一种抑制端粒酶活性的肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术和分子生物学研究领域。 发明涉及一种高效抑制端粒酶 活性的蛋白肽段及其制备和应用。 背景技术

端粒酶 (Telomerase)是一种合成和延伸细胞染色体端粒的 核糖核蛋白， 它包 含两种基本成分：逆转录酶催化亚基 hTERT和 RNA组分 hTR。端粒酶能以自身 RNA为模板， 反转录合成端粒重复列， 加到染色体的末端， 以弥补细胞分裂时 端粒 DNA的丢失， 维持端粒的长度。 研究表明在正常人体细胞内端粒酶活性几 乎检测不到， 因此， 人正常体细胞分裂次数是有限的， 细胞每分裂一次， 端粒便 丢失 50-200bp， 当端粒缩短到一定程度时细胞生长受到抑制， 即称为细胞衰老， 并走向死亡。 然而， 在绝大多数恶性肿瘤细胞 (85%)中普遍可以检测到端粒酶活 性且活性较强， 端粒酶对端粒的重新合成补偿了它在细胞繁殖 过程中的持续丢 失， 从而使得细胞可以不断的分裂， 这是细胞永生化和癌变的一个重要机制。

Kim等分析总结了大量研究结果， 检测了 100多种恶性肿瘤标本， 指出端粒 酶诊断肿瘤的敏感性为 85%， 特异性为 91%， 阳性预测值为 91%， 阴性预测值 为 81%， 充分表明端粒酶在肿瘤诊断中的价值 (Kim NW， Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 1994 Dec 23; 266(5193):2011-5.)。 端粒酶的激活被认为是发生恶 性肿瘤的主要因素之一， 其激活及表达程度与肿瘤的发生和转移密切相 关， 抑制 端粒酶并使端粒缩短被认为是抑制癌细胞的一 种机制，因此端粒酶成为肿瘤靶向 治疗的理想靶点。 有许多公司正在开发端粒酶抑制剂治疗肿瘤， 其中 GRN163L 已经开始了临床 2期实验， 几个端粒酶疫苗也即将完成临床试验进入市场 。

LPTS (Liver Putative Tumor Suppressor) 是本发明人利用定位克隆的方法 从人的正常肝 cDNA文库中得到的一个肝相关的候选抑癌新基� � [ C. Liao， M.J. Zhao, H. Song, K. Uchida, K.K. Yokoyama, T.P. Li, Identification of the gene for a novel liver-related putative tumor suppressor at a high-frequency loss of

heterozygosity region of chromosome 8p23 in human hepatocellular carcinoma.

Hepatology 2000, 32 721-727] 。 LPTS基因定位于人第 8号染色体 8p23区段， 该区段在多种恶性肿瘤细胞中高频缺失。研究 表明 LPTS在肝癌组织及肝癌细胞 系中表达量极低或检测不到， 将 LPTS基因导入肝癌细胞， 能抑制肝癌细胞的生 长、 增殖、 最后引起死亡 [Liao C， Zhao MJ; Mutation analysis of novel human liver-related putative tumor suppressor gene in hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol, 2003， 9:89-93]]。 LPTS基因于 2004年已获得中国发明专利授权 (赵 慕钧等： "一种肝癌相关基因及其应用"， 专利号： ZL 00 1 15395. 1， 专利权人： 中国科学院上海生物化学研究所； 授权公告日： 2004年 10月 13 日）。 2001年 Lu博士的实验室报导了 LPTS基因的另一个全长转录本 PinXl ,发现 PinXl编码 的蛋白可以结合端粒酶催化亚基 hTERT并抑制端粒酶活性 [Zhou X.Z. , Lu K.P ； The Pin2/TRF 1 -interacting protein PinXl is a potent telomerase inhibitor. Cell, 2001， 107， 347-359] ， 从机制上第一次证明了 LPTS/PinXl作为一种天然的端 粒酶抑制蛋白可抑制肿瘤细胞的增殖， 为肿瘤的靶向治疗提供了新的途径。本发 明人在 2005年申请了一项有关制备 LPTS蛋白的发明专利 (赵慕钧等： "端粒酶 活性抑制蛋白的制备和纯化" ， 专利申请号： 200510030526.5， 申请日： 2005 年 10月 14日； 专利权人： 中国科学院上海生命科学研究院；)。 在该专利中提供 了 LPTS蛋白（LPGENEl)禾卩 LPTS抑制端粒酶的活性片段 LPTS 133-328(LPGENE2) 的制备方法， 并提供了 LPTS抑制端粒酶的活性片段位于其 C端的 133-328氨基 酸残基。 本发明人在 2008年申请的专利揭示了 TAT 与 LPTS 133-328 的融合蛋 白 （专利申请号： 200810041324.4)， 经证实该融合蛋白可穿透细胞膜的且具有极 其优异的抑制肿瘤细胞生长的效果。

鉴于 LPTS蛋白是一种与肿瘤细胞生长密切相关的重� �的蛋白， 因此非常需 要对其进行进一步地深入研究， 以开发出更为有效的肿瘤抑制药物， 满足临床应 用所需。 发明内容

本发明的目的在于提供一种高效抑制端粒酶活 性的蛋白肽段及其制备和应用

在本发明的第一方面， 提供一种分离的多肽 (蛋白；)， 所述多肽是：

(a) 包含 SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽；

(b) SEQ ID NO: 1氨基酸序列经过一个或多个 (如 1-10个； 较佳地 1-5个； 更 佳地 1-3个；)氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的， 且具有 (a)多肽功能的由 (a)衍生的多肽； 或

(c) 与 (a)限定的多肽序列有 90% (；较佳地 95%， 更佳地 98%， 最佳地 99%)以 上相同性且具有 (a) 多肽功能的由 (a)衍生的多肽。

在另一优选例中， 所述的多肽不具有 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列 (； LPTS全 长序列）， SEQ ID NO: 2中第 133-328位所示氨基酸序列 (LPTS ₁₃ w ₂₈ )和 SEQ ID NO: 2中第 254-328位所示氨基酸序列。

在另一优选例中， 所述的多肽包含 SEQ ID NO: 2 中第 255〜328 位所示氨 基酸序列， 或

包含 SEQ ID NO: 2 中第 256〜328 位所示氨基酸序列，或包含 SEQ ID NO: 2 中第 257〜328 位所示氨基酸序列， 或包含 SEQ ID NO: 2 中第 258〜328 位 所示氨基酸序列， 或

包含 SEQ ID NO: 2 中第 259〜328 位所示氨基酸序列，或包含 SEQ ID NO: 2 中第 260〜328 位所示氨基酸序列， 或包含 SEQ ID NO: 2 中第 261〜328 位 所示氨基酸序列， 或

包含 SEQ ID NO: 2 中第 262〜328 位所示氨基酸序列，或包含 SEQ ID NO: 2 中第 263〜328 位所示氨基酸序列， 或包含 SEQ ID NO: 2 中第 264〜328 位 所示氨基酸序列， 或

包含 SEQ ID NO: 2 中第 265〜328 位所示氨基酸序列，或包含 SEQ ID NO: 2 中第 266〜328 位所示氨基酸序列， 或包含 SEQ ID NO: 2 中第 267〜328 位 所示氨基酸序列， 或

