Etat de la technique La g) ycoprotëine de t'enveloppe de HIV est codée par le gène "env", et la traduction de l'ARNm correspondant donne une protéine glycosylée, gp 160, sous forme d'un précurseur dont la masse moléculaire est de 160 kDa. La gap 160 est clivée à l'intérieur de la cellule pour donner, au niveau de la membrane cytoplasmique lors du bourgeonnement du virus en cours de formation, d'une part la gpl20 que Iton retrouve à l'extérieur de la cellule et du virus, et, d'autre part, la gp41, partie trans- membranaire de la glycoprotéine, qui correspond à l'extrémité carboxy-terminale du précurseur. Une fois la particule virale libérée, la gp4 I seule protéine trans- membranaire, présentera son extrémité carboxy-terminale tournée vers l'intérieur du virus et son extrémité amino-terminale faisant saillie à l'extérieur, se maintenant associée de façon non covalente à la gpl20 Par son extrémité amino-terminale, elle est fixée d'une manière non covalente à la gp41 alors que le reste de la protéine est impliqué dans la reconnaissance du récepteur CD4 et des co-récepteurs CCR5 ou CXCR4 (spécifique des lymphocytes T4 auxiliaires, macrophages; Trkola et al., J.

Virol., 72, 1876-8, 1998 ; Scho (s et al., J. Virol., 72, 4032- 4037, 199 ; Rubbert et 1, J Immunology, 160, 3933-3941, 1998) La liaison de la gpl20 au CD4 permet d'exposer la membrane de la cellule cible à la partie hydrophobe amino-terminale de la gap41, ce qui induit le mécanisme de fusion des membranes du virus et des cellules, cette fusion étant à l'origine de la pénétration du virion dans la cellule cible lors de l'infection (Wong-Staal et a Molecular Genetic Medecine, 2, Friedman ed, 189- 219, 1992; Berger et aI. . Nature, 91 : 240, 1998).

Ce processus de reconnaissance du récepteur viral, suivi de la fusion des membranes grâce à l'interaction de l'extrémité amino-terminale de la protéine de fusion avec la membrane de la cellule cible, n'est pas un mécanisme propre au HIV. Il est rendu possible grâce à la présence, sous forme oligomérique, des glycoprotéines transmembranaires du virus. Des pontages par agents chimiques ont permis de mettre

en évidence des trimères au niveau des glycoprotéines de 1'enveloppe de MuLV (Pinter et al., J Virol, 30, 157-165, 1979), de MuMTV (Racevskis et al., J Virol, 35, 937-948, 1980) II a aussi été montré que la protéine de 1'enveloppe de RSV forme des oligomères retrouvés dans les cellules infectées et les particules virales (Einfeld et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85, 8688-8692, 1988). Le virus de l'influenza exprime également à sa surface une hémagglutinine sous forme trimérique. Dans ce dernier cas, ! a forme muttimérique est nécessaire au transport intracellulaire de la <BR> <BR> <BR> protéine(Copeland etal., J Cell Biol, 103, 1179-1191, 1986) L'influenzaexprime aussi à sa surface une neuraminidase sous forme de tétramère (Vargllese et al., Nature, 303, 35-40, 1983).

Bien que la nature oligomérique des différentes protéines codées par le gène e/71^ ne fait aucun doute le nombre de monomère est resté quant à lui sujet à controverse pendant longtemps. La glycoproteine ap 160 a en effet été décrite <BR> <BR> <BR> longtempS comme pouvant s'assembler en dimeres ou tetrameres (Pinter et crl., J. <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P>Virol, 63, 2674-2679, 1989; W094/00557 du CNRS; Schawaller et al., Virology, 172, 367-369, 1989; Earl et al., Proc Natl Acad Sci, 87, 648-652, 1990; Earl et al., J Virology, 6S, 3015-3096, 1994) D'autres rapports plus récent ont toutefois démontré que la gpl60 pourrait stassocier en fait naturellement, par sa partie gp41, sous ta forme de trimères (Min Lu et crl., Nature Structural Biology, 9, 1075-1082, 199 ; Veisshorn et al., EMBO J, 15, 1507-1514, 1996; Weisshorn et al., Nature, 387,426-430, 1997), les formes dimériques ou tétramériques résultant en fait de ponts disulfures inter-chaînes abbérrants, ou de formes oligomériques transitoires (voir ci- dessous).

Dans un but vaccinal, on peut produire et purifier la glycoproteine de 1'enveloppe de HIV, soit en cultivant le virus HIV sur des lignées cellulaires et en purifiant la glycoproteine du milieu de culture (W094/00557 du CNRS), soit en exprimant un recombinant de cette protéine par un vecteur différent de l'HIV, et en la purifiant du milieu de culture (W091/13906, Chiron).

