本发明涉及分子病毒学和免疫学领域。 具体地， 本发明涉及 一种截短的人乳头瘤病毒 33型 L1蛋白，其编码序列和制备方法， 以及包含其的病毒样颗粒， 所述蛋白和病毒样颗粒可用于预防 HPV (特别是 HPV33 )感染及由 HPV (特别是 HPV33 )感染所 导致的疾病例如宫颈癌等。 本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒 用于制备药物组合物或疫苗的用途， 所述药物组合物或疫苗用于 预防 HPV (特别是 HPV33 )感染及由 HPV (特别是 HPV33 )感 染所导致的疾病例如宫颈癌等。 背景技术

人乳头瘤病毒 (Human Papillomavirus, HPV)属于乳头瘤病 毒科 (Papillomaviridae)乳头瘤病毒属， 为无包膜 DNA病毒。 该 病毒基因组为默链闭环 DNA， 大小约为 7.2 ~ 8kb，具有 8个开放 阅读框。 该病毒基因组按功能的不同可以分为三个区域 ： ①早期 区（E)， 约 4.5kb， 编码 El、 E2、 E4 ~ E7共 6个与病毒复制， 转 录及转化有关的非结构蛋白； ②晚期区 (L)， 约 2.5kb， 编码主要 衣壳蛋白 L1和次要衣壳蛋白 L2; ③长调控区（LCR)， 位于 L区 末端与 E区起始端之间， 长约 800 ~ 900bp， 不编码任何蛋白， 含 DNA复制和表达调控元件。 HPV病毒颗粒直径为 45 ~ 55nm， 核 衣壳呈 20面体对称， 有 72个壳微粒， 由 L1及 L2组成。

目前已知的 HPV约有 90多种亚型，在人群中主要引起皮肤， 粘膜的疣状病变。 根据其与肿瘤发生的关系， HPV可分为 3组： ①低或无致癌风险组， 包括 HPV6、 11、 39、 41、 42、 43； ②中 度致癌风险组， 包括 HPV31、 33、 35、 51、 52; ③高度致癌风险 组， 包括 HPV16、 18、 58、 45。

HPV分子流行病学调查证实， 高危型 HPV感染是宫颈癌发 生的重要启动因子。 在所有宫颈癌标本中， HPV DNA检出率高 达 80 %以上。 宫颈癌是一种常见的女性恶性肿瘤， 其发病率仅次 于乳腺癌， 是严重威胁女性健康的杀手。 据统计， 每年世界范围 内约有 490,000例的新发病例，约有 270,000人死于该疾病（ Boyle, P., and J. Ferlay. Ann Oncol 2005 , 16:481-8 ) 。 在所有宫颈癌 病例中， 发生于发展中国家的占了约 83 %， 在这些国家中， 宫颈 癌甚至能够占到女性恶性肿瘤的 15 %。 而在发达国家， 这个数字 仅占到 1.5 %。 在撒哈拉以南地区， 中南亚， 拉丁美洲， 东亚均为 宫颈癌的高发区。 我国也属于宫颈癌高发区。 在陕西略阳县， 已 婚妇女中宫颈癌的发病率高达 1026/100000。

有关世界范围内宫颈癌标本中 HPV 型别分布的荟萃分析发 现， 宫颈癌中最常见的 HPV型别依次是 16、 18、 45、 31、 33、 58、 52、 35、 59、 56、 6、 51、 68、 39、 82、 73、 66和 70 (按照 降序 列， Clifford GM， Smith JS, Plummer M， et al. Br J Cancer, 2003, 88(1): 63-73 ) 。 近期一项对中国妇女感染 HPV 型别的调查结果表明，在宫颈癌患者中 HPV33的感染率为 3.6%， 在 HPV16 ( 58.7% )、 HPV18 ( 11.0% )、 HPV58 ( 7.2% )之后， 位于第 4 位 （Y P Bao , N Li , J S Smith and Y L Qiao. International Journal of STD & AIDS ， 2008， 19:106-111)。 这 说明 HPV33 在世界范围内的妇女宫颈癌患者中的感染率较 高， 是普遍易感染的 HPV型别之一。

目前已上市的 HPV疫苗为 Merck的 Gardasil®及 GSK的 Cervarix®, 上述两种疫苗分别含有 HPV6/11/16/18及 HPV16/18 VLP, 但均不包含在中国及亚洲妇女中普遍易感的 HPV33 型别 VLP。

因此，针对中国以及亚洲等发展中国家妇女安 全有效的 HPV 疫苗， 特别是针对 HPV16, 18及 33等高危型别的疫苗， 是有效 预防宫颈癌， 改善广大妇女（特别是我国及亚洲妇女）健康 状况 的有效途径。

HPV L1蛋白为主要衣壳蛋白， 分子量为 55-60kDa， 是 HPV 疫苗主要靶蛋白。在多种表达系统中表达的 HPV L1蛋白无需 L2 蛋白辅助即可形成在形态结构上与天然病毒颗 粒相似的病毒样颗 粒（ Virus-Like Particle, VLP )。 该病毒样颗粒为二十面体立体 对称结构， 由 72个 L1蛋白的五聚体组成。 其保留了病毒颗粒的 天然表位， 具有较强的免疫原性， 可诱导针对同型 HPV 病毒的 中和抗体 (Kirnbauer, R.， F. Booy, et al. 1992 Proc Natl Acad Sci U S A 89(24): 12180-4)。 并且， 病毒样颗粒不带有病毒核酸， 无 潜在致癌危险， 具有良好的安全性。 因此， VLP疫苗已成为 HPV 疫苗发展的主要方向。

HPV VLP疫苗研制的关键是能够大量高效制备 VLP样品。 目前较为常用的 VLP表达系统可以分为真核表达系统及原核表 达系统。

常用的真核表达系统有痘病毒表达系统、 昆虫杆状病毒表达 系统、 酵母表达系统。 在真核表达系统中所表达的 HPV L1蛋白 天然构象破坏少， 能自发形成 VLP, 往往只需进行简单的密度梯 度离心即可得到纯化的 VLP, 为纯化工作提供极大的便利。 但是 由于真核表达系统的表达量低， 培养成本高， 给大规模工业化生 产带来了极大困难。 目前已上市的 HPV疫苗 Gardasil®采用了酿 酒酵母表达系统， 其表达量低， 生产成本高， 因此该产品价位偏 高， 影响其广泛应用。

