in Form mehrerer, vorzugsweise 1 bis 3 Einzelgaben zu verabrei¬ chen.

Zubereitungen für die intravenöse Verabreichung sind vor allem für die Notfallbehandlung zweckmäßig.

Die therapeutische Verabreichung der pharmazeutischen Zubereitung kann 1 bis 4 mal am Tage zu festgelegten oder variierenden Zeitpunkten erfol¬ gen, z.B. jeweils vor den Mahlzeiten und/oder am Abend. Es kann jedoch erforderlich sein, von den genannten Dosierungen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von der Art, dem Körpergewicht und dem Alter des -zu behan¬ delnden Individuums, der Art und Schwere der Erkrankung, der Art der Zu¬ bereitung und der Applikation des Arzneimittels sowie dem Zeitraum bzw. Intervall, innerhalb welchem die Verabreichung erfolgt. So kann es^fl^Ul

einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der oben genannten Menge Wirkstoff auszukommen, während in anderen Fällen die oben angefüh te Wirkstoffmenge überschritten werden muß. Bei akuten Fällen wird zu Beginn der Behandlung eine höhere Dosis verabreicht. Nach Eintreten der gewünschten Wirkung wird auf eine niedrigere ^" Dosis zurückgegangen.

Die Festlegung der jeweils erforderlichen optimalen Dosierung und App¬ likationsart der Wirkstoffe kann durch jeden Fachmann aufgrund seines Fachwissens leicht erfolgen.

Die pharmazeutischen Zubereitungen bestehen in der Regel aus den erfin¬ dungsgemäßen Wirkstoffen, gewünschtenfalls in Kombination mit Phospho- diesterasehemmern, und nichttoxischen, pharmazeutisch verträglichen Arz¬ neimittelträgem, die als Zumischung oder Verdünnungsmittel in fester, halbfester oder flüssiger Form oder als Umhünungsmittel, beispielswei¬ se in Fonrx einer Kapsel, eines Tablettenüberzugs, eines Beutels oder eines anderen Behältnisses, für den therapeutisch aktiven Bestandteil in Anwendung kommen. Ein Trägerstoff kann z.B. a s Vermittler für die Arz¬ neimittelaufnähme durch den Körper, als Formulierungshilfsmittel, als S ^' üßungsmittel _ft als Geschmackskorrigens, als Farbstoff oder als Konser¬ vierungsmittel dienen.

Zur oralem, Anwendung können z.B. Tabletten, Dragees, harte und weiche Kapseln, z.B. aus Gelatine, dispergierbare Pulver, Granulate, .wäßri- ge und ölige Suspensionen, Emulsionen, Lösungen oder Sirupe kommen.

Tabletten können inerte Verdünnungsmittel, z.B. Calciumcarbonat, Cal- ciumphosphat, Natriumphosphat oder Lactose; Granulierungs- und Vertei- luπgs ittel, z.B. Maisstärke oder Alginate; Bindemittel, z.B. Stärke, Gelatine oder Akaziengummi; und Gleitmittel, z.B. Aluminium- oder Magne- siumstearat, Talkum oder Silikonöl, enthalten. Sie können zusätzlich mit einem Überzug versehen sein, der auch so beschaffen sein kann, daß er eine verzögerte Auflösung und Resorption des Arzneimittels im Gastroin- testinaltrakt bewirkt, so daß z.B. eine bessere Verträglichkeit, Pro- trahierung oder eine Retardierung erreicht wird. Gelatinekapseln können den Arzneistoff vermischt mit einem festen, z.B. Calciumcarbonat oder Kaolin, oder einem öligen, z.B. Oliven-, Erdnuß- oder Paraffinöl , Ver¬ dünnungsmittel enthalten.

Wäßrige Suspensionen, die gegebenenfalls kurzfristig zubereitet werden, können Suspendiermittel, z.B. Nat iumcarboxymethylcellulose, Methylcel- lulose, Hydroxypropylcellulose, Natriu alginat, Polyvinylpyrrolidon Traganthgum i oder Akaziengummi; Dispergier- und Benetzungsmittel, z.B. Polyoxyethylenstearat, Heptadecaethylenoxycetanol , Polyoxyethylensorbi- tolmonooleat, Polyoxyethylensorbitanmonooleat oder Lecithin; Konservie¬ rungsmittel, z.B. Methyl- oder Propylhydroxybenzσate; Geschmacksmittel; Süßungsmittel, z.B. Saccharose, Lactose, Natriumcyclamat, Dextrose, In- vertzuckersirup, enthalten.

