Beschreibung

Gegenstand der Erfindung sind Testelemente, insbesondere diagnostische Testelemente, zur Ermittlung der Anwesenheit oder Konzentration von biologischen, medizinischen oder biologisch oder medizinisch wirksamen Substanzen, inklusive Nukleinsäuren, Proteinen, Viren, Mikroorganismen und Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass diese Testelemente Nanofasern enthalten.

Diagnostische Testelemente, insbesondere Teststreifen, enthalten dem Stand der Technik nach vielfältige, auf Fasern basierende Materialien. Insbesondere zu erwähnen sind Papiere oder Vliese. Speziell Vliese werden genutzt, um die Abtrennung von unerwünschten Probenbestandteilen durchzuführen. Als Beispiel wird verwiesen auf die Blutabtrennungsvliese bei NW-Glucosetesten oder bei den Teststreifen aus dem Reflotron ^® System. Die Fasern, die bei Papieren oder Vliesen des Standes der Technik verwendet werden, sind gekennzeichnet durch Durchmesser zwischen ca. 5 μm und 200 μm.

Nanofasern sind im Prinzip bekannt und seit ca. 1930 Stand der Technik. Sie werden erzeugt durch das so genannte Elektrospinnverfahren, bei dem durch Anlegen von hoher Spannung im Bereich von 10-55 kV an einen Tropfen einer Polymerlösung oder Polymerschmelze eine dünne Faser erzeugt wird (Formhals, A., US-Patente 1 ,975,504 (1934), 2,160,962 (1939, 2,187,306 (1940)).

Nanofasern zeichnen sich durch extrem geringe Durchmesser aus. Je nach Material sind die Fasern mit Durchmessern von 10-2000 nm erhältlich. Teilweise werden verzweigte Fasern erhalten oder Fasern, die mehr oder weniger große, mehr oder weniger häufige Polymerperlen (Beads) auf dem Faden enthalten. Wichtige Einflussgrößen sind dem Fachmann bekannt

oder der einschlägigen Literatur (z.B. Li und Xia, Adv. Mater. 16 (2004), 1151-1170) zu entnehmen.

Die Verwendung von Nanofasem in Medizinprodukten ist in US 2003/ 0171053 beschrieben. Dabei handelt es sich um eine medizinische

Vorrichtung, die mit einer Nanofaserschicht umhüllt ist, um die

Bioverträglichkeit zu verbessern. Weitere Publikationen beziehen sich auf eine Gehirnsonde, die zur Verbesserung der Biokompatibilität und

Messstabilität mit Polylactid-Nanofasern belegt ist (z.B. US 2002/0106496 oder DiPaolo et al., Proc. 2 ^nd Joint EMBS/BMES Conf. Houston TX, USA, 23-

23, Oktober 2002).

US 2003/0217928 offenbart ein Verfahren zur Elektrosynthese von Nanostrukturen, die zur Detektion eines Analyten, auch innerhalb eines elektrisch leitfähigen Arrays, eingesetzt werden können.

WO 02/40242 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Produkten für den medizinischen und zellbiologischen Einsatz, z.B. Stents, durch Elektrospinnen von Nanofasern auf Basis von Collagen.

WO 03/026532 bescheibt die Verwendung von Nanofasern für medizinische Geräte, beispielsweise Ballons, Katheter, Filter und Stents. Es findet sich keinerlei Hinweis auf die Verwendung von Nanofasern in diagnostischen Testelementen.

WO 03/087443 offenbart ein Verfahren zum Aufbringen von Nanofasern auf einen Gegenstand, beispielsweise medizinische Geräte, wie Stents, oder Vorrichtungen zur kontrollierten Freisetzung von Arzneimitteln.

Feng et al. (Angew. Chem. Int. Ed. 42 (2003), 800-802) und Feng et al. (Angew. Chem. Int. Ed. 41 (2002), 1221-1223) beschreiben die Herstellung superhydrophober Oberflächen aus kurzen Nanofasern.

