【명세서】

【발명의 명칭】

TLR4길항 펩타이드 【기술분야】

본 발명은 TLR4 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드에 관한 것으로， 더욱 상세하게는 TLR4/MD2 복합체에 결합하여 염증성 사이토카인 분비 억제 및 NF-KB와 ■ 의 활성화를 억제하는 펩타이드로, 상기 펩타이드를 포함하는 TLR4길항제 및 자가면역 질환또는 염증성 질환의 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

【배경기술】

톨-유사 수용체 (TLRs; Toll-1 ike receptors)는 병원균-연관 분자 패턴 (PAMPs； pathogen-associated molecular patterns)이나 위험-연관분자 패턴 (DAMPs； danger-associated molecular patterns)을 감지할 수 있으므로 숙주의 감시 시스템에서 매우 중요하다 (Akira, S et al. , Proceedings of the Japan Academy, 5er/es公 85: 143-156, 2009). 톨-유사수용체 4 (TLR4； Toll-like receptor 4)는 TLR 패밀리에서 처음으로 규명된 수용체로서， 면역 관련 병리학에서 광범위하게 연구되고 있다 (Duffy, L. et al. , ImmunoTargets and therapy 5：69, 2016； Achek, A et al. , Arch. Phamacal Res. 39:1032-1049, 2016) . TLR4는 세포 표면에 위치하고 있으며 지질다당류 (LPS; 1 ipopolysaccharide)를 인식한다 (Kawai T. et al . , Nat. Immunol. 11:373-384， 2010). LPS는 그람 음성 박테리아의 외막에 위치한 거대 당지질 분자이며， 지질 A, 핵심 영역 및 0-항원으로 알려진 소수성 도메인으로 구성된다. 지질 A는 LPS의 생물학적 활성을 담당하며 , TLR4 -매개 면역 반응의 주요 유도 물질이다 (Park, B.S. et al. Nature 458:1191-1195, 2009) . LPS (1 ipopolysaccharide)-결합 단백질 (LBP)이 LPS에 결합하면 응집체를 형성하고 CD

14 (cluster of differentiation 14)에 전달되며 MD2 (myeloid differentiation factor 2)에 결합함으로써 , LPS-결합 MD2는 TLR4와 상호 작용하여 복합체의 이량체화 및 후속신호 전달의 개시를 유도한다 (Park, B.S et al. , Exp. Mol. Med.45:e66, 2013) . 다른 TLR과는 달리 TI 4는 Myd88 (myeloid differentiation primary response gene 88) 및 TRIF (Toll/interleukin-1 receptor (TIR)-domain-containing adaptor-inducing 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

interferon- 13 ) 의존 경로를 유도할 수 있다 (Nijland， R. et al . , Mar. Drugs 12:4260-4273， 2014) . MyD88 -의존 경로의 개시는 핵 인자 NF_KB 및 MAPK의 초기 단계 활성화를 유도하고， 이는 IL-1P , IL-6 및 TNF-a와 같은 전염증성 사이토카인의 생산을초래한다. TLR4자극은 TRIF의존경로를통해 NF-KB및 IRF3 (interferon regulatory transcription factor 3)의 후기 단계 활성화를 유도한다. 두 경로 모두 대식세포 및 수지상 세포와 같은 선천성 면역 세포의 성숙과 활성화를유도한다 (Akira, S et al . , Proceedings of the Japan Academy, Series B 85：143-156, 2009； Kawai , T. et al . , Nat . Immunol . 11： 373-384, 2010； Kawai , T. et al . , Immunity 34： 637-650, 2011).

숙주 방어 기전에서 TLR4 활성화는 침입하는 병원체에 대한 면역반응의 조절을 돕는 전염증성 사이토카인의 생성에 기인하지만， 비정상적인 TLR4 신호전달은 염증반응 및 급성， 만성 질병을유발한다 (Yang, Y. et a】., Cell Death Dis.7：e2234, 2016； Lee, Y.S. et al.， EMBO Mol. Med.7:577-592, 2015； Pierer, M. et al., PLoS One 6：e23539, 2011). 특히, TLR4는류마티스성 관절염의 발병 기전에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 상기 류마티스성 관절염은 자가면역 질환의 일종으로， 주로 활액 관절에 영향을 주어 만성 염증을 일으켜 관절 조직을 파괴한다. 또한, TLR4는 전신 홍반 루푸스, 전신경화증 (systemic sclerosis) , 쇼그렌 증후군 (Sjogren’ s syndrome) , 근염 (Myositis) 및 염증성 장질환 (inflammatory bowel disease, IBD) 등의 자가면역 질환과 연관이 있는 것으로 알려져 있다 (Laura Duffy et al., ImmunoTargets and Therapy. 2016:569-80, 2016； Zhang , P. L. , et al. J . Immunol . 177, 6880-6888, 2006) .

따라서， 염증을 막고 병원체에 대한 면역반응을 회복시키는 새로운 TLR4 차단제의 개발은 류마티스성 관절염, 전신 홍반 루푸스， 전신경화증， 쇼그렌 증후군， 근염 및 염증성 장질환과 같은 TLR4 관련 자가면역 질환에 대한 강력한 치료제 개발을가능하게 한다.

지금까지 개발된 TLR4 -표적 치료제는 다당류, 당지질， 항체, 소분자 및 올리고 펩타이드를 포함하며， 이들의 일부는 염증성 질환을 예방하거나 완화시키기 위해 전염증성 사이토카인의 분비를 감소시킬 수 있는 약물/보조제로서 임상 시험 중에 있다 (Basith, S. et al . , Expert Opin. Ther. Pat . 21： 927-944, 2011； Patra, M.C. et al . , Expert Opin. Ther . Pat . 26:719-730, 2016) . 예를들어， TUM의 세포 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

내 TIR 도메인에 결합하는 TAK-242 (Resatorvid) (Matsunaga , N. et al . , Mol . Pharmacol. 79 :34-41 , 2011)및 LPS결합포켓에 결합하는 Er i toran (E5564) (Shi rey , K.A. et al. , Nature 497 :498-502 , 2013)는 하위 신호 전달 캐스케이드를 차단하는 것으로 알려져 있다. 또한， Mycobacterium «는 TLR4에 대해 길항 작용을 나타내며， 현재 중증 패혈증 환자에 대한 임상 3 상이 진행 중이다 (NCT02330432) . NI-0101 (Novimmune의 15C1)은 TLR4 신호 전달을 차단하고 LPS 투여 후 생성되는 사이토카인의 방출을막는단클론항체로 (Monnet E . et al . , Clin. Pharmacol . Ther. 101： 200-208 , 2017) , 임상 1 상이 완료되어 안전성 및 내약성이 우수하다 (NCT01808469및 NCT03241108) .

TLR4 매개 염증을 하향 조절할 수 있는 신약 개발을 위해 다양한 접근법이 이용되고 있으며， 그러한전략중하나는 phage di splay (PD) 기술이다. PD는다양한 단백질 상호 작용 연구에서 특정 표적 단백질에 대해 스크리닝 된 무작위 파지 라이브러리로부터 새로운 펩타이드를 찾아내기 위해 사용되는 가장 강력한 연구 도구이다 (Smi th, G.P et al . , Methods Enzymol . 217 : 228-257 , 1993) . PD는 단백질/펩타이드라이브러리가 phage coat 단백질 중하나와의 융합생성물로서 M13 파지의 표면상에 표시된다는 사실에 기초하며， 이 무작위 표면 펩타이드 집단에서 원하는 표적에 대한 단백질/펩타이드의 결합 친화성을 토대로 특정 펩타이드가 선택된다 ( zazy， H.M et al. , Clin. Biochem. 35 :425-445， 2002) .

이에， 본 발명자들은 상기 방법을 이용하여 TLR4 경로를 억제할 수 있는 새로운 펩타이드를 동정하고， 구조적 안정성 및 효능을 향상시키고자 예의 노력한 결과, PIP2 (phage di splay-der ived inhibi tory pept i de 2)가시험관내 LPS-유발성 TLR4 신호 전달을 차단할 수 있고， 락탐 가교 ( lactam br idge)에 의해 고리화된 cPIP2 (cycl i c PIP2)가 상대적으로 안정한 단백질 동역학 및 LPS에 의해 유도된 TLR4 신호전달 경로에 대한 강한 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였으며， 류마티스성 관절염 (RA) 래트 모델에서 cPIP2가 염증 증상을 완화시킴을 확인함으로써, 본발명을완성하게 되었다.

【발명의 상세한설명】

【기술적 과제】

본 발명의 목적은 TLR4 신호전달 경로를 억제할 수 있는 펩타이드 및 상기 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

펩타이드를포함하는 TLR4길항제를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목작은, 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 TLR4 신호전달 경로에 의해 발생하는 자가면역 질환 및 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는데 있다.

【기술적 해결방법】

상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 제공한다.

본 발명은 또한， 서열번호 1 또는 2의 아미노산서열로 표시되는 펩타이드를 포함하는 TLR4 (Tol卜like receptor 4) 길항제를 제공한다.

본 발명은 또한， 서열번호 1 또는 2의 아미노산서열로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한， 서열번호 1 또는 2의 아미노산서열로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

【발명의 효과】

본 발명에 따른 펩타이드는 LPS에 의해 유도되는 TLR4 신호전달 경로를 억제함으로써 염증성 사이토카인의 분비 억제 및 NF-KB와 MAPKs의 활성화를 억제하는 효과가 우수하므로, TLR4 신호전달 경로에 의해 발생하는 자가면역 질환 및 염증성 질환의 예방또는 치료용 약학조성물로 유용하다.

【도면의 간단한설명】

도 1은 TLR4 결합 펩타이드의 스크리닝에서, (a)는 재조합 hTLR4 단백질에 특이적으로 결합하는 파지의 상대적인 농축량을 각 패닝 라운드 후에 수집된 파지의 산출/투입 비율에 의해 평가한 것이며， ( 는 RAW264.7 세포를 24시간 동안 다양한 농도의 PIP로 처리하여 세포 생존력을 MTT 분석으로 측정한 것이고, ( 는 TNF-a 분비를 PIP의 농도가 다른 RAW264.7 세포에서 ELISA에 의해 평가한 것이다. 모든 실험은 독립적으로 3회 실시하였으며, 독립 실험의 평균 土況을 계산하였다. two-tailed paired Student t-test 0 P <0.05 , ** P 0.01) . 2019/209030 1»（：1^112019/004968

도 2는 TLR 신호 전달 경로에 대한 PIP2의 억제 효과를 확인한 것으로, (a)는 HEK-BlueTM hTLR4 세포에서 SEAP 분석을 통해 NF-KB의 활성 수준을 모니터링하여 초기에 평가한 것이며， ( 는 RAW264.7 세포의 전체 단백질 추출물에서 NF-KB (I KB a cytosolic degradat ion)의 발현 수준 및 p-IRF3과 ATF3의 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 측정한 것이고， ( 는 p-ERK, p-JNK 및 p-p38을 포함하는 MAPK의 발현 수준을 PIP2 처리된 세포에서 측정한 것으로， 비활성 MAPK, ERK, JNK및 p38은 대조군으로 사용되었다. ( 는 p-p65의 발현 수준을 면역 형광 염색으로 측정하고 공초점 현미경으로 검출한 것으로， 적색으로 염색된 부분은 인산화된 NF-KB (p-p65)를 나타내고 청색 염색 Hoechst는 핵 염색 (scale bar = 20iim)이다. (e) 및 (f)는 IL-6 및 IFN-13의 분비 수준을 ELISA에 의해 RAW264.7 세포에서 측정한 것이며, (g)는 RAW264.7 세포에서 iNOS 및 C0X2의 발현 수준을 웨스턴 블랏으로 측정한 것이고， ( 는 N0 분비 키트를 사용하여 N0 생성을 평가한 것이며 , ( i )는 N0의 세포질 분비 수준을 DAF-DA 염색을 이용한 FACS로 측정한 것이고， ( 는 DCF-DA 염색법을 사용하여 FACS에 의해 세포질에서 요 의 생성을 측정한 것이며， (k)는 상이한 TLR 리간드 [ (TLR2/1 (PAM3CSK4) , TLR2/6 (FSL-1) , TLR9 (CpG-ODN) , 또는 TLR7/8 (R848) ] 영향하에 PIP2 처리된 RAW264.7 세포에서 TNF- a의 분비 수준을 비교한 것이다. 모든 실험은 독립적으로 3회 실시하였으며， 독립 실험의 평균 土SEM을 계산하였다. two-tailed paired Student t-test (* P <0.05 , ** P <0.01) . 도 3은 인간 말초 혈액 단핵 세포 (hPBMCs)에서 PIP2가 사이토카인 분비, 및 NF-KB 및 MAPKs 활성화 억제를 확인한 것으로， (a) 및 ( 는 TLR4 리간드 LPS, TLR2/1 리간드 PAM3CSK4 및 TLR2/6 리간드 FSL-1의 영향하에 TNF- a 및 IL-6의 분비 수준을 PIP2 처리된 hPBMC에서 평가한 것이며 , ( 는 NF-KB활성화, IicBa의 분해， 및 MAPK의 발현 수준을 웨스턴 블랏으로 평가한 것으로, 비활성 MAPK는 대조군으로 사용하였고 p -act in은 로딩 대조군으로 사용하였다 . 모든 실험은 독립적으로 3회 실시하였으며， 독립 실험의 평균 士況M을 계산하였다. two-tailed paired Student t-test 0 P <0.05 , ** P <0.01) .