10 ölige Suspensionen können z.B. Erdnuß-, Ol ven-, Sesam-, Kokos- oder Pa- raffinö ^' l und Verdickungsmittel , wie z.B. Bienenwachs, Hartparaffin oder Cetylalkohol , enthalten; ferner Süßungsmittel , Geschmacksmittel und Antioxidantien.

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In Wasser dispergierbare Pulver und Granulate können die Arzneistoffe in Mischung mit Dispergier-, Benetzungs- und Suspendiermitteln, z.B. den oben genannte, sowie mit Süßungsmitteln, Geschmacksmitteln und Farbstof¬ fen enthalten.

Zu

Eriülsfonen können z.B. Oliven-, ErdnuQ- oder Paraffinöl neben Emulgier- ßrittelπ, wie z.B. Akaziengummi, Traganthgummi, Phosphatiden, Sorbitan- cnooleat, Polyoxyethylensorbitanmonooleat, und Süßungs- und Geschmacks¬ mitteln enthalten.

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Zur rektalen Anwendung der Arzneistoffe we den Suppositorien verwendet, die mit Hilfe von bei Rektalte peratur schmelzenden Bindemitteln, bei¬ spielsweise Kakaobutter oder Polyethylenglykol , hergestellt werden.

30 Zur parenteralen Anwendung der Arzneistoffe dienen steril injizierbare, gegebenenfalls kurzfristig herzustellende, wäßrige Suspensionen, isoto¬ nische Salzlösungen oder sonstige Lösungen, die Dispergier- oder Benet¬ zungsmittel und/oder pharmakologiseh verträgliche Verdünnungsmittel, z.B. Propylen- oder Butylenglykol , enthalten. 5

Die orale Anwendung der Arzneistoffe ist bevorzugt.

Bevorzugt ist auch die inhalative Applikation der erfindungsgemäßen Ver¬ bindungen. Diese werden entweder direkt als Pulver oder durch Vernebeln von die erfindungsgemäßen Verbindungen enthaltenden Lösungen oder Suspen¬ sionen verabreicht. Die Verneblung kann dabei auf herkömmliche Weise, beispielsweise durch Preßluftvernebler oder Ultraschallvernebler, erfol¬ gen. Besonders vorteilhaft ist die Verabreichung aus Sprühdosen, insbe¬ sondere solcher mit einem herkömmlichen Dosierventil (Dosier-Aerosole). Mittels Dosier-Aerosolen ist es möglich, pro Sprühstoß eine definierte Menge an Wirkstoff bereitzustellen. Von besonderem Vorteil sind hier so- genannte Synchron-Inhalatoren, womit die Wirkstoffabgäbe synchron zur Einatmung geschehen kann. Geeignete Synchron-Inhalationsvorrichtungen sind z.B. in dar DE-PS 1945257, DE-PS 19 17911 und DE-OS 20 55 734 offenbart.

Für Inhalationszwecke kommen die Wirkstoffe vorzugsweise in mikronisier- ter Form zum Einsatz, wobei Teilchengrößen von weniger als 10um vorteil¬ haft sind. Zur Applikation aus Sprühdosen werden die Wirkstoffe in üb¬ lichen Treibmitteln dispergiert, vorzugsweise unter Zuhilfenahme eines Dispergiermittels. Als Treibmittel kommen insbesondere Gemische von Tri- chlorfluoπnethan (Frigen ^® 11) und Dichlordifluormethan (Frigen®12) in Fra¬ ge» wobei Trichlorfluormethan ganz oder teilweise durch 1 ,1 ,2-Trichlor- trifluor ethan (Frigen ^® 113) ersetzt werden kann. Als Dispergiermittel kommen insbesondere die für diese Zwecke gebräuchlichen Sorbitanester (Spane ^® der Firma Atlas GmbH) und Lecithin in Frage. Das Dispergiermittel wird in der gekühlt vorgelegten schwerer flüchtigen Treibmittelkomponen- te gelöst. In die Lösung wird der mikronisierte Wirkstoff bzw. werden die mikroπisierten Wirkstoffe eingerührt. Die Dispersion wird in Sprühbüch¬ sen eingefüllt. Nach dem Vercrimpen wird die leichter flüchtige Treib¬ mittelkomponente aufgedrückt.

Der _. oder die Wirkstoffe können gegebenenfalls mit einem oder mehreren der angegebenen Träger- oder Zusatzstoffe auch in ikroverkapselter Form formuliert werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigten am isolierten Meerschweinchen- Myokard positiv inotrope Wirkung bei nicht vorhandener positiv chronotro- per oder sogar negativ chronotroper Wirkung; beides ist erwünscht für eine die Herzkraft selektiv steigernde Substanz.