在原核表达系统中利用大肠杆菌表达系统表达 HPV L1蛋白 已有报道。例如已报道利用大肠杆菌表达 HPV16 L1蛋白（ Banks, L.， G. Matlashewski, et al. (1987). J Gen Virol 68 (Pt 12): 3081-9 )。 但是大肠杆菌表达的 HPV LI蛋白大多失去其天然构象， 不能产 生针对 HPV 的保护抗体。 或者尽管上述蛋白通过包含体纯化， 复性等步骤也可得到 HPV VLP ( Kelsall, S. R. and J. K. Kulski (1995). J Virol Methods 53(1): 75-90 )，但是在复性过程中蛋白损 失量大，得率低， 因此， 难以在大规模生产上应用。 虽然 HPV L1 蛋白也可以在大肠杆菌中以正确构象可溶性地 表达， 溶解于菌体 的裂解上清中， 但是其表达量较低， 而且上清中杂蛋白种类多且 量大， 要从中纯化出目的蛋白难度相当大。 虽然也有文献报道通 过 GST融合表达的方式可以增加上清中 L1蛋白的表达量， 而且 有助目的蛋白的纯化（Li， Μ·， T. P. Cripe, et al. (1997). J Virol 71(4): 2988-95 ) ， 但融合蛋白的切割往往需要价格昂贵的酶， 依 然无法应用于大规模生产。

因此，本领域仍然需要能够低成本获得且能够 诱导针对 HPV 的保护性抗体的 HPV L1蛋白及由其组成的病毒样颗粒， 从而使 大规模工业化生产宫颈癌疫苗成为可能。 发明内容

本发明至少部分基于发明人的出人意料的发现 ： 利用大肠杆 菌表达系统能大量表达可以诱导针对 HPV33 的中和抗体的截短 的 HPV33 L1蛋白， 该截短的 HPV33 L1蛋白具有高产率， 且经 纯化后纯度可达到 96 %或更高， 并且纯化后的所述蛋白经进一步 处理可得到可诱导针对 HPV33的保护性抗体的病毒样颗粒。 因此，在一个方面，本发明涉及一种截短的 HPV33 L1蛋白或 其变体， 其与野生型 HPV33 L1蛋白相比， N端截短了 9-19个氛基 酸， 例如 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18和 19个 ^酸。

在一个优选的实施方案中， 与野生型 HPV33 L1蛋白相比，该 截短的 HPV33 L1蛋白的 N端截短了 9个、 11个、 14个或 19个氛基 酸。

在另一个优选的实施方案中，该截短的 HPV33 L1蛋白（以下 也简称为截短蛋白）具有 SEQ ID NO: 4， SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6或 SEQ ID NO: 7所示的氛基酸序列。 在另一个优选的 实施方案中， 该截短蛋白具有如 SEQ ID NO: 4所示的氛基酸序 列。

在另一个方面， 本发明涉及编码本发明的截短蛋白或其变体 的多核苷酸以及含有该多核苷酸的载体。

可用于插入目的多核苷酸的载体是本领域公知 的， 包括但不 限于克隆载体和表达载体。在一个实施方案中 ，载体是例如质粒， 粘粒， 噬菌体， 柯斯质粒等等。

在另一个方面， 本发明还涉及包含上述多核苷酸或载体的宿 主细胞。 此类宿主细胞包括但不限于， 原核细胞例如大肠杆菌细 胞， 以及真核细胞例如酵母细胞， 昆虫细胞， 植物细胞和动物细 胞（如哺乳动物细胞， 例如小鼠细胞、 人细胞等） 。 本发明的宿 主细胞还可以是细胞系， 例如 293T细胞。

在另一个方面， 本发明涉及一种 HPV33病毒样颗粒， 其中该 病毒样颗粒含有本发明的截短蛋白或其变体， 或者由本发明的截 短蛋白或其变体组成或形成。

在一个优选的实施方案中， 本发明的 HPV33病毒样颗粒包含 与野生型 HPV33 L1蛋白相比， N端截短了 9-19个氛基酸， 例如 9 个、 11个、 14个或 19个氛基酸的截短的 HPV33 L1蛋白， 或由所述 蛋白组成或形成。 在一个特别优选的实施方案中， 本发明的 HPV33病毒样颗粒包含具有 SEQ ID NO: 4， 5， 6或 7所示序列的 截短的 HPV33 L1蛋白， 或由所述蛋白组成或形成。

在另一个方面， 本发明还涉及包含上述截短蛋白或其变体， 或上述多核苷酸或载体或宿主细胞或 HPV33病毒样颗粒的组合 物。 在一个优选的实施方案中， 所述组合物包含本发明的截短蛋 白或其变体。 在另一个优选的实施方案中， 所述组合物包含本发 明的 HPV33病毒样颗粒。

在另一个方面， 本发明还涉及一种药物组合物或疫苗， 其包 含本发明的 HP V33病毒样颗粒， 任选地还包含药学可接受的载体 和 /或赋形剂。本发明的药物组合物或疫苗可以� �于预防 HPV (特 别是 HPV33 )感染或由 HPV (特别是 HPV33 )感染所导致的疾病 例如宫颈癌等。

在一个优选的实施方案中， 所述 HPV33病毒样颗粒以预防 HPV感染或宫颈癌有效量存在。 在另一个优选的实施方案中， 本 发明的药物组合物或疫苗还包含至少一种选自 下列的病毒样颗粒: HPV6 L1蛋白病毒样颗粒， HPV11 L1蛋白病毒样颗粒， HPV16 L1 蛋白病毒样颗粒， HPV18 L1蛋白病毒样颗粒， HPV31 L1蛋白病 毒样颗粒， HPV45 L1蛋白病毒样颗粒， HPV52 L1蛋白病毒样颗 粒， HPV58 L1蛋白病毒样颗粒； 优选地， 这些病毒样颗粒各自独 立地以预防宫颈癌或者相应 HPV亚型感染有效量存在。

本发明的药物组合物或疫苗可通过本领域公知 的方法进行施 用， 例如但不限于通过口服或者注射进行施用。 在本发明中， 特 别优选的施用方式是注射。

在一个优选的实施方案中， 本发明的药物组合物或疫苗以单 位剂量形式进行施用。 例如但不意欲限定本发明， 每单位剂量中 包含的 HPV33病毒样颗粒的量为 5 g - 80 g， 优选 20 g - 40 g。 在另一个方面， 本发明涉及一种获得本发明的截短蛋白的方 法， 其包括利用大肠杆菌表达系统表达本发明的截 短蛋白， 然后 将含有该截短蛋白的裂解上清进行纯化处理。

在一个优选实施方案中， 获得本发明的截短蛋白的方法包括 a)在大肠杆菌中表达所述截短蛋白，

b)将表达所述截短蛋白 的 大肠杆菌在盐浓度为 100mM-600mM的溶液中破碎， 分离得到上清液，

c)用水或低盐溶液将 b )获得的上清液的盐浓度降至 lOOmM 或以下， 最低至 0， 并收集沉淀，

d)将 c )获得的沉淀在 150mM - 2500mM盐溶液中重新溶解， 同时加入还原剂， 分离得到溶液， 该溶液中含纯度至少 50 %的截 短的 HPV33 L1蛋白。