Die Verwendung von Fasern üblichen Durchmessers in Testelementen für diagnostische Anwendungen hat spezifische Nachteile. Dies betrifft insbesondere die Separation von Blutzellen. Hier ergibt sich eine relativ grobe, uneinheitliche Porosität. Durch die großen Poren werden Blutzellen entweder nicht zurückgehalten oder sie werden im Inneren einer Gewebelage oder eines Vlieses zurückgehalten. Dabei kommt es, bedingt durch die großen Poren, zu einer Lyse infolge von hoher Kapillarität oder durch Verletzung der Membran von roten Blutkörperchen an scharfen Ecken und Kanten, besonders bei Glasfaservliesen. Nachteilig bei Vliesen oder Geweben nach dem Stand der Technik ist auch, dass diese Materialien relativ dick werden und entsprechend große Volumina an Flüssigkeit in den Faserzwischenräumen zurückhalten. Gerade beim Entwicklungstrend zu immer kleineren Probenvolumina ist dies äußerst störend.

Gebilde aus hydrophoben konventionellen Fasern können als Flüssigkeitssperre dienen. Beispiele dafür sind unter dem Handelsnamen Tyvek ^® bekannt. Nachteilig an diesen Gebilden ist jedoch, dass eine wässrige Lösung, die mit diesen Geweben in Kontakt kommt, nicht von der Oberfläche abperlt, sondern auf der Oberfläche verbleibt, wiewohl sie nicht in der Lage ist, in die Poren einzudringen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung von Testelementen, mit denen die Nachteile des Standes der Technik zumindest teilweise beseitigt werden. Diese Aufgabe wird gelöst durch Testelemente zum Nachweis eines Analyten, welche Nanofasern enthalten.

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Nanofasern bei der Herstellung von Testelementen, z.B. Teststreifen, Arrays oder Sensoren. Als Nanofasern im Sinne der vorliegenden Erfindung sind dabei vorzugsweise elektrogesponnene oder/und kontinuierliche Fasern zu verstehen. Die Fasern haben vorzugsweise einen Durchmesser von 10-2000 nm, besonders bevorzugt von 10-1000 nm und am meisten bevorzugt von 10- 500 nm. Bevorzugte elektrogesponnene bzw. kontinuierliche Nanofasern

- A - können in beliebiger Länge hergestellt werden. Für die Anwendung in Testelementen weisen die Fasern vorzugsweise zumindest eine Länge von >1 mm, besonders bevorzugt >2 mm auf. Dies steht im Gegensatz zu den bei Feng et al. (2002), supra und Feng et al. (2003), supra beschriebenen kurzen Nanofasern.

Die Nanofasern im Sinne der vorliegenden Erfindung können hydrophile Nanofasern, hydrophobe Nanofasern und Gemische davon sein.

Die Nanofasern werden aus Polymeren durch ein Elektrospinnverfahren hergestellt. Geeignete Verfahren sind in den zuvor genannten Dokumenten des Standes der Technik offenbart. Beispiele für geeignete Polymere sind organische Polymere, z.B. Polyolefine, wie etwa Polyethylen, Polypropylen, Cycloolefinpolymere, wie etwa Topas ^® , Polypenten oder Copolymere davon, fluorierte oder teilfluorierte Polymere, wie Polytetrafluorethylen oder andere, Polyester, wie etwa Polyterephthalat, Polyamide, wie etwa Poly-ε- caprolactam, Polyurethane, Polyaromaten, wie etwa Poly[p-xylylen] und Derivate davon, Polyvinylalkohole, Polyvinylamine, Polyethylenimine, Polyalkylenoxide, wie etwa Polyethylenoxide bzw. Kombinationen oder Copolymere davon. Des Weiteren können auch anorganische Nanofasern, wie etwa Nanofasern auf Basis von Oxiden, wie Silikaten, z.B Glas, wie Silikat-, Alkalisilikat- Quarz- oder Wasserglas, oder Nanofasern auf Basis von Metallalkoxy-Kondensaten oder Kombinationen davon verwendet werden. Auch Kombinationen organischer und anorganischer Nanofasern können eingesetzt werden.

Die Nanofasern als Bestandteile von analytischen Testelementen liegen vorzugsweise in Form von Vliesen, Geweben, Membranen, Schichten oder Kombinationen davon vor. Die Herstellung solcher Materialien kann wie zuvor erwähnt durch Elektrospinnen von Polymeren aus Lösung oder aus der Schmelze erfolgen.

Die Herstellung eines solchen Nanofasermaterials kann so erfolgen, dass

die Fasern ungeordnet abgelegt werden. Es ist aber auch möglich, die Fasern mehr oder weniger geordnet abzulegen, um isotrope oder anisotrope Effekte zu erreichen. Die Materialeigenschaften können sowohl durch die Wahl des Materials als auch durch die Wahl der Faserdurchmesser als auch durch die Wahl der Faserdichte und der Spinnparameter in weiten Grenzen beeinflusst werden.