Ferner wurde beobachtet, daß nach Verabreichung der erfindungsgemäßen Ver¬ bindungen eine Erschlaffung der glatten Muskulatur des Respirationstrak¬ tes eintrat, was für Substanzen für die Behandlung von Asthmaanfällen er¬ wünscht ist. Schließlich macht die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbin- düngen auf die glatte Muskulatur der Blutgefäße sie zur Regulation des Blutdrucks geeignet.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter veranschaulicht, ohne sie hierauf zu beschränken.

B e i s p i e l e

1. 8-Brom-adenosin-3' ,5'-monophosphorsäurebenzylester (Verbindung 1 ) a) 8-Bromadenosin-3' ,5'-cyclophosphorsäure

1,32 g (4,00 Mol) Adenosin-3' ,5'-cyclophosphorsäure (cAMP) werden in 2 ml 2n NaOH gelöst. Man verdünnt die sirupöse Lösung mit 25 ml eines 1n Natriumacetatpuffers (pH 3,9), gibt unter Rühren 880 mg (5,5 mMol) Brom in 35 ml des gleichen Puffers zu und rührt über Nacht. Anschlies- send wird der entstandene Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewa¬ schen, bis das Waschwasser farblos ist, dann mit Äceton und Ether nach¬ gewaschen. Die 1,17 g (71 %) Rohprodukt werden zur weiteren Umsetzung verwendet.

UV-Spektrum (Wasser, pH 1): λ _ma ax _γ (lg£) = 253 nm (4,18)

b) 8-Bromadenosin-3',5'-monophosphorsäurebenzyltriester 816 -mg (2,00 mMol) 8-Bromadenosin-3' ,5'-phosphorsäure werden in 20 ml Hexamethylphosphorsäuretriamid suspendiert (Ultraschallbad). Dazu wird eine etherische Lösung von Phenyldiazomethan, hergestellt aus 4,5 g N- Nitroso-N'-nitro-N-benzylguanidin (20 mMol ) _t gegeben und bei Raumtempe¬ ratur unter Lichtausschluß gerührt. Wenn das Edukt in Lösung gegangen und seine Anwesenheit dünnschichtchromatographisch nicht mehr nachzuwei¬ sen ist, wird aufgearbeitet. Nach Abziehen des Lösungsmittels im Vakuum wird der Rückstand auf eine Kieselgelsäule gegeben, und die farbigen Nebenprodukte werden mit Methylenchlorid eluiert. Die Substanzzone wird . mit Methylenchlorid/Methanol 10:1 bis 5:1 eluiert. Ausbeute: 717 mg (72 %) .

Das entstandene Diastereomerengemisch (ax:äq = 60:40) des axialen und . äquatorialen Esters kann dünnschichtchromatographisch auf Kieselgel ge¬ trennt werden, Laufmittel ist Methylenchlorid/Methanol 10:1. Diese Tren¬ nung ist zwar zur Charkaterisierung der Einzelverbindungen angebracht, 5 jedoch für die pharmakologische Verwendung nicht erforderlich.

Rfa,x _« = 0,60, Rf.a.q = 0,41; weitere charakterisierende Daten sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt.

2. 8-Benzylthioadenosin-3' ,5'-monophosphorsäurebenzyltriester tθ (Verbindung 3) aj 8-Beflzylthioadenosin-3' ,5'-phosphorsäure

408 mg (1,0 mMol) 8-Bromadenosin-3' ,5'-phosphorsäure werden in 20 ml E ^' önanol , das 0,1 mMol Natriu ethylat enthält, unter Schutzgas (N ₂ ) vor¬ gelegt und dazu gleichzeitig 20 ml einer 0,25 n Natriumethylat-Lösung f5 und 1,4 ml Benzylthio! gegeben. Anschließend wird 5 Stunden unter Rückfluß gekocht. Danach zieht man das Lösungsmittel ab, säuert mit 1n HC1 an und entfernt überschüssiges Mercaptan im Vakuum. Eventuell ge¬ bildetes Disulfid wird ausgeethert. Der verbleibende Rückstand wird in 1n Ammoniak gelöst, nochmals mit Ether extrahiert und das Produkt durch 0 Einstellen des pH auf 1 mit 2n HC1 gefällt. Ausbeute 250 mg (58%). UV-Spektrum (H m _? -~θ pK T): λ _m iTlU _av (log ε) 282 (4,30)