更一般性地， 本发明还涉及一种获得 HPV L1蛋白例如本发 明的截短蛋白的方法， 其包括

a)在大肠杆菌中表达编码 HPV L1蛋白的 HPV L1基因， b)将表达 HPV L1 蛋白 的 大肠杆菌在盐浓度为 100mM-600mM的溶液中破碎， 分离得到上清液，

c)用水或低盐溶液将 b )获得的上清液的盐浓度降至 lOOmM 或以下， 最低至 0， 收集沉淀，

d)将 c )获得的沉淀在 150mM - 2500mM盐溶液中重新溶解， 同时加入还原剂， 分离得到溶液， 该溶液中含纯度至少 50 %的 HPV L1蛋白。

本发明还涉及一种获得本发明的 HPV33病毒样颗粒的方法， 其在获得本发明的截短蛋白的^？上， 包括步骤：

e)将纯度至少 50 %的上述截短的 HPV33 L1蛋白进一步通过 色谱层析纯化，

f)将步骤 e)中得到的截短蛋白去除还原剂。

本发明还涉及一种制备疫苗的方法， 其包括将本发明的 HPV33 病毒样颗粒与药学可接受的载体和 /或赋形剂混合， 任选 地还混合一种或多种选自 HPV6, 11， 16, 18， 31 , 45， 52和 58 的 HPV型别的病毒样颗粒。 如上所论述的， 所获得的疫苗可以 用于预防 HPV(特别是 HPV33 )感染或由 HPV(特别是 HPV33 ) 感染所导致的疾病例如宫颈癌等。 在另一个方面， 本发明涉及一种预防 HPV感染或由 HPV感染 所导致的疾病的方法， 其包括将预防有效量的根据本发明的 HPV33病毒样颗粒或药物组合物或疫苗施用给受� ��者。 在一个优 选的实施方案中， 所述 HPV感染是 HPV33感染。 在另一个优选的 实施方案中， 所述由 HPV感染所导致的疾病包括但不限于， 宫颈 癌。 在另一个优选的实施方案中， 所述受试者是哺乳动物， 例如 人。

在另一个方面， 还涉及根据本发明的截短蛋白或 HPV33病毒 样颗粒在制备药物组合物或疫苗中的用途， 所述药物组合物或疫 苗用于预防 HPV感染或由 HPV感染所导致的疾病。 在一个优选的 实施方案中， 所述 HPV感染是 HPV33感染。 在另一个优选的实施 方案中， 所述由 HPV感染所导致的疾病包括但不限于， 宫颈癌。 本发明中相关术语的说明及解释

在本发明中， 除非另有说明， 否则本文中使用的科学和技术 名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。 并且， 本文中所用 的细胞培养、 分子遗传学、 核酸化学、 免疫学实验室操作步骤均 为相应领域内广泛使用的常规步骤。 同时， 为了更好地理解本发 明， 下面提供相关术语的定义和解释。

根据本发明，表述" N端截短了 个 ^酸的蛋白质"是指， 用 起始密码子 （用于起始蛋白质翻译）编码的甲硫氛酸残基 置换蛋 白质 N末端的第 1 - X位氨基酸残基所获得的蛋白质。 例如 N端截 短了 9个氛基酸的 HPV33 L1蛋白是指， 用起始密码子编码的甲硫 氨酸残基置换野生型 HPV33 L1蛋白 N末端的第 1 - 9位氛基酸残 基所获得的蛋白质。

根据本发明， 术语"变体"是指这样的蛋白， 其 列与 本发明的截短的 HPV33 L1蛋白（如 SEQ ID NO: 4， 5， 6或 7所示 的蛋白）的氛基酸序列具有一个或多个（例如 1-10个或 1-5个或 1-3 个）氛基酸不同或者具有至少 60%， 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% , 98%, 或 99%的同一性， 并且其保留了所述截短蛋 白的必要特性。 此处术语"必要特性"可以是如下特性中的一个� �� 者多个： 能够诱导针对 HPV33的中和抗体； 能够在大肠杆菌中可 溶性地表达； 利用本发明所涉及的表达纯化方法能够获得高 产率 的纯化蛋白。 术语"同一性，，是对核苷酸序列或氛基酸序� �的相似 性的量度。 通常将序列排列起来， 以获得最大限度的匹配。 "同一 性"本身具有本领域公知的意义并且可用公开� �算法 （例如

BLAST )来计算。

根据本发明，术语"大肠杆菌表达系统"是指由� ��肠杆菌 (菌株) 与载体组成的表达系统， 其中大肠杆菌 （菌株）来源于市场上可 得到的菌株，例如但不限于： ER2566, BL21(DE3), B834(DE3), BLR(DE3)„ 根据本发明， 术语"载体（vector ) ，，是指， 可将多核苷酸插 入其中的一种核酸运载工具。 当载体能使插入的多核苷酸所编码 的蛋白获得表达时， 载体称为表达载体。 载体可以通过转化， 转 导或者转染导入宿主细胞， 使其携带的遗传物质元件在宿主细胞 中获得表达。 载体是本领域技术人员公知的， 包括但不限于： 质 粒； 噬菌体； 柯斯质粒等等。

根据本发明， 术语"截短的 HPV33 L1 蛋白"是指在野生型 HPV33 L1蛋白的 N端和 /或 C端去掉一个或者多个氛基酸后的蛋 白质， 其中野生型 HPV33 L1蛋白的例子包括但不限于 NCBI数 据库中 P06416.1， ACV84008.1， ACV84011.1 , ACV84012.1 或 ACL12333.1等全长 L1蛋白。

术语"截短的 HPV33 L1蛋白基因片段 "是指这样的基因片段， 其与野生型 HPV33 L1蛋白基因 （cDNA )相比， 在 5'端或 3'端 去掉编码一个或多个氛基酸的核苷酸， 其中野生型 HPV33 L1蛋 白基因的全长序列例如但不限于 NCBI 数据库中如下序列： GO479013.1 , GQ479014.1 , M12732.1 , GQ479012.1 , GQ479015.1 , GQ479016.1 ， EU918766.1 ， GQ479017.1 ， GQ479018.1 或 GQ479019.1等。

根据本发明， 术语"药学可接受的载体和 /或赋形剂 "是指在药 理学和 /或生理学上与受试者和活性成分相容的载体� � /或赋形剂， 其是本领域公知的 (参见例如 Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR， 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995 ) ， 并且包括但不限于： pH调节剂， 表面活性剂， 佐剂， 离子强度增强剂。 例如， pH调节剂包括但 不限于磷酸盐緩冲液； 表面活性剂包括但不限于阳离子， 阴离子 或者非离子型表面活性剂， 例如 Tween-80; 佐剂包括但不限于铝 佐剂 （例如氢氧化铝） ， 弗氏佐剂 （例如完全弗氏佐剂） ； 离子 强度增强剂包括但不限于氯化钠。

根据本发明，术语"有效量 "是指能够有效实现预期目的的量。 例如， 预防疾病（例如 HPV感染）有效量是指， 能够有效预防， 阻止， 或延迟疾病 （例如 HPV感染） 的发生的量。 测定这样的 有效量在本领域技术人员的能力范围之内。

