3 ' ，4-二羟基 -3, 5 ' -二甲氧基联苄在制备治疗白内障的药物中的� �用 技术领域

本发明涉及含有机有效成分的医药配制品， 具体涉及含联苄类化合物的药物。

背景技术

白内障是一种发病率、 致盲率均居当今世界眼病之首的眼病。 有关白内障的致病机理目 前还没有统一认识， 但人们认为白内障与晶状体蛋白变性有密切关 系。 对于白内障的治疗有 药物治疗和手术治疗。 手术治疗存在一定的风险， 一是手术后的创伤修复， 残留在晶状体上 皮细胞 （LEC) 反弹性增殖、 移行， 会再次形成白内障即 "二次白内障"， 越来越多的白内障 病人属于早期发展或等待手术或手术不成功的 范畴； 二是一些老年患者常伴有其他疾病如糖 尿病、 高血压、 心脏病等， 不愿意手术治疗， 希望通过药物防治来提高生存质量； 三是手术 费用相对较贵， 难以解决低收入患者、 偏远地区患者的需求。 药物治疗分为西药和中药。 目前， 西医白内障治疗的药物一般有以下几类： ①辅助营养 类药如利眼明、 Colin-rosol等； ②与醌类学说有关的药物如卡他林、 法克林、 白内停、 治障 宁等； ③抗氧化损伤药物如谷光甘肽、 硫拉、 SOD等； ④其他类如腮腺素、 仙诺特、 视明露 等。 我国传统中药治疗则通过全身辨证施治， 早期白内障， 对肝肾两亏者予补益肝肾， 方选 杞菊地黄丸或石斛夜光丸； 脾虚气弱者予补脾益气， 方选补中益气汤； 肝热上扰者予清热平 肝， 方选石决明散； 阴虚挟湿热者予滋阴清热， 宽中利湿法， 方选甘露饮。 但是上述治疗药 物只能延缓病情的发生、 发展； 效果仍不理想。 因此， 研制疗效确切、 安全高效的治疗白内 障药物十分必要。

上述石斛夜光丸中石斛为名贵中药材， 我国传统医学认为它具有明目等功效， 《秘传眼 科七十二症全书》 记载 "石斛， 味辛， 性寒， 明盲目"， 《本经》 记载石斛具有 "补五脏虚劳 羸瘦， 强阴……。" 《本草纲目拾遗》 中记载 "除虚热， 生津……， 滋阴褪障……。" 现代 研究表明， 石斛含多种酚类化合物， 化合物 3 ' ，4-二羟基 -3， 5 ' -二甲氧基联苄即是其中一种。

3 ' ，4-二羟基 -3， 5 ' -二甲氧基联苄是一种联苄类化合物， 其化学结构式如下式 （ I ) 所示， 它的分子式是 C ₁₆ H ₁₈ 0 ₄ ， 分子量为 274。 由式 （ I ) 可见， 其结构中既有活泼的酚羟基， 又有芳 香性和一定的疏水性， 具有广泛的药理活性， 目前发现它具有抗氧化性、 抑菌、 松弛平滑肌 等活性， 具有抗衰老、 抗诱变、 抗肿瘤、 抗痉挛、 抗血小板凝聚作用等功效。 ■

( I ) 发明内容

本发明要解决的技术问题是提供 3 ' ，4-二羟基 -3， 5 ' -二甲氧基联苄的新用途， 即在制药 中的新应用。

现代医学研究表明， 白内障的发生机制主要包括晶状体渗透压改变 、 氧化损伤及晶状体 蛋白质非酶糖基化， 而且这三种因素相互影响。 在上述三种发生机制中， 晶状体氧化损伤和 渗透压改变是白内障发生发展的关键。 基于上述思想， 本发明人对石斛中的酚类化合物进行 了逐一研究， 发现 3 ' ， 4-二羟基 -3， 5 ' -二甲氧基联苄具有双靶酶抑制活性， 除公知的抑制 iNOS活性的抗氧化作用外， 还具有抑制 AR活性的抗高渗透压作用。