b) S-genzylthioadenosin-3' ,5'-monophosphorsäurebenzyltriester

3GQ. rag (0,66 mMol) 8-Benzylthio-cAMP werden in 15 ml trockenem Aceton 5 suspendiert, dazu gibt man eine etherische Phenyldiazomethanlösung (aus 3,2 g N-Nitroso-N'-nitro-N-benzylguanidin). Durch mehrmaliges Einengen und Zugeben von Aceton entfernt man den Ether möglichst vollständig. Die rote Lösung wird im Dunkeln bei Raumtemperatur 2 Tage gerührt und dann durch Abziehen des Lösungsmittels, Chromatographie auf einer Kie- sεlgelsäule mit Methylεnchlorid als Eluens aufgearbeitet. Die Substanz wird mit Methylenchlorid/Methanol 6:1 εluiert. Ausbeute 220 mg (61 %), Diastereomerengemisch. Die Ausbeute bei der Verwendung von Hexa ethyl- phosphorsäurεtriamid als Lösungsmittel beträgt 74 %.

Für die Charakterisierung der Substanz wurde das Diastereomerengemisch dünnschichtchromatographisch getrennt, was für die pharmakologische Ak¬ tivität (da additiv) jedoch nicht vonnöten ist.

OM I

Laufmittel CH ₂ Cl ₂ /Me0H 10:1. Verhältnis axial: äquatorial 54:46. R^-Werte in Methylenchlorid/Methanol (10:1): Rf Qλ = 0,74; Rf. a.q = 0,61.

Weitere physikalische Daten finden sich in der folgenden Tabelle I, die auch zusätzliche beispielhaft hergestellte erfindungsgemäße Verbindungen und deren physikalische Daten enthält. Dabei bedeutet P den Verteilungs- koeffi-ienten Ocfnol/Puff«-. pH 7.4: P . [*ffgffi % ggaπol ^

Tabelle I Erfindungsgemäfie Verbindungen und deren Charakterisierungsdaten

belle I (Fortsetzung) (Kernresonanzdaten)

Verschiebungen sind in ppm gegen TMS (δ « 0) , die relative Anzahl der Protonen in

Klammern angegeben. S * Singulott, D » Dublett, M ■ Multlplett ^α Lösungsmittel* CDC1-, + 1 Tropfen Methanol-d, ^p Dublett (Kopplungskonstante mit ^J1 P)

W;

Tabelle I (Fortsetzung Kernresonanzdaten)

r» i

* Dublett (Kopplungskonstante mit H-3')

** H-3', H-4', H-5', H-5" bilden eine komplizierte Multiplcttstruktur; deswegen ist hier keine genaue Zuordnung möglich. Bei den Substanzen 3 und 4 liegen in diesem Gebiet außerdem die Uunzylprotonen des Θ-Substituenten

Tabelle I (Fortsetzung) (Kernresonanzdaten)

i

— _>

CM

In α l _j CD- _j OO aufgenoπmen

3. Tabletten mit 100 mg 8-(4-Chlorphenylthio)-3' ,5 '-monophosphor¬ säurebenzyl t ri ester 40,000 kg Wirkstoff, 24,000 kg Milchzucher und 16,000 kg Maisstärke werden mit 4,000 kg Polyvinylpyrrolidon (MG 25.000) in ungefähr 5,5 Liter Wasser granuliert und durch ein Sieb von 1,25 mm Maschenweite ge¬ preßt. Nach dem Trocknen werden 10,000 kg Carboxymethylcellulose, 4,000 kg Talkum und 2,000 kg Magnesiu stearat zugegeben. Auf einer Ex¬ zentermaschine wird das Granulat zu Tabletten von 9 mm Durchmesser, 250 mg Gewicht und einer Härte von 4 bis 5 kg verpreßt.

4. Dosieraerosolzubereitung enthaltend 8-Brom-adenosin-3' ^'-mono¬ phosphorsäurebenzyl ester 0,540 g Span® 85 und 0,135 g Aroma werden in 10,215 g gekühltem Frigen ^® 11 gelöst. In die Lösung werden 0,270 g mikronisierter Wirk- Stoff eingerührt und in 24 ml -Dosen eingefüllt. Nach dem Vercrimpen werden 14,971 g Frigen ^® 12 eingepreßt. Bei einem Kammervolumen des Do¬ sierventils von 125 ul werden pro Ventilhub 1,5 mg 8-Brom-adenosin- 3' ,5' -monophosphorsäurebenzyl ester als Aerosol freigesetzt.