包含 SEQ ID NO: 2 中第 268〜328 位所示氨基酸序列，或包含 SEQ ID NO:

2 中第 269〜328 位所示氨基酸序列， 或包含 SEQ ID NO: 2 中第 270〜328 位 所示氨基酸序列， 或

包含 SEQ ID NO: 2 中第 271〜328 位所示氨基酸序列，或包含 SEQ ID NO: 2 中第 272〜328 位所示氨基酸序列， 或包含 SEQ ID NO: 2 中第 273〜328 位 所示氨基酸序列， 或

包含 SEQ ID NO: 2 中第 274〜328 位所示氨基酸序列，或包含 SEQ ID NO: 2 中第 275〜328 位所示氨基酸序列， 或包含 SEQ ID NO: 2 中第 276〜328 位 所示氨基酸序列， 或

包含 SEQ ID NO: 2 中第 277〜328 位所示氨基酸序列，或包含 SEQ ID NO: 2 中第 278〜328 位所示氨基酸序列， 或包含 SEQ ID NO: 2 中第 279〜328 位 所示氨基酸序列， 或

包含 SEQ ID NO: 2 中第 280〜328 位所示氨基酸序列，或包含 SEQ ID NO: 2 中第 281〜328 位所示氨基酸序列， 或包含 SEQ ID NO: 2 中第 282〜328 位 所示氨基酸序列， 或

包含 SEQ ID NO: 2 中第 283〜328 位所示氨基酸序列，或包含 SEQ ID NO: 2 中第 284〜328 位所示氨基酸序列， 或包含 SEQ ID NO: 2 中第 285〜328 位 所示氨基酸序列， 或

包含 SEQ ID NO: 2 中第 286〜328 位所示氨基酸序列，或包含 SEQ ID NO: 2 中第 287〜328 位所示氨基酸序列， 或包含 SEQ ID NO: 2 中第 288〜328 位 所示氨基酸序列， 或

包含 SEQ ID NO: 2 中第 289〜328 位所示氨基酸序列，或包含 SEQ ID NO: 2 中第 290〜328 位所示氨基酸序列。 在本发明的另一方面， 提供一种分离的多核苷酸， 它含有一核苷酸序列， 该 核苷酸序列编码所述的多肽。 在本发明的另一方面， 提供一种载体， 它含有所述的多核苷酸。 在本发明的另一方面， 提供一种遗传工程化的宿主细胞， 它含有所述的载体

在本发明的另一方面， 提供一种所述的多肽的制备方法， 该方法包括：

(a) 在适合表达的条件下， 培养所述的宿主细胞；

(b) 从培养物中分离出所述的多肽。 在本发明的另一方面， 提供所述的多肽的用途， 用于制备抑制细胞内端粒酶 活性的组合物。

在另一优选例中， 所述的组合物用于防治端粒酶异常激活相关疾 病。

在另一优选例中， 所述的端粒酶异常激活相关疾病是肿瘤。 在本发明的另一方面， 提供一种复合物， 所述的复合物包含所述的多肽， 以 及与该多肽相容的物质。

在另一优选例中， 所述的复合物是融合蛋白， 所述的多肽与至少一条功能性 蛋白相连接 (；较佳地通过肽键连接；)， 所述的功能性蛋白有 5-500个 (；较佳地 5-300 个； 更佳地 10-250个)氨基酸。

在另一优选例中， 所述的功能性蛋白选自： 穿膜蛋白 (如反式激活蛋白 ΤΑΊ 标签蛋白 (如 GST蛋白）， 报告蛋白 (如 GFP蛋白）， 人血清白蛋白 (延长半衰期)， 人 IgGl : Fc片段 (延长半衰期)。

在另一优选例中， 所述的多肽与所述的功能性蛋白直接相连， 或通过连接肽 连接。 所述连接肽的长度为 1-20个氨基酸， 更佳为 2-10个氨基酸。 如所述连接 肽的氨基酸序列为： GGS。

在另一优选例中， 所述的融合蛋白不具有 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列 (LPTS全长序列）， SEQ ID NO: 2中第 133-328位所示氨基酸序列 (LPTS ₁₃ w ₂₈ )和 SEQ ID NO: 2中第 254-328位所示氨基酸序列。

在另一优选例中， 所述的复合物包含选自以下的物质： 蛋白活性促进剂、 蛋 白活性稳定剂、 延长蛋白半衰期的制剂 (如 PEG, PEG-脂质体；)。 在本发明的另一方面， 提供一种组合物， 它含有安全有效量的所述的多肽或 所述的复合物， 以及药学上可接受的载体。

在另一优选例中， 所述的组合物用于抑制细胞内端粒酶活性。

在另一优选例中， 所述的组合物用于防治端粒酶活性增高肿瘤。 在本发明的另一方面， 提供一种制备组合物的方法， 所述组合物抑制细胞内 端粒酶活性， 所述方法包括： 将安全有效量的所述的多肽或所述的复合物与 药学 上可接受的载体混合。 在本发明的另一方面， 提供一种药盒， 所述药盒中含有所述的多肽； 或含有 所述的复合物； 或含有所述的组合物。

在另一优选例中， 所述的药盒用于抑制细胞内端粒酶活性。

在另一优选例中， 所述的药盒用于防治端粒酶活性增高肿瘤。 在本发明的另一方面， 提供一种 (优选体外， 优选非治疗性地;)抑制细胞内端 粒酶活性的方法， 包括给予受试者有效量的所述的多肽； 或所述的复合物； 或所 述的组合物。 本发明的其它方面由于本文的公开内容， 对本领域的技术人员而言是显而 易见的。 附图说明

图 1、 SDS-PAGE显示 GST-LPTS _29Q _ ₃₂₈ 融合蛋白的诱导表达及纯化。

泳道 1为 IPTG诱导前的 GST-LPTS _29Q _ ₃₂₈ 基因工程菌表达的蛋白； 泳道 2为

IPTG诱导后该工程菌表达的蛋白； 泳道 3-5为纯化后收集到的 3管

GST-LPTS _290-328 蛋白。 图 2、 GST-LPTS ₂₉₀ -328 - GST-LPTS _133-328 以及 GST-LPTS抑制端粒酶活性的检 测与比较。

A、 GST-LPTS ₂₉₀ -328 - GST-LPTS ₁₃₃ _ ₃₂₈ 以及 GST-LPTS融合蛋白结构示意图;

B、 TRAP法检测 GST-LPTS _290-328 ， GST-LPTS _133-328 以及 GST-LPTS蛋白抑制 端粒酶的活性。 蛋白的用量分别为 5、 10、 25、 50、 100、 200、 250nM， 如图所 示。 GST蛋白作为对照。 检测样品经 10%PAGE非变性胶电泳后银染结果。 图 3、 LPTS _29Q _ ₃₂₈ 对肝癌 BEL7404细胞生长的影响。