도 4는 마우스 골수 유래 대식세포 (mBMDM)에서 PIP2가 TLR4 매개 사이토카인 분비를 저해하고 생체 내에서 TLR4 매개 염증 반응을 완화시키는 것을 확인한 것으로， (a) 내지 ( 는 TNF-a , IL-6 및 IFN-|3의 분비 수준이 PIP2 처리에 의해 감소한 것을 나타낸 것이며, ( 는 N0 분비 키트를 사용하여 N0 분비를 평가한 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

것이다. (e) 내지 (g)는 C57BL/6J 마우스를 70 nmol/g의 PIP2로 복강 투여 (i.p.) 후 5나요/요의 LPS를 복강 투여 (i.p)하여， 혈장에서 TNF-a, IL-6 및 IL-12p40의 수준을 모니터링 한 것이다. 모든 실험은 .독립적으로 3회 실시하였으며， 독립 실험의 평균 士 SEM을 계산하였다. two-tai led paired Student t-test (* P <0.05, ** P <0.01).

도 5는 PIP2-TLR4 복합체의 이미지와 생물 물리 분석 및 PIP2의 구조를 나타낸 것으로, (a)는 TLR4 (적색 염색)의 발현 수준과 FITC-PIP2 (녹색 염색)의 위치를 면역 형광법으로 평가하고 공초점 현미경으로 분석한 것으로， Hoechst 염색 (파란색)은 핵 (눈금 막대 = 20um)이며， 공초점 이미지는 FITC-PIP2와 TLR4의 co-localization을 나타낸다. (b)는 리간드로서 칩 고정 hTLR4 및 SPR을 사용하는 분석물로서 PIP2를 이용하여 PIP2의 TLR4 결합 친화력을 평가한 것으로， 센서 그램

(sensorgram)은 PIP2가 TLR4의 세포외 도메인 (ECD; Extra Cellular Domain)에 농도 의존적으로 결합함을 제시한다. ( 는 PIP2에 대한 분자 동역학 시뮬레이션 (MDS; Molecular Dynamics Simulat ion)으로, PIP2의 N-말단은 MDS 말단에서 나선 구조를 유지하지만, C-말단 절반은 루프 구조를 획득하였다. MDS 동안 전체 단백질

(청색)과 백본 원자 (자주색)의 초기 입체 구조에 대한 RMSD ( root -mean-square deviation)가 최소 제곱합을 사용하여 제시된다. PIP2의 나선형 구조는 Asp6와 LyslO (cPIP2) 사이의 락탐 가교 (lactam bridge)의 형성을 통해 안정화되었다. 도 6은 TLR4 결합 PIP2의 구조 동력학 및 TLR4/MD2과 PIP2-TLR4의 비교 계면 분석을 나타낸 것으로, (a)는 TLR4 또는 MD2에 결합된 백본 원자 및 전체 PIP2 펩티드의 평균 제곱근 편차 (RMSD)는 최소 제곱합을 사용하여 계산하며， 수소 결합 거리는 PIP2의 잔기와 TLR4의 ECD의 패치 A 및 B 잔기의 상호 작용 사이의 시간 함수로서 계산하였다. ’ 의 오른쪽 상단 패널은 요와 단량체 TLR4의 패치 B 사이의 수소 결합 상호 작용의 시간 의존적 형성을 나타내는 것이며 (첫 번째 시뮬레이션)， 아래의 두 패널은 초기 시뮬레이션을 검증하고 PIP2가 PIP2-TLR4

(TLR4/MD2) 복합체로 도킹 시뮬레이션 할때 PIP2가 TLR4의 패치 A 및 패치 B와 강한 정전기 상호 작용을 확립함을 제안하는 것이다 (두 번째 시뮬레이션). ( 는 MD2 및 PIP2와 상호 작용하는 사람과 마우스 TLR4 사이의 아미노산 동일성/유사성을 설명한 것으로， PIP2가 TUR4의 MD2 -결합패치 A 및 묘와 경쟁적으로 상호 작용함으로써 LPS유도된 TLR4 활성화를 차단한다는 것을 나타낸다. 도 7은 고리형 PIP2 (cPIP2)가 염증성 사이토카인 분비를 억제하고 산화 스트레스를 감소시키며 대식세포에서 MAPK 발현을 방해하는 것을 확인한 것으로， (a)는 MTT 분석으로 세포 생존력을 측정하여 cPIP2가 비독성임을 확인한 것이며, (b) 내지 ( 는 TNF- a , IL-6 , IFN-p 및 IFN- a를 ELISA로 측정한 것이다. (0는 NO 분비 키트를 사용하여 NO 분비를 측정한 것이며， (g)는 NO의 세포질 분비를 DAF-DA 염색으로 FACS에 의해 측정한 것이고, ( 는 세포질에서 R0S 생성을 DCF-DA 염색으로 FACS에 의해 측정한 것이다. ( 0는 인간 단핵구 세포 (THP-1) 유래 대식 세포를 cPIP2로 처리하고 다중 TLR 리간드 [TLR2/1 (PAM3C況 4)， TLR2/6 (FSL-1) , TLR9 (CpG-ODN) 또는 TLR7/8 (R848)]를 사용하여 펩타이드의 억제 효과를 모니터링한 것으로, cPIP2가 TLR4는 크게 억제하지만 다른 TLR의 억제는 불충분한 것을 보여준다. ( 는 MAPKs의 발현 수준뿐만 아니라 NF- K B 활성화 및 I ic B a의 분해를 웨스턴 블랏으로 평가한 것으로， 비활성 MAPK를 대조군으로 사용하고 P -act in을 로딩 대조군으로 사용하였다. 모든 실험은 독립적으로 3회 실시하였으며， 독립 실험의 평균 土 SEM을 계산하였다. two-tai led pai red Student t-test (* P <0.05， ** P <0.01) .

도 8은 PIP2와 TLR2의 생물 물리적 상호 작용을 확인한 것으로， 센서그램은 PIP2가 농도 의존적으로 TLR2의 세포 외 도메인 (ECD)에 결합하는 것을 보여준다.

도 9는 MD2의 존재 및 부재 하에서의 PIP2 -결합 TLR4의 PLIF (protein l igand interact ion f ingerpr ints) 분석에 대한 것으로, (a)는 MD2가 없는 TLR4에 도킹된 PIP2이며， PIP2는 TLR4의 ECD와 일치하지 않는 상호 작용을 보이고 PIP2 펩타이드의 약 43%가 TLR4의 N-말단과 소수성 상호 작용하는 것을 나타낸다. ( 는 TLR4/MD2 복합체와 도킹된 PIP2이며， 이때 대부분이 MD2의 소수성에 의해 조절되고， 도킹된 PIP2의 80%가 MD2의 Phel21과소수성 상호 작용을 나타낸다.

도 10은 고리형 PIP2 (cPIP2)의 RA 래트 모델에서의 염증 감소를 확인한 것으로， (a)는 정상군， 대조군 및 CPIP2 처리군에서 1 , 3 및 6주차 발의 상태를 시각적으로 모니터링 (스케일바 = 10mm)한 것이고， (b) 및 ( 는 각각 발목 직경 및 관절 지수를 측정한 것이며， (d) 내지 (0는 각각 헤마톡실린 및 에오신 (ME) 염색 (d)， 사프라닌- 0 (S⑴ 염색 (e) 및 TNF- a 염색 (f ) 결과 (배율 = 200배)를 나타낸 것이다. 2019/209030 1＞（그1'/1 ?2019/004968

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로사용되는 것이다.

TLR4의 과다 활성화는 광범위하게 다양한 신경 변성， 자가면역 및 염증질환의 병태생리에 주요 원인으로 알려져 있다. 예를 들어, TLR4 신호 전달의 LPS 매개 활성화는 미세아교세포의 활성화 및 염증 유발 인자의 분비를 통해 대뇌 허혈 에서 염증 과정에 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다 (Samson, Y et al.， Rev. Neurol. (Paris) 161 : 1177-1182， 2005) . 허혈/재관류 손상 마우스 모델의 관 상피 세포 (tubular epi thel i al cel I s)에서 TLR4의 발현 수준이 증가하는 반면, TLR4-/- 및 MyD88-/- 마우스는 신장 기능 이상， 관상 손상 및 전염증성 사이토카인의 축적된 분비로부터 보호되어 TLR4가 신장 손상 중재에 중요한 역할을 할 수 있다고 보고되어 있다 (Wu, H. et al.， J. Clin. Invest. 117 :2847-2859 , 2007) . 또한 LPS와 HMGB1 (high-mobi l i ty group protein 1)은 뇌에서 기억 이상을 유도하여 미세아교세포의 활성화와 염증성 뇌졸중의 발병을 유도하여 허혈성 뇌 손상을 유발한다 (Mazarat i , A et al . , Exp. Neurol . 232 : 143-148, 2011； Shih, R.H et al . , Front. Mol. Neurosci . 8 :77, 2015) . 이와 관련하여, 항산화 및 항염증 작용으로 잘 알려진 천연 플라보노이드인 캠퍼롤 (Kaempferol )은 fflGBl 수준을 감소시키고， TLR4 매개 염증 반응을 하향 조절하며, 마우스를 혈액 뇌장벽 (blood-brain barr ier)의 파괴 및 신경 염증으로부터 보호한다 (Cheng, X et al . , Int . Immunopharmacol . 56:29-35, 2018) . 또한， R0S와 NO의 생성은 신경 퇴행성 질환과 암의 병인에 기여하는 것으로 알려져 있다 (Liou, G.Y et al. , Free Radio. Res. 44： 479-496 , 2010； Bhat t acharyya , A et al . , Physiol . Rev. 94 : 329-354 , 2014； Uttara , B et al . , Cun' Neuropharmacol. 7:65-74, 2009) . R0S 생산 저해는 혈관평활근 세포의 TLR4 -매개 염증성 및 증식성 표현형을 완화시키는 것으로 알려져 있다 (Pi , Y. et al. , Lab. Invest. 93:880-887, 2013) . TLR4 발현 감소와 ROS 생성 감소는 급성 폐 손상의 진행을 지연시키는 것으로 밝혀졌다 (Asehnoune , K et al . , J. Immunol . 172:2522-2529 , 2004) . 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