根据本发明， 术语"色谱层析"包括但不限于： 离子交换色谱 (例如阳离子交换色谱） 、 疏水相互作用色谱、 吸附层析法（例 如羟基磷灰石色谱 )、凝胶过滤（凝胶排阻 )层析、亲和层析法。

根据本发明， 本发明的截短的 HPV33 L1蛋白优选通过如下 步骤获得： 将表达截短的 HPV33 L1蛋白的大肠杆菌在盐浓度为 100 - 600mM， 优选 200 - 500mM的緩冲液中进行破碎， 离心破 碎溶液， 得到上清液； 用水或低盐浓度（通常低于破碎用的盐浓 度） 的溶液降低所得上清液的盐浓度至盐浓度 lOOmM - OmM, 从而截短的 HPV33 L1蛋白在上清液中沉淀； 将沉淀在含还原剂 及盐浓度为 150 - 2500mM，优选 200mM以上的溶液中重新溶解， 从而分离得到含截短的 HPV33 L1蛋白的溶液， 其中所述蛋白的 纯度为至少 50 %， 优选至少 70 %， 更优选至少 80 %。

可用于本发明的方法中的緩冲液是本领域公知 的， 包括但不 限于， Tris緩冲液， 磷酸盐緩冲液， HEPES緩冲液， MOPS緩 冲液等等。

根据本发明， 宿主细胞的破碎可通过本领域技术人员熟知的 各种方法来实现， 包括但不限于匀浆器破碎、 均质机破碎、 超声 波处理、 研磨、 高压挤压、 溶菌酶处理等等。

可用于本发明的方法中的盐包括但不限于酸式 盐， 碱式盐， 中性盐， 例如碱金属盐、 碱土金属盐、 铵盐、 盐酸盐、 硫酸盐、 碳酸氢盐、 磷酸盐或磷酸氢盐， 特别是 NaCl、 KC1、 NH ₄ C1、 (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 中的一种或几种。 特别优选的盐是 NaCl。 可用于本发 明的方法中的还原剂包括但不限于 DTT, 2 -巯基乙醇， 其用量 包括但不限于 10mM-100mM。

根据本发明的 HPV33 病毒样颗粒可通过如下步骤获得： 将 上述纯度至少 50 %的截短的 HPV33 L1蛋白通过例如色傳层析进 行进一步分离， 得到经纯化的截短蛋白溶液； 去除该溶液中的还 原剂， 得到所述 HPV33 病毒样颗粒。 去除还原剂的方式是本领 域已知的， 包括但不限于， 透析， 超滤或者层析等。 发明的有益效果

目前用于制备 HPV 病毒样颗粒的表达系统可以分为真核表 达系统和原核表达系统。

在真核表达系统中表达的 HPV L1蛋白天然构象破坏少， 能 自发形成 VLP， 往往只需进行简单的纯化过程即可获得具有正 确 构象的 VLP。但目前真核表达系统例如杆状病毒表达系 统和酵母 表达系统存在表达量低， 培养成本高等缺陷， 给大规模工业化生 产带来了极大困难。

在原核表达系统中， 大肠杆菌表达系统具有培养成本低， 表 达量大的优点。 然而， 在大肠杆菌中表达的 HPV L1蛋白往往失 去正确的天然构象， 以包含体形式表达于沉淀中。 目前对表达于 包含体中的蛋白进行复性依然是一个世界性难 题。 复性困难和效 率低下使得从包含体中获得有正确构象的 VLP 难以在大规模生 产中实施， 只能局限于小规模的实验室研究中。 虽然 HPV L1也 可以以正确构象可溶性地表达于大肠杆菌中， 但是其表达量低下。 并且， 从包含种类繁多的可溶性蛋白的大肠杆菌裂解 上清中纯化 出 HPV LI蛋白也相当困难， 往往需要借助融合表达及亲和层析 等手段， 而这些手段又往往需要昂贵的酶， 因此， 仍然无法实现 工业化生产。

本发明提供的 N端截短的 HPV33 L1蛋白和其制备方法有效 地解决了上述问题。 首先， 本发明使用大肠杆菌表达系统来表达 N端截短的 HPV33 L1蛋白， 确保了其高表达量。 其次， 本发明 采用温和的手段选择性沉淀大肠杆菌裂解上清 中的截短蛋白， 然 后采用含盐緩冲液重新溶解截短蛋白， 从而在保持截短蛋白的正 确构象的前提下使蛋白纯度有了显著提高， 并且获得的截短蛋白 溶液可以直接通过色谱层析例如离子交换层析 及疏水交换层析进 行进一步纯化， 获得高纯度的目的蛋白 （例如纯度达到 96% ) 。 进一步， 所获得的高纯度截短蛋白可以组装为病毒样颗 粒， 并且 该病毒样颗粒可以在体内诱导高滴度的针对 HPV33的中和抗体， 具有良好的免疫原性， 是一种良好的疫苗形式， 可用于预防 HPV33对人体的感染。 由此可见， 本发明具有以下优点： 本发明 的截短蛋白在保留全长 HPV33 L1蛋白的抗原性及颗粒组装能力 的同时， 可在大肠杆菌表达系统中实现大量表达； 本发明所采用 的制备方法无需使用昂贵的酶， 成本低廉； 截短蛋白在纯化过程 中构象没有经过剧烈的变性复性过程， 损失小， 产率高； 截短蛋 白所形成的病毒样颗粒能够诱导高滴度的针对 HPV 的保护性抗 体， 可用于生产疫苗。 因此， 本发明的截短蛋白和其制备方法可 应用于大规模工业化生产， 并且使大规模工业化生产宫颈癌疫苗 成为可能。 下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案 进行详细描述， 但是本领域技术人员将理解， 下列附图和实施例仅用于说明本发 明， 而不是对本发明的范围的限定。 根据附图和优选实施方案的 下列详细描述， 本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术 人 员来说将变得显然。 附图说明

图 1显示了在实施例 2的不同步骤中获得的 HPV33N9C-L1 蛋白的 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道 M:蛋白分子量标 记； 泳道 1: 破菌上清（即， 破碎菌体后离心获得的上清） ； 泳 道 2: 无盐沉淀产物（即， 透析后离心获得的沉淀）； 泳道 3: 重 溶后上清（即， 将无盐沉淀产物重新溶解后离心获得的上清） ； 泳道 4: 重溶后沉淀（即， 将无盐沉淀产物重新溶解后离心获得 的沉淀） 。 结果显示， HPV33N9C-L1 蛋白在通过沉淀， 重溶的 步骤之后， 纯度从之前的约 10 %提高到了约 70 % (参见泳道 1 和 3 ) 。