La purification de gpl60 à partir de cellules infectées par HIV ne permet que d'obtenir des tétramères probablement une forme oligomérique transitoire, c'est à dire une forme qui ne correspond pas à celle prise par sa partie gp41 à la surface du virus (W094/00557 du CNRS).

L'espression d'un recombinant de la ap 160 par un vecteur différent de l'HIV, bien que présentant l'avantage de se soustraire aux dangers liés à l agellt infectieux HIV, ne permet pas aussi de retrouver la structure oligomérique native" de la gp 160. En effet, VanCott et al. ont montré que la gpl 60 recombinante exprimée par la vaccine, bien que présentant un pouvoir d'adhésion au CD4, comporte des différences structureHes(J.Imm.Meth.,!83,p.H4,cot.!,ti.)9-22,1995).Randa !!r//. ont égalemellt montré que la gpl60 recombinante exprimée par la vaccine comporte des ponts disutfuresinter-chamesabbérants(Viroiogy,)79,827-833,!990).

Récemment, Parren et al ont mis en évidence une corrélation entre l'obtention d'anticorps pouvant neutraliser iZ7 litro l'infectioll de cellules par HIV et fa nature oligomérique de la gpl20 (J of Virology, 79, 3512-3519, 1998) Poul cela, Parren et crl. ont utilisé une gpl90 exprimée par HIV dans des cellules infectées, probablement pour contourner les problèmes liés aux différences structurales entre une gp120 native, exprimée à la surface du HIV, et celles produites par des vecteurs d'expression, telle que la vaccine Par ailleurs, on sait que des anticorps spécifiques de la structule oligomérique de la gpl 60 peuvent être générées (Earl et al., iSllpCl), et participent de fait à un effet neutralisant contre I'infection in oitro de cellules par le HIV.

La présente invention vise à fournir un procédé d'obtention de produits d'expression du gène env recombinant permettant ta restauration de leur forme trimérique, cette forme étant utilisable dans le cadre d'une vaccination ou dans la mise en oeuvre d'un diagnostic d'infection par HIV. En effet, les essais cliniques conduits sur des gp160 recombinantes posent le problème du spectre d'inhibition qui reste limité à quelques souches virales ulliquement (Pialoux et al., Aids Res. Hum. Retr., 11 J7J-Jg I, 1995 ; Salmon-Ceron et al., Aids Res Hum Retr, 19 1479-1486, 1995).

A ce jour, bien que la íorme trimérique d'ulle gpl60 a été plusieurs fois identifiée dans un mélange d'autres formes polymériques, personne n'a purifié, ni suggéré de purifier, la forme trimérique de) a gp) 60. La présente vise à pallier ce besoin.

Résumé de l'invention

A cet effet, l'invention concerne toute glycoprotéine recombinante purifiée répondant aux propriétés suivantes : a) ulle capacité d'adhésion au CD4; b) une affinité avec un anticorps anti-gp l 10 capable de neutraliser is its o t'infection de cellules par HIV; c) une affinité avec Ull anticorps anti-gp41; d) une forme trimérique dépourvue de ponts disulfures inter-chaines Un deuxième objet de la présente invention concerne un vaccin comprenant ! a glycoprotéine purifiée selon l'invention, et un adjuvant.

Un troisième objet de) a présente invention concerne 1'utilisation de la glycoprotéine selon l'invention dans la mise en oeuvre de toute méthode de diagnostic in vitro d'infections causées par HIV.

Un dernier objet de ta présente invention concerne un procédé d'obtention d'une glycoprotéine selon l'invention, dans lequel on exprime, aux moyen de techniques de recombinaison génétique, une glycoprotéine répondant aux propriétés a), b) et c) selon l'invention, on la purifie, et on la soumet à des étapes impliquant au moins un agent réducteur, un détergent ionique et/ou un détergent neutre dans des conditions telles que l'on obtient ulle glycoprotéine répondant aux conditions selon t'invention.

Description détaillée de l'invention Dans le cadre de la presente invention, la capacite d"adhesion au CD= peut etue déterminée par une précipitation radio-immune, par ELISA ou par résonance ptasmonique de surface, le détail des ces méthodes étant exposé dans la suite de la description. Ces méthodes sont susceptibles d'être modifiées dans la limite des connaissances actuelles, I'objectif étant de s'assurer simplement que la glycoprotéine selon l'invention forme bien un complexe avec le CD4.

Les molécules de CD4 peuvent être préparées de toutes sortes de manières différentes, incluant une purification depuis une source naturelle, ou le recours à des techniques de recombinaison génétique. Dans ce cadre, on peut utiliser les CD4 décrits dans W08903222, W08902922, Smith et al. (Science, 238,1704-1707, 1987)

et Littman et al. (Nature, 325, 453-455, ! 987), par exemple. La société ERC BioServices Corporation, 649A Lofstrand Lane, Rockeville, MD 20850, USA, <BR> <BR> <BR> commercialise également un CD4 produit par les cellules CHO ST4. 2 (117 : Aids Research and Référence Reagent Program Catalog, the Nat Inst Helath par exemple.