TLM는 여러 질병의 시작과 함께 나타나며， 염증성 사이토카인의 과도한 분비를 활성화에 영향을 미치므로, 중요한 치료 타겟이다 (Achek, A et al. , Arch. Pharmacal Res. 39: 1032—1049, 2016 Patra, M.C et al . , Expert Opin. Ther. Pat . 26:719-730 2016). 이러한 이유로, 새로운 TLR4 길항제의 개발은 매우 활발하며， 지금까지 다양한 단백질, 작은 펩타이드， 화학 작용제 및 항체 등이 있다. 이들 중 TLR4 펩타이드 저해제 (VIPER)는 TLR4와 그의 어댑터 단백질 Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain-containing adapter protein/MyD88 adapter-like (TIRAP/Mal ) 및 TIR domain-containing adaptor protein-inducing IFN-|3 (TRIF)-related adaptor molecule (TRAM) 사이의 상호작용을 차단함으로써 RAW264.7 세포에서 IL-6의 LPS-유도 분비를 억제하였다. 또한， 합성 리피드 A 유사체인 Eritoran (E5564)은 ［ 와 MD2 포켓의 결합을 차단함으로써 TLR4의 활성화를 방지한다 (Opal, S.M. et al. , AM 309:1154-1162, 2013). E5564는 임상 3상 (NCT00334828)까지 진행되었으나, 환자의 중증 패혈증 상태를 개선하지 못하여 중단되었다 (Opal, S.M. et al . , AMA 309:1154-1162 2013). 본 발명에서는 TLR4를 억제하기 위해， PD 시스템을 통해 설계된 펩타이드 라이브러리를 TLR4-결합 및 특이성에 대해 스크리닝 하였다. hTLR4를 사용하여 PD 라이브러리로부터 선택된 펩타이드를 PIP2로 명명하였으며， PIP2는 2개의 세린 및 1개의 라이신으로 인해 극성이 약간 강한 소수성 도데카펩타이드 (dodecapeptide)로 서열번호 1 (NH ₂ -LGVFSSWWIKLV_C00H)의 아미노산 서열로 표시된다 (도 5c). 상기 PIP2는 TLR4 신호 전달에 대해 길항제 효과를 나타냈다. 즉, PIP2는 LPS유도 염증 반응을 유의하게 억제하여 전염증성 사이토카인 및 I 형 IFNs 분비를 방해하고 MAPK의 발현 수준을 낮추며 다른 세포주에서 산화 스트레스 마커의 생성을 감소시켰다 (도 2 및 3). 또한， LPS로 챌린지 한 후 생체 내에서 관찰된 TLR4매개 염증 역시 억제하였다 (도 4).

펩타이드의 고리화는 펩타이드 약물의 반감기를 향상시키고 또한 세포 흡수를 증가시키기 위해 널리 시행되고 있다 (Taylor, J.ff et al . , Biopolymers 66 : 49-75， 2002 ; Davies, J.S et al. , J. Pept . Sci . 9： 471-501 , 2003) . 이에, In 7/co에서 TLR4-PIP2 복합체의 구조 정보 개선을 통해 PIP2의 안정성과 효능을 향상시켰다. 즉, 락탐 가교 (lactam bridge)를 통해 Asp6와 LyslO을 연결하여 \¥0 2019/209030 1＞（：1'/100019/004968

PIP2의 나선형 구조를 안정화시키고 (도 5c) , 서열번호 2 (LGVF況) WWIKLV)의 아미노산 서열로 표시하였다. cPIP2은 TLR4 억제 효과를 유지할뿐만 아니라 저해 농도가 현저히 감소하였다 (도 7) .

따라서， 본 발명은 일관점에서, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 TLR4 (Tol l-1 ike receptor 4) 신호전달 경로를 억제하는 것을 특징으로 할 수 있으며， 상기 TLR4 신호전달 경로는 LPS ( 1 ipopolysacchar ide)에 의해 유도되는 것을 특징으로 할수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 TLR4/MD2 복합체에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 용어， “펩타이드” 는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다 상기 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법에 따라 제조될 수 있으며, 바람직하게는 고체상 합성 기술에 따라 제조될 수 있으나， 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 용어， “TLR4” 는 병원체 감염에 대한 감시자로서 기능하는 막관통 (tranmembrane) 단백질 패밀리인 TLRs에 속하는 단백질로서, TLR4 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 말하며， CD 284(cluster of di f ferent iat ion 284)로 명명되가도 한다. 상기 TLM는 그람-음성 박테리아의 LPS를 비롯한 다양한 PAMPs (pathogen-associ ated molecular patterns)를 인지하기 때문에 선천성 면역 시스템의 활성화에 매우 중요하다.

본 발명에서 용어, “TLR4 신호전달 경로” 는 TLR4를 통한 신호전달 경로를 말하며, TLR4 및 MD2에 의해 형성된 막-횡단 복합체인 TLR4/MD2 복합체에 의존하는 LPS 반응일 수 있으며， 이를 통해 신호가 전달된다. TLR4는 여러가지 어댑터 단백질에 의해 신호를 전달하며, 상기 신호전달 경로는 MaKTIRAP로도 지칭됨)과 MyD88 , 및 트램 (TRAM)과 트리프 (TRIF)로 작동한다. TLR4 매개 신호 전달 경로는 다양한 하위 신호 전달 분자를 통해 MyD88 -의존적 및 MyD88 -비의존적 신호 전달의 활성화를 유도한다. MyD88 -의존 경로의 개시는 NF- K B의 초기 단계 활성화 및 TNF- a 및 IL-6와 같은 전염증성 사이토카인의 분비를 유도하며， MyD88 -비의존적 경로의 개시는 IRF3 및 7의 활성화, IFNs의 분비 및 NF_ K B의 후기 단계 활성화를 유도한다 (Park , B . S et al . , Exp. Mol . Med. 45 : e66 , 2013； Ni j l and, R et al . , Mar. 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

Drugs 12:4260-4273, 2014) . 또한 , TLR4는 ERK, JNK 및 p38를 포함하는 MAPK의 활성화를유발하고， 염증성 사이토카인 및 IFN을분비한다 (Achek, A et al., Arch. Pharmacal Res.39:1032-1049, 2016； Kawai ,T et al . , Nat . Immunol .11:373-384, 2010； Kawai , T et al . , Semin . Immunol .19:24-32, 2007). 대식세포에서 관련 리간드에 의한 TLR4의 자극이 C0X2와 를 유도하고 N0의 생성을 유도하며， 미토콘드리아와 세포내 R0S를 생성한다 (Kim, J.Y et al . , Eur. J. Pharmacol. 584:175-184, 2008； Liu, K.-L. et al . J . Agric. Food Chem.54:3472-3478， 2006； West , A.P. et al . Nature 472:476, 2011； Mancek—Keber , M. et al . Sci . Signal . 8:ra60_ra60, 2015) .

본 발명에서 용어, “억제” 는 결핍, 부조화, 그 밖의 많은 원인에 의하여 생물 활동이나 활성이 저하되는 현상을 말하며， TLR4의 활성을 부분적으로 또는 완전히 블로킹하거나， 감소시키거나， 예방하거나, 활성화를 지연시키거나, 불활성화시키거나또는하향조절하는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어， “TLR4/MD2 복합체”는 TLR4 및 MD2에 의해 형성된 막-횡단 복합체를 의미하며, 본 발명의 서열번호 1 또는 2로 표시되는 펩타이드는 TLR4/MD2복합체에 결합함으로써 TLR4신호전달경로를 억제할수 있다.

PIP2가두가지 가능한메커니즘에 의해 TLR4신호 전달을차단할수 있음을 in silico분석으로 확인하였다. 소수성 때문에, PIP2는 TLR4/MD2복합체에서 MD2를 결합하는 것이 바람직하며, TLR4는 MD2, 보조 수용체 및 LPS 결합 포켓을 필요로하기 때문에 (Kim, H.M. et al., Cell 130:906-917, 2007； Ohnishi, T et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10： 405-410, 2003), MD2에 LPS의 유입을차단하는 것이 PIP2의 TLR4 -길항 메커니즘 중 하나 일 수 있다 (Park, S. et al. , Biomaterials 126:49-60, 2017). PIP2는 hTLR4의 ECD를사용하여 抑를통해 처음선택되었으므로， MD2가 없는 경우 PIP2는 TLR4와 도킹한다. PIP2는 TLR4의 세포 외 영역에 있는 4개의 서로다른위치에 있다 (도 9). 또한， TLR4신호 전달동안 MD2가 ECD와상호 작용하고 마우스와 인간에서 TLR4의 패치 A와 B가정전기적 접촉을 형성한다 (Park, B.S. et al., Nature 458:1191-1195, 2009； Kim, H.M. et al., Cell 130:906-917, 2007). 비교 구조 분석 결과， 이 패치의 잔기는 보존되어 TLR4-MD2 상호 작용에 결정적으로 중요하다. MD2 유래의 작은 펩타이드는 이러한 패치에 결합하여 TLR4-MD2상호 작용을 방해한다고 알려져 있다 (Slivka, P.F. et al . , ChemBioChem 10:645-649, 2009). 본발명에서는 PIP2가이러한잔기에도결합하여 유사한접촉을 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

할 수 있음을 발견하였고, PIP2는 Val l08 및 Aspl55를 특이적으로 인식하고 TLR4의 패치 B와의 C-말단 정전기적 상호 작용을 통해 자체를 안정화시켰다. 결론적으로, 본 발명에서는 TLR4 신호 전달을 차단하기 위해 MD2 외에도 TLR4-MD2 상호 작용을 차단하는 것이 중요함을 알수 있었다. 따라서， 본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를포함하는 TLR4 (Tol l-l ike receptor 4) 길항제에 .관한 것이다. 본 발명의 “서열번호 1 또는 2의 펩타이드” 는 TLR4/MD2 복합체에 효과적으로 결합하는 능력을 갖는 한， “서열번호 1 또는 2의 서열과 동일한 펩타이드 뿐만 아니라， 이의 아미노산이 보존적 치환에 의하여 치환된 펩타이드， 이와 서열 상동성이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상， 더욱 바람직하게는 90% 이상인 펩타이드를 모두포함할 수 있다상기 용어 ’’상동성”이란 야생형 (wi ld type) 아미노산 서열 및 야생형 핵산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것을 말한다.

본 발명에서 용어, “길항제” 는 임의의 메커니즘에 의하여, 수용체 또는 세포 내 매개체와 같은 다른 분자의 영향을 부분적으로 또는 완전히 저해하는 분자를 의미한다.

본 발명에서 용어 , “TLR4 길항제” 는 TLR4의 생물학적 활성을 직간접적으로, 또는 실질적으로 방해， 감소 또는 저해할 수 있는 물질을 말하며, 바람직하게는 TLR4와 반응성인 펩타이드는 TLR4 또는 TLR4/MD2 복합체에 직접 결합하고， TLR4의 활성을 중화시킴으로써 TLR4 신호전달 경로를 차단하여， NF- K B 및 EAPKs의 활성화의 감소를 유발해 염증성 사이토카인， N0 및 묘 의 분비를 감소시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 서열번호 1 또는 2로 표시되는 펩타이드는 리포폴리사카라이드 (LPS)에 의해 유도되는 TLR4 신호전달 경로를 억제함으로써 인터루킨- 6 IL-6)， N0 및 R0S의 분비와 NF- K B와 MAPKs의 활성화를 억제하는 효과가 우수하여， TLR4 신호전달 경로에 의해 발생하는 자가면역 질환 및 염증성 질환의 예방또는 치료용 약학조성물로 유용하게 활용할 수 있다.

유기체의 생물학적 복합성은 PPI (protein-protein interact ion) 상호작용체의 크기로 표시된다 (Stumpf , M .P. et al . , Proc. Natl . Acad. Sci . U. S. A. 105 : 6959-6964， 2008) . 대략， 의약 단백질의 절반 (총 3000-5000)은 질병 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

상태와관련이 있을 것으로 예상된다 (Hambly, K et al. , Mol. Divers. 10273-281, 2006). 생물학적 과정을 이해하는데 있어서 PPI의 역할은 필수적이며， ’druggability'의 특성은 deregulate PPI의 강력한 조절제를 찾는 데 결정적으로 중요하다. 또한， 소분자로 PPI 인터페이스를 저해하는 것은 어려운 문제이다.