因此， 上述在制药中的新应用即为， 3 ' ，4-二羟基 -3， 5 ' -二甲氧基联苄在制备治疗白内 障的药物中的应用， 所述的药物不是石斛提取物。

上述应用中，所述药物由 3 ' ，4-二羟基 -3， 5 ' -二甲氧基联苄和医学上可接受的辅料组成， 其中， 3 ' ，4-二羟基 -3， 5 ' -二甲氧基联苄在药物中的质量百分含量为 0.1%〜1%。

上述应用中， 所述药物为滴眼液或眼膏， 其中， 所述滴眼液由以下重量配比的原料组成: 3 ' ，4-二羟基 -3， 5 ' -二甲氧基联苄 0.1〜1%，硼砂 5-10%，硼酸 5_10%，对羟基苯甲酸乙酯 0. 0〜 0. 05%， 氯化钠 5〜10%， 其余为水； 所述的眼膏由以下重量配比的原料组成： 3 ' ，4-二羟基 -3， 5 ' -二甲氧基联苄 0.1〜1%， 凡士林 65〜80%， 羊毛脂 10〜15%， 液体石蜡 8〜15%。 本发明所述的 3 ' ，4-二羟基 -3， 5 ' -二甲氧基联苄可以采用常规的方法从中药石� �或其它 植物中提取得到， 也可以由合成或其他方法制得。

本发明所述的应用， 其中体现所述用途的化合物 3 ' ，4-二羟基 -3， 5 ' -二甲氧基联苄具有 双靶抑制活性， 一方面显著抑制醛糖还原酶的活性， 阻断多元醇代谢通路， 阻止极性分子山 梨醇的积蓄， 减轻高渗透压对细胞损伤； 另一方面又显著抑制 iNOS的活性， 减少 N0的产生， 从而减轻氧化损伤作用， 实现治疗白内障的目的。

此外， 体现本发明所述用途的化合物 3 ' ，4-二羟基 -3， 5 ' -二甲氧基联苄的分子小， 不仅 _ 易被机体吸收， 而且可透过细胞膜， 既无积蓄作用， 又没有毒副作用。

具体实施方式

为了便于描述， 以下将化合物 3' ，4-二羟基 -3， 5' -二甲氧基联苄简称为 gigant ₀ l。 例 1 Gigantol的制备

Gigantol 提取方法为现有技术， 本发明人参照文献 （张朝凤， 邵莉， 王磊， 等. 兜唇石 斛酚类化学成分研究 [J]. 中国中药杂志，2008，33(24):2922〜2925。杨莉，� �丽华，王峥涛，等. 叠 鞘石斛中联苄类成分的定性定量分析 [J].中国药学杂志， 2007， 42(21):1620~1623.) 的报导制 备 gigantol, 具体实施过程如下：

干燥叠鞘石斛切碎打成粗粉， 用 95%乙醇加热回流提取 2〜3 次， 每次加乙醇量为 12000ml/kg药材， 回流约 2小时， 合并药液后抽滤， 将滤液浓縮至无乙醇味， 得浸膏， 加水 混悬后， 用等体积乙酸乙酯萃取 3次， 回收溶剂得乙酸乙酯萃取物。 将乙酸乙酯萃取物经硅 胶柱色谱， 用石油醚-乙酸乙酯 （石油醚：乙酸乙酯的配比分别为 100:0， 100:1, 50： 1， 100： 3， 25： 1, 20： 1, 15： 1, 12： 1, 10： 1, 9： 1, 8： 1, 6： 1) 溶剂系统进行梯度洗脱， 收 集石油醚-醋酸乙酯 (9: 1)洗脱部分； 该部分经过反复硅胶柱色谱， 石油醚-醋酸乙酯洗脱冲 掉其他物质后， 用氯仿-甲醇梯度洗脱分离纯化得到淡黄色油� �物。 所得到的淡黄色油状物 TLC喷洒 2%硫酸香草醛试剂显红色。