Die Applikation eines solchen Nanofasermaterials auf ein Testelement, z.B. einen Teststreifen, kann dadurch erfolgen, dass die Fasern einfach auf die Oberfläche aufgesponnen werden. Sie können auch aufkalandriert oder appliziert werden durch Aufbringen auf auf eine Kleberschicht, wie z.B. einen Acrylatkleber, einen Haftkleber oder ein Klebeband. Es ist auch möglich, das Trägermaterial durch Lösungsmittel anzulösen und die Fasern auf das gequollene Material abzulegen, genauso wie es möglich ist, durch geeignete Lösungsmittel bei der Herstellung der Fasern einen Anlöseeffekt auf der Oberfläche des Trägers zu erreichen, welcher dann infolge, nach Verdampfen des Lösungsmittels, zu einer festen Verbindung zwischen den Nanofasem und der Oberfläche führt. Das tritt beispielsweise leichter ein, wenn die Bedingungen so gewählt werden, dass Nanofasern mit Beads gebildet werden. Es ist aber auch leicht möglich, diese Fasern mit anderen Fasern aus einer weiteren Düse zu vermischen oder nach Applikation einer ersten Schicht mit Beads, die besonders gute Verbindungen zum Trägermaterial ergeben, eine weitere Schicht mit Fasern anderer Gestalt und Dicke oder/und Material aufzubringen.

Das Testelement, das die Nanofasern enthält, kann beispielsweise ein Teststreifen, ein Array oder ein Sensor, z.B. ein elektrochemischer Sensor, sein. Die Nanofasern können dabei auf poröse oder nicht-poröse Materialien des Testelements aufgebracht sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Testelement einen Teststreifen, der mindestens ein poröses Trägermaterial, beispielsweise in Form eines Papiers, eines Vlieses oder/und einer Membran, enthält. Dabei

können Nanofasern zumindest auf eine Oberfläche eines solchen porösen Trägermaterials aufgebracht werden.

Durch Ablage der Nanofasern auf ein konventionelles Papier oder Vlies oder eine Membran kann die Oberfläche dieses Trägermaterials so modifiziert werden, dass eine wesentlich feinere Porengröße an der belegten Oberseite erreicht wird. Dadurch sind völlig andere, wesentlich verbesserte

Filtereigenschaften erreichbar. Ein solcherart modifiziertes Material kann in an sich bekannter Weise durch Kleben oder Laminieren o.a. auf einen Teststreifen gebracht werden. Andererseits kann das Material des

Teststreifens oder einzelne Komponenten davon auch vollständig aus

Nanofasern bestehen.

Beispielsweise können Nanofasern in Filterelementen zur Abtrennung von partikulären Bestandteilen aus einer Probe verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Filterelement ein Element zur Abtrennung von Blutzellen, vorzugsweise Erythrozyten.

Dabei ist es möglich, durch Verwendung von Nanofasern in Blutabtrennungsvliesen die Neigung von Hämolyse zu unterbinden, da die feinen Fasern die Membran von Erythrozyten unterstützen und es nicht zum Zerreißen der Erythrozyten-Membran infolge von Kapillaraktivität kommt. Es ist auch praktisch ausgeschlossen, dass die wenigen feinen Faserenden von Nanofasern in der Lage sind, die Membran von Erythrozyten zu beschädigen und dadurch Hämolyse zu verursachen. Bei Verwendung eines Vlieses aus Nanofasern ist es möglich, ein sehr dünnes Vlies, z.B. mit einer Dicke von 0,02 μm bis 50 μm, bevorzugt 0,05 μm bis 5 μm, besonders bevorzugt 0,08 μm bis 2 μm, mit hoher Filtereffektivität bereitzustellen, welches dann auch in der Lage ist, sehr geringe Blutvolumina zu verarbeiten und selbst nur eine sehr geringe Rückhaltung besitzt. Bei dieser Anwendung werden bevorzugt hydrophile Polymere, wie etwa Polyamide, Polyurethane, Polyvinylalkohole, Polyvinylamine, Polyethylenimine, Polyethylenglykole oder Copolymere davon, z.B. aus Polyurethan und Polyethylenglykol, verwendet, um daraus