图 2显示了实施例 3中经 HIC (疏水相互作用色谱 ) 纯化获 得的 HPV33N9C-L1的 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道 M: 蛋白分子量标记； 泳道 1: 用 Butyl Sepharose 4 Fast Flow柱进行 纯化前的样品；泳道 2: Butyl Sepharose 4 Fast Flow柱穿透级分； 泳道 3: Butyl Sepharose 4 Fast Flow柱 200mmol/L NaCl洗脱级 分（ ΙΟμΙ )。 结果显示， 经过 Butyl Sepharose 4 Fast Flow柱纯化 后， HPV33N9C-L1蛋白纯度达到 98 %以上 （参见泳道 3 ) 。

图 3显示了实施例 4中所得的 HPV33N9C-L1病毒样颗粒的 透射电镜观察（放大 50,000倍， Bar=0.2 m ) 结果。 视野中可见 大量半径为 25nm左右的病毒样颗粒，颗粒大小与理论大小� �符， 且均 一致。

图 4显示了实施例 4中所得的 HPV33N9C-L1病毒样颗粒的 动态光散射观测结果。 结果显示， HPV33N9C-L1 病毒样颗粒的 水化分子动力学半径为 27.77nm， 颗粒组装百分比为 100%。

图 5显示了实施例 5中用 HPV33N9C-L1病毒样颗粒接种小 鼠后不同阶段血清的中和抗体滴度。 在初次免疫 2周后， 中和抗 体滴度即有明显上升； 在经过一次加强免疫后， 中和抗体的滴度 即能达到 10 ⁵ 的较高水平。

图 6显示了实施例 5中用 HPV33N9C-L1病毒样颗粒接种兔 子后不同阶段血清的中和抗体滴度。 在初次免疫 1个月后， 中和 抗体滴度即有明显上升； 在经过一次加强免疫后， 中和抗体的滴 度即能达到 10 ⁶ 的较高水平。

图 7显示了实施例 6得到的 N端截短了 11个， 14个或 19个 氨基酸的 HPV33 L1蛋白— HPV33N11C-L1 , HPV33N14C-L1 , HPV33N19C-L1 (其 ^^列分别是 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 )的 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。 泳道 M， 蛋白分子量标记； 泳道 1， HPV33N11C-L1蛋白， 上样体积 为 ΙΟμΙ; 泳道 2， HPV33N14C-L1蛋白， 上样体积为 ΙΟμΙ; 泳道 3, HPV33N19C-L1蛋白， 上样体积为 10μ1。 结果显示， 实施例 6得到的蛋白 HPV33N11C-L1 , HPV33N14C-L1 , HPV33N19C-L1 的蛋白纯度均达到了 98 %以上。

图 8显示了实施例 6中所述的 HPV33N11C-L1病毒样颗粒的 透射电镜观察（ 50,000 倍， 0.2um ) 结果。 结果显示， 视野中可 见大量半径为 25nm左右的病毒样颗粒， 颗粒大小与理论大小相 符， 且均 一致。

图 9显示了实施例 6中所述的 HPV33N14C-L1病毒样颗粒的 透射电镜观察（ 50,000 倍， 0.2um ) 结果。 结果显示， 视野中可 见大量半径为 25nm左右的病毒样颗粒， 颗粒大小与理论大小相 符， 且均 一致。

图 10显示了实施例 6中所述的 HPV33N19C-L1病毒样颗粒 的透射电镜观察（ 50,000 倍， 0.2um ) 结果。 结果显示， 视野中 可见大量半径为 25nm左右的病毒样颗粒， 颗粒大小与理论大小 相符， 且均 一致。

图 11显示了实施例 6中所述的 HPV33N11C-L1病毒样颗粒 的动态光散射观测结果。 结果显示， HPV33N11C-L1病毒样颗粒 的水化分子动力学半径为 28.34nm左右，颗粒组装百分比为 100%。

图 12显示了实施例 6中所述的 HPV33N14C-L1病毒样颗粒 的动态光散射观测结果。 结果显示， HPV33N14C-L1病毒样颗粒 的水化分子动力学半径为 26.03nm左右，颗粒组装百分比为 100%。

图 13显示了实施例 6中所述的 HPV33N19C-L1病毒样颗粒 的动态光散射观测结果。 结果显示， HPV33N19C-L1病毒样颗粒 的水化分子动力学半径为 27.11nm左右，颗粒组装百分比为 100%。 具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明 （而非限定本发明） 的实施 例来描述本发明。

除非特别指明， 本发明中所使用的分子生物学实验方法和免 疫检测法， 基本上参照 J. Sambrook等人， 分子克隆： 实验室手 册， 第 2版， 冷泉港实验室出版社， 1989， 以及 F. M. Ausubel 等人， 精编分子生物学实验指南， 第 3版， John Wiley & Sons, Inc., 1995 中所述的方法进行； 限制性内切酶的使用依照产品制 造商推荐的条件。 本领域技术人员知晓， 实施例以举例方式描述 本发明， 且不意欲限制本发明所要求保护的范围。 实施例 1. 具有 SEQ ID NO: 4所示序列的截短的 HPV33 LI 蛋白的表达

HPV33 L1全长基因片段的制备

以从福建省厦门市子宫颈癌病人阴道分泌物中 提取的 DNA 为模板， HPV33S: 5，-CAT ATG TCC GTG TGG CGG CCT AG-3' (SEQ ID NO:12)为正向引物， HPV33 R: 5，-GTC GAC TTA TTT TTT AAC CTT TTT GC-3' (SEQ ID NO:13)为反向引物， 在 PCR仪（Biometra, T3 ) 中按照如下条件进行 PCR反应， 制备 HPV33 L1全长基因片段。

在 HPV33阳性的多份标本中，扩增得到大小特异的 1.5kb左 右的产物，经测序获得 3条 HPV33 L1基因序列（ SEQ ID ΝΟ:1 , 2和 3 )。 在本实施例中， 示例性地将 SEQ ID NO: 1作为模板， 用于制备编码本发明的截短蛋白的 DNA片段。 截短的 HPV33 L1基因的非融合表达载体的构建

以前一个步骤获得的 HPV33 L1全长基因片段（ SEQ ID NO: 1 )为模板， 以 HPV33N9F: 5'-CATATs ACA gTg TAC CTg CCT CCT-3' ( SEQ ID NO: 14 )为正向引物（其 5'端引入限制性内切 酶 Ndel位点 CAT ATG, ATG为大肠杆菌系统中的起始密码子）； 以 HPV33R: S'-GTC GAC TTA TTT TTT AAC CTT TTT GC-3' ( SEQ ID NO: 13 )为反向引物 （其 5'端引入限制性内切酶 Sflfl 位点） ， 在 PCR热循环仪 ( Biometra T3 ) 中按照如下条件进行 PCR反应。

扩增得到 1.5kb左右的大小特异的 DNA片段。 将该 PCR产 物与商售的 pMD 18-T载体（TAKARA公司生产）连接， 转入大 肠杆菌；提取质粒，经 NdellSaH酶切鉴定，得到插入截短的 HPV33 L1基因的阳性克隆 pMD 18-T-HPV33N9C-Ll _e