따라서， 펩타이드 기반 치료제는 단백질 성질 및 유사한 결합 방식으로 인해

PPI 치료시 단백질의 영향을 극복할 수 있다. 펩타이드 또는 펩타이드 유사 약물의 개발은 특히 소분자 기반 치료법에 덜 적합한 PPI 인터페이스를 목표로 하여 'druggable genome’을 확장하는 핵심 방법이다. 펩타이드 약물은 소분자에 비해 낮은 독성과 향상된 표적 선택성을 갖는다. 치료제로서의 유망한 효과에도 불구하고， 펩타이드-기반 약물의 개발은 숙주 단백질 분해 효소에 대한 안정성이 낮아 생체 내 활성이 낮고 생체 이용률이 낮다.

펩타이드 스테이플링 (peptide stapling)은 알파-나선형 형태의 짧은 펩타이드를 제한하기 위해 사용되며， 스테이플링 동안 두 아미노산의 sidechain은 락탐 가교를 통해 공유 결합되어 거대 고리형 펩타이드를 형성한다. 락탐 연결 전략은 치료용 펩타이드의 효능을 향상시키기 위해 연구되고 있으며, 락탐 연결 전략을 사용하여 제한된 펩타이드가 선형 유사체보다 우수하다고 보고되어 있다 (Harrison, R.S. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 10711686-11691 , 2010) . 이에, 본 발명에서는 lactam bridge를 통해 Asp6와 LyslO을 연결하여 PIP2의 나선형 구조를 안정화시키는 단백질 디자인 기법을 구현하였다 (도 5c 및 화학식 1). 구조 동역학은 락탐 연결이 선형 구조인 PIP2와 비교하여 cPIP2에서 나선형 구조를 안정화시키고 N- 및 C-말단의 free moment를 제한하는 것을 확인하였다. 또한， cPIP2의 백본 및 전체 단백질 RMSD는 PIP2와 비교하여 대단히 안정화되어 있었다 (도 5c). cPIP2의 TLR4 억제 효능을 시험관 내에서 확인한 결과, cPIP2가 TLR4억제 효과를 유지할뿐만 아니라 저해 농도 (PIP2 IC50 = 40 yM, cPIP2 IC50 = 25yM)도 현저히 감소시킨다는 것을 발견하였다 (도 7). 따라서， 본 발명은 또 다른 관점에서 , 서열번호 1 또는 2의 아미노산서열로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어， “자가면역 질환” 은 자기관용을 유도하거나 계속 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

유지하는데 있어서 문제가 발생하여 자기항원에 대한 면역반응이 일어나, 이로 인해 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는 과정에 의해 발병되는 질환을 의미한다 상기 자기관용이란 자기 (sel f )를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 면역학적 무반응성 ( immunologic unrespons iveness)을 말한다 본 발명의 자기면역 질환은 인슐린-의존성 당뇨병, 다발 경화증, 실험적 자가면역 뇌척수염, 류마티스성 관절염， 실험적 자가면역 관절염， 중증 근무력증， 갑상선염, 실험적 형태의 포도막염, 하시모토 갑상선염， 원발성 점액수종， 갑상샘 중독증, 악성 빈혈, 자가면역 위축 위염, 에디슨 질환, 조기 폐경， 남성 불임증, 소아 당뇨병， 굿파스처 증후군, 보통 천포창, 유천포창， 교감성 안염, 수정체성 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소， 원발성 담관 경화증， 잠재성 간경변증， 궤양성 대장염， 쇼그렌 증후군， 경피증， 베게너 육아종증, 다발근육염/피부근육염 및 전신 홍반 루푸스를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 상기 펩타이드를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 자가면역 질환의 증상을 예방， 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

상기 “약학적으로 허용되는” 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때， 통상적으로 위장 장애， 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는， 락토즈， 덱스트로즈, 수크로즈， 솔비톨， 만니톨， 자일리톨， 에리스리톨， 말티톨, 전분, 아카시아 고무， 알지네이트, 젤라틴， 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트， 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈， 폴리비닐피롤리돈 , 물， 메틸하이드록시벤조에이트， 프로필하이드록시벤조에이트， 탈크， 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다 또한， 충진제， 항응집제, 윤활제, 습윤제， 향료， 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할수 있다.

이에, 본 발명에서는 상기 자가면역 질환의 일종인 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthr i t i s , RA)에서 cPIP2의 보호 효과를 확인하였다. 상기 류마티스성 관절염은 주로 관절 연골의 침식성 염증이 특징인 다요인성 자가면역 질환으로， 종양과 같은 활액의 팽창 및 인접 관절 연골의 점진적인 파괴로 2019/209030 1＞（그1'/1012019/004968

이어진다. 류마티스성 관절염의 정확한 원인은 아직 밝혀지지 않았지만 류마티스성 관절염 중에 관찰된 면역학적 조절장애는 염증 및 활액 세포 증식을 촉진시키는 데 관여하는 것으로 알려져 있다 (Isaacs, J.D. Nature reviews. Immunology, 605-611, 2010및 Smolen, J.S. et al . Nature reviews. Disease primers, 18001, 2018) . 본 발명에서는 RA 래트 모델에서 cPIP2이 류마티스성 관절염에 미치는 영향을 확인한 결과, cPIP2는 염증을 현저하게 감소시키고 연골 조직의 재생을 촉진시킨다는 것을 발견하였다 (도 10). 결론적으로， PIP2, 특히 cPIP2는 TLR4신호 전달의 유망한 억제제로서， 자가 면역 질환 또는 염증성 질환의 치료조에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 상기 펩타이드와 함께 자가면역 질환 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 인간을 제외한 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속， 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말， 과립, 정제， 에멀젼, 시럽， 에아로졸， 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀， 멸균주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구， 경피， 피하， 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며， 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령， 성별， 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고， 본 발명에 따른 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 자가면역 질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다. 본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 표시되는 핍타이드를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어， “염증성 질환” 은 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF- a , IL-1, IL-6, 프로스타글란딘 (prostaglandin) , 루코트리엔(leukotriene) 또는 N0와 같은 염증 유발물질 (염증성 사이토카인)에 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

의해 유발되는 질환을 의미하며, 본 발명의 염증성 질환은 천식, 습진, 건선, 알러지, 류마티스성 관절염, 건선 관절염 (psoriat ic arthritis) , 접촉성 피부염 (contact dermatitis) , 아토피성 피부염， 여드름, 아토피성 비염， 알레르기성 피부염， 만성 부비동염， 지루성 피부염 (seborrheic dermatitis) , 위염， 통풍， 통풍 관절염， 궤양， 만성 기관지염, 폐염증, 크론병， 궤양성 대장염， 강직성 척추염 (ankylosing spondylitis) , 패혈증， 맥관염， 활액낭염， 루프스， 류마티스 다발성 근육통， 측두 동맥염 , 다발성 경화증， 고형암 , 알쯔하이머병， 동맥경화증， 비만 및 바이러스 감염을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 상술한 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약학적 제제를 포함하기 때문에， 상술한 본 발명의 조성물과 중복된 내용은그 기재를 생략한다.

【발명의 실시를 위한 형태】

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로， 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 실시예 1： TLR4결합펩타이드라이브러리의 구축및스크리닝 방법

1-1： PD펩타이드 라이브러리

PD (phage display) 펩타이드 라이브러리는 이전에 기술된 방법으로 제작하고 스크리닝 하였다 (Park, S. et al. Biomaterials 126 : 49-60， 2017) .

12mer 펩타이드 라이브러리는 forward프라이머 5'_GCC CAG CCG GCC ATG GCC (NNK)i ₂ TCG AGT GGT GGA GGC GGT TCA G-3 ' (서열번호 3) 및 reverse프라이머 5'-GCC AGC ATT GAC AGG AGG TTG AG-3 ' (서열번호 4)로 합성하였다. NNK 랜덤 코돈 (N=A八:八｝/T， K=G/T)의 경우 모든 아미노산을 암호화 가능한 상태에서 정지코돈을 최소화하기 위하여 선택하였다. DNA 생성물을 p四N2 phagemid에 클로닝하고 DH10B (E. coli) 세포에 트랜스펙션 시킨 다음， 파지 라이브러리는 XLl-Blue (E. coli) 세포로 형질전환하여 증폭시켰다. Hyperphage, M13K07ᅀpill (PROGEN Biotechnik GmbH, Heidelberg, Germany)를 배양액에 첨가하고 (최종 농도， lx 10 ¹² PFU / mL) , 37 ^° C에서 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

30분간배양하였다. 그후, 세포펠릿을원심분리 (3300Xg, 10분, 4 ^° C)하여 신선한 2 x YT 배지 ( 100 _// g/m요 암피실린 및 25 _// g/mL 카나마이신) 30mL에 재현탁시키고 밤새 30°C에서 배양함으로써, 파지 입자를회수하였다. 1-2： 바이오패닝

바이오패닝 과정 역시 이전에 기술된 방법으로수행하였다 (Park, S. et al. Biomaterials 126 : 49—60 , 2017) .

재조합 hTLR4 단백질 (2.5yg/mL)을 Nunc MaxiSorp 96 -웰 플레이트 (Thermo Fisher Scientific Inc. , Waltham, MA, USA)에 코팅하고 4 ^° C에서 밤새 배양하고， 다음날실온에서 5% skim mi lk로 blocking하여 웰을파지 라이브러리에 노출시켰다. 결합된 파지는 용출， 회수하여 파지 적정 (titration)을 하였으며, 파지 역가는 암피실린 ( 10yg/mL)을 함유한 플레이트상의 콜로니 형성 단위 (cfu)로 계산하였다. 이후, 파지를 증폭하고 정제하여 패닝 (paming)에 사용하였으며, 각 라운드 (총 6라운드)에서 입출력 비율을 계산하여 농축 효율을 추정하였다. 형질전환 된 클론의 선발 및 분리는 이전에 기술된 바와 같이, 파지 ELISA를 통한 6차 바이오패닝 후수행하였다 (Park, S. et al . Biomaterials 126 : 49-60 , 2017) .

1-3： DNA시퀀싱 및 펩타이드합성

실시예 1-2의 ELISA를 통해 선택된 파지로부터 Miniprep Kit (GeneAl 1 Biotechnology, Seoul , Korea)를 사용하여 파지 DNA를 분리하였다. 분리된 DNA는 5'-TTG TGA GCG GAT AAC AAT TTC-3 ' (서열번호 5)의 프라이머를 사용하여 서열을 분석하였다 (Macrogen, Inc. 한국， 서울) . BioEdit 소프트웨어를 사용하여 DNA 서열을 아미노산 서열로 번역하고 변형을 평가하기 위해 정렬하여 다양성 정도를 평가하였다 (Hal 1 , T.A et al . , NucleicAcids Symposium Series, 95-98 , 1999) . 사용된 모든펩타이드는 Peptron, Inc. (대전， 한국)에서 합성 및 구입하였다. 실시예 2： 11고4에 대한 ?0 (파지-디스플레이) 펩타이드 라이브러리의 스크리닝

2-1： 111산특이적 결합펩타이드

^4 특이적 결합 펩타이드를 확인하기 위해 고상 스크리닝 방법을 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

사용하였다. 상기 실시예 1과 같이， _P HEN2 ( 12-mer) PD 라이브러리를 제작하여 재조합 인간 TLR4 (hTLR4) 단백질로 코팅된 96 -웰 플레이트에 노출시켰다. hTLR4에 대한 PD 라이브러리를 풍부하게 하기 위해 6회의 바이오패닝을 수행하고， 각 라운드후에 농축 비율은 용출된 파지의 역가를통해 평가하였다 (도 la) . 그 다음, hTLR4에 결합할 수 있는 파지 클론을 phage-ELISA에 의해 선택하고 BioEdit 소프트웨어를 사용하여 그들의 뉴클레오티드 변이를 추정하기 위해 서열을 분석하였다.