De préférence, la capacité d'adhésion est au moins identique à cette d'une gp120 d'une souche d'HIV infectieux, par exempte une gp ! 20 provenant des isolats SF2, HXB2, BRU, MN, SC, NY5, CDC4, WMJ2, RF, MAL, ELI, Z96, Z3, Z321 et JY 1 (Vlyeus et al., Human Retroviruses and Aids, Los Aiamos, New Mexico, 1990), ou des autres isolats décrits par Tersmette et al. (J Virol, 69, 9096-2039, 1988), Popovic et cil. (Science, 224, 497-500, 1984), et EP 173 (Transgene S. A.), par exemple.

L'affinitémesurée(K.d)parrésonancepiasmonique de surface peut être aussi de l'ordre de 10-4 à 10-12 M, de préférence 10-9 à 10-1l M, ce qui est conforme aux affinités déjà mesurées pour des gp120 (Smith et al., Science, 238: 1704, 1987; Lasky et al., Cell, 50 975, 1987), par exemple La glycoprotéine recombinante selon l'invention présente aussi une affinité avec un anticorps anti-gp ! 20 capable de neutraliser in vitro 1'infection de cellules par HIV. Le terme"anticorps"rearoupe toutes les immunoglobulines ou fraaments de celles-ci, d'origillal polyclonale, monoclonale ou chimérique (voir US4816397), par exemple Tous les anticorps connus, ou susceptibles d'être préparés, capables de reconnaître Ull épitope de la gpl90 et de neutraliser in vitro I'infection de cellules par un HIV, peuvent être pris en compte dans le cadre de la présente invention II suffit qu'une glycoprotéine du HIV présente une affinité avec un anticorps de ce type pour qu'on la considère comme répondant aux besoins de la présente invention Sans vouloir être limité par les techniques et anticorps utilisables pour les besoins de l'invention, à titre d'information, on peut citer les articles de VanCott et cil. (1995, sitpi-a), et Earl et al. (1994, supra), par exemple.

En ce qui concerne les tests de mesure de l'efficacité neutralisante d'un anticorps in vituo, on peut citer les articles de Pialoux et al. (1995, supra) et Salmon- Céron et al. ( 1995, supl a) par exemple. Il suffit d'observer une neutralisation in vitro de l'infection de cellules par HIV, quelque soit le seuil de neutralisation, pour considérer que l'anticorps satisfait aux besoins de la présente invention

Par ailleurs, la glycoprotéine recombinante selon l'invention présente aussi une affinité avec un anticorps anti-ap41. Les remarques exposées ci-dessus s'applique mutatis mutandis à la gp41, à la différence presque l'effet neutralisant d'un anticorps anti-gp41 n'est pas important, tout en pouvant être un critère préférentiel à ne pas négliger.

La mesure de l'affinité de la glycoprotéine sous forme trimérique avec tes anticorps anti-gp41 et anti-gpl20 peut être effectuée par une réaction immullologique direct avec l'anticorps, ou par ELISA, par exemple Les conditions opératoires peuvent varier dans les I imites des connaissances actuelles, les variations et/ou adaptations par rapports aux techniques connues ne représentant pas en fait un obstacle difficile pour t'homme du métier.

La forme trimérique de la lycoproteine selon 1'invention peut etre observee sur gel SDS PAGE en condition réductrice ou non (voir 1'exemple 1). L'homme du métier peut cependant recourir à toutes sortes d'autres analyses, comme la centrifugation analytique ou t'analyse par diffusion de ta tumière. L'objectif est simplement de mettre en évidence l'association de trois molécules de ap 160 non-liees par des ponts inter-chaînes.

La glycoprotéine selon l'inxention, en répondant aux propriétés exposées ci- dessus, peut donc être composée de tout ou partie de la protéille gp41, et de tout ou partie de la protéine gpl20 De ce fait, cette glycoprotéine peut être codée par tout ou partie d'ull gène enl natif (provenant d'un isolat d'HIV) ou non, ladite alycoproteine étant soit purifiée à un stade ou le clivage n'est pas encore effectuée il1 sitll, ou Iedit clivage étant rendu inopérant soit à cause de la nature de l'hôte cellulaire qui ne serait pas pourvu des enzymes nécessaires, soit à cause d'inhibiteurs de ces enzymes, soit encore du fait que le site de clivage a été génétiquement modifié, par exemple La modification génétique du site de clivage est bien connu de 1'homme du métier, et permet d'obtenir des protéines entières, de tailles variables, renfermant tout ou partie de la gp41 et tout ou partie de la gp41 A titre d'information, non limitative, on peut citer les glycoprotéines gpl60 et gpl40 décrites par EP541753 (sllpra), EP679187 (. rupra), Earl et al. (I 994,. suprcr), Kieny et al. ( 1988, sl(pra), l'enseignement technique de cette littérature étant incorporé par référence dans la description de la présente invention

