La presente invención está comprendida en el campo de los métodos de evaluación incruentos de la actividad lactasa intestinal.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La determinación de la actividad lactasa intestinal es de importancia en pediatría y gastroenterología y puede llevarse a cabo directamente, a partir de una muestra de mucosa, o indirectamente, a partir del nivel de glucosa en sangre o del hidrógeno expirado, después de la administración de una dosis al individuo.

La determinación directa tiene la desventaja de constituir un método complejo y caro debido a que requiere instrumental específico y personal muy especializado para la práctica de la extracción de la muestra que deberá someterse a análisis posteriormente, a parte de resultar desagradable y no carente de peligro para el individuo.

La determinación indirecta tiene la desventaja de que se trata de un método cruento que precisa la extracción de sangre por una persona especializada antes de que se pueda analizarse la muestra, a parte de ser compleja

y susceptible de errores, debido a la existencia de glucosa proveniente de la digestión de otros alimentos tomados por el individuo, y de glucosa endógena que pudiera haberse movilizado. Otros métodos de determinación de la lactasa intestinal se basan en que determinados disacaπdos son, en base a su afinidad a la lactasa, susceptibles de actuar como sustrato de la lactasa y se transforman, por acción de la enzima, en determinados monosacáridos que son absorbidos fácilmente por el intestino y eliminados por la orina.

Así, los métodos descritos en las patentes españolas ES-P-478590 y ES-P-482073, se basan en la evaluación "ιn vivo" mediante la administración oral de 3- O-metil lactosa y el análisis de la 3-O-metιl-D-glucosa en orina. Sin embargo, estos métodos presentan el inconveniente de la necesidad de emplear un procedimiento cromatográfico para la detección de 3-O-metιl-D-glucosa en la orina, lo cual implica instalaciones y equipos de análisis complejos y costosos . Por otra parte, en la patente española ES-P-

9001680 se describe la preparación del disacárido 4-0-β- galactopiranosil-D-xilosa de la fórmula (I)

para la evaluación de la actividad lactasa intestinal. Dicho disacárido se administra oralmente, actúa como sustrato de la lactasa intestinal y se descompone, en el tracto intestinal, en xilosa y galactosa, absorbiéndose la xilosa y eliminándose por la orina donde puede evaluarse directamente mediante un método colorimétrico simple. El disacárido de la patente española ES-P-9001680 presenta el inconveniente de que

presenta, a pesar de tener una estructura bastante similar a la de la lactosa, una afinidad mejorable a la lactasa. Ello implica que sólo una parte de la 4-0-β-galactopiranosil-D- xilosa ingerida se hidroliza en base a la actividad enzimática de la lactasa y, por tanto, la parte no descompuesta en xilosa y galactosa se elimina con las heces. Esto conlleva un margen de errores relativamente sustancial en vistas de que los valores bajos o hasta la inexistencia de xilosa en la orina analizada, pueden provenir tanto de actividad deficiente o nula de lactasa intestinal como de una deficiente hidrolización del disacárido por su falta de afinidad a la lactasa. Para aliviar este margen de errores, es necesario que el individuo inqiera una cantidad sustancial del disacárido, lo cual a su vez puede conducir a problemas intestinales tales como diarrea y a las molestias correspondientes para el individuo.

La patente española ES-P-9001680 también describe un método de preparación para la 4-O-β- galactopiranosil-D-xilosa, que básicamente comprende una síntesis a partir de bencil-β-D-xilopiranosido y que sigue una secuencia de operaciones que implica reacciones de protección selectiva, glicosilación y desprotección. Tanto el número de etapas de reacción, la utilización de reactivos caros tales como el triflato de plata en la reacción de glicosilación, y el empleo de columnas de cromatografía en la purificación de intermedios y del producto final, producen costes y presentan dificultades para llevar a cabo este procedimiento a escala industrial.

Por otra parte, Gorin et al. en "The Synthesis of β-Galacto- And β-Gluco-Pyranosyl Disaccharides by Sporobolomvces Sinqularis" , Can. J. Chem. 42(1964) 2307- 2319, describen la síntesis de una pluralidad de disacáridos, entre ellos 2-O-β-D-galactopiranosil-D-xilosa y la 3-O-β-D- galactopiranosil-D-xilosa, mediante un procedimiento puramente experimental. En esta publicación se llega a la

conclusión de que los productos resultantes de la transferencia de galactosilo, en el empleo de varios aceptores, surgen principalmente más de la sustitución de los grupos hidroxilo secundarios que de los grupos hidroxilo primarios, pareciendo el requisito estructural mínimo para la reacción con un aceptor, el hidroxilo vecino al grupo hidroxilo sustituido. No obstante, en esta publicación no se describe ninguna utilidad de los diversos disacáridos sintetizados .