A、 Western Blot检测 GFP、 GFP-LPTS、 GFP-LPTS _290-328 在其稳定转染细胞 株 GFP/7404 , GFP-LPTS/7404和 GFP-LPTS ₂₉ Q _-328 /7404中的表达。 兔源 anti-GFP 抗体作为杂交探针；

B、 MTT法绘制各稳定细胞株的生长曲线图；

C、 GFP/7404, GFP-LPTS/7404和 GFP-LPTS ₂₉ 。 _-328 /7404等细胞培养过程中细 胞状态图。 图中箭头所指为处于危机期、 衰老症状的细胞，

D、 为脱壁死亡后的 GFP-LPTS ₂₉₍ « ₂₈ /7404细胞。 图 4、 Southern Blot实验检测 LPTS和 LPTS ₂₉₍ « ₂₈ 对肝癌 BEL7404细胞端粒 长度的影响。 A、 转染 GFP或 GFP-LPTS的 BEL7404细胞经 FACS分选后持续培养， 选取 不同的培养代数 (； PD)细胞如图所示， 抽取其基因组 DNA， 经 Hinf l和 Afa l内切 酶消化后与单链端粒重复序列 ³² p-(TTAGGG) ₆ 探针杂交；

B、转染 GFP或 GFP-LPTS _29Q _ ₃₂₈ 的 BEL7404细胞经 FACS流式细胞仪分选后 倍增 8代， 抽取其基因组 DNA， 经 Hinf l和 Afa l内切酶消化后与单链端粒重复 序列 ³² p-(TTAGGG) ₆ 探针杂交。 本图为放射自显影后的结果。 具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次分离到 LPTS蛋白 （全长序列如 SEQ ID NO: 2) 的抑制端粒酶的活性区域， 该活性区域位于 LPTS蛋白的第 290-328位

(LPTS _29Q _ ₃₂₈ )。 该活性区域的活性超过全长 LPTS蛋白及 LPTS上的其它片段， 并 能更快地诱导肿瘤细胞死亡。本发明为肿瘤的 靶向治疗提供了更为有效的抑制端 粒酶活性的蛋白。 术语

如本文所用， "分离的"是指物质从其原始环境中分离出来 (如果是天然的物 质， 原始环境即是天然环境)。 如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多 肽 是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多 肽如从天然状态中同存在的其他物 质中分开， 则为分离纯化的。

如本文所用， "对象" 、 "个体" 、 或 "患者" 指需要进行诊断或治疗的 任何目标， 尤其是哺乳动物对象， 特别是人， 其它对象包括牛、 狗、 猫、 豚鼠、 兔、 大鼠、 小鼠、 马等。 特别受关注的是那些端粒酶异常激活的对象。

如本文所用， "核酸"和 "核酸序列"指聚合形式的任意长度的核苷酸 (核糖 核苷酸或脱氧核糖核苷酸；)。 它包括 (；但不限于;)单链、 双链的 DNA或 RNA， 基因 组 DNA和 cDNAo

如本文所用， "药学上可接受的"的成分是适用于人和 /或哺乳动物而无过度 不良副反应 （如毒性、 剌激和变态反应） 的， 即具有合理的效益 /风险比的物质。 术语 "药学上可接受的载体"指用于治疗剂给药的载� ��， 包括各种赋形剂或稀释 剂。

如本文所用， "有效量" 或 "安全有效量" 指以单剂或连续剂一部分给予个 体的量对治疗或预防是有效的。 该用量根据所治疗个体的健康状况和生理状况 、 所治疗个体的类别 （如非人灵长类等；)、 治疗医师对医疗状况的评估、 及其它的 相关因素而定。 预计该用量将在相对较宽的范围内， 可通过常规实验来确定。

如本文所用， 所述的 "含有" ， "具有" 或 "包括"包括了 "包含" 、 "主 要由 ......构成" 、 "基本上由 ......构成" 、 和 "由 ......构成" ； "主要由 ......构 成" 、 "基本上由 ......构成"和 "由 ......构成"属于 "含有" 、 "具有 "或 "包 括" 的下位概念。 本发明的多肽及其编码基因

LPTS是第一个被发现可以直接和人端粒酶催化� �基 hTERT结合并抑制端 粒酶催化活性的蛋白。 本发明人以全长的 LPTS蛋白为基础， 预测并筛选了多种 LPTS序列片段， 经过反复研究比较， 发现 LPTS蛋白抑制端粒酶的活性区域可 以缩小到该蛋白的第 290-328位氨基酸序列区域内， 该位置才是抑制端粒酶催化 活性的最关键区域， 其足以发挥抑制端粒酶催化活性的作用， 从而获得了本发明 的多肽。

为了验证所述的多肽的功能， 本发明人在体外通过基因工程技术表达了 GST-LPTS _29Q _ ₃₂₈ 融合蛋白。 在本发明的一个实施例中， 采用测定端粒酶活性的 TRAP(telomeric repeat amplification protocol)实验技术， 检测了 GST-LPTS _290-328 融 合蛋白在体外抑制肿瘤细胞端粒酶的活性。 该方法是一种基于 PCR技术的端粒酶 活性检测方法，端粒酶来源于一种肝癌细胞裂 解液。检测结果发现 GST-LPTS ₂₉₍₎ _ ₃₂₈ 有很强的抑制端粒酶的活性。 为此， 本发明人进一步比较了 GST-LPTS _29Q _ ₃₂₈ 与 GST-LPTS和 GST-LPTS ₁₃ w ₂₈ 蛋白的活性。 检测结果表明 GST-LPTS和

GST-LPTS ₁₃₃ _ ₃₂₈ 蛋白在 50nM的时候显示有抑制端粒酶的活性， 100nM的时候抑 制活性较强，但不能完全抑制反应体系中的端 粒酶； 而 LPTS _29Q _ ₃₂₈ 在 50nM的时候 抑制活性已很强， 在 ΙΟΟηΜ的时候可完全抑制体系中的端粒酶活� �。 以上结果说 明 LPTS _29Q _ ₃₂₈ 具有比全长 LPTS和 LPTS ₁₃₃ _ ₃₂₈ 更强的端粒酶抑制活性， 是 LPTS蛋 白抑制端粒酶活性的功能域。

为了检测 1^18 ₂₉₍₎ _ ₃₂₈ 在体内抑制肿瘤细胞的活性， 在本发明的一个实施例中， 构建了 LPTS _29Q _ ₃₂₈ 、 LPTS与绿色荧光蛋白 GFP融合的真核表达质粒，