Nanofasern durch Elektrospinnen zu erzeugen. In gleicher Weise bevorzugt sind anorganische Materialien, wie Oxide, bevorzugt Gläser, wie Quarz-, Silikat-, Alkalisilikat- oder Wasserglas, oder Metallalkoxy-Kondensate oder Kombinationen davon.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können Nanofasern auf die Oberfläche eines Trägermaterials aufgebracht werden, um dessen Eigenschaften, insbesondere hinsichtlich der Benetzungsfähigkeit von Flüssigkeiten, zu modifizieren. So kann eine hydrophobe Oberfläche, z.B. eine nicht-poröse Oberfläche, wie etwa das Testfeld eines Arrays, zur Erhöhung der Benetzungsfähigkeit mit hydrophilen Nanofasern beschichtet werden. Eine hydrophile Oberfläche im Sinne der vorliegenden Erfindung weist dabei vorzugsweise einen intrinsischen Kontaktwinkel <90° mit Wasser auf.

Als intrinsischer Kontaktwinkel wird der Kontaktwinkel auf einer ideal glatten Oberfläche bezeichnet, der als Maß für die durch chemische Gruppen bestimmte Oberflächenenergie dient, ohne jeglichen Einfluss der Oberflächengeometrie.

Beispielsweise kann durch Ablage von Nanofasern auf Oberflächen das Benetzungsverhalten dramatisch verändert werden. Während ein Wassertropfen auf reinen PMMA-Oberflächen einen Kontaktwinkel von ca. 70-80 Grad ausbildet, spreitet ein Wassertropfen auf einer PMMA- Oberfläche, die mit einer dünnen Schicht von Nanofasern aus Polyamid (PA) partiell bedeckt ist. Eine Menge von 10-500 mg/m ² , insbesondere von 50- 300 mg/m ² , z.B. ca. 200 mg/m ² , Nanofasern z.B. aus Poly-ε- aminocaprolactam mit einer Dicke von 20-2000 nm, z.B. 600 nm, hat sich als günstig erwiesen.

Andererseits kann die Beschichtung einer Oberfläche, z.B. einer nichtporösen Oberfläche, wie etwa ein Teststreifengehäuse, insbesondere im Bereich der Probenauftragzone, ein Bereich zwischen den Testfeldern eines

Arrays, etc. mit hydrophoben Nanofasern erfolgen, um die Benetzungsfähigkeit der Oberfläche zu verringern und eine Oberfläche mit hydrophoben oder superhydrophoben Eigenschaften zu erzeugen. Eine hydrophobe Oberfläche im Sinne der vorliegenden Erfindung weist dabei vorzugsweise einen intrinsischen Kontaktwinkel ≥90° mit Wasser auf. Eine superhydrophobe Oberfläche im Sinne der vorliegenden Erfindung weist dabei vorzugsweise einen Kontaktwinkel >140°, vorzugsweise ≥150° mit Wasser auf.

Eine Nanofaserbeschichtung als Hydrophobsperre mit superhydrophoben Eigenschaften ist insbesondere von Interesse bei der Entwicklung von einem hygienischen Teststreifen, bei dem unbedingt verhindert werden muss, dass Probenflüssigkeit, z.B. Blut, auf dem Teststreifen haften bleibt. Um dies zu erreichen, wird aus einem hydrophoben Basismaterial, z.B. einem fluorierten oder teilfluorierten Polymer, wie etwa Polytetrafluorethylen (PTFE), einem modifizierten, z.B. löslichen PTFE, wie Teflon ^® AF, einem Copolymer aus Tetrafluorethylen und Hexafluorpropylen (FEP), teilfluorierten Polyurethanen, fluorierten Polyaromaten etc. oder anderen oder einem Polyolefin, wie z.B. PP, Polypenten oder anderen oder Polyolefin-Copolymeren, ein Nanofasergebilde durch Elektrospinnen gefertigt. Es zeigte sich, dass bereits durch eine sehr dünne, z.B. 2 μm Schicht von solchen Fasermaterialien bzw. von Fasern mit Beads eine superhydrophobe Oberfläche geschaffen werden kann, auf der ein Wassertropfen einen Kontaktwinkel von ≥140° aufweist. Ein aufgesetzter Wassertropfen rollt auf einer solchen Oberfläche bereits bei einer Neigung von unter 20° ab. Ein Blutstropfen, der mit der Oberfläche einer solchen Schicht in Kontakt gebracht wird, zeigt keine Neigung, diese Schicht zu benetzen bzw. an ihr zu haften.