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Para solucionar los inconvenientes del estado de la técnica anteriormente descrito, la presente invención tiene como objeto el uso de β-D-galactopiranosil-D-xilosas , concretamente de

2-O-β-D-galactopiranosil-D-xilosa de la fórmula general

OH y de 3-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa, de la fórmula general (III)

para la preparación de composiciones y disoluciones que se emplean para la evaluación incruenta y fiable de la lactasa intestinal.

Por otra parte, la invención también tiene como objeto un procedimiento que permite la preparación de las

β-D-galactopiranosil-D-χilosas cuyo uso se reivindica, así como de otras β-D-galactopiranosil-D-xilosas, mediante un método simplificado frente a los procedimientos convencionales de este tipo de disacáridos. Las β-D-galactopiranosil-D-xilosas, a saber, la 2-0-β-D-galactopiranosil-D-xilosa y la 3-0-β-D- galactopiranosil-D-xilosa cuyo uso se reivindica, presentan una afinidad a la lactasa sustancialmente mejorada frente a los disacáridos empleados convencionalmente en este tipo de evaluaciones, lo cual resulta sorprendente en vistas de que ambos compuestos son estructuralmente menos similares a la lactosa que por los compuestos anteriormente empleados, tales como la 4-0-β-galactopiranosil-D-xilosa, de la que se diferencian estructuralmente por sendos grupos hidroxilo adyacentes respectivamente al enlace glicosídico en la molécula.

Los disacáridos de las fórmulas (II) y (III) pueden incorporarse en composiciones y disoluciones en sí convencionales, individualmente o conjuntamente, o incluso mezcladas con una cantidad del disacárido convencional de la fórmula (I) y/o con cantidades menores de lactosa. Tales composiciones y disoluciones pueden contener cantidades de ingredientes en sí convencionales, farmacéuticamente aceptables, de al menos un aditivo seleccionado entre estabilizantes, protectores, saborizantes, lactosa, gelificantes, fluidificantes y conservantes . Las disoluciones pueden ser agua, soluciones acuosas o salinas en si convencionales.

Se ha podido observar que incluso cuando se emplea una mezcla de los tres disacáridos (I), (II) y (III), la evaluación de la actividad lactasa intestinal, a través de la xilosa presente en la orina eliminada, resulta sustancialmente mejorada frente a la evaluación posibilitada cuando se administra sólo el disacárido (I), lo cual evidencia claramente el efecto sorprendente inherente en la

invención.

El procedimiento según la invención, incluye la posibilidad de preparar β-D-galactopiranosil-D-xilosas que incluyen los disacáridos I, II y III antes mencionados, y comprende las siguientes etapas: Se hacer reaccionar una D- xilosa y un sustrato de β-D-galactopiranósido en presencia de una enzima β-galactosidasa, según el esquema de reacción

-D-galactopiranosido D-xilosa

n-galactosidaεa

I + II + III

siendo la concentración de D-xilosa de 2 a 20 veces superior a la del β-D-galactopiranósido, en un medio acuoso tamponado a pH 5,0 - 9,0 y a una temperatura entre 4 y 37°C; desactivar la β-galactosidosa mediante calentamiento a 100°C cuando se alcanza el máximo rendimiento de formación de disacáridos detectado (normalmente después de 4 a 8 horas) mediante cromatografía en capa fina o con una columna de carbón activo, y aislamiento de los disacáridos formados mediante filtración en columna de relleno con un diluyente seleccionado entre agua o agua /alcohol. Se obtiene así una mezcla de los disacáridos (I), (II) y (II) que pueden incorporarse en composiciones o disoluciones tanto como mezclas de los tres disacéridos, o como mezclas, después del aislamiento correspondiente, de uno de los disacáridos (II) o (III) con el disacárido (I), o individualmente.

En una realización del procedimiento, el β-D- galactopiranósido utilizado es Ó-nitrofenil β-D- galactopiranósido mientras que en otra realización es lactosa.

Por otra parte, la β-galactosidasa puede ser, por ejemplo, la de Escherichia Coli, como la comercializada por la firma española SIGMA-ALDRICH QUÍMICA, S.A.

El procedimiento puede llevarse a cabo en presencia de codisolventes miscibles en agua tales como acetonitrilo, dimetilformamida ó dimetilsulfóxido.