淡黄色油状物化合物鉴定为 gigantol: 紫外有吸收有四个吸收峰， 分别在 206nm， 224nm, 274nm和 300nm有最大吸收， 其中 300为肩峰； 在 IR中有 5个主要的吸收峰， 分别在 3500(0H)， 2900， 1600， 1520 (C-H)和 1220cm- 1 (C- 0- C)。在 1HNMR有两个甲氧基信号分别在 δ 3.77禾口 3· 85， 一个等位苯甲基质子信号在 52.83， 及六个芳香族信号 δ 6.81 (1H， d， J = 9 Hz, 3"_H)、 δ 6.77 (1H, dd， J= 2 and 9 Hz, 2"- H)、 δ 6.65 (1H, d, J = 2 Hz, 6"_H)和 δ 6.29 (3H， brs, A-ring protons)； 两个羟基信号在 δ 5.57和由 D20转换确定。 且在质谱中有一个离子峰 [Μ] + 在 m/z274(C16H1804)和一个基峰在 m/zl37。 经与文献数据对照 (Juneja R.K., Sharma S.C., Tandon J.S. A substituted 1 ,2-diarylethane from Cymbidium giganteum [J]. Phyto chemistry, 1985,24(2):321~324.), 化合物鉴定为 3' ，4-二羟基 -3， 5' -二甲氧基联苄 （ _g i _g antol)。

下述实施例 2〜5所述的滴眼液或眼膏均使用本例所制得的 gigantol。 例 2 滴眼液 1

(1) 处方：

Gigantol 3.00g - . - .

7.98g

对羟基苯甲酸乙酯 0.26g

氯化钠 7.35g

注射用水 加至 1000ml

(2) 制备方法： 取硼酸、 硼砂加入适量注射用水中， 加热使溶解， 加入 gi _gan tol、 氯化 钠、 对羟基苯甲酸乙酯搅拌溶解， 再继续煮沸 15min， 搅拌， 混合均匀、 放冷； 用硼砂水溶液

(1： 20) 调节 pH至 6.0〜7.0， 氯化钠调成等渗后， 过滤灭菌， 补充水量至全量 （1000ml) ， 充分搅拌均匀， 合格后灌封即制成滴眼液。

(3) 用法和用量：

滴眼， 每天 2-3次， 每次 1-2滴， 一疗程 30天。 例 3 滴眼液 2

(1) 处方：

Gigantol 1.00g

羧甲纤维素钠 2.0g

对羟基苯甲酸乙酯 0.3g

氯化钠 10.0g

注射用水 加至 1000ml

(2) 制备方法：

取羧甲纤维素钠溶于 30%的注射用水中， 过夜使其溶解， 用布氏漏斗垫 200目尼龙布过滤， 备用； 将对羟基苯甲酸乙酯加入少量水中， 加热使溶解， 备用； 将氯化钠加入适量注射用水 中， 加热溶解， 备用。

取上述羧甲纤维素钠置于水浴上加热煮沸， 在搅拌下加入 gigantol, 搅拌均匀后加入对 羟基苯甲酸乙酯溶液、 氯化钠溶液， 加注射水至 1000 ml, 充分搅拌均匀。 用 200目尼龙布垫 于布氏漏斗上减压过滤， 灌装于容器中， 密封， 用流通蒸汽 10CTC灭菌 30min，在避菌环境下， 分装于洗净灭菌的滴眼瓶中， 严封即得。

(3) 用法和用量：

滴眼， 每天 3次， 每次 1〜2滴， 一疗程 30天。 例 4 滴眼液 3 -

( 1 ) 处方：

Gigantol 6. 00g

硼砂 0. 100g

硼酸 19. 500g

依地酸二钠 0. 10g

羟苯甲脂 0. 25g

羟苯丙脂 0. 16g

PVP-K30 20. OOg

注射用水 加至 1000ml

( 2)制备方法： 取羟苯甲脂、 羟苯丙脂加入适量注射用水中， 加热、 搅拌使溶解， 备用； 取硼酸、 硼砂加入少量注射用水中， 加热使溶解， 依次将依地酸二钠、 gigantol加入使溶解， 将此溶液加入到上述羟苯甲脂与羟苯丙脂混合 溶液中， 加入 PVP-K30使溶解， 加注射水至全量 ( 1000 ml ) ， 充分搅拌均匀， 灌于容器内密封， 以 10CTC流通蒸汽灭均 30 min， 合格后灌封 即制成滴眼液。 例 5 眼膏