Plus particulièrement, on peut utiliser comme source de gène enl, tous les isolats de HIV connus, notamment ceux décrits ci-dessus Le clonage peut être avantageusement effectué par la technique PCR, suivie d'une insertion du fragment d'ADN dans un vecteur approprié. On peut ensuite supprimer le (s) site (s) de clivage par mutagenèse dirigée comme décrit par Kieny et al. (198,. strpj-a), ou dans t'exempte t ci-après. La préparation des vecteurs, et toutes les autres procédures techniques peuvent être effectuées selon les protocoles décrits dans les ouvrages de Sambrook et czl. (Molecular Cloning, A Laboratory l\/Ianual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U. S. A., ! 989).

Le vecteur d'expression dans lequel on clone finalement le fragment d'ADS codant pour une glycoprotéine selon l'invention, peut être un plasmide, Ull phage, ADN entier de virus, un cosmide, un ADN destiné à s'intégrer dans une cellule, etc.

Ce vecteur comprend de préférence des séquences régulant l'expression du gène em'. et le cas échéant d'autres séquences régulant la translocation de la glycoprotéine vers la membrane de la cellule hôte productrice Les cellules hôtes les plus adaptées, en raison d'un glycosylation proche voire identique à cette désirée, sont des cellules eucaryotes supérieures, pouvant inclure, par exemple, des lignées cellulaires immortalisées provenant du singe (Cos-7, ATCC CRL 1651 ; Vero76, ATCC CRL 1587), du hamster (BHK, ATCC CRL 10 ; CHO, PNAS USA, 77 : 4216, 1980), de la souris (TM4, Mather, Biol Reprod, 23, 243-951, 1980), de l'homme (Hela, ATTC CCL2; W138, ATCC CCL75 ; Hep G2 ; HB 8065), du chien (MDCK, ATCC CCL34), etc Les vecteurs d'expression les plus appropriés sont ceux se reproduisant dans des eucaryotes, notamment le virus de la vaccine qui est bien connu dans l'art antériellr (W086/07593), par exemple Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, on peut produire notamment des gpl60 selon l'enseignement décrit dans EP541753 (supra), ou des ap l 40 selon la méthode de Earl et al. (1990, strpra), voire tout autre variant de glycoprotéine dans laquelle une ou plusieurs parties de gp41 et/ou gpl20 seraient éliminées, l'objectif étant que ta partie gp41 soit suffisante pour que la formation de trimères s'effectue, et que la partie gpl20 soit suffisallte pour être reconnue par des anticorps anti-gpl20 neutralisants et par le CD4. Pour faire le choix de genets en modifiés répondant aux besoins de la présente invention, I'homme du métier, est à

même de procéder par étape ou par hasard, et de choisir ensuite parmi toutes les séquences ne répondant pas à nos besoins, celles qui y satisfont.

Après avoir produit la glycoprotéine par des techniques de recombinaison génétique, ou par infection de cellules avec HIV, on la purifie au moyen de techniques connues de l'homme du métier, notamment celles faisant intervenir des lectines de <BR> <BR> <BR> lentille (Pialoux et al., l992, Sl/p1'a; Salmon-Céron et al,l995, sltp1a), celle décrite dans WO91/13906 (sllpra) pouvant être éventuellement encore adaptée aux besoins de la présente invention, ou même celle décrite à l'exemple I (immuno-affillité), par exempte.

Rn ce qui concerne les protéines recombinantes, on peut noter qu'une partie des glycoprotéines ainsi purifiées présentent des ponts disulfures inter-chaines, quelque soit la nature de t'hôte ou du vecteur utilisé. Les glycoprotéines s'associent en fait en dimères (une partie étant covalents) visibles sur gel SDS PAGE après fixation par un agent de pontage. En ce qui concerne les glycoprotéilles pul-ifiées de cellules infectées par HIV, celles-si se présentent aussi sous forme de tétramères (WO94/00557, supra).

Afin de répondre aux besoins de ta présente invention, on dissocie donc les glycoprotéines, puis on les soumet à des conditions favorisant leur ré-assemblage naturel, c'est à dire sous forme de trimères Pour cela, on soumet la glycoprotéine à des étapes impliquant au moins un a(gent réducteur, un détergent ionique et/ou Ull détergent neutre dans des conditions telles que 1'on obtient une glycoprotéine satisfaisant aux besoins de la présente invention On peut choisir un ou plusieurs agent (s) réducteur (s) parmi les molécules de dithiothréitol, ß-mercaptoéthanol, glutathion réduit ou le borohydrure de sodium, par exemple.