GFP-LPTS ₂₉₍ « ₂₈ 和 GFP-LPTS。 在肝癌 BEL7404细胞中分别转染 GFP-LPTS ₂₉₍ « ₂₈ ， GFP-LPTS以及对照 GFP表达质粒， 经 2周的 G418筛选之后， 分别采用流式细胞 仪 FACS分选出有绿色荧光蛋白表达的细胞， 然后进行传代培养。 分选得到的 GFP-LPTS ₂₉₀ -328/7404, GFP-LPTS/7404, GFP/7404细胞， 利用兔源 anti-GFP多克 隆抗体进行 western blot检测， 发现都可以稳定表达相应的蛋白。 在细胞传代培养 的过程中， GFP-LPTS ₂₉₍ « ₂₈ /7404细胞的生长较 GFP-LPTS/7404和 GFP/7404的要 慢。 本发明人选取 FACS分选后倍增 5代的上述稳定细胞株， 进行了 MTT试验， 并绘制生长曲线。 结果证明， 与对照 GFP/7404细胞相比较， GFP-LPTS _29Q _ ₃₂₈ /7404 细胞生长最慢， GFP-LPTS/7404渐次。 说明 LPTS _29Q _ ₃₂₈ 抑制肿瘤细胞的生长能力 较其全长蛋白 LPTS要强。 在肿瘤细胞中过表达 LPTS蛋白， 可以导致细胞生长变 慢、 变扁平、 进入危机期， 最终死亡。 但这是一个较长期的效应， 一般需要培养 6 周后出现。 细胞在转染 LPTS _29Q _ ₃₂₈ 后， 很快发生死亡， 经 2周的 G418筛选之后只 能获得少量细胞进行 FACS分选， 分选获得的 LPTS _29Q _ ₃₂₈ /7404细胞继续培养 10 天左右， 就相继出现衰老症状， 并且很快就全部变圆后脱壁死亡。 结果说明过表 达 LPTS _29Q _ ₃₂₈ 导致肿瘤细胞死亡的能力很强，可能比 LPTS全长蛋白抑制肿瘤的效 率要高， 更有应用价值。

为了证明 LPTS _29Q _ ₃₂ ^ 制肿瘤细胞是靶向抑制细胞端粒的合成， 在本发明的 一个实施例中， 采用 Southern Blot方法检测了 GFP-LPTS ₂₉₍ « ₂₈ /7404，

GFP-LPTS/7404, GFP/7404细胞端粒的长度。 实验结果表明， 对照 GFP/ 7404细 胞传代过程中端粒保持稳定， 长度在 4.5kb左右； GFP-LPTS/7404细胞在传代过程 中端粒逐渐缩段， 在培养第 5代时端粒缩短至 3.8kb左右， 第 25代的时候端粒缩 短到 2.8kb左右； GFP-LPTS _29Q _ ₃₂₈ /7404细胞传代时间短， 培养过程中细胞死亡多， 在第 8代时端粒已经缩短至 2.5kb左右了。 结果说明， LPTS _29Q _ ₃₂₈ 有着非常强的端 粒酶抑制活性， 其在细胞体内能抑制端粒的合成和延伸， 是一种靶向抑制端粒酶 的肿瘤抑制肽。

由于本发明揭示了抑制端粒酶催化活性的最关 键区域， 因此可以理解， 一些 蛋白（比如一些包含有本发明的多肽的融合蛋 白；)， 只要它们包含有该最关键区域、 且不包含影响该关键区域结构或活性的因素 (可通过有限次实验方便地验证；)，也将 具有抑制端粒酶催化活性的作用， 这些蛋白也被包含在本发明中。 本发明的多肽可以是重组多肽、 天然多肽、 合成多肽， 优选重组多肽。 本发 明的多肽可以是天然纯化的产物， 或是化学合成的产物， 或使用重组技术从原核 或真核宿主 (例如， 细菌、 酵母、 高等植物、 昆虫和哺乳动物细胞;)中产生。 根据 重组生产方案所用的宿主， 本发明的多肽可以是糖基化的， 或可以是非糖基化的 。 本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨 酸残基。

本发明还包括所述多肽的片段、 衍生物和类似物。 如本文所用， 术语 "片段 "、 "衍生物"和 "类似物"是指基本上保持本发明所述多肽相同� ��生物学功能 或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或 类似物可以是 ω有一个或多个保守 或非保守性氨基酸残基 (优选保守性氨基酸残基;)被取代的多肽， 而这样的取代的 氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码 的， 或 (ϋ)在一个或多个氨基酸残 基中具有取代基团的多肽，或 ( )成熟多肽与另一个化合物 (比如延长多肽半衰期 的化合物， 例如聚乙二醇;)融合所形成的多肽， 或 (iv)附加的氨基酸序列融合到此 多肽序列而形成的多肽 (如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的� �列或蛋白 原序列， 或与 IgG片段的形成的融合蛋白；)。 根据本文的教导， 这些片段、 衍生 物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范 围。

本发明还包括具有与所述多肽相同功能的、 SEQ ID NO: 1序列的变异形式。 这些变异形式包括 (但并不限于 一个或多个 (通常为 1-10个， 较佳地 1-5个， 更佳地 1-3个， 最佳地 1-2个；)氨基酸的缺失、 插入和 /或取代， 以及在 C末端和 / 或 N末端添加一个或数个 (通常为 10个以内， 较佳地为 5个以内， 更佳地为 3 个以内;)氨基酸。 例如， 在本领域中， 用性能相近或相似的氨基酸进行取代时， 通常不会改变蛋白质的功能。 又比如， 在 C末端和 /或 N末端添加一个或数个氨 基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还 包括所述多肽的活性片段和活性衍 生物。

该多肽的变异形式包括： 同源序列、 保守性变异体、 等位变异体、 天然突变 体、 诱导突变体、 在高或低的严紧度条件下能与所述多肽杂交的 DNA所编码的 蛋白、 以及利用抗所述多肽的抗血清获得的多肽或蛋 白。本发明还提供了其他多 肽， 如包含所述多肽或其片段的融合蛋白。

发明还提供所述多肽或多肽的类似物。 这些类似物与天然所述多肽的差别可 以是氨基酸序列上的差异， 也可以是不影响序列的修饰形式上的差异， 或者兼而 有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体 。诱导变异体可以通过各种技术得 到， 如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变， 还可通过定点诱变法或其他已 知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同 于天然 L-氨基酸的残基 (如 D-氨基 酸)的类似物， 以及具有非天然存在的或合成的氨基酸 (如 β、 Υ -氨基酸)的类似 物。 应理解， 本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多 肽。

修饰 (通常不改变一级结构)形式包括： 体内或体外的多肽的化学衍生形式如 乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化， 如那些在多肽的合成和加工中或进一步加 工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种 修饰可以通过将多肽暴露于进行糖 基化的酶 (如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成� �� 修饰形式还包括具有磷 酸化氨基酸残基 (如磷酸酪氨酸， 磷酸丝氨酸， 磷酸苏氨酸)的序列。 还包括被修 饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解 性能的多肽。

在本发明中， "所述多肽保守性变异多肽"指与 SEQ ID NO: 1的氨基酸序列 相比， 有至多 10个， 较佳地至多 5个， 更佳地至多 3个， 最佳地至多 2个氨基 酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多 肽。这些保守性变异多肽最好根据 表 1进行氨基酸替换而产生。

Val (V) lie; Leu; Met; Phe; Ala Leu 本发明所述多肽的用途包括 (但不限于；)： 直接做为药物治疗端粒酶异常激活 相关的疾病 (如肿瘤)。

含有或偶联有所述多肽的融合分子也包括在本 发明中。 例如， 可构建本发明 的多肽与靶向分子的融合分子；该种融合分子 由于包含了靶向于特定组织或器官 的分子而可实现在局部区域增加药物的浓度， 而不影响其它区域； 所述的靶向分 子例如是： 抗体、 配体等。 又例如， 可构建本发明的多肽与多聚分子的融合分子 ； 该融合分子的半衰期增长； 所述的多聚分子例如是 IgG Fc。