利用 M13(+)/(-)引物，测得 pMD 18-T-HPV33N9C-L1质粒中 插入的目的片段的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 8所示， 其编码的 氛基酸序列如 SEQ ID NO: 4所示。 该序列对应的蛋白质为 N端 被截短 9个氛基酸、 C端未被截短的 HPV33 L1蛋白， 将其命名 为 HPV33N9C-L1。

将上述的 pMD 18-T-HPV33N9C-L1质粒进行 Λ^^ΙΛ^η酶切， 获得 HPV33N9C-L1基因片段。再将该片段与经 iVi^IA^n酶切的 非融合表达载体 pTO-T7 (罗文新等， 生物工程学报， 2000， 16:53-57 )相连接， 转入 ER2566细菌； 提取质粒， NdellSall 酶切 鉴 定得 到 插 入 目 的 片 段 的 阳 性表 达克 隆 pTO-T7-HPV33N9C-Ll。 取 Ιμί的 pTO-T7-HPV33N9C-Ll质粒（ 0.15mg/ml )转化 40μί以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌 ER2566 (购自新英格兰 生物实验室公司） ， 将其涂布于含卡那霉素 （终浓度 25mg/mL, 下同） 的固体 LB培养基（LB培养基成分： 10g/L蛋白胨， 5g/L 酵母粉， 10g/L氯化钠， 下同） ， 并 37°C静置培养 10-12小时至 单菌落清晰可辨。 挑取单菌落至含 4mL液体 LB培养基（含卡那 霉素） 的试管， 在 37。C 220转 /分钟下振荡培养 10小时， 从中取 lmL菌液于 -70°C保存。

HPV33N9C-L1蛋白的大量表达

从 -70。C中取出携带重组质粒 pTO-T7-HPV33N9C-Ll的大肠 杆菌菌液， 接种入 50ml含卡那霉素的 LB 液体培养基中， 在 200rpm, 37。C下培养大约 8小时； 然后转接入 10瓶 500ml含卡 那霉素的 LB培养基中 （每瓶接入 5ml菌液）， 在 200rpm， 37°C 下培养过夜， 作为种子液。

采用上海保兴生物公司生产的 50L发酵罐进行大规模培养。 校正发酵罐 PH电极， 将 30L LB培养基装入发酵罐， 原位 121°C 灭菌 30min; 校正溶氧电极， 以灭菌后未通气前为零点， 以发酵 时通气后未接种前初始搅拌速度 lOOrpm时为 100%。

补料准备：配制 30%的蛋白胨和酵母骨混合物（20g蛋白胨、 10g酵母骨溶至 100ml ) ， 50%的葡萄糖 (50g溶至 100ml)， 121。C 灭菌 20min。

次曰将 10瓶种子液共 5L接入发酵罐中，设定温度 37。C， pH 值 7.0， 手动调节搅拌速度及通气量， 维持溶氧在 40%以上。

流加补料：将 50%的葡萄糖和 30%的蛋白胨和酵母骨混合物 按溶质质量比 2: 1的比例混合。 流加速度如下：第一小时： 5%;第二小时： 10%;第三小时：

20%； 第四小时： 40%; 第五小时及以后 60% (以 25mL/min为 100% ) 。

当细菌浓度达到 00 ₆ 。。为 10左右时，将培养温度降至 25。C， 加入 4g IPTG诱导培养 4小时。 终浓度为大约 60 ( OD ₆₀₀ ) ， 下 罐， 离心收集菌体。 获得表达了 HPV33N9C-L1蛋白的菌体， 重 大约 2.5kg。 实施例 2. 纯度约 70 %的 HPV33N9C-L1蛋白的获得

按 lg菌体对应 10mL裂解液 (20mM Tris緩冲液， pH7.2， 300mM NaCl)的比例重悬菌体。 采用 APV 均质机 (An Invensys Group产品）以 600bar压力破碎菌体 5次。以 13500rpm (30000g) 离心菌体破碎液 15min， 留取上清（即， 破菌上清） 。 通过 10 % SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测上清， 此时上清中 HPV33N9C-L1 的纯度约为 10% (参见图 1， 泳道 1 ) 。

采用 CENTRASETTE 5切向流装置（ PALL产品）对上清进 行透析， 所用膜包截留分子量为 30kDa， 透析液为 10mM磷酸盐 緩冲液 pH6.0， 透析体积为三倍上清体积，运行压力为 0.5psi， 流 速为 500mL/min， 切向流速为 200mL/min。

充分透析后， 使用 Beckman J25 高速离心机以 9500rpm (12000g)离心 20min， 收获沉淀（即， 无盐沉淀产物） 。 用 1/10 上清体积的 20mM磚酸盐緩冲液 pH8.0, 20mM DTT, 300mM NaCl重悬沉淀， 搅拌 30min， 然后使用 Beckman J25高速离心 机以 13500rpm (30000g)离心 20min，并收获上清和沉淀（即， 重 溶后沉淀）。 使用 20mM磷酸盐緩冲液 pH8.0， 20mM DTT稀释 该上清至 3倍体积， 以使 NaCl终浓度为 0.1M, 然后使用 0.22μπι 孔径滤膜进行过滤， 所获得的样品 （即， 重溶后上清）用于进行 阳离子交换色谱纯化（如实施例 3所述）。取 150μ 过滤后样品， 加入 0μL· 6Χ Loading Buffer ( 12% (w/v) SDS, 0.6% (w/v)溴盼 蓝， 0.3M Tris-HCl pH 6.8, 60%(v/v) 甘油， 5%(ν/ν) β -巯基乙 醇）， 混匀并于 80。C 7j浴 lOmin; 然后取 ΙΟμΙ^于 10 % SDS-聚丙 烯酰胺凝胶中以 120V电压电泳 120min; 然后以考马斯亮兰染色 显示电泳条带。 电泳结果见图 1。 结果显示， HPV33N9C-L1蛋白 在经过沉淀、 重溶的步骤之后， 得到了纯化和富集， 其纯度从之 前的约 10 %提高到了约 70 % (见图 1， 泳道 1和 3 ) 。 实施例 3: HPV33N9C-L1的色谱纯化

HPV33N9C-L1的阳离子交换色谘纯化

仪器系统： GE Healthcare公司 (原 Amershan Pharmacia 公司）生产的 AKTA explorer 100型制备型液相色傳系统。

层析介质： SP Sepharose 4 Fast Flow( GE Healthcare公司）。 柱体积： 5.5cmx20cm„

緩冲液： 20mM磚酸盐緩冲液 ρΗ8·0， 20mM DTT

20mM磚酸盐緩冲液 pH8.0, 20mM DTT, 2M NaCl„ 流速： 25mL/min

检测器波长： 280nm。

样品为实施例 2中获得的经 0.22μπι孔径滤膜过滤的、 纯度 约为 70 %的 HPV33N9C-L1蛋白溶液。

洗脱程序为： 400mM NaCl洗脱杂蛋白， 800mM NaCl洗脱 目的蛋白， 收集 800mM NaCl洗脱级分。

HPV33N9C-L1的 CHT II (羟基磷灰石色谱） 纯化 仪器系统： GE Healthcare公司 (原 Amershan Pharmacia 公司）生产的 AKTA explorer 100型制备型液相色傳系统。