Las columnas de filtración empleadas para el aislamiento de los disacáridos pueden estar rellenas de Sephadex ™ G-10 o Biogel™ P2, o bien de carbón activo. Los disacáridos II y III pueden obtenerse también mediante otros métodos convencionales, tal y como los descritos por Gorin et al. en "The Synthesis of β-Galacto- And β-Gluco-Pyranosyl Disaccharides by Sporobolomyces Sinqilaris" , Can. J. Chem. 42(1964) 2307-2319. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA FIGURA

La única figura es una representación gráfica de la evolución de a) la hidrólisis in vivo, de una mezcla de las β-D- galactopiranosil-D-xilosas (I), (II) y (III) como porcentaje de xilosa eliminada en orina y b) la actividad lactasa intestinal (nm/min/mg proteína) durante el crecimiento de las ratas según lo descrito en los ejemplos.

MODOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN Los siguientes ejemplos describen con carácter ilustrativo aunque no limitativo, aspectos relevantes de la invención.

Ejemplo 1: Preparación de una mezcla de 4-0-β-D- galactopiranosil-D-xilosa (disacárido I), 2-0-β-D- galactopiranosil-D-xilosa (disacárido II) y 3-0-β-D- galactopiranosil-D-xilosa (disacárido III) A una solución de Ó-nitrofenil β- galactopiranósido (4g, 50mM) y xilosa (20g, 500nM), en agua tamponada (0,05 M KH ₂ P0 ₄ , lmM MgCl ₂ , 5mM mercaptoetanol, 265mL, pH 7,0), se adicionó β-galactosidasa de E. Coli de SIGMA (1,5 mg, 560 U), y la mezcla se incubó a 25°C durante 5 h y 45 min. Pasado este tiempo, la mezcla se calentó a

100°C durante 10 min. , se concentró y el residuo resultante se introdujo en una columna de carbón activado utilizando un gradiente de agua-etanol 1:0 --> 85:15. Se eluyeron primero los monosacáridos xilosa y galactosa, y seguidamente la mezcla de los disacáridos I, II y III. Se obtuvieron 2 g de mezcla de disacáridos ( 50% relativo a los equivalentes de Ó- nitrofenil β-galactopiranósido iniciales), en una relación I: II: III de 8,6:1,4:1,0 respectivamente.

De las distintas funciones que contenían los disacáridos I, II y III pudo separarse algunas con cada uno de ellos puro, que se utilizaron para caracterizarlos por RNM. El espectro de 'H-RMN (300 MHz, D ₂ 0) , medido con un espectómetro Varían XL-300, de las fracciones con el disacárido I fue idéntico al del producto previamente preparado.

Con objeto de caracterizar y determinar de forma inequívoca la regioquímica del enlace formado en los disacáridos II y III, las fracciones enriquecidas en estos compuestos se acetilaron y los productos resultantes se aislaron por HPLC semipreparativo (columna fase normal Si0 ₂ , hexano-acetato de etilo 1:1, detección por índice de refracción). Posteriormente, se registró el espectro de 'HRMN (300 MHz, CDL ₃ ) de cada uno de los derivados obtenidos:

Derivado acetilado de 2-0-β-D-galactopiranosil- Ó-D-xilopiranosa

Derivado acetilado de 2-0-β-D-galactopiranosil- β-D-xilopirañosa

Derivado acetilado de 3-0-β-D-galactopiranosil- Ó-D-xilopirañosa - Derivado acetilado de 3-0-β-D-galactopiranosil- β-D-xilopirañosa

La relación de disacáridos I, II y II obtenidos en la columna cromatográfica se determinó por cromatografía de gases con un cromatógrafo equipado con un detector de ionización de llama y columna capilar SE-54 (fase

estacionaria: 5% difenil y 95% dimetilpolisiloxano, 15 m de longitud, 0,15 mm de diámetro interno y μm de espesor). En lo análisis se empleó un flujo de nitrógeno de lmL/min. El programa de temperaturas utilizado fue: temperatura inicial 160°C; tiempo inicial 2 min; incremento de temperatura 5°C/min; temperatura final: 250°C. La muestras se analizaron tras trimetilsilicación mediante el protocolo siguiente: una alícuota (10 μl ) se calentó a 100°C durante 10 min, tras lo cual se adicionó piridina (25 μL) que contenía como referencia interna bencil β--xilopiranósido (lOmM) y N- trimetilsilimidazol (25 μL), y se continuó la calefacción a 60°C durante 30 min. Los tiempos de retención de los picos asignables a los distintos disacáridos fueron los siguientes: - bencil β--xilopiranósido (referencia interna): 12,04 min - disacárido I: 20,35 y 20,50 min disacárido II: 18,46 y 19,50 min disacárido III: 18,30 min