On peut choisir un ou plusieurs détergent(s) ionique(s) parmi les sels de dodécyl sulfate, notamment le dodécyl sulfate de sodium (SDS) ou de lithium, les sels de dioctyl sulfosuccinate (de sodium, par exemple), les sels de cétryltriméthylammonium (de brome, par exemple), les sels de cétylpyridinium (de chlore, par exemple), les N-dodécyls- ou N-tétradécyl-sulfobétaïne, les zwittergents 3-14, et le 3- [ (3-cholamidopropyl) -dimethylamino] -1-propane sulfonate (CHAPS), par exemple.

De même, on peut choisir un ou plusieurs détergent (s) neutre (s) parmi le tween200, le tween800, 1'octylglucoside, le lauryl-maltoside, I'hecamegt), le lauryl- <BR> <BR> <BR> <BR> diméthylamine, le décanoyl-N-méthyl-glucamide, le polyéthylène-glycol-laul-yl-éther, le triton X 1000, le Lubrol PXO, par exemple.

Les conditions opératoires doivent être suffisantes pour dissocier les glycoprotéines, et les ré-assembler en trimères Pour cela, généralement on peut dissocier les glycoprotéines à l'aide d'un ou plusieurs détergent(s) ionique(s), en présence d'agent réducteur ou non, puis on peut favoriser le réassemblage des monomères en substituant le détergent ionique par un détergent neutre, par exemple au moyen d'une dialyse De cette manière, on est assuré d'obtenir une glycoprotéine selon l'invention comprenant moins de 50% d'autres contaminants protéiques (constitués principalement par des diméres covatents) De préférence, pour obtenir exclusivement des trimères de glycoprotéines selon l'invention, on soumet au cours du traitement les glycoprotéines purifiées à Ull agent réducteur, de sorte à libérer tes diméres covatents, ! e cas échéant on bloque des fonctions sutfhydryts libres au moyen de molécules appropriées, telles que des agents d'alkylation comme le N-éthyl-maléimide ou 1' iodo-acétamide, puis on ré-oxyde doucement les fonctions sulfhydryls restantes en présence d'un agent oxydant tel que du glutathion oxydé, par exemple.

Dans un mode de réalisation particulier de ta présente invention, on peut <BR> <BR> <BR> soumettle la glycoprotéine purifiée successivement à un agent réducteur, à un agent d'alkylation, à un agent oxydant, à un détergent ionique et à une dialyse contre un détergent neutre, par exempte Dans un autre mode de réalisation particulier de ta présente invention, on peut soumettre la glycoprotéine purifiée successivement à un détergent ionique, à un agent réducteur, à un agent oxydant et à une dialyse contre un détergent neutre A la fin du procédé, on peut substituer le détergent neutre par un tampon approprié, par exemple au moyen d'une dialyse.

Un autre objet de la présente invention concerne un vaccin comprenant la glycoprotéine selon la présente invention et un adjuvant. Ce vaccin peut contenir

comme antigène de surface du HIV uniquement la glycoprotéine selon la présente invention, les formes dimériques ou monomériques d'une gp 160 ou gp 190 étant spécifiquement exclues, par exemple, pour des raisons d'immunogénéicités réduites.

On peut également adjoindre à ce vaccin d'autres valences concernant d'autres maladies, les quantités d'antigènes et/ou Ia formulatioll de chaque valence devant néanmoins être probablement optimisée(s) de sorte à assurer une réponse immunitaire efficace, par exemple. Les valences d'autres pathogènes peuvent provenir de bactéries, de virus ou de parasites, par exemple ceux provoquant des hépatites (A à G), la rougeole, les oreillons, la polio, la tuberculose, la diphtérie, la malaria, etc Parmi les adjuvants utilisables, on peut dénombrer tous tes sets d'aluminium, comme les phosphates et hydroxydes d'aluminium : l'adjuvant de Freund ; <BR> <BR> <BR> le N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isogluamyl-L-alanine-2- [1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero- <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 3-(hydloxyphosphoryloxy)](voirSanchez-Pescador etal.. J Immu,141, 1790-1797, 1988); les molécules dérivées de Qllillaja saponas comme le StimulonS) (Aquila, US) ; 1'Iscoms0 (CSL Itd, US); toutes molécules à base cholestérol et analogues, comme le DC Chol(E) (Targeted Genetics); le glycolipide Bay R1005( (Bayers, DE); les antigènes de Leishmanicl brasiliensis comme le LelF (nom technique) disponible auprès de Corixa Corp. (US), les polymères de la famille de potyphosphazènes, comme I'Adjumer (nom technique) disponible auprès du Virus Research Institute" (US).

Les compositions vaccinales selon l'invention peuvent être utilisées pour la prévention d'infections par le HIV- I, le dosage et la voie et la fréquence d'administration devant cependant être probablement optimisé de sorte à obtenir une réponse immunitaire efficace.