( 1 ) 处方：

Gigantol lg

凡士林 74. 00g

羊毛脂 13g

液体石蜡 12g

共制得 lOOg

( 2) 制备方法： 取液体石蜡用 200目尼龙布滤过后干热灭菌， 除去内含水分， 放冷； 取 凡士林、 羊毛脂混合熔化， 用 200目尼龙布滤过后 15CTC干热灭菌、 去水 2h以上， 放冷。

将 gigantol经 0. 22 mm微孔滤膜过滤灭菌处理后，加入到上述液体� ��蜡中制成细腻糊状， 然后分次加凡士林、 羊毛脂的混合物， 研磨均匀， 再分装于洁净、 灭菌、 干燥的玻璃瓶内， 即可。

( 3) 用法和用量：

涂于眼睑内， 每天 1次， 每次 30-100mg， 一疗程 30天。

例 6 (药理、 药效实验) 实验一 Gigantol对离体培养的晶状体的保护作用

实验目的： 研究 gigantol对体外培养的氧化损伤晶状体的保护作� ��。

1.实验材料

1.1实验动物

动物 4〜5周龄的 Wistar大鼠 20只， 体重 80〜120 g， 雌雄各半， 由广州中医药大学实验动 物中心提供， 合格证号： 粤临证字 2007A025。

1.2.受试药物

取实施例 1得到的 gigantol先加入 DMS0溶解， 再用 PBS分别配制成浓度为 3g I L的溶液， 经 0. 22 mm微孔滤膜过滤灭菌处理后， _20°C保存待用。

1.3 试剂

DMEM低糖培养基 (杭州吉诺生物医药技术有限公司）；胎牛血� � (杭州四季青生物工程材料 有限公司）； 磷酸盐缓冲液 (PBS， 福州迈新生物技术开发公司）； 30 %过氧化氢 (¾0 ₂ ， 浙江临 安化工二厂）； 吡诺克辛钠滴眼液即白内停 (武汉天天明药业有限责任公司， 批号： 070102) ; Bradford蛋白质定量试剂盒 (上海申能博彩生物科技有限公司）； 谷胱甘肽 (GSH)、超氧化物歧 化酶 (S0D)、 丙二醛 (MDA)测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所� ��品； 其他试剂均为国产 分析纯。

1. 4 仪器

E-52AA型旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂）； SHZ— Di l i型循环水式真空泵 (巩义市英峪 予华仪器厂）； BS110S型电子分析天平 (北京赛多利斯天平有限公司）旋转蒸发仪，� �净工作台， 全自动酶标仪， 裂隙灯显微镜、 可见分光光度计等； HI-98128型 pH计（北京 HANNA) ; SW-CJ-IF 型超净台（苏州净化设备厂）； Galaxy-s型 C0 ₂ 培养箱 (美国 RS Biotech)： ST-PT型解剖显微镜（日 本 OLYMPUS)； 5810-R型低温高速离心机（德国 Eppendorf)； 7200型分光光度计（上海尤尼柯仪 器有限公司）。

2.方法

2.1 体外大鼠晶状体的培养及分组

颈椎脱臼处死大鼠， 用眼科剪镊迅速摘取双眼眼球， 以含 800 U I ml青霉素、 800 g I ml 链霉素的冷 PBS液漂洗眼球后， 投入含相同浓度双抗的 PBS液中浸泡， 转入超净台。 约 10 min 后将大鼠眼球转移至含 500 U / ml青霉素、 500 g / ml链霉素的 DMEM培养液中， 小心从眼球后 极部剪开巩膜， 取出晶状体， 去除晶状体表面的虹膜和玻璃体， 晶状体经 PBS液漂洗 2遍后， 再用 DMEM液漂洗 1遍， 然后再放人已预热的 24孔组织培养板中培养， 每孔 1 ml DMEM培养基（含 20 % 胎牛血清、 ΙΟΟμ g/ml青霉素、 100 μ _β / ml链霉素）， 预培养 5 h (37°C , 5 %C0 ₂ ， ）后， 剔 除受损伤或已混浊的晶状体。将 40只未受损伤、透明的晶状体按照随机原则分 4个组培养， 每 组 10只： ①正常对照组： DMEM培养基 