그 결과, 독특한서열을 갖는 PIP1-PIP5로 명명된 5개의 12-mer 펩타이드를 합성하였다. PIP1 및 PIP4는 N 말단 2개의 잔기를 제외하고는 동일하였으나， 다른 펩타이드들은고유한서열을지녔으며 주로소수성 잔기를포함하고 있었다.

2-2： TLR4결합펩타이드의 세포독성

실시예 2-1에서 합성된 PIP1-PIP5 펩타이드 20 100 nM 농도를 사용하여 RAW264.7 (ATCC, Manassas, VA, USA) 세포에 대한 세포독성을 MTT (l-(4 , 5-dimethylthiazol-2-yl )-3 , 5-diphenylformazan； Sigma-Aldrich Co. )를 사용하여 조사하였다.

RAW264.7 세포를 2 x 10 ⁵ 세포/웰의 밀도로 접종하고 24시간 동안 상이한 농도의 펩티드로 처리하여, 다음날 배지를 제거하고 희석된 MTT용액 (최종 농도: 500ug/mL) ( 100 /웰)으로 교체한 다음 37 ^° C에서 3시간 동안 배양하였다. MTT 용액을 제거하고 디메틸술폭시드 용액 (lOOuU웰， Sigma-Aldrich Co. )을 첨가한 다음， 30분후 540nm에서의 흡광도를분광광도계로측정하였다 (Molecular Devices Inc. ) .

그 결과， 80yM미만 농도에서 펩타이드는 세포 독성을 나타내지 않았으나， 100 의 펩티드로처리된 세포의 생존력은 약간감소하였다 (도 lb) .

2-3： TLR4결합펩타이드의 TNF-a 분비 억제

실시예 2-2의 결과에 따라, 이번에는 20 80 n 의 농도에 대하여 TNF-a 생성을추가조사하였다. Mouse TNF alpha ELISA Ready-SET-Go kit (eBioscience, San Diego, CA, USA) 또는 Human TNF alpha ELISA MAXä Deluxe (BioLegend, San Diego, CA, USA)를 사용하여, 특정 흡광도에서 마이크로 플레이트 분광 광도계 시스템 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

(Molecular Devices Inc.)에서 판독하고, 모든 데이터를 SoftMax Pro 5.3 소프트웨어 (Molecular Devices Inc.)를사용하여 분석하였다.

그 결과， PIP1-PIP5 중에서 PIP2 (서열번호 1： LGVFSSWWIKLV)가 농도 의존적으로 TNF- a (tumor necrosis factor a) 분비를 현저하게 감소시키는 것을 알수 있었다 (도 lc).

따라서， LPS의 존재하에 PIP를 처리한 RAW264.7 세포에서 TNF- a 생성을 ELISA를 통해 다시 한번 확인하였다. 또한， TLR4 특이적인 경향을 평가하기 위해 PIP2의 물리 화학적 특성을 추가로 조사하였으며， 후속 실험으로 TLR4 신호 전달에 대한 PIP2의 길항 효과를 조사하였다. 실시예 3： 대식세포에서 PIP2의 TLR4신호 전달 경로 억제

3-1: SEAP (secreted embryonic alkaline phosphatas) 분석

TLR 신호 전달 경로에 대한 PIP2의 조절 효과를 확인하기 위하여， SEAP (secreted embryonic alkaline phosphatas) 분석을 실시하였다. SEAP 리포터 유전자는 NF- KB (nuclear factor- KB) 및 AP-1 (activator protein 1) 결합부위를 함유하는 IL-12p40 최소 프로모터의 조절하에 있으며， TLR4 활성화시 유도된다 (Fuji oka, S. et al. Mol. Cell. Biol. 24:7806-7819, 2004) . 따라서， LPS의 존재하에 상이한농도의 PIP2 (20, 40또는 SOyM)를사용하여 TLR4 억제 활성을측정하였다.

HEK-Blue™ hTLR4세포 (InvivoGen, San Diego, CA, USA)를 96 -웰 플레이트에 2 x 10 ⁴ 세포/웰의 밀도로 접종하고 2일간 배양하였다. 상층액을 제거하고 HEK-Blue 검출 배지 (IvivoGen, San Diego, CA, USA)에 1시간동안상이한농도의 PIP2 (20, 40 또는 80uM)로 처리한 후， 24시간 동안 LPS (lOOng/mL)를 처리하였다. 배양 상등액을수집하여 새로운 96 -웰 플레이트에 넣고 SEAP 활성을 VersaMax Microplate Reader (Molecular Devices Inc. , Sunnyvale, CA, USA)로 630nm에서 톱광도를 측정하여 평가하였다.

그 결과， LPS-처리된 세포는 NF-KB의 활성화가 유도되었으나, 1시간 동안 PIP2로 전처리 후 24시간 동안 내로 자극한 세포는 SEAP 활성이 농도 의존적으로 감소하였다 (도 2a). 반면， PIP2만으로 처리된 세포에서는 SEAP 활성에 영향이 없었다. 0 2019/209030 1»(：1^1{2019/004968

3-2： NF-KB 및MAPK의 활성화 억제

LPS-자극 RAW264.7 세포에서 NF-KB 및 MAPK (mitogen-activated protein kinases)의 활성화를 웨스턴 블롯으로 조사하여 PIP2의 억제 효과를 분석하였다. p-JNK (c-Jun N-terminal kinase) , p-IRF3 (interferon regulatory transcription factor 3)， ERK (extracellular signal-regulated kinase) 및 p38 (p38 mitogen-activated protein kinase)에 대한 1차 항체 (Cell Signaling Technology Inc. , Danvers, MA, USA); p-ERK, p-p38, I K -B a , JNK, ATF3, C0X2 (cyclooxygenase 2), 욘-actin에 대한 1차항체 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA)； 및 iNOS (inducible nitric oxide synthase)에 대한 1차 항체 (BD Biosciences)는 1:500-1000의 비율로 희석하여 사용하였다. 2차 항체인 항-마우스/-토끼 peroxidase-conjugated immunoglobulin G항체 (Thermo Fisher Scientific Inc. )는 1:1,000의 비율로 사용하였으며, SuperSignal West Pico ECL 용액. (Thermo Fisher Scientific Inc.)으로 단백질을 검출하고 Fusion solo S 시스템 (Vilber Lourmat , France)으로 시각화하였다.

그 결과， PIP2는 LPS-유도된 NF-icB 및 IKBCI 분해 활성을 억제하였다 (도 2b). 또한， PIP2는 ATF3 (activating transcription factor 3)의 활성화 및 IRF3의 인산화를 억제하였으며， LPS-처리된 세포의 활성화 수준과 비교하여 ERK, JNK 및 p38의 인산화를포함하는 MAPKs의 활성화를성공적으로 억제하였다 (도 2c).

그 다음， PIP2 (80uM)로 1시간 동안 처리 한 RAW264.7 세포를 24 -웰 플레이트에서 2 x 10 ⁵ 세포/웰의 농도로 밤새 성장시킨 다음， LPS (lOOng/M)로 30분 처리 하여 p-p65을 분석하였다. FICT-PIP2 (Peptron, Inc)의 경우, 세포를 1시간 동안 의 FITC 접합 펩타이드로 전처리 한 다음， 30분 동안 LPS 처리 (100ng/mL)하였으며, 세포를 3.7% 포름알데히드 용액 (Sigma-Aldrich Co. )으로 5분간 고정하고 0.2% Triton X-100 용액 (AMESC0, Solon, OH, USA)으로 5분간 침투시켰다. 세포는 2시간 동안 p-p65 (Cell Signaling Technology 1:1000) 또는 TUM (Abeam, Cambridge, UK, 1:1000)에 대한 1차항체를 반응시킨 후, Alexa Fluor 408 및/또는 488 2차 항체 (Invitrogen)와 함께 반응시키고, Hoechst 33258 용액 (5yM, Sigma-Aldrich Co. )으로 처리하여 핵을 염색하였다. 형광 강도를 공초점 현미경 (LSM-700, Carl Zeiss Microscopy GmbH)을사용하여 측정하고， 이미지는 Zen 2009소프트웨어를사용하여 분석하였다. 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

그 결과， LPS-유도된 p-p65 발현 수준이 PIP2에 의해 억제되는 것을 확인하였다 (도 2d).

3-3： IL-6. IFN-P 및 TNF- a의 억제

RAW264.7 세포를 2 x 10 ⁵ 세포/웰의 밀도로 96 -웰 플레이트 (BD Biosciences)에 접종하여 PIP2를 처리하고， IL-6 분비는 Mouse /Human IL-6 ELISA MAX™ Deluxe (BioLegend)또는 Mouse IL-6 Platinum ELISA (eBioscience, San Diego, CA, USA)로 측정하였으며， TNF- a 생성은 Mouse TNF alpha ELISA Ready-SET-Go kit (eBioscience, San Diego, CA, USA) 또는 Human TNF alpha ELISA MAX™ Deluxe (BioLegend, San Diego, CA, USA)로 측정하였다. 특정 흡광도에서 마이크로 플레이트 분광 광도계 시스템 (Molecular Devices Inc.)으로 관독하고, 모든 데이터를 So ft Max Pro 5.3소프트웨어 (Molecular Devices Inc.)를사용하여 분석하였다. 그 결과， LPS-유도된 IL-6 및 IFN-P의 생산 또한 PIP2에 의해 농도 의존적으로 저해되었다 (도 2e-f).

또한, 다른 TLR및 그 하위 신호 전달에 대한 PIP2의 효과를 확인하기 위해， 세포를 PAM ₃ C況4 (TLR1/2) , FSL-1 (TLR2/6) , Resiquimod/R848 (TLR7/8) 또는 CpG-ODN (TLR9)과 함께 PIP2로 처리하고, 이어서 TNF-a의 분비 수준을 ELISA에 의해 모니터링 하였다. TNF-a 생성은 Mouse TNF alpha ELISA Ready-SET-Go kit (eBioscience, San Diego, CA, USA) 또는 Human TNF alpha ELISA MAX™ Deluxe (BioLegend, San Diego, CA, USA)로 측정하였다. 마찬가지로 특정 흡광도에서 마이크로 플레이트 분광 광도계 시스템 (Molecular Devices Inc.)으로 판독하고， 모든 데이터를 So ft Max Pro 5.3 소프트웨어 (Molecular Devices Inc.)를 사용하여 분석하였다.

그 결과， PIP2가 TLR2/1- 및 2/6 - 를 억제하였으며, TLR7/8 - 및 9 - 매개 TNF-a 분비를 저해하였다 (도 2k).

즉， TLRs 외부 도메인 (ECD)의 구조적 및 서열 유사성 때문에 TLR-1/2/6에서 PIP2가 낮은 친화성의 결합 부위를 가질 수 있으며, 하위 신호 전달을 비특이 적으로 변경할 수 있음을 나타내는 것이다. 이는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 결과에 의해 일부 뒷받침되었다 (도 8).

결론적으로 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 PIP2가 TLR4 경로 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

^· (MyD88 -의존성 및 TRIF-독립적 경로)를 현저히 억제시킨다는 것을 알수 있다.

3-4： iNOS및 C0X2수준 확인

R0S와 NO의 생성은 iNOS의 세포 수준 및 다른 요소들과 직접적으로 관련되어 있으므로 (Kim, J.Y et al . , Eur. J. Pharmacol . 584:175-184， 2008； Liu, K.-L. et al . J. Agric. Food Chem. 54:3472-3478, 2006； West, A.P. et al . Nature 472： 476, 2011； Mancek-Keber , M. et al . Sci . Signal .8:ra60-ra60, 2015)) , PPS2로 전처리 한 LPS-자극 세포에서 iNOS및 C0X2 수준을 모니터링 하였다.