含有所述多肽的编码序列的融合基因也包括在 本发明中。 例如， 可构建含有 所述多肽的编码序列以及组织或器官特异性启 动子 (两者操作性连接；)的融合基 因， 所述基因当施加于体内后， 被启动子驱动在特定的组织或器官内表达。

本发明还包含一些复合物， 该复合物含有本发明的多肽， 以及与本发明的多 肽相连接或偶联的其它功能性蛋白或分子。 这些功能性蛋白 (有 5-500个； 较佳 地 5-300个； 更佳地 10-250个氨基酸)包括但不限于： 穿膜蛋白， GST蛋白 (纯化 标签)， GFP蛋白 (报告蛋白）， 人血清白蛋白 (延长半衰期)， 人 IgGl : Fc片段 (延 长半衰期;)等。 其它分子还可以是选自以下的物质： 蛋白活性促进剂、 蛋白活性 稳定剂、 延长蛋白半衰期的制剂。 所述的延长蛋白半衰期的制剂例如是 PEG (可 用于与本发明的多肽的氨基端或羧基端联接； )， PEG-脂质体 (可用于包埋本发明的 多肽）， 所述的 PEG的分子量可以是 1000-50000; 较佳地 20000-40000。

作为本发明的一种实施方式， 所述的多肽可与一些对于穿透细胞膜有效的分 子融合或偶联，从而更方便地进入到细胞内发 挥作用。已知的穿膜蛋白有许多种， 包括： 反式激活蛋白 TAT、 Penetratin、 基于信号序列的肽、 pVEC、 Transportan, Amphiphilic model peptide禾口 Arg9等等。 本发明的多核苷酸可以是 DNA形式或 RNA形式。 DNA形式包括 cDNA、 基 因组 DNA或人工合成的 DNA。 DNA可以是单链的或是双链的。 DNA可以是编 码链或非编码链。

术语 "编码多肽的多核苷酸" 可以是包括编码此多肽的多核苷酸， 也可以是 还包括附加编码和 /或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体， 其编码与本发明有相同的氨基酸序列 的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多 核苷酸的变异体可以是天然发生的 等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷 酸变异体包括取代变异体、缺失变 异体和插入变异体。 如本领域所知的， 等位变异体是一个多核苷酸的替换形式， 它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插 入， 但不会从实质上改变其编码的 多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之 间具有至少 50%， 较佳地至少 70%， 更佳地至少 80%相同性的多核苷酸。 本发明特别涉及在严格条件下与本发 明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。 在本发明中， "严格条件"是指： （1)在较 低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱， 如 0.2 X SSC, 0.1%SDS, 60°C ; 或 (2)杂 交时加有变性剂， 如 50%(v/v)甲酰胺， 0.1%小牛血清 /0.1% Ficoll， 42°C等； 或 (3) 仅在两条序列之间的相同性至少在 90%以上,更好是 95%以上时才发生杂交。 并 且， 可杂交的多核苷酸编码的多肽与 SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生 物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。 如本文所用， "核酸片段" 的 长度至少含 15个核苷酸， 较好是至少 30个核苷酸， 更好是至少 50个核苷酸， 最好是至少 100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增 技术 (如 PCR)以确定 和 /或分离编码本发明所述多肽的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式 提供， 更佳地被纯化至均质。 本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用 PCR扩增法、重组法或人工合 成的方法获得。 对于 PCR扩增法， 可根据本发明所公开的有关核苷酸序列， 尤 其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的 cDNA库或按本领域技术人员已知 的常规方法所制备的 cDNA库作为模板， 扩增而得有关序列。 当序列较长时， 常 常需要进行两次或多次 PCR扩增， 然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接 在一起。

一旦获得了有关的序列， 就可以用重组法来大批量地获得有关序列。 这通常 是将其克隆入载体， 再转入细胞， 然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离 得到有关序列。

此外， 还可用人工合成的方法来合成有关序列， 尤其是片段长度较短时。 通 常， 通过先合成多个小片段， 然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前， 已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明 蛋白 (或其片段， 或其衍 生物;)的 DNA序列。然后可将该 DNA序列引入本领域中已知的各种现有的 DNA 分子 (或如载体)和细胞中。 此外， 还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列 中。

应用 PCR技术扩增 DNA/RNA的方法 (Saiki, et al. Science 1985;230： 1350-1354) 被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从 文库中得到全长的 cDNA时， 可优 选使用 RACE法 (RACE-cDNA末端快速扩增法；)，用于 PCR的引物可根据本文所 公开的本发明的序列信息适当地选择， 并可用常规方法合成。可用常规方法如通 过凝胶电泳分离和纯化扩增的 DNA/RNA片段。 载体和细胞

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体， 以及用本发明的载体或编码序 列经基因工程产生的宿主细胞， 以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组 DNA技术 (Science, 1984； 224： 1431)， 可利用本发明的多 聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的本发明 的多肽。 一般来说有以下步骤：

(1) .用本发明的编码所述多肽的多核苷酸 (或变异体；)， 或用含有该多核苷酸的 重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2) .在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3) .从培养基或细胞中分离、 纯化蛋白质。

本发明中， 本发明的多核苷酸序列可插入到重组表达载体 中。 术语 "重组表 达载体"指本领域熟知的细菌质粒、 噬菌体、 酵母质粒、 植物细胞病毒、 哺乳动 物细胞病毒如腺病毒、 逆转录病毒或其他载体。 只要能在宿主体内复制和稳定， 任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重 要特征是通常含有复制起点、启动 子、 标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本 发明的多核苷酸序列和合适的 转录 /翻译控制信号的表达载体。 这些方法包括体外重组 DNA技术、 DNA合成 技术、 体内重组技术等。 所述的 DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动 子上， 以指导 mRNA合成。 这些启动子的代表性例子有： 大肠杆菌的 lac或 trp 启动子； λ噬菌体 PL启动子； 真核启动子包括 CMV立即早期启动子、 HSV胸 苷激酶启动子、 早期和晚期 SV40启动子、 反转录病毒的 LTRs和其他一些已知 的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表 达的启动子。表达载体还包括翻译 起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外， 表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基 因， 以提供用于选择转 化的宿主细胞的表型性状， 如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素 抗性以 及绿色荧光蛋白 (GFP)， 或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当 DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体， 可以用于 转化适当的宿主细胞， 以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞， 如细菌细胞； 或是低等真核细胞， 如酵母细胞； 或是高等真核细胞， 如哺乳动物细胞。 代表性例子有： 大肠杆菌， 链霉菌属； 鼠 伤寒沙门氏菌的细菌细胞； 真菌细胞如酵母； 植物细胞； 果蝇 S2或 Sf9的昆虫 细胞； CHO、 COS, 293细胞、 或 Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时， 如果在载体中插入增强子序列 时将会使转录得到增强。 增强子是 DNA的顺式作用因子， 通常大约有 10到 300 个碱基对， 作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子 包括在复制起始点晚期 一侧的 100到 270个碱基对的 SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增� � 子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载 体、 启动子、 增强子和宿主细 胞。