Pharmakologie

Zur Bestimmung positiv inotroper Wirkungen wurden Papillarmuskeln aus dem rechten Ventrikel des Meerschweinchenherzens verwendet. Die adrener- gen Nervenendigungen waren frei von Noradrenalin (Katecholamin-Entspei- cherung durch intraperitoneale Injektion von 5 mg/kg Reserpin 24 Stunden vor Präparation der Tiere). Die Aufhängung der Muskeln erfolgte an einem induktiven Kraftaufnehmer in einer mit Sauerstoff gesättigten physiolo¬ gischen Nährlösung (Volumen 50 ml). Die Kraftregistrierung erfolgte iso- metrisch, Kontraktionskurven wurden mittels eines Tintenschreibers auf¬ gezeichnet und dann analysiert. Vor Zugabe der Testsubstanz wurden die Muskeln bei konstanter Reizung (Frequenz 0,2 Hz, Reizdauer 1 ms) bis zum Erreichen eines stationären Zustands ("steady State") der Kraft in der Nährlösung äquilibriert. Die Konzentration der Testsubstanz wurde dann erhöht, wenn die Kraft innerhalb von 10 min nicht weiter zunahm.

In der folgenden Tabelle II sind die Konzentrationen der einzelnen Test¬ substanzen aufgetragen, bei denen der positiv inotrope Effekt gerade erkennbar war (Schwelienkonzentration) oder 50 % der maximalen Kraftzu- nähme erreichte (ECgg). Diese Werte wurden im unteren Teil der Tabelle denen bereits bekannter Testsubstanzen gegenübergestellt. Weiterhin wer¬ den Schwelleπkonzentrationen und EC _r - _Q -Werte für die aufgeführten Test¬ substanzen in Anwesenheit des Phosphodiesterase-Hemmstoffs 1-Methyl-3- ϊsobutylxanthirt (IBMX) (2 x 10 Mol/1) angegeben. Es resultiert eine Verschiebung zu 30 - 40-fach niedrigeren Konzentrationen im Vergleich zu den Werten ohne Phophodiesterase-Hemαistoff. Ein ähnlicher Synergis¬ mus wurde auch mit Papaverin (1 x 10 Mol/1) und mit Theophyllin (3 x 10~ ⁴ Mol/1) beobachtet.

Tabelle II Schwellenkonzentrationen von erfindungsgemäßen und Vergleiche- Verbindungen

VQ I '

Zur Bestimmung der erschlaffenden Wirkung von δ-CHgS-cAMP-OCH CgHr- (Ver¬ bindung 2) auf die glatte Muskulatur des Respirationstraktes wurden iso¬ lierte Trachea!streifen des Meerschweinchens verwendet. Aufhängung der Präparate erfolgte wie bereits beschrieben. Nach Vorgabe einer geeigneten Testspannung (0,8 g) wurde die erschlaffende Wirkung der Testsubstanz in Abhängigkeit von der Konzentration getestet. Nach Auswaschen der Test¬ substanz wurde der Versuch mit einem bereits bekannten cAMP-Derivat (Dibutyryl-cAMP, Vergleichsverbindung 1) wiederholt.

Tabelle III

Abnahme der MuskelSpannung (T) in % des Kontrollwertes

Weiterhin wurde die relaxierende Wirkung erfindungsgemäßer Verbindungen auf die Trachea!Spangen-Kette des Meerschweinchens in vitro geprüft:

Vier parallele, aus jeweils 6 Einzelringen bestehende Trachea!spangen- Ketten des Meerschweinchens (d und ?, 430 - 600 g) im Organbad (5 ml, Krebs-Henseleit-Lösung mit Zusatz von Phentolamin (10~ Mol/1, 37°C, Vorspannung der Organe 2 g, Begasung mit Carbogen) entwickeln nach etwa 20 bis 30 Minuten eine stabile, tonische Spontankontraktur. An diesen dauerkontrahierten Organen kann unter isometrischen Meßbedingungen durch Applikation der Prüfsubstanz in kumulativhalblogarithmisch ansteigender Konzentration. (z.B. 1x10 ^"6 + 2x-10~ ⁶ + 7x1θ ^"6 + 2xlθ ^"5 usw. Mol/1) eine Relaxation herbeigeführt werden, wobei nach jeder Einzeldosis der Test¬ substanz eine konstante Relaxations-Antwort abgewartet wird, bevor die nächst höhere Konzentration appliziert wird. Ober einen Zeitraum von-^üy

bis 30 Minuten wird somit eine vollständige Dosis-Wirkungskurve der Testsubstanz erhalten. Die jeweilige Relaxation wird als Prozentbruch¬ teil der durch Gabe von (-)Isoprenalin (10 -6 Mol/1) maximal erreichbaren Relaxation ausgedrückt.

In Tabelle IV sind die ED (Dosis der halbmaximal möglichen Relaxation) und die relative Wirkungsstärke im Vergleich zu Theophyllin für erfin¬ dungsgemäße Verbindungen angegeben.

Tabelle IV