그 결과， PIP2는 나 에 의해 유도된 iNOS 및 C0X2 발현을 효과적으로 억제 하였다 (도 2g).

세포질 N0 및 R0S의 측정은 DAF-FM및 DCF-DA염색을 이용하였다.

RAW264.7 세포를 6cm접시 (SPL Life Sciences, Pochun , Korea)에 1 x 10 ⁶ 의 밀도로 접종하여 PIP2를 처리하고， DAF-FM과 DCF-DA염료 (Thermo Fisher Scientific, Inc.)를 사용하여 각각 분석하였다. Diva 소프트웨어 (BD Biosciences)가 장착된 FACSAria III 기기를사용하여 세포에서 검출된 형광강도를 측정하였다.

또한， N0분비는 nitric oxide detection kit (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi , Korea)를사용하였다.

RAW264.7 세포를 2 x 10 ⁵ 세포/웰의 밀도로 접종하고， 96 -웰 플레이트 (BD Biosciences)에서 배양하고 PIP2를 처리하였다. 흡광도는 마이크로 플레이트 관독기 분광 광도계 (Molecular Devices Inc.)를 사용하여 540nm에서 즉정하였고, 데이터는 So ft Max Pro 5.3 소프트웨어 (Molecular Devices Inc.)를 사용하여 분석하였다.

그 결과, NO의 세포 외 분비뿐만 아니라 N0와 R0S의 세포 내 생성은 PIP2에 의해 억제되었다 (도 2h-j). 실시예 4： 인간 말초 혈액 단핵 세포 (hPBMCs)에서 PIP2의 TLR4 신호 전달 경로 억제

PIP2의 면역 억제 효과를 웨스턴 블롯을 통한 사이토카인 분비 및 단백질 발현의 평가를 통해 hPBMCs에서 평가하였다. 말초 혈액의 단핵 세포는 병원균 침입에 대한 방어 면역 반응에 중요하다. 이 세포는 사이토카인 및 케모카인을 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

분비하여 병원균 및 위험 신호를 검출하는데 중요한 역할을 하며 조직 침윤형 수지상 세포 (DC)의 전구체이다. DC는 유력한 항원 제시 세포이며， 위험에 대한 첫 번째 면역 반응을조율하는데 중요하다 (Pierer, Met al., PLoS One 6： e2S539 , 2011). 또한， hPBMCs에서 TLRs 발현이 높을 경우， 전신 홍반성 루푸스 및 만성 통증 증후군과 같은 질병의 발병 기전과 연관된다 (Guo, Y. et al . nt . J. Clin. Exp. Med. 8:20472-20480, 2015； Kwok, Y.H et al., PLoS 0neT-eAA2?>2, 2012； Wong, C.K. et al., Clin. Exp. Immunol . 159:11-22, 2010) .

웨스턴 블롯에 사용한 hPBMC는 PromoCel 1 (Heidelberg, Germany)에서 구입하였으며， 사이토카인 분비의 평가에 사용한 hPBMC는 Lonza Inc. (Allendale, NJ , USA)로부터 구압하였다. TNF-a 및 IL-6의 분비는 LPS, PAM ₃ CSK ₄ 또는 FSL-1 (InvivoGen, San Diego, CA, USA)의 존재하에 다양한농도의 PIP2로 처리된 세포에서 ELISA로 분석하였다.

그 결과, PIP2는 LPS 매개 TNF-a의 분비를 유의하게 억제하였고， PAM3CSK4 또는 FSL-1 자극 세포에서는 분비를 약간 저해하였다 (도 3a). 또한， LPS-유도된 IL-6의 분비는 PIP2와 동시 처리 후에 상당히 억제되었지만， PAM3CSK4 또는 FSL-1 자극 세포에서는 효과가거의 없었다 (도 3b).

LPS 매개 MAPKs의 활성도 hPBMCs에서 평가한 결과， PIP2 처리된 세포는 NF-KB의 인산화를 상당히 감소시키고 IicBa의 분해를 억제하였다 (도 3c). 또한, p-ERK, p-JNK 및 p-p38을 포함하는 MAPK의 발현 수준도 PIP2 처리 세포에서 유의하게 억제되었다. 실시예 5： PIP2에 의한마우스골수유래 대식세포 (mBMDMs)에서의 TLR4신호 전달경로 억제 및 LPS유도된 전신 사이토카인 반응 억제

5-1： mBMDMs에서의 PIP2에 의한 TLR4신호 전달 경로 억제

RAW264.7 세포 및 hPBMC와 유사하게， mBMDM에 PIP2의 TLR 억제 효과를

LPS-유도된 TNF-a , IL-6 및 IFN-|3의 분비를 평가하여 추가로조사하였다.

그 결과， PIP2는 이들 세포에서 전염증성 사이토카인 및 IFN-P의 분비를 유의하게 억제하였다 (도 4a-c). 더욱이, PIP2는 mBMDMs에서 LPS-유도된 N0 분비를 농도 의존적으로 억제하였다 (도 4d). _. 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

5-2： 생체내 LPS유도된 전신 사이토카인 반응 억제

다음으로, PIP2의 면역 억제 효과를마우스에서 전신성 사이토카인의 수준을 측정하여 생체 내에서 평가하였다.

Orient Bio, Inc. (Seoul, Korea)로부터 8주령의 C57BL/6J마우스 (20-25g, n = 5)를 얻었다. 마우스에 PIP2 (70nmol/g 체중)를 1시간동안복강투여 (i.p.)하여 전처리한후， LPS (5 _U g/g동물 중량)를 2시간 동안 항원 처리하였다. 대조군에는 동량의 PBS를 주입하였다. 혈장 샘플을 수집하여 전염증성 사이토카인 분비의 평가를 위해 냉동 보관하였다. ELISA 키트 (BioLegend, San Diego, CA, USA)를 사용하여 TNF-a (1:100)， IL-12p40 (1:50) 및 IL-6 (1:100)을 분석하였다. 모든 동물 실험은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (승인 번호 : KHNMC AP 2016-006)의 승인을받았다.

TNF-a , IL-12p40 및 IL-6은 자극 전 및 자극 후 2시간 동안 수집된 혈장 샘플에서 측정하였며， 그 결과, ［ 에 의해 유도된 사이토카인의 전신성 분비가 PIP2처리로 인해 유의하게 감소한다는 것을알수 있었다 (도 4e-g) . 실시예 6： PIP2의 구조 및 TLR4저해 기전

6-1： 면역 형광법 및 공초점 현미경에 의한 TLR4 발현과 FITC-PIP2 위치 확인 ^'

PIP2와 TLR4의 결합을 확인하기 위해, FITC (fluorescein isothiocyanate)를 펩타이드의 N 말단에 접합시켰다. RAW264.7 세포를 LPS 자극 전에 1시간 동안 FTTC-PIP2로 전처리하고, FITC-PIP2 및 TLR4의 형광 강도를 면역 형광 염색 및 공초점 현미경을사용하여 분석하였다. TLR4및 FITC-PIP2의 local ization은위치와 관련하여 모니터링 하였다. - 그결과, TLR4는 LPS-처리된 세포의 원형질막상에 위치하였고， FITC-PIP2도 원형질막에 위치하였으며, 그 신호는 TLR4의 형광과 거의 일치하였다. FITC-PIP2와 LPS를모두 처리한세포는 FITC-PIP2와 TLR4가원형질막에 완벽하게 겹쳐져 노란색 신호를나타냈다 (도 5a).

6-2： SPR을 이용한 PIP2및 TLR4의 결합동역학확인

표면플라즈몬공명 (SPR; surface p 1 asmon resonance)을통해 요와 TLR4의 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

결합 동역학을 연구하여 거대 분자， 핵산 및 소형 분자의 생물 물리학적 상호작용을 연구를 할 수 있다 （Drescher, D.G et al . , Methods Mol . Biol . 493:323-343, 2009） .

SPR은 ProteOn GLR 센서 칩과 함께 ProteOn XPR36 기기 （Bio-Rad Laboratories, Inc.）를사용하여 수행하였다. hTLR4및 hTLR2 （R & D시스템）는 GLM 센서 칩의 표면에 아민 커플링에 의해 고정화시켰다. 다양한농도의 PIP2분자 （0, 12.5, 25, 50, 100 및 200uM）를 칩에 주입하여 고정화 단백질과의 결합을 분석하였다. ProteOnTM Manager 소프트웨어 （버전 2.0）를 사용하여 데이터를 분석하고， 단백질 표면의 데이터는 운동 속도 상수 （ka 및 kd）에 맞게 그룹화하였다. 결합상수 KD는하기 수학식 1로 계산하였다.

【수학식 1]

X 增- ¹ 및 1.13 X 10-¾ ^_1 이며， 센서그램은 2의 孔묘4에 대한 결합이 농도 의존적으로증가함을나타냈다（도 ¾）.

아울러， 동일한조건을 ?1?2 및 孔요2결합동역학에도 적용하였으나, ?2와 11止2사이의 농도독립적인상호작용패턴을보였다 （도 8）.

?2는 12.5， 25, 50! 농도의 분석물로 사용되었으며， 이는 반응 단위 ）의 좁은 범위인 8-9에 해당하여, 이것은 100 및 200나 ¾1의 라 2가 사용되었을 때 중첩되는 의해 더 지지될 수 있다. 이러한 결과 및 무의미한 0 결과는 부분적으로 라 요와 11고2의 상호 작용이 비특이적이라는 것을 설명할 수 있다.

6-3： 단백질 모델링

세포 이미징 및 으요 분석을 통해 확인된 ?2와 !1묘4의 잠재적인 상호 작용을 比 1比0 분석을 통해 추가로 조사하였다. ?2 올리고 펩타이드는 ?1?2 2019/209030 1»(：1/10公019/004968

처리 된 in vitro 시스템에서 조절되는 것으로 확인된 TLR4와의 결합 구조를 예측하는데 사용된 컴퓨터 절차를 통해 모델링 하였다.

PIP2 올리고 펩타이드의 3D 모델은 M0E (2016.08) 및 I-TASSER온라인 서버 를 통해 생성하였다 (Zhang, Y et al. , BMC Bio informatics 9:40, 2008). 구조는 I-TASSER에서 동일한 폴드와 TM 점수 ñ 0.5가 선택되고 검증되었다 (Bowie, J.U et al. , Science 253:164-170, 1991). MOE 및 PR0CHECK68에 의해 생성된 Ramachandran 플롯을 통해 최종 3D 모델 펩타이드의 전체 기하학적 및 입체 화학적 특성을 조사 하였다 (Laskowski, R.A et al. , J. Biomol. NMR 8： 477-486, 1996).

그 결과， I-TASSER34와 PSIPRED에 의해 예측된 2차 구조는 펩타이드의 N-말단과 C-말단이 감겨져 있는 반면， 중심부는 주로 나선형을 나타냈다 (표 1). 표 1은 PIP2의 2차 구조 예측 및 상동성 모델링 매개 변수를 나타낸 것이다. 또한， I-TASSER34와 M0E에 의해 제안된 3D 구조는 어떠한 가닥도 보이지 않았고 주로 나선형 topology를 나타냈다 (도 5c).

【표 1】

샀·麥· ¾ 31炎然 $ : 찼 貧效 :淨. ¾ 公 八浴¾ ¾勢滅然섟 ? ^' ^5 銳別 效표¾1錄系 :歎紋 I

6-4： 펩타이드의 분자 동역학 및 구조 안정화

26

정정용지 (규칙 제 91조) 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

예측된 PIP2의 구조를 표준화하고 안정화하기 위해, 확립된 분자 동역학 시뮬레이션 (MDS) 시스템을 활용하였다.