Un dernier objet de la présente invention concerne l'utilisation de la glycoprotéine selon l'invention dans la mise en oeuvre de toute méthode de diagnostic in vitno d'infections causees par HIV.

D'autres caractéristiques de la présente invention apparaîtront au cours des descriptions suivantes d'exemples de formes de réalisation qui sont fournis à des fins d'illustration de la présente invention et qui ne sont pas destinés à être limitatifs La manipulation des cellules, la préparation des vecteurs, la transformation de cellules, et toutes les autres procédures techniques sont, en l'absence de précisions contraires, effectués selon les protocoles décrits dans l'ouvrage de Sambrook et al. ( 1989, stlpra).

Ces exemples sont précédés d'une brève description de la figure l, et des méthodes mesurant l'affinité de la gp160 au CD4.

Mise en évidence d'une affinité au CD4 par précipitation radio-immune : on utilise un CD4 recombinant marqué au soufre 35 produit par des cellules CHO (Genentech, USA ; VanCott et al., 199, sarpJa). On effectue ensuite des expériences de co- précipitation, au cours desquelles le CD4 est ajouté en quantité croissante à une quantitée fixe de gpl60 purifiée sous forme trimérique pour déterminer le point de saturation, puis on tes coprécipite avec un antisérum anti-gp 160 Pour cela, on mélange le CD4 et la ap 160 pendant 1 h à 4°C, on ajoute l'anticorps (OKT4, Ortho Diagnostics, US), on lave les complexes, et on les sépare par électrophorèse Mise en évidence d'une affinité au CD4 par ELISA : ta mesure des constantes d'affinité du CD4 pOUI la glycoprotéine selon l'inventioll est mesurée en utilisant la technique de Friauet et al. (J. of immunological methods, 77, 3O5-J 19, 198).

Mesure de l'affinité de la gpl90 sur le CD4 par résonance plasmonique de surface : le Biacoree est un appareil pour l'analyse des interactions biospécifiques en temps réel et sans marquage qui utilise le principe de résonance plasmonique de surface. Lors de t'analyse, un des interactants (le ligand) est couplé à une matrice hydrophile (dextran) ou hydrophobe (surface HPA). L'autre interactant (analyte) passe au contact de la surface par t'intermédiaire d'une cartouche de transfert microfluidique L'augmentation de masse au voisinage de la surface due à l'interaction entre les molécules, est représentée en fonction du temps sur un sensorgramme. Différentes chimies de couplage permettent ta fixation de pratiquement toutes les biomolécules sur la matrice L'utilisateur crée donc une surface biospécifique sur mesure, pour chaque type d'application En pratique la glycoprotéine selon l'invention est couplée sur la matrice et différentes concentration de CD4 sont envoyées par l'appareil au contact de cette matrice. A chaque fois la masse de CD4 fixée sur la glycoprotéine est enregistrée Le logiciel Biaeval3@ calcule automatiquement la constante de dissociation du CD4 sur la gpl 90.

Figure 1 représentation de t'analyse SDS PAGE en condition réductrice obtenue avec la gpl60 produite par VVTG9150, purifiée, traitée pour faire des trimères et fixée par un agent de pontage (col 3 et 4) ; au regard de celle obtenue en condition réductrice avec la gpl60 produite par VVTG9150, purifiée et directement fixée (col 2) ; au regard de celle obtenue en condition réductrice avec des monomères de gap 160