Ejemplo 2: Ensayo cinético de la hidrolización in vitro Los disacáridos I, II y III y lactosa se hidrolizaron según el método de A. Rivera-Sagredo, F.J. Cañada, 0. Nieto, J. Jiménez-Barbero y M. Martín-Lomas, Eur. J. Biochem. , 209 (1992) 415-422, con lactasa intestinal de cordero a pH 6,0, con los siguientes resultados, relativos a constantes de Michaelis (K_,) y velocidades máximas (V _max , :

Disacárido κ _B (mM) (%)

lactosa 11 ,0 100 disacárido I 340,0 20 disacárido II 14,0 20 disacárido III 4,0 70

Puede observarse que las constantes Michaelis

de los disacáridos II y III son sustancialmente más bajas que las del disacárido I, siendo la K _m del disacárido III incluso más baja que la de la lactosa, lo cual evidencia una afinidad extraordinaria de los disacáridos II y III a la lactasa.

Ejemplo 3: Eliminación de xilosa en orina tras administración oral de una mezcla de los disacáridos I, II y III

Una mezcla de los disacáridos I, II y III en una relación 8,6:1,4:1,0 respectivamente) preparada mediante el procedimiento del ejemplo 1, se empleó para evaluar la actividad de la lactasa intestinal. Para ello, un grupo de 17 ratas lactantes Sprague-Dawley de la misma carnada y con 12 días de edad, se mantuvo en ayuno durante 6 horas separado de la madre. Transcurrido este tiempo, se recogió orina basal de cada animal mediante presión vesical transabdominal e inmediatamente se administraron a cada uno 18,2 mg de la mezcla de disacáridos diluida en 0,3 mL de agua destilada utilizando una sonda intragástrica. A partir de ese momento se recogió orina durante las 5 horas siguientes, determinándose en la misma la xilosa eliminada mediante análisis colorimétrico basado en la reacción floroglucinol y usándose la orina basal como blanco. Inmediatamente tras la recogida de la orina, se sacrificaron tres de los animales en los que se determinó directamente la actividad lactasa en la mucosa intestinal. Para ello, se resecó un trozo de intestino delgado, se lavó, se recogió la mucosa mediante raspado con vidrio y se homogeneizó ésta, midiéndose la actividad lactasa espectrofotométricamente en el homogenado. Los animales restantes fueron devueltos a la madre y con ellos se repitió el experimento en condiciones similares a los días 15, 18, 21, 24 y 30 en que quedó extinguida la carnada. Los valores medios resultantes de esta experiencia aparecen recopilados en la figura, en la cual se refleja la hidrólisis de la mezcla de los disacáridos I, II y III in vivo y la actividad

lactasa intestinal durante el crecimiento de la rata. Para ello, se representa la eliminación de xilosa (%) [curva a)] y la actividad lactasa (nm/min/mg proteína) [curva b)] frente a la edad (en días). Los resultados de esta experiencia indican: 1) Que se detecta la presencia de xilosa en orina procedente de la hidrólisis de los disacáridos administrados por la acción de la lactasa intestinal; y 2) Que el curso de la eliminación de xilosa en orina, originada por la administración oral, corre paralelo con la conocida modificación fisiológica de la actividad lactasa intestinal que declina a lo largo del desarrollo del individuo. Esta experiencia demuestra que la metodología es útil para la evaluación "in vivo" de la actividad lactasa intestinal, siendo el procedimiento empleable para la evaluación de esta actividad de manera incruenta con fines diagnósticos, lo que tiene particular aplicabilidad en individuos lactantes en que se sospeche la existencia de una deficiencia de esta enzima.

Ejemplo 4: Un grupo de ratas lactantes Sprague-Dawley de la misma carnada y con 15 días de edad, se mantuvo en ayuno durante cuatro horas en cajas metabólicas a 30°C. A cada una de ellas se le administraron 18.2 g del disacárido I en 0.5 mi de agua destilada. Se recogió orina de los animales, presionando la vejiga transabdominalmente durante 5 horas. La xilosa eliminada en la orina durante este tiempo se evaluó espectroscópicamente. La eliminación de xilosa resultó ser del 21%, es decir, menos de la mitad que la que resultó de la mezcla de los productos I, II y III a los 15 días.

Comparándose los datos de este ejemplo con los del ejemplo 3 resulta evidente que las afinidades "in vivo" de los disacáridos II y III son tan elevadas que incluso compensan la peor afinidad del disacárido I, cuando los tres disacáridos se administran en una mezcla en la que prevalece el disacárido I.