用重组 DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常 规技术进行。 当宿 主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收 DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获， 用 CaCl ₂ 法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。 另一种方法是使用 MgCl ₂ 。 如 果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿 主是真核生物，可选用如下的 DNA 转染方法： 磷酸钙共沉淀法， 常规机械方法如显微注射、 电穿孔、 脂质体包装等 获得的转化子可以用常规方法培养， 表达本发明的基因所编码的多肽。 根据 所用的宿主细胞， 培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。 在适于宿主细胞 生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适 当的细胞密度后，用合适的方法 (如 温度转换或化学诱导;)诱导选择的启动子， 将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、 或在细胞膜上表达、 或分泌到细胞 外。 如果需要， 可利用其物理的、 化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯 化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所 熟知的。这些方法的例子包括但并 不限于： 常规的复性处理、 用蛋白沉淀剂处理 (盐析方法)、 离心、 渗透破菌、 超 处理、 超离心、 分子筛层析 (凝胶过滤)、 吸附层析、 离子交换层析、 高效液相层 析 (HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结 合。 作为本发明的一个具体实施方式， 主要通过 PCR扩增获得 LPTS _29Q _ ₃₂₈ 基因 序列， 通过特异设计引物从模板 pT-LPTS质粒扩增。 将 LPTS _29Q _ ₃₂₈ 基因片段， 插入 pGEX-4T-l质粒， 该质粒可表达 GST荧光蛋白， 得到 pGEX-LPTS _29Q _ ₃₂₈ 重 组质粒。 将 pGEX-LPTS _29Q _ ₃₂₈ 重组质粒转化表达宿主菌 co// BL-21(DE3)， 从而 得到 GST- LPTS _29Q _ ₃₂₈ 融合蛋白表达工程菌。 GST-LPTS _29Q _ ₃₂₈ 在大肠肝菌中通过 IPTG进行诱导表达，使用商品化的亲和纯化柱 GS-4B进行 GST-LPTS _29Q _ ₃₂₈ 融合 蛋白的纯化制备。 组合物

本发明还提供了包含本发明的多肽的各种组合 物， 特别是药物组合物。 该组 合物可用于预防或治疗端粒酶异常激活相关疾 病， 所述疾病包括 (但不限于 肿 瘤。

包含本发明的多肽的各种组合物可以包含按多 肽的实际用途所选用的缓冲剂 ； 还可包含适用于预定用途的其它物质。本领域 技术人员都善于选择合适的缓冲 剂， 本领域已知有多种缓冲剂适用于预定用途。 在有些实例中， 该组合物可含有 药学上可接受的赋形剂， 本领域已知有多种而无需在此详细讨论。药学 上可接受 的各种赋形剂在多种出版物已有详述， 包括如 "Remington's Pharmaceutical Sciences" ( 《雷明顿药物科学》 ， 第 19版（1995)Mack Publishing Co.)。

可将本发明的组合物制备成各种剂型， 如注射剂、 粒剂、 片剂、 丸剂、 栓剂、 胶囊、 悬浮液、 喷雾、 栓剂、 透皮药物 (如贴片等；)、 油膏、 洗剂等。 适用于口服 或局部使用的药用级别的有机或无机载体和 /或稀释剂， 可用于配制包含治疗活 性化合物的各种组合物。本领域已知的稀释剂 包括水性介质、植物性和动物性油 和脂肪。 还可用稳定剂、 润湿剂和乳化剂、 改变渗透压的盐类或维持合适 pH值 的各种缓冲剂和皮肤渗透增强剂等作为辅助性 材料。

给予本发明组合物的常规和药学上可接受的途 径包括： 肌内、 皮下、 皮内、 肺内、 静脉内、 瘤内、 经鼻、 经口服或其它肠胃外给药途径。 如果需要可以组合 给药途径， 或按疾病情况进行调节。 可以单剂量或多剂量给予。

所选用的多肽的量， 是按可产生抑制端粒酶活性的效果而无明显的 副作用的 量而定。 通常， 给予约 O.Ol w g-lOmg多肽 /kg体重， 优选 O. l w g-lmg多肽 /kg体 重， 更优选0.1 4 ₈ -10(^ 8多肽/1¾体重。 药盒

本发明还提供了一种防治端粒酶异常激活相关 疾病的药盒， 其中含有本发明 的多肽或含有该多肽的组合物。 此外， 为了方便给药， 所述的药盒中还可含有注 射用的针， 和 /或药学上可接受的载体， 和 /或使用说明书。 本发明的优点：

1、首次发现 LPTS _29Q _ ₃₂₈ 在体外具有非常显著的端粒酶抑制活性， 而且是 LPTS 中已知的具有端粒酶抑制能力最强的区域。

2、首次发现异源表达 LPTS _29Q _ ₃₂₈ 可以抑制肿瘤细胞生长， 导致细胞端粒缩短 并最终死亡。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件如 Sambrook等人， 分子克隆： 实验室指南 （New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的 条件。

除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟 练人员所熟悉 的意义相同。此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆 可应用于本发 明中。 文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用 。 实施例 1、 LPTS ₂₉ o_ ₃₂₈ 基因片段的制备

pT-LPTS质粒的构建： 设计引物 L1 :

5 ' - AGGAATTC ATGTCT ATGCTGGCTGAACG-3 ' (SEQ ID NO: 3)； 禾卩 L2:

5'-ACGCTCGAGCTTTGGAATCTTTCTTCTTCT-3'(SEQ ID NO: 4)。 利用该对引 物从正常人肝组织中反转录 PCR扩增获得 LPTS全长 cDNA片段。 PCR产物装 入 pMD-18T载体 (购自 TaKaRa公司）， 从而获得 pT-LPTS质粒。

LPTS _29Q _ ₃₂₈ 基因片段通过 PCR方法从 pT-LPTS质粒扩增 (该质粒含有 LPTS 基因全长 cDNA片段)。 设计 PCR引物 P1 :

5 ' - AGGAATTC ACCCTGAAGCCCAAAAAGAGG -3，（SEQ ID NO: 5)和 P2:

5'-ACGCTCGAGCTTTGGAATCTTTCTTCTTCTTCT -3'(SEQ ID NO: 6)。 以 pT-LPTS质粒为模板， 用引物 PI和 P2进行 PCR反应。 PCR反应条件为： 94 °C 30秒， 55°C退火 30秒， 72°C延伸 30秒， 共扩增 30个循环。 PCR扩增后得到的 DNA产物经 DNA测序确定无误后， 即获得 LPTS _29Q _ ₃₂₈ 基因片段，用于后续 GST 融合蛋白和真核表达质粒的构建。该 LPTS _29Q _ ₃₂₈ 基因序列所编码的氨基酸序列见 SEQ ID NO: 1。