层析介质： CHT- II (购自 Bio - RAD)

柱体积： 5.5cmx20cm

緩冲液： 20mM磚酸盐緩冲液 pH8.0， 20mM DTT

20mM磚酸盐緩冲液 pH8.0, 20mM DTT, 2M NaCl„ 流速： 20m;L/min。

检测器波长： 280nm。

样品为： 前一步碌获得的 800mM NaCl洗脱级分， 将 NaCl 浓度稀释至 0.5M。

洗脱程序为： 500mM NaCl洗脱杂蛋白， lOOOmM NaCl洗脱 目的蛋白， 收集 lOOOmM NaCl浓度时的洗脱级分。

HPV33N9C-L1的 HIC (疏水相互作用色谘） 纯化

仪器系统： GE Healthcare公司 (原 Amershan Pharmacia 公司）生产的 AKTA explorer 100型制备型液相色傳系统。

层析介质： Butyl Sepharose 4 Fast Flow ( GE Healthcare公 司） 。

柱体积： 5.5cmx20cm

緩冲液： 20mM磚酸緩冲液 pH8.0， 20mM DTT。

20mM磚酸緩冲液 ρΗ8·0， 20mM DTT, 2M NaCl„ 流速： 20m;L/min。

检测器波长： 280nm。

样品为： 前一步骤获得的 lOOOmM NaCl洗脱级分。

洗脱程序为： lOOOmM NaCl洗脱杂蛋白， 200mM NaCl洗脱 目的蛋白， 收集 200mM NaCl浓度时的洗脱级分。 取 200mM NaCl浓度时的洗脱级分 150μί, 加入 30 L 6X Loading Buffer, 混匀并于 80。C水浴 lOmin; 然后取 ΙΟμΙ于 10 % SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以 120V电压电泳 120min; 然后以考马斯 亮兰染色显示电泳条带。 电泳结果见图 2。 结果显示， 经过上述 纯化步碌后， HPV33N9C-L1蛋白的纯度大于 98 %。 实施例 4: HPV33N9C-L1病毒样颗粒的组装

仪器系统为 PALL生产的 CENTRASETTE 5切向流系统； 膜包截留分子量为 30kDa; 样品为实施例 3所得的纯度大于 98 % 的 HPV33N9C-L1。

样品的复性： 以复性緩冲液（50mM PB (磷酸钠緩冲液） pH 6.0, 2mM CaCl ₂ ， 2mM MgCl ₂ ， 0.5M NaCl, 0.003% Tween-80 ) 充分交换样品緩冲液， 交换体积为样品原始体积的 10倍以上。切 向流装置的运行压力为 0.5psi， 切向流速度为 10mL/min。在复性 緩冲液交换完后， 用储存緩冲液（20mM PB (磷酸钠緩冲液） pH 6.5, 0.5M NaCl )进行交换， 交换体积为样品体积 4倍以上。 切 向流装置的运行压力为 0.5psi， 切向流速度为 25mL/min。 交换完 毕后，使用 PALL 0.20μπι滤器无菌过滤样品，得到 HPV33N9C-L1 病毒样颗粒， 将其置于 4 ^e C保存备用。 实施例 5: HPV33N9C-L1 VLP的形态学检测及其免疫原性 的测定

HPV33N9C-L1病毒样颗粒的透射电镜观察

使用的仪器为日本电子公司生产的 100kV透射电镜，放大倍 数为 100,000倍。 将实施例 4所得 HPV33N9C-L1病毒样颗粒用 2%磷钨酸 pH7.0负染， 固定于喷炭的铜网上， 进行观察。 电镜结 果见图 3， 其中可见大量半径为 25nm左右的病毒样颗粒， 大小 均匀， 呈现为空心形态。

HPV33N9C-L1病毒样颗粒动态光散射观察

使用的仪器为美国 Protein Solutions 公司生产的 DynaPro MS/X型动态光散射仪 (含温度控制器），使用的算法为 Regulation 算法。 样品为实施例 4所得 HPV33N9C-L1病毒样颗粒。 样品经 0.22μπι 滤膜过滤后进行测量。 测量结果见图 4。 结果显示， HPV33N9C-L1 VLP的水化分子动力学半径为 27.77nm。

HPV33假病毒中和细胞模型的建立

由于 HPV难以在体外进行培养， 而且 HPV宿主特异性强， 难以在人以外的宿主上繁殖， 缺乏合适的动物模型， 因此， 为了 能对 HPV 疫苗的免疫保护性进行快速评估， 需要建立有效的体 外中和实验模型。

假病毒 ( pseudovirions )体外感染模型：利用 HPV VLP可非 特异性包装核酸的特性，通过在细胞内表达 HPV的 L1和 L2蛋白， 通过包裹细胞内的游离体病毒 DNA或外源导入的报告质粒， 组 成 HPV 假病毒 (Yeager, M. D, Aste-Amezaga, M.et al (2000) Virology (278) 570 - 7)。 具体方法包括重组病毒表达系统法及多 质粒共转染方法。 本实施例示例性采用多质粒共转染方法。

HPV假病毒的构建方法如下：

用 CsCl密度梯度离心方法分别纯化质粒 p33Llh (携带编码 HPV33 L1蛋白（NCBI数据库， P06416.1)的核苷酸序列的 pAAV 载体)、 质粒 p33L2h (携带编码 HPV33 L2蛋白（NCBI数据库， P06418.1)的核苷酸序列的 pAAV载体)及带有绿色荧光蛋白基因 的质粒 pN31-EGFP ( pN31-EGFP和上述的 pAAV载体均由 NIH 的 John T.Schiller教授馈赠） 。 利用 CsCl密度梯度离心来纯化 质粒的方法是本领域公知的， 参见《分子克隆： 第三版》 。