(col. 5 et 6) ; et au regard de celle obtenue en condition non-réductrice avec la ap 160 produite par VVTG9150 et purifiée (col 7) Exemple 1 Un vecteur recombinant basé sur le virus de la vaccine, VVTG9150, est utilisé pour la production de gp 160. La construction du plasmide de transfert du gène codant pour la protéine enl hybride HIV-IN LAI dans le génome du virus de la vaccine VVTG9] 50 est décrite ci-après Le fragment d'ADN PstI-Kpnl de pTGI 163, réf Kieny et al. (Prot. En., 2, 219-225, 1998) qui contient la séquence codant pour le peptide signal et les premiers acides aminés de la gpl20 du virus HIV IL\I, est inséré aux sites Pstl et Kpnl du bactériophage M 1 3TG 130, réf Kieny et al. (Gene, 26, 91-99, 1983) générant M 13TG4147. Le fragment Pstl-Pstl de pTG 1 163, contenant la totalite du gène codant pour une gpl 60/soluble de HIV-IA est introduit dans le site de r°estriction Pstl de M13mp70, générant M13TG4137 L'ADN du bactériophage M13TG4137 est ensuite coupé par Bgl II, digélé par la polymérase I (fragment de Klenow) afin de générer une extrémité franche, puis coupé par EcoRI, afin d'être inséré aux sites EcoRV et EcoRI <BR> <BR> <BR> du bactériophage M13TG4147, générant M13TG4158 Une délétion sur M13TG4158 est ensuite réalisée avec un oligonucléotide, qui permet l'introduction d'ull site Sphl et d'un site Smal. On obtient le bactériophage M13TG4168 Le gène codant pour la gp120MN est ensuite amplifié à partir d'ADN de cellules SupTI infectées avec le virus HIV- I ;< par la technique de PCR avec des oligonucléotides qui introduisellt respectivement des sites SphI et Smal. Le fragment d'ADN amplifié est ensuite digéré par Sp/11 et 1 et inséré aux sites correspondant de M 1 3TG4 168, générant M 13TG4174. Une mutagenese dirigee sur M 13TG4174 est réalisée avec un oligonucléotide permettant de muter un site potentiel d'arrêt de transcription (TTTTTNT) reconnu par le virus de vaccine dans les gènes précoces et d'introduire un site de restriction EcoRI, générant ainsi M 13TG8120. Le fragment Pstl-Pstl de MI-)'TG8120 est ensuite cloné dans le site Pstl du plasmide pTG9148 génélant pTG9150 (le virus VVTG9150 après transfection) pG9148 est d'ailleurs généré de la façon suivante la séquence correspondant au promoteur H5R du virus de la vaccine est amplifiée par la technique de PCR avec des oligonucléotides introduisant respectivement des sites BamHI et BgllI. Le fragment d'ADN amplifié est ensuite digéré par BglII et BamHI et inséré aux sites

correspondant de M13TG6131 (Gene, 26,91-99, 1983) générant M13TG8124. Le fragment BamHI-Bglll de M13TG8124 contenant la séquence promotrice HSR est introduit dans le site de restriction BamHI de pTG9133 générant pTG9 ! 45. Le plasmide pTG9133 a été construit par introduction d'un site BczmHI entre les sites Clapi et EcoRI de pTGIH-TK (Nature, 312,5990, 163-166, 8 Nov. 1984) par ligation d'un adaptateur OTG4451/OTG4452 Un site de clonage multiple issu de M13TG131 digéré par 711 et EcoRl est introduit dans les sites BamHI et EcoRI de pTG9145 générant pTG9148.

En conclusion, VVTG9150 code donc pour une gp160 hybride et soluble dans lacuelle la partie ap 120 derive du HIV-I MN, et la partie transmembranaire gp41 provient d'un isolat LA 1. Plusieurs modifications sont en outre introduites dans cette séquence codante. Premièrement, un site de restriction Sphl est créé immédiatement en aval de la séquence codant pour le peptide signal, sans altérer la séquence en acides aminés Deuxièmement, un site de restriction SmnI est créé immédiatement au-dessus de la séquence de clivaae entre la gpl20 et la gp41, sans altération de la séquence en acides aminés. Troisièmement, les deux sites de clivage en position 507-516 (numérotation des acides aminés conforme à Myers et al., in : Human retroviruses and AIDS, Los Alamos Nat Lab, USA, 1994) sont mutés (séquence originale <BR> <BR> <BR> KRR... REKR muté en QNH QEHN) Quatrièmement, la séquellce codant pour le peptide hydrophobique transmembranaire IFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIV (acides minés 689-710 de Myers et a !.) est supprimée. Cinquièmement, un codon stop a été substitué pour le second codon E codant PEGIEE (acides aminés 735-740 de Myers et al ), c'est-à-dire le 29ieme acide aminé du domaine intracytoplasmique.

VVTG9150 est ensuite propagé pour produire la gpl60 hybride sur des cellules BHK2 1, dans des conditions conventionnelles (Nature, 312, 163-166, 1984).

La glycoprotéine hybride gp 160 est alors purifiée successivement par <BR> <BR> <BR> chroliatoaraphies echanaeuse d'ions, une chromatographie d'immunoaffinite, une ael filtration, et une concentration. En résumé, on fait passer le milieu de culture contenant la gpl60 successivement au travers de deux supports DEAE Trisacryl LS Plus, mis en équilibre dans des colonnes BPG200# et BPG 1000 (Pharmacia) avec un tampon pH 8, 3 contenant 2,42 g/l de Tris et 1 ml/l de triton X ! 00. Puis on fait passer les fractions d'élution contenant la gpl60 au travers d'un support AF-Tresyl Toyopearl@ (Tosoh Corp, JP) sur lequel a été greffé l'anticorps IAMSF3 (publication ? ) et qui a été mis à l'équilibre dans un tampon composé de 29,22 g/l de

NaCI, 2,42 g/l de Tris et ! ml/1 de triton X 100. On collecte l'élution dès l'augmentation de DO visible sur l'écran et ce, jusqu'à la ligne de base. On neutralise ensuite le pH de l'élution avec 4% (v : v) de tampon Tris HCI 2M On soumet l'élution neutralisée à une filtration surgel dans une colonne XK 50/100@ contenant te support sephacryl HR S300 mis à l'équilibre dans un tampon PBS Si la concentration en protéines est alors inférieure à 0,44 mg/ml, on concentre l'élution dans une cellules Amicon(E) équipée d'une membrane YM30. Puis, on inactivel'élutionou)e concentrât dans un bain marie à 60°C pendant I h, et on le filtre (0,99y1m) dans un flacon Nalgène@. On peut ainsi obtenir environ 1, 34 mg/ml de gp160 pure à 91 % (visualisée sur SDS PAGE).