作为对照用的 LPTS ₁₃₃ _ ₃₂₈ 基因片段通过上述相同方法获得， PCR引物为 P3 : 5 ' - ACGCTCGAGAAGGATCTGTC ATCTCGG-3 ' (SEQ ID NO: 7)和 P2。LPTS基因 序列从质粒 pT-LPTS中通过 EcoR I和 Xho l双酶切后得到， 该基因片段编码的 蛋白对应于 LPTS蛋白的全长。 实施例 2、 GST-LPTS ₂₉ o_ ₃₂₈ 融合蛋白表达工程菌的构建和诱导

实施例 1中得到的 LPTS _29Q _ ₃₂₈ 基因片段和 LPTS ₁₃₃ _ ₃₂₈ 基因片段均经 EcoR I 和 Xho I双酶切， 然后插入 pGEX-4T-l质粒 (购自 Amersham Pharmacia公司）， 该质粒能表达 GST蛋白。 实施例 1中得到的 LPTS基因片段可直接插入 pGEX-4T-l质粒，获得 pGEX-LPTS _290-328 、 pGEX-LPTS _133-328 禾卩 pGEX-LPTS重组 质粒。将这三种重组质粒分别转化宿主菌 co// DH5a， 再从 co// DH5a转化菌 株中抽取质粒， 测序验证无误后再转化蛋白表达宿主菌 co// BL-21(DE3)， 从 而得到 GST-LPTS ₂₉₍ « ₂₈ 、 GST-LPTS ₁₃ w ₂₈ 和 GST-LPTS融合蛋白表达工程菌株。

GST-LPTS _29Q-328 在大肠肝菌 BL-21 (DE3) 中的诱导表达。 含

pGEX-LPTS _29Q _ ₃₂₈ 质粒的融合蛋白表达工程菌先 37°C过夜扩增培养，第二天按照 1: 100比例接种于 400毫升含 Ampf抗生素的 LB培养基中， 37°C继续培养至 OD600约等于 0.6时加入 IPTG至终浓度 0.5 mM， 37°C诱导表达 3-4小时。 5000 rpm， 10分钟离心收集菌体， 弃上清， 剩下的菌体保存于 -80°C备用。 该菌体含 有目标 GST-LPTS _29Q _ ₃₂₈ 融合蛋白 (；见图 1)。 采用同样的方法， 本发明人诱导表达 了 08丁-1^丁8 ₁₃₃ _ ₃₂₈ 和 GST-LPTS融合蛋白。 GST以及上述融合蛋白的结构示意 图见图 2A。

图 1是 10%SDS-PAGE胶电泳后考马斯亮蓝染色后的结果， 泳道 1为 IPTG 诱导前的工程菌， 泳道 2为 IPTG诱导后的工程菌， 在 40kD处有特异条带被诱 导出， 为 GST-LPTS ₂₉₍ « ₂₈ 蛋白。 实施例 3、 GST-LPTS ₂₉₍₎ _ ₃₂₈ 融合蛋白的纯化制备

GST-LPTS ₂₉₀ -328融合蛋白的纯化制备使用商品化的亲� �纯化柱 GS-4B (；购自 Sigma公司）进行。 该亲和纯化柱为还原性谷胱苷肽 GSH和 Sepharose 4B耦合而 成，上样前先按照厂商说明装填至终体积 2毫升左右，并用 20〜30 ml溶液 A (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.2 mM EDTA, I mM DTT, 0.5mM PMSF, 1 M NaCl)平 衡。 实施例 2中最终获得的菌体用 10 ml溶液 A重悬， 超声波破碎细菌 (；超声仪 为宁波新芝制造;)，超声条件如下：工作时间 7秒，间隙时间 25秒，工作功率 400W, 工作次数 20-30次）。 超声后的菌体液加入 TritonX-100至终浓度 1%， 冰上放置 30分钟； 然后 12000 rpm， 4°C下离心 10分钟， 离心后的上清转移到新的离心管 继续重复离心一次； 再次离心后得到的含融合蛋白的上清液， 连到平衡好的 GS-4B纯化柱， 在压力差下过柱； 样品过柱完后， 用 20〜30 ml溶液 A洗柱子； 然后继续用 20〜30 ml溶液 B (20 mM Tris-HCl pH 7.4， 0.2 mM EDTA， 0.1 M NaCl) 洗柱子； 最终用 5 ml溶液 C (15 mM还原型谷胱苷肽 GSH， 20 mM Tris-HCl pH 7.4， 0.2 mM EDTA, 0.1 M NaCl )洗脱蛋白， 共收集 3管， 每管约 1.5毫升， 收 集的纯化后蛋白可于 -80°C保存备用。 采用同样的方法， 本发明人纯化获得了 GST-LPTS _133-328 禾卩 GST-LPTS蛋白备用。

图 1中泳道 3， 4， 5为洗脱收集到的 3管蛋白。 可以看到， 纯化后得到的 GST-LPTS _29Q _ ₃₂₈ 蛋白条带单一， 纯度可以达到 95%以上， 可以用来做进一步的应 用。 收集到的 GST-LPTS ₂₉₍ « ₂₈ 蛋白经 Bradford法测定浓度。 实施例 4、 GST-LPTS ₂₉ o_ ₃₂₈ 融合蛋白抑制端粒酶活性的检测以及与

GST-LPTS, GST-LPTS ₁₃ 3-328蛋白抑制活性的比较

为了检测 08^1^18 ₂₉₍₎ _ ₃₂₈ 融合蛋白抑制端粒酶的活性， 本发明人采用了体 外 TRAP实验。 TRAP(telomeric repeat amplification protocol)是一种基于 PCR技 术的端粒酶活性检测方法。 首先制备含有端粒酶的肝癌 BEL7404细胞裂解液， 将处于对数生长旺盛期的 BEL7404细胞 (购自中国科学院上海细胞库;)用

Washing Buffer(10 mM Hepes-KOH pH7.5， 1.5mM MgCl ₂ ， 10 mM KC1， 1 mM DTT) 洗 2遍； 每 10 ⁶ 个细胞用 1毫升冰预冷的 Lysis Buffer ( 10 mM Tris-HCl pH 7.5， 1 mM MgCl ₂ ， 1 mM EGTA， 0.1 mM PMSF, 5 mM巯基乙醇， 0.5% CHAPS, 10% glycerol )重悬， 置冰上裂解 30分钟； 然后 15000rpm， 4°C高速离心 30分钟， 得 到的上清即为含有端粒酶的肝癌 BEL7404细胞裂解液。 该细胞裂解液可保存在 -80°C冰箱。

TRAP反应先取 l L 细胞裂解液， 加入 GST-LPTS _29Q _ ₃₂₈ 蛋白或者其他待测 定蛋白， 冰上混合 10分钟； 然后再加入 l L Ts 引物 （0.1 g/ L， 序列为 5 ' -AATCCGTCGAGCAGAGTT-3 ' )， 0.25 10 mM dNTP， 42 反应缓冲 液 （20 mM Tris-HCl pH8.3， 1.5 mM MgCl ₂ ， 63 mM KC1， 0.005% Tween-20, 1 mM EGTA， 0.1 mg/ml BSA)， 以上总体积一共为 50 μ ■, 然后在 25 °C下延伸反应 30 分钟， 90°C灭活 3分钟； 再加入 l L Cx 引物 (序列为