Ein besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein Testelement, umfassend (a) zumindest einen mit hydrophilen Nanofasern belegten Bereich und (b) zumindest einen mit hydrophoben Nanofasern belegten Bereich. Die mit hydrophilen Nanofasern belegten Bereiche sind

vorzugsweise Testfelder, die zum Aufbringen von Probenflüssigkeiten, wie Blut, vorgesehen sind, um deren Benetzung zu verbessern. Die mit hydrophoben Nanofasem belegten Bereiche sind vorzugsweise in der Umgebung der Testfelder oder/und Probenaufgabestellen angeordnet, um eine unerwünschte Benetzung mit Probenflüssigkeit zu verhindern.

In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann ein Gemisch von hydrophilen und hydrophoben Nanofasern auf eine Oberfläche. z.B. auf eine nicht-poröse Oberfläche, zur gleichmäßigeren Verteilung von Flüssigkeiten über die Oberfläche aufgebracht werden. Beispiele für Fasergemische sind Teflon ^® AF und Poly(urethan-g- ethylenoxid).

Durch Aufbringen einer dünnen Schicht einer Mischung hydrophiler und hydrophober Nanofasern kann eine Oberfläche so modifiziert werden, dass sich ein aufgetragener Flüssigkeitstropfen, besonders ein wässriger Tropfen, gleichmäßig verteilt. Überraschenderweise wurde gefunden, dass beim Eintrocknen eines solchen Tropfens darin gelöste Stoffe eine wesentlich gleichmäßigere Schicht bilden als ohne die Anwesenheit von Nanofasern. Damit wird es möglich, eine in flüssiger Form aufgetragene Testchemie wesentlich gleichmäßiger zu verteilen, z.B. auf eine Elektrode eines elektrochemischen Sensors, als bisher. Dies ist auch von Bedeutung bei der Herstellung von Arrays, z.B. für molekulardiagnostische Untersuchungen. Besonders der Aspekt der Eigenfluoreszenz spielt hier eine große Rolle. Durch die extrem geringe Menge an Material, z.B. 10-500 mg/m ² , die für den Effekt notwendig ist, ergibt sich nur eine sehr niedrige Eigenfluoreszenz, was wiederum das Signal/Rauschverhältnis bei der Auswertung der Arrays günstig beeinflusst.

Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur qualitativen oder/und quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer Probe, bei dem man ein Testelement wie zuvor beschrieben verwendet. Das Verfahren kann ein immunchemisches Verfahren oder ein auf Nukleinsäurehybridisierung

beruhendes Verfahren oder auch ein enzymatisches Verfahren sein. Bevorzugte Anwendungen sind elektrochemische oder/und photometrische Nachweisverfahren, z.B. zum Nachweis von Glucose aus Blut oder anderen Körperflüssigkeiten.

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Nanofasermaterial, vorzugsweise von elektrogesponnenen oder/und kontinuierlichen Nanofasern, wie zuvor beschrieben, als Filter in einem Testelement, das zum Nachweis von Analyten dient. Der Filter kann die Nanofasern als solche oder/und aufgebracht auf ein poröses Trägermaterial, wie zuvor angegeben, enthalten. Wenn der Filter die Nanofasern als solche, d.h. in ungestützer Form enthält, liegt das Material als gegebenenfalls asymmetrische Membran vor. Das Material der Membran kann, wie zuvor angegeben, hydrophile Nanofasern, hydrophobe Nanofasern oder Gemische davon enthalten.

Die Vorteile der Erfindung bestehen insbesondere darin, dass Vliese oder Filtermaterialien zur Verwendung auf Teststreifen erzeugt werden können, die wesentlich dünner sind, feinere gleichmäßigere Porenweite aufweisen und weniger Material erfordern als Materialien gemäß dem Stand der Technik. Von Vorteil ist auch, dass die Benetzbarkeit von Oberflächen durch Nanofasern dramatisch verbessert werden kann. Weiterhin von Vorteil ist, dass aus hydrophoben Polymeren superhydrophobe Oberflächen erzeugt werden können, auf denen ein Wassertropfen oder ein Blutstropfen sich nicht hält, sondern unter einem geringen Winkel bereits abgerollt wird. Vorteilhaft ist weiterhin, dass es bei der Separation von Blut praktisch nicht zur Hämolyse kommt. Durch Nanofasern kann die Applikation von Nachweisreagenzien auf Oberflächen wesentlich homogener erfolgen als bisher und die Eigenfluoreszenz kann reduziert werden.