使用磷酸钙转染法， 用纯化后的 p33Llh、 p33L2h、 pN31-EGFP各 40 g共转染培育于 10cm细胞培养孤中的 293FT 细胞（ Invitrogen )。 磷酸钙转染法是本领域公知的， 参见《分子 克隆： 第三版》 。 简言之， 将 p33Llh、 p33L2h、 pN31-EGFP各 40 g加入 lmL的 HEPES溶液（每 50mL去离子水含有 pH = 7.3 的 1M Hepes 125μL· _i 4。C储存）和 lmL的 0.5mol/L CaCl ₂ 溶液的 混合溶液中，混匀，然后逐滴加入 2mL 2xHeBS溶液（ 0.28M NaCl (16.36g) , 0.05M HEPES (11.9g), 1.5mM Na ₂ HP0 ₄ (0.213g) , 溶 解于 lOOOmL去离子水， pH = 6.96， -70。C储存）中， 室温下静置 lmin; 然后将混合液加入培养有 293FT细胞的 10cm细胞培养亚 中， 培养 6hr; 然后弃去原培养液， 加入 10mL新鲜的完全培养 液（Invitrogen公司 ) 。 转染 48hr后， 弃去培养基， 用 PBS清 洗细胞 2次； 然后将细胞刮下收集细胞， 进行细胞计数， 并且每 10 ⁸ 个细胞用 lmL裂解液（0.25% Brij58， 9.5mM MgCl ₂ )重悬。 裂解后， 以 5000g离心 10min， 收集上清， 加入 5M NaCl (终浓 度为 850mM )，从而获得假病毒液，将其分装为小份后置� � -20。C 保存。 抗体中和滴度的测定

将 293FT细胞（ Invitrogen )#于 96孔细胞培养板中（ 1.5xl0 ⁴ / 孔） 。 5hr后如下进行中和实验： 将待测的血清样品 （含待测抗 体）分别用 10 % DMEM进行连续倍比稀释， 然后取 50μ 各个经 稀幹的样品分别与 50μί稀幹于 10 % DMEM中的如上制备的假病 毒液混合 ( moi=0.1 ) ； 在 4。C下孵育 lh后， 将混合物分别加入 预铺有 293FT细胞的 96孔细胞培养板中， 并在 37。C培养 72h; 然后先通过荧光观察确定各样品大概的抗体滴 度， 再用流式细胞 仪 ( EPICS XL, 美国 Beckman Coulter公司）检测各孔细胞的感 染率， 计算血清的准确抗体滴度。 感染率为待测细胞样品在阳性 区中的细胞数量百分率减去未感染的对照细胞 样品在阳性区中的 数量百分率。

感染抑制率 = ( 1 -加入血清的孔的感染率 /未加入血清的孔 的感染率） χΐοο%。

抗体中和滴度的定义为： 达到高于 50 %感染抑制率的最大稀 释倍数。 经 50倍稀释后仍能达到 50 %以上感染抑制率的抗体被 视为具有中和能力。

HPV33 VLP用于免疫动物的免疫保护性的评价

使用小鼠来评价本发明的 HPV33 VLP的免疫保护性。 免疫 用动物为 4-5周龄 SPF级 BALB/c小鼠 8只。 根据实施例 1 - 4 所述方法制备 HPV33N9C-L1 病毒样颗粒。 将该颗粒稀幹至 O.lmg/ml, 然后加入等体积的完全弗氏佐剂 （用于初次免疫）或 等体积的不完全弗氏佐剂 （用于加强免疫） ， 混合均匀。 免疫程 序为： 0周时初次免疫； 2， 4和 6周时加强。 免疫方式为肌肉注 射， 初次免疫剂量为 lO g/只， 加强免疫剂量为 lO g/只。

初次免疫后， 每 2周抽取外周静脉血， 分离血清。 然后根据 上述方法检测小鼠血清中针对 HPV33假病毒颗粒的中和抗体滴 度。 检测结果如图 5所示。 结果表明， 根据实施例 1-4所述方法 获得的 HPV33N9C-L1病毒样颗粒具有良好的免疫原性， 可在小 鼠体内诱导高滴度的针对 HPV33的中和抗体，可用作预防 HPV33 感染的有效疫苗。 除了使用弗氏佐剂外， 该疫苗也可使用本领域 公知的其他佐剂， 例如氢氧化铝或磷酸铝佐剂。 还使用兔子来评价本发明的 HPV33 VLP的免疫保护性。 免 疫用动物为 6 ~ 8周龄普通级雌性兔 4只（购自广西省疾病预防与 控制中心） 。 将实施例 1-4所制备的 HPV33N9C-L1病毒样颗粒 稀释至 1.0mg/ml， 然后加入等体积的完全弗氏佐剂 （用于初次免 疫）或等体积的不完全弗氏佐剂 （用于加强免疫） ， 混合均匀。 免疫程序为： 0周时初次免疫； 4， 8和 12周时加强。 免疫方式为 肌肉注射， 初次免疫剂量为 l.Omg/只， 加强免疫剂量为 l.Omg/ 只。

初次免疫后， 每 2周抽取外周静脉血， 分离血清。 然后根据 上述方法检测兔子血清中针对 HPV33假病毒颗粒的中和抗体滴 度。 检测结果如图 6所示。 结果表明， 根据实施例 1-4所述方法 获得的 HPV33N9C-L1病毒样颗粒具有良好的免疫原性， 可在兔 子体内诱导高滴度的针对 HPV33的中和抗体，可用作预防 HPV33 感染的有效疫苗。 除了使用弗氏佐剂外， 该疫苗也可使用本领域 公知的其他佐剂， 例如氢氧化铝或磷酸铝佐剂。

以上结果表明， 通过本发明的方法获得的 HPV33 病毒样颗 粒具有良好的免疫原性， 可在动物体内诱导高滴度的中和抗体， 从而可用作预防 HPV感染的疫苗。 实 施 例 6 ： HPV33N11C-L1 ， HPV33N14C-L1 ， HPV33N19C-L1蛋白和病毒样颗粒的制备以及形态学 观察

依据实施例 1 - 3描述的方法， 制备和纯化 N端截短了 11 个， 14个或 19个 ^酸的 HPV33 L1蛋白 （其 ^酸序列分别为 SEQ ID NO:5, 6, 7； 核苷 ^^列分别为 SEQ ID NO: 9， 10， 11 ) 。 这些蛋白质的纯度都达到 98 %以上（见图 7 ) 。

依据实施例 4 的方法， 将经纯化的 HPV33N11C-L1， HPV33N14C-L1 , HPV33N19C-L1蛋白组装成病毒样颗粒。

依据实施例 5 描述的方法， 对 HPV33N11C-L1， HPV33N14C-L1 , HPV33N19C-L1病毒样颗粒进行透射电镜观察 和动态光散射观察。 结果示于图 8-13。 图 8， 9和 10显示， 这些 截短蛋白可形成半径为 25nm左右的病毒样颗粒， 颗粒大小与理 论大小相符， 且均匀一致。 图 11， 12和 13显示， 这些病毒样颗 粒的水化分子动力学半径在 27nm左右，颗粒组装百分比为 100%。

另外， 通过使用实施例 5描述的方法可证实， 本发明所获得 的 HPV33N11C-L1 , HPV33N14C-L1 , HPV33N19C-L1病毒样颗 粒同样具有良好的免疫原性， 可在动物体内诱导高滴度的中和抗 体， 从而可用作预防 HPV感染的疫苗。 尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描 述， 但本领域 技术人员将理解： 根据已经公开的所有教导， 可以对细节进行各 种修改和变动， 并且这些改变均在本发明的保护范围之内。 本发 明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物 给出。