5， -GCGCGG(CCCTTA) ₃ CCCTAA-3， )， 0.5 μ (2 U) Taq酶，进行 PCR反应 (94 。C 40秒， 50°C退火 40 秒， 72°C延伸 1分钟， 扩增 30个循环）； PCR产物进行

10% PAGE非变性胶分离后银染显色。 显色结果中条带越多说明体系中的端粒 酶活性越高， 反之说明体系中的端粒酶活性被抑制的越多。

图 2B为 TRAP实验结果， 从图中可以看出 GST-LPTS和 GST-LPTS ₁₃ ^ ₃₂₈ 蛋 白在 50nM的时候显示有抑制端粒酶的活性， ΙΟΟηΜ的时候抑制活性较强， 但不 能完全抑制反应体系中的端粒酶；而 GST-LPTS _29Q _ ₃₂₈ 在 50nM的时候抑制活性已 很强， 在 ΙΟΟηΜ的时候可完全抑制体系中的端粒酶活� �。

以上结果说明， LPTS _29Q _ ₃₂₈ 具有比全长 LPTS和 LPTS ₁₃₃ _ ₃₂₈ 更强的端粒酶抑 制活性， 是 LPTS蛋白抑制端粒酶活性的功能域。 实施例 5、 LPTS ₂₉₍₎ _ ₃₂₈ 抑制肝癌细胞 BEL7404的生长并导致其死亡 为了检测 1^18 ₂₉₍₎ _ ₃₂₈ 在体内抑制肿瘤细胞的活性， 本发明人构建了

LPTS _29Q _ ₃₂₈ 、 LPTS与绿色荧光蛋白 GFP融合的真核表达质粒。 具体操作如下： 将实施例 1中得到的 LPTS _29Q _ ₃₂₈ 基因片段， 经 EcoR I和 Xho l双酶切后插入 pEGFP-C2质粒 (；购自 Clontech；)， 得到 pEGFP-LPTS ₂₉₍ « ₂₈ 表达质粒。 利用 EcoR I 和 Xho I双酶切 pT-LPTS质粒得到 LPTS基因 cDNA片段， 同样插入 pEGFP-C2 质粒， 得到 pEGFP-LPTS表达质粒。 pEGFP-C2可表达 GFP蛋白作为对照。 上 述质粒转染 BEL7404细胞后可以表达相应的蛋白。

在肝癌 BEL7404细胞中分别转染 GFP-LPTS _29Q _ ₃₂₈ ，GFP-LPTS以及对照 GFP 表达质粒， 经 2周的 G418筛选之后， 分别采用流式细胞仪 FACS分选出有绿色 荧光蛋白表达的细胞， 然后进行传代培养。 分选得到的 GFP-LPTS _29Q _ ₃₂₈ /7404， GFP-LPTS/7404, GFP/7404细胞，利用兔源 anti-GFP多克隆抗体进行 Western Blot 检测， 发现都可以稳定表达相应的蛋白， 如图 3A中所显示。

在细胞传代培养的过程中， GFP-LPTS _29Q _ ₃₂₈ /7404细胞的生长较

GFP-LPTS/7404和 GFP/7404的要慢。 本发明人选取 FACS分选后倍增 5代的上 述稳定细胞株，进行了 MTT试验，并绘制生长曲线。结果证明，与对照 GFP/7404 细胞相比较， GFP-LPTS ₂₉₍ « ₂₈ /7404细胞生长最慢， GFP-LPTS/7404渐次， 见图 3B。

说明 LPTS _29Q _ ₃₂₈ 抑制肿瘤细胞的生长能力较其全长蛋白 LPTS要强。

在肿瘤细胞中过表达 LPTS蛋白， 可以导致细胞生长变慢、 变扁平、 进入危 机期， 最终死亡。 这是由于 LPTS蛋白抑制了肿瘤细胞的端粒酶活性， 使细胞的 端粒不能延伸而变短， 导致细胞衰老而死亡。 但这是一个较长期的效应， 一般需 要培养 6周后出现。但细胞在转染 LPTS _29Q _ ₃₂₈ 后，很快发生死亡，经 2周的 G418 筛选之后只能获得少量细胞进行 FACS分选， 分选获得的 LPTS _29Q _ ₃₂₈ /7404细胞 继续培养 10天左右， 就相继出现衰老症状， 并且很快就全部变圆后脱壁死亡， 见图 3C。

以上结果说明， 过表达 LPTS _29Q _ ₃₂₈ 导致肿瘤细胞死亡的能力很强， 比 LPTS 全长蛋白抑制肿瘤的效率要高， 更有应用价值。 实施例 6、 LPTS ₂₉₍₎ _ ₃₂₈ 缩短肝癌 BEL7404细胞端粒长度

为了证明 LPTS _29Q _ ₃₂ ^ 制肿瘤细胞是靶向抑制细胞端粒的合成，本发 明人采 用 Southern Blot方法检测了 GFP-LPTS ₂₉ 。 _-328 /7404， GFP-LPTS/7404, GFP/7404 细胞端粒的长度。 采用 FACS分选后后的细胞， 按图 4A所示的培养代数收集细 胞， 抽取细胞的基因组 DNA， 用 Hinf l和 Afa l内切酶消化后， 与同位素标记的 ³² P-(TTAGGG) ₆ 探针杂交， 该探针为端粒单链 DNA重复序列 (TTAGGG), 分析 细胞的端粒长度。 端粒长短视放射自显影后的条带灰度以及处于 的位置综合判 断， 条带离上端加样孔的位置越近， 对应细胞的端粒越长。从图 4A中可以看到， 对照 GFP/7404细胞传代过程中端粒保持稳定，长度在 4.5kb左右； GFP-LPTS/7404 细胞在传代过程中端粒逐渐缩短， 在培养第 5代时端粒缩短至 3.8kb左右， 第 25 代的时候端粒缩短到 2.8kb左右； GFP-LPTS _29Q _ ₃₂₈ /7404细胞传代时间短， 培养过 程中细胞死亡多， 在第 8代时端粒已经缩短至 2.5kb左右了 (；图 4B；)。

结果说明， LPTS _29Q _ ₃₂₈ 有着非常强的端粒酶抑制活性， 其在细胞体内能靶向 抑制端粒的合成和延伸。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作 为参考， 就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修 改，这些等价形式同样落于本申请 所附权利要求书所限定的范围。

序列表

〈110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 一种抑制端粒酶活性的肽及其制备方法和应用

<130> 100985

〈160> 7

<170> Patentln version 3. 3

<210> 1

〈211> 39

PRT

智人 ( Homo sapiens )

<400> 1

Thr Leu Lys Pro Lys Lys Arg Arg Gly Lys Lys Lys Leu Gin Lys Pro

1 5 10 15

Val Glu l ie Ala Glu Asp Ala Thr Leu Glu Glu Thr Leu Val Lys Lys

20 25 30

Lys Lys Lys Lys Asp Ser Lys

35

<210> 2

〈211> 328

PRT

智人 ( Homo sapiens )

<400> 2

Met Ser Met Leu Ala Glu Arg Arg Arg Lys Gin Lys Trp Ala Val Asp

1 5 10 15

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20 25 30

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