I-TAS湖R로부터 선택된 PIP2의 가장 좋은 모델은 순환 형태인 cPIP2로， GROMACS V5.6.2를 사용하여 AMBER99SB-ILDNP force field에서 MD 시뮬레이션을 수행하였다 (Lindorff-Larsen， K. et al . , Proteins 78:1950-1958, 2010) . 상기 시스템은 공지의 방법 (Jorgensen, W.L et al . , The Journal of chemical physics 79:926-935， 1983； Bussi, G et al. , J. Chem. Phys. 126:014101， 2007； Parrinello, M et al . , J. Appl . Phys. 52:7182-7190， 1981； Hess , B et al . , J . Comput . Chem. 18:1463-1472， 1997)을 적용하여 수행하였다. 평형 구조는 각각 Uis (PIP2) 및 150ns (cPIP2)에 대해 위치 제한 없이 NPT조건에서 시뮬레이션하였다 (Parrinello,

M et al. , J. Appl. Phys. 52:7182-7190， 1981).

그 결과, PIP2의 N 말단이 나선형 구조를 유지하고 C 말단이 고리형 구조로 변형된 것을 확인하였다. 나선형 topology는 Ser6의 극성 측쇄와 Val3의 백본 산소 사이의 정전기적 상호 작용에 의해 육지된다 (도 5c).

또한, 반감기를 높이고 이차 구조를 유지하기 위해 작은 펩타이드를 스테이플링 하는 것은 널리 활용되고 있다 (Dietrich, L. et al . , Cell Chem Biol 24 :958-968 , 2017； Verdine, G.L et al . , Methods Enzymol . 503:3-33， 2012； White, A.M et al . , Expert Opin Drug Discov 11:1151-1163, 2016) . PIP2의 유연한 C_말단을 고려하고, 이것이 TLR4억제 효능을 감소시킬 수 있다고 가정하여， PIP2의 안정성을 향상시키는 펩타이드 스테이플링을실행하였다.

그 결과, 극성 Ser6은 Asp로 대체되었고， 락탐 bridge가 Asp6와 LyslO 사이에 확립되었다 (화학식 1) .

【화학식 1]

L G V F S B W W I K LV

1. _— .. J

Lactam Bndge

스테이플링 효과를 _C PIP2의 전체 구조에 맞게 조절하기 위해, PIP2의 순환 형태; MD궤도를 시각화하여 PIP2의 궤적과 비교하였다. 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

그 결과， cPIP2는 나선 형태를 유지하지만， PIP2는 C-말단 나선이 상실되는 것을 알 수 있었다. 이는 cPIP2의 안정적인 특성으로 인해 PIP2에 비해 TLR4 신호 전달을 저농도에서 장시간 억제할수 있음을 시사한다. 실시예 7： 도킹 시뮬레이션 및 PIP2 -결합 TLR4복합체의 계면 분석

실시예 3 및 4의 in vi tro 결과는 PIP2가 LPS-유도된 TLR4 활성화를 현저히 저해함을 시사한다. 따라서, 가능한 결합 패턴과 PIP2의 TLM 길항 작용을 조사하였다.

인간 TLR4의 재조합 ECD를 사용하여 파지 ELISA를 통해 선별된 PIP2는 TLR4의 하기 3가지 상이한 상태로 도킹되어 특이적 결합 위치를 결정하였다. 즉， 인간 TLR4/MD2 복합체 (3照 I )와 PIP2의 결합 친화력을 평가하기 위해， 관련 X 선 결정 구조를 PDB로부터 검색하였다. 결합 친화력을 평가하고 PIP2의 TLR4 길항 메커니즘을 제안하기 위해, PIP2가 TLR4에 결합할수 있는 부분은 i ) 단량체 TLR4의 세포 외 도메인; i i ) MD2에 결합된 단량체 TLR4의 세포 외 도메인; i i i i하나의 단량체가 MD2에 부착되고 다른 단량체가 비어있는 TLR4의 이량체 세포 외 도메인으로 볼 수 있다.

온라인 단백질-단백질 도킹 서버 ZD0CK69와 독립형 M0E 수트를 사용하여 PIP2와 TLR4간의 상호 작용 메커니즘을 예측하고 평가하였다 (Shah, M et al .， Sci . Rep. 5: 13446， 2015) . TLR은 수용체로， PIP2는 도킹의 각 라운드에서 리간드로 간주되었다. ZD0CK과 M0E를 별도로 사용하여 각 TLR과 PIP2에 대해 500 개의 도킹 컨스트럭션을 생성하였다.

PIP2의 소수성 특성은 상호 작용하는 단백질과의 비극성 접촉에 대한 높은 가능성을 시사하지만, 과량의 라이신은 음으로 하전된 용매에 노출된 잔기와 sal t br idges를 형성할 수 있다. 단량체 형태로 TLR4 단독으로 도킹하는 경우， PIP2는 ECD와 일치하지 않는 결합을 나타낸다. PIP2가 TLR4 ECD와 함께 형성한 4개의 도킹 된 클러스터들 중에서， N 말단의 하나의 클러스터는 약간 일정하고 비분산이었다. 도킹된 PIP2의 약 43%가 TLR4의 특정 위치에 모여있으며， MD2 의존 TLR4 활성화와 관련하여 매우 중요한두 번째 클러스터는 도킹된 PIP2의 ~ 9%를 차지하였다.

따라서， PIP2-TLR4의 상위 150개 도킹의 상호 작용 데이터베이스를 구축하고 PLIF (protein l igand interact ion f ingerpr int s)을 통해 나타냈다 (도 9) . 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

상호작용하는 잔기는 대부분 비극성 또는 소수성이다. 또한， TLR4 防1）의 N- 말단에서 PIP2의 주된 클러스터링이 PLIF 분석으로 확인되었다.

다음으로, TLR4와 TLR4/MD2 heterodimer 사이의 PIP2가 선호하는 결합 친화력을 확인하기 위해， TLR4/MD2 dimer i c와 tr imer i c （결합된 MD2 중 하나는 제거되었고 두 번째는 TLR4/MD2 tetramer에 결합된 채로 남아 있음） 복합체와 PIP2를 도킹하였다. 도킹된 PIP2는 거의 모두 MD2의 소수성 cavi ty를 가지고 TLR4 ECD와 함께 비특이적 클러스터링을 나타내지 않았다. 또한， 상위 150개의 PIP2-MD2 （TLR4） 도킹 복합체에 대해 PLIF 분석을 수행하여 일관되게 상호 작용하는 핵심 잔기를조사하였다.

그 결과， TLR4의 활성화에 관여하는 것으로 알려진 （Kim, H.M. et al .， Cell

130:906-917， 2007） MD2의 gat ing loop （Serl20-Lysl28）가 PIP2 상호 작용에 특히 관여한다는 것을 확인하였다. Gat ing loop의 I l e52와 Phel21은 도킹된 PIP2의 80 % 이상과 상호 작용하였으며 （도 9b）, 이 상호 작용에 관여하는 PIP2의 주요 잔기는 PIP2-TLR4도킹에서 관찰된 것들과 대체로 유사하였다.

상기 예비 도킹 결과로부터, PIP2가 MD2 공동 （cavi ty） 또는 TLR4 （클러스터

2）와의 MD2 결합을 경쟁적으로 방해함으로써 TLR4 신호 전달을 저해한다는 것을 알 수 있었다. 클러스터 1에서의 PIP2의 결합은 TLR4 시그널링을 차단하는 가장 확실한 방법이지만， TLR4의 N-말단의 억제는 그의 하위신호를 저해하지 않는 것으로 보인다. 이러한 이 두 가지 결합이 TLR4 신호 전달을 억제할 수 있다고 볼 수 있으므로, MDS를사용하여 구조 동역학에 대해 추가로 조사가 필요하다.

이에， 강력한 TLR4 길항제로 PIP2를 초기 평가 후， 제안된 나선 구조를 안정화시키고 억제 효능을 향상시키기 위해 펩타이드 고리화를 수행하였다. M0E에서 수행된 단백질 디자인 알고리즘은 펩타이드의 안정성을 향상시키기 위해 돌연변이 또는 변형될 수 있는 잔기를 조사하여 TLR4 결합 친화도를 향상시키는 데 사용하였다.

그 결과, 제시된 변형 중에서 Ser6/Asp돌연변이가선택되었고, LyslO의 NH3 +와 Asp6 측쇄의 C00- 사이에 락탐 브릿지가 만들어져 cPIP2 （서열번호 2： LGVFSDWWIKLV）로 명명되었다. cPIP2는 단백질 동역학 및 in vi tro 효능 분석으로 통해 그구조적 안정성에 대해 추가로 조사하였다. 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

실시예 8： PIP2결합 TLR4의 구조동역학

8-1： TLR4-PIP2의 안정성

PIP2가 MD2의 공동 (cavity)과 결합하거나 TLR4 및 MD2 상호 작용을 경쟁적으로 방해함으로써 TLR4 신호 전달을 방해할 가능성이 있기 때문에 두 개의 PIP2 도킹 복합체를 100ns 동안 시뮬레이션 하였다. 먼저, TLR4-PIP2 (PIP2가 TLR4의 중심부에 결합하는)의 안정성을 조사하였다.

MDS가 제공한 구조적 유연성 및 제한된 움직임은 PIP2의 C-말단 Val 및 Leu의 백본 산소가 TLR4의 양전하를 띤 Arg208, 238 및 극성 Ser291과 강한 수소 결합을 형성함을 보여준다. 이것은 MD 궤적을 따라 이들 잔기들 사이의 최소 거리를 추적함으로써 추가로 확인하였다 (도 6a). 또한， TLR4의 유사 부위는 MD2 결합에 결정적인 것으로 확인되었으며, 패치 A및 패치 묘로 표시되었다 (Kim, H.M. et al. Cell 130906-917, 2007).

PIP2-MD2(TLR4) MD 궤적을 분석하면 RMSD의 지속적인 상승을 보여준다 (도 6a) . 이는 TLR4/MD2 복합체에서 PIP2에 의해 유도된 입체 구조 변화보다는 PIP2의 상대적 안정성에 영향을 미치는 MD2의 병진 운동에 의한 결과이다.

8-2： PIP2와 TLR4와의 결합 친화력

다음으로, TLR4의 패치 A와 B에서 PIP2의 결합 친화력을 확인하기 위해 두 개의 TLR4 분자, 하나의 MD2와 두 개의 PIP2 분자를 포함하는 단일 복합체를 조립하고 MDS로분석하였다.

그 결과， PIP2 펩타이드 중 하나는 MD2에 결합하고 다른 하나는 인접한 TLR4의 패치 A 및 B 근처에서 MD2에 결합하지 않았다 (도 6b) . MD2의 외부 병진 운동이 관찰되지 않았기 때문에 두 번째 TLR4가 MD2 결합 PIP2의 안정성에 유의미한 영향을 미치는 것으로 볼 수 있다. 그러나 Phel26이 활성 상태에서 비활성 상태로 전환되는 것을 관찰하지 못했다. MD2의 게이팅 루프 (gating loop)에 위치한 Phel26은 리간드 의존성 TLR4 신호 전달에 결정적인 것으로 알려져 있다 (Shah, M et al., Sci. Rep. 6 : 39271， 2016) .

또한， PIP2와 TLR4의 MD2 -결합 패치와의 결합 친화력을 평가하기 위해， PIP2-TLR4 (TLR4/MD2) 복합체에서의 PIP2-TLR4 계면을 시간별로 분석하였다.

그 결과, TLR4의 패치 A는 PIP2의 Trp8은 Vall08과 C-H-ir (아텐) 결합을 \¥02019/209030 1»（：1710조2019/004968

하였으며， 이는 1^8의 인돌 그룹에서 쇼31）155와 질소 원자 사이의 정전기 접촉에 의해 더욱 강화되었다. 이러한 상호 작용은 상당히 안정적이며 13 실행 전반에 걸쳐 유지됨을 궤적분석으로 확인하였다.

또한, 1^ 10은 2¾13 후에 쇼31）155 및 요31）183과 8311 131 （¾65를 확립하였으며, 11 4와 접촉하지 않은 라 2의 （:-말단 잔기가 20애 후에 강한 수소 결합을 한다는 것을 발견하였다 （도 63）.