A partir de 560 yl de gpl60 purifiée (lmg/ml), on ajoute 65 ul de tampon IM phosphate de sodium pH7,8; 5,5 ul d'eau distillée et ! 9, 5 u) de dithiothreitol 250 mM (DTT), et on agite au vortex pendant 15 s. On ajoute 51, 5). d de phosphate de sodium IM (NaH2PO4), puis on bloque les groupes sulfllydryls par addition de 95 kil de N- ethyl-maléimide 1 00mM, on incube pendant 15 min, on réoxyde les groupes sulfhydryls par addition de 32,5 pll de eilutathion réduit à 150 mM, et 484 il de glutathion oxydé à 100 mM, on incube pendant 30 min. On dissocie ensuite les dimères de gpl60 par addition de 13,2 pll de dodecyl sulfate de sodiulll (SDS) à 10% On place l'échantillon dans une cassette de dialyse d'une capacité de 3 ml contre 3 1 de tampon PBS avec I OmM d'octyl~lucoside On effectue la dialyse pendant la nuit à température ambiante sous agitation douce. On élimine enfin le détergent par une ou plusieurs nouvelles dialyses contre du tampon PBS. Les gp) 60 ainsi traitées se retrouvent sous forme de trimères exclusivement.

La figure 1 représente l'analyse SDS PAGE en condition réductrice (DTT) obtenue avec la gpl60 produite par VVTG9150, purifiée, traitée pour faire des trimères et fixée par l'agent de pontage bi-fonctionnnel éthylène-glycol-bis- succinimidyl-succinate (EGS) (col. 3 et 4) ; au regard de celle obtenue en condition réductrice avec la gpl60 produite par VVTG9150, purifiée et directement fixée par l'EGS (col 2 des dimères); au regard de celle obtenue en condition réductrice avec des monomères de gpl60 (col. 5 et 6) ; et au regard de cette obtenue en condition non- réductrice avec la gpl60 produite par VVTG9150 et purifiée (col. 7 : en absence d'agent réducteur, les liaisons inter-chaînes conduisent à la formation de dimères, trimères et tétramères) Exemple 2

On exprime par le virus de la vaccine une gpl20 prolongée des ! 29 premiers acides aminés de la partie N-terminale de la gp41, comme décrit par Earl et al., Proc.

Natl Acad Sci USA, 87, 648-652, 1990. Dans la mesure ou la partie gp41 est limité à ses ! 29 premiers acides aminés, celle-ci ne comporte pas de région trans- membranaire. Cette glycoprotéine présente sur gel SDS PAGE un poids moléculaire de l'ordre de 140 kD et est communément appelée gpl40 On purifie cette gp ! 40 successivement par chromatographie d'échange d'ions, chromatographie d'affinité avec des lectines de lentilles, et par gel filtration, comme décrit par Pialoux et al. ( I 99D, sllps a) et Salmon-Céron et al. ( 1995, .sllpra).

A partir de 100 pal de gp 140 purifiée (1 mg/ml), on ajoute 2 µl de dithiothreitol 250 mM (DTT), et 10 il de SDS (10%), on incube le mélange pendant 15 min, On lui ajoute 20 µl de glutatllion oxydé (950mM), on i'incube une nuit à 4°C, puis on place 1'échantillon dans une cassette de dialyse d'une capacité de 3 ml contre 3 I de tampon PBS contenant 10mM d'octylglucoside On effectue la dialyse pendant la nuit à température ambiante sous agitation douce. On élimine enfin le détergent par une ou plusieurs nouvelles dialyses contre du tampon PBS. Contre toute attente, cette méthode permet d'éliminer tous les ponts disulfures inter-chaines sans que l'on ait à bloquer les groupes sulfhydryls avec un agent alkylant Les gap ! 40 ainsi traitées se retrouvent sous forme de trimères exclusivement Exemple 3 On exprime par le virus de la vaccine une gpl60 telle que décrite par Kieny et al. (Protein Engineering, 2, 219-225, 1988). On la purifie comme décrit à l'exemple 1, puis on la traite avec du SDS, et on la dialyse contre un tampon PBS contenant ! OmM d'octylglucoside On obtient après traitement un mélange de trimères non-covalents et de dimères covalents de la gp l 60, la forme prédominante étant constituée de trimères.