이는 ?1?2 - 11^4 시스템에 의한 유사한 경향으로， 이러한 일관성은 （：_말단 잔기, 특히 Vall2의 카르복실기 및 1x1111의 백본 산소는 이량체 및 사량체 형태에서 모두 2 - 11止4 상호 작용의 안정성에 결정적이었다 ［ ?2 - 11고4, 2-1' （11고4/·）］ （도加）. 실시예 9： 070110 ?2의 11고 -유도염증반응억제

9-1： 대식세포에서 산 요의 1!고4 억제능

의 11고4 억제 잠재력을 실시예 3의 ?\?2 분석에서 사용된 것과 동일한 대식세포에서 확인하였다.

。 2의 농도 5, 25 및 50나 에서 1^1264.7 세포에 대한 세포 독성을 조사한 결과， 독성이 없는 것으로 확인되었다 （도 73）.

이어서， ^¥264.7 세포에서 분비된 염증 유발성 사이토 카인의 수준을 모니터링함으로써 2의 11고4 저해 효과를此犯쇼로 평가하였다.

다음으로, 산화스트레스 마커 （즉， 炯 및 1¾光）에 대한산 요의 억제 효과를 조사하였다. 그 결과, 炯의 세포 외 분비 및 및 1¾ 의 세포 내 생성은 1?2에 의해 억제되는 것을 알수 있었으며， 이는라 2의 결과와 일치한다 （도 7^） .

9-2： 1¾ ³ -1 세포에서 0 ?2의 孔! 억제능

111?4 및 다른 孔1 에 대한 0 ?2의 효과는 ¾?-1 세포에서 比-6 분비의 평가를 통해 조사하였다.

¾?-1 （아주대학교 의료센터） 세포에 80 의 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

13-acetate； Sigma-Aldrich Co. , St. Louis , MO, USA)를 처리하여 대식세포로 분화시켰다. 이후， 세포는 상이한 TLR 리간드 (LPS (TLR4) , PAM3CSK4 (TLR1/2) , FSL-1 (TLR2/6) , resiquimod / R848 (TLR7 / 8) 또는 CpG -0DN (TLR9)］로처리하였다. 그 결과， cPIP2가 TLR4 매개 IL-6 분비를 억제하는 것을 알 수 있었으며, 50uM에서 다른 TLR을 약간저해한다는 것을확인하였다 (도 7i) .

또한， LPS에 의해 유발된 MAPK:의 활성화는 THP-1 세포에서의 웨스턴 블랏 분석을 통해 평가하였다. 그 결과， LPS처리 후의 발현 수준과 비교하여， cPIP2가 NF- _K B (p65의 인산화및 IKBCI의 분해)의 활성화를성공적으로저해하였으며， ERK, JNK 및 p38을 포함하는 MAPK의 인산화 수준을 억제하였다. cPIP2는 ［ 에 의한 ATF3의 활성화및 IRF3의 인산화도억제하였다 (도거) .

결론적으로， cPIP2는 PIP2의 억제 특성을 유지할 뿐만 아니라 억제 농도 (IC50)가 나 에서 25uM으로 감소되었다. 즉， 펩타이드의 효율이 향상되었음을 확인할수 있었다. 실시예 10: Cyclic PIP2의 in vivo에서의 류마티스성 관절염 치료효과 in _F /fro에서 LPS-유도된 염증 반응에 대한 cPIP2의 억제 활성을 확인한 후에, 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis； RA) 래트 모델을 사용하여 in r/ra에서 cPIP2의 효과를추가로조사하였다. 10-1： RA래트모델의 제조

RA래트모델을다음과같이 제조하였다.

먼저， 소의 제 2형 콜라겐 (bovine collagen type II , Sigma-Aldrich Co. LLC)과 완전 프로인트 보조제 (complete Freund's adjuvant, Sigma-Aldrich Co. LLC. )의 1 : 1 용액을 30분간 혼합하고, 상기 혼합 용액 (소의 제 2형 콜라겐 0.5mg 포함) 250 를 4주령 수컷 Lewis 래트의 꼬리에 주입하였다. 3주 후， 상기 Lewis 래트의 족근， 발목 관절， 무릎 관절 및 발에서 부종 및 흥반의 증거가 각각 관찰되었다.

10-2： cPIP2의 RA래트모델에서의 치료효과확인

RA 치료 실험은 아주대학교 의과대학기관 동물실험위원회의 승인을 받아 2019/209030 1»（그1^1{2019/004968

진행하였다 (승인번호 2013-0070) .

정상군 (Normal) , 미처리군 (untreated) , cPIP2 (lnmol/g체중) 처리군의 세 가지 실험군에 대해 실험을 진행하였다.

_C PIP2 처리군의 경우， 100 成의 cPIP2(최종 농도 1154.知g/mL로 PBS에 현탁)를 RA래트 모델들의 무릎 관절에 개별적으로 주입하였다. RA래트 모델들을 1, 3또는 6주차 (n=3)에 각각 희생시켜 치료 효과를 평가하였다.

먼저， 6주 동안 발의 시각 모니터링, 발목 직경의 측정 및 관절 지수(articular index； AI) 측정을 통해 RA 래트에 대한 cPIP2의 영향을 평가하였다.

구체적으로， 상기 세 종류의 실험군의 뒷발을 관찰하고 측정하여 발목 직경과 AI 점수를 1 , 2 , 3 , 4, 5 및 6주차에 측정하였다. 래트 3마리의 발목 직경을 Vernier 캘리퍼스를 사용하여 측정하였다. 시는 하기와 같이 블라인드 테스트하고， 점수화하였다: 부종 또는 홍반이 없는 경우 (점수 0) , 경미한 부종 및 홍반 (+1) , 중등 부종 및 족쇄 (+2)， 관절의 제한된 사용으로 인한 부종 및 중족골에서의 확대 징후 (+3) , 및 관절 경직 및 전체 뒷발과 연관된 심각한 증상으로 과도한 부기 (+4) .

모든 발목 직경과 AI 점수는 독립적으로 3회 측정하였고， 그 결과를 평균 士 표준 편차 (SD)로 나타내었다.

그 결과， 도 10a에서 보는 바와 같이， 미처리군 (untreated)의 경우， 6주 동안 부어오른 관절， 뻣뻣한 족저, 심한 부종 및 홍반이 관찰되었으나， _C PIP2 처리군 (cPIP2-treated)의 경우， 3주차에서 발목의 부어오름과 부종이 상당히 감소하였으며, 6주차에는 정상군 (normal)과 비슷한 수준으로 회복하였음을 확인하였다 (도 10a참조) .

또한， 6주간의 치료 기간 동안 RA 래트의 발목 직경 및 AI 점수를 모니터링한 결과, 도 10b 및 도 10c에서 보는 바와 같이， 미처리군의 경우， RA 래트의 발목 직경과 평균 AI 값이 현저하게 높았으나， _C PIP2 처리군의 경우， 발목 직경 및 AI 값이 현저히 감소하였다 (도 10b및 도 10c참조) . 또한, 헤마톡실린 및 에오신 (ME) 염색법， 사프라닌- 0(safranin-0; S⑴ 염색법 및 TNF-a 염색법을 사용하여， RA 발병 중 염증 및 연골 분해 정도를 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

평가하였다.

구체적으로, 1， 3 또는 6주차에 실험군을 희생시키고 무릎 관절을 해부하였다 (각 주차마다 n=3). 제거한 관절을 10% 포르말린 (Sigma-Aldrich， St. Louis， MO, USA)으로 3일간고정하고 6%질산 (Sigma-Aldr ich)을사용하여 2일 동안 석회질을 제거하였다. 상기 고정된 조직을 100% 에탄올로 탈수시키고 파라핀에 함침시켰다. 상기 함침된 표본을 8um슬라이스로 절단하였다. 상기 절단된 표본을 헤마톡실린 및 에오신 (H湖), 사프라닌- 0(safranin-0; SO) 및 TNF_a로 염색하였다. S0 염색을 위해 표본에서 파라핀을 제거한 후 수화시켰다. 그런 다음， 슬라이드를 3번 세척하고 메이어의 헤마톡실린 용액 (Mayer ‘s hematoxylin solution； Muto Pure Chemicals, Tokyo, Japan)으로 5 분간 처리한 후， 슬라이드를 20 분간 다시 세척하였다. 염색된 조직을 0.002%의 fast green 용액 (Sigma-Aldr ich)으로 30초간 발색시키고 1% 빙초산으로 세척하였다. 상기 슬라이드를 0.1% SO 용액 (Sigma-Aldr ich)에 6분간놓고봉입제 (mtxmt ing medium; Muto Pure Chemicals)로 고정시켰다.

TNF-a 염색을 위해， 상기 슬라이드를 무수시트르산 (Daejung Chemicals,

Shiheung, Korea) 및 무수트리소듐시트레이트 (Yakuri Pure Chemicals, Kyoto, Japan)로구성된 10X10 ^_3 M소듐시트레이트 완충용액에 120내지 130 ^° C에서 10분간 방치하고， PBS로 세척하였다. 상기 슬라이드를 37 ^° C에서 60분 동안 10% BSA를 포함하는 PBS로 블록킹한 후， 1차 항체 (rabbit anti -rat TNF-a (1:100); Novus Biologicals, Littleton, CO, USA)와 함께 4 ^° C에서 밤새 방치하였다. 그 후, 상기 표본에 2차항체 (goat anti-rabbit Alexa Fluor® 594； Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 1:200비율로 2시간동안처리하였다. 상기 슬라이드를나중에 ProLong Gold Anti fade Reagent (Thermo Fisher Scientific Inc.)로세척하고장착하였다. 면역형광 이미지는 Axio Imager AKCarl Zeiss Microimaging GmbH, Gottingen, German)을 사용하여 얻었고， Axiovision소프트웨어 (Rel.4.8； Carl Zeiss Microimaging GmbH)로 분석하였다. TNF-a 양성 영역은각표본에 대하여 무작위로선택된 3개의 필드에서 ImageJ 소프트웨어 (Nat ional Institute of Health, Bethesda, MD, USA)를사용하여 전체 연골면적의 백분율로 계산하였다.

H&E 염색 결과, 도 10d에서 보는 바와 같이, 미처리군의 경우, 모든 주차에서 유의성 있는조직학적 변화가관찰되지 않았다. 반면 , cPIP2처리군에서는 2019/209030 1»（：1^1{2019/004968

1주 후에 연골 두께에 주목할 만한 증가가 있었고, 4주차 및 6주차후에 열공（製孔; l acunae）에 수많은 골세포（osteocytes）가존재함을 확인하였다（도 10d참조）.

S0 염색 결과， 도 10e에서 보는 바와 같이， 미처리군과 비교하여 cPIP2 처리군의 경우 활액 조직（synovi al t i ssue） 부분에서 뚜렷한 S0 양성 반응이 관찰되었다. 둥근 형태의 성숙한 연골세포는 글리코사미노글리칸（GAGs ; 진한 적색）의 침착에 의해 둘러 쌓여 있으며， 3주차에 연골 및 뼈 사이의 경계에서

GAGs가 현저히 재생됨을 확인하였다（도 10e 참조）. 염색된 부위는 6주차에 더욱 증가하였다. 상기 결과는 RA 래트에 cPIP2를 처리하면 in Vo에서 연골 조직의 재생을 성공적으로 촉진시키며, 류마티스성 관절염에서 흔히 관찰되는 염증 상태를 완화시킨다는 것을보여준다.

또한, 상기 세 종류의 실험군으로부터 얻은 활액 조직에서의 TNF- a 발현 수준을 측정한 결과, 도 10f에서 보는 바와 같이， 정상군의 활액 조직에서는

TNF- a 발현되지 않았고， RA 래트의 조직에서는 TNF- a의 발현 수준이 높게 측정되었다. 반면, CPIP2 처리군에서는 TNF- a의 발현 수준이 치료 첫 주 동안 유의하게 감소하였다（도 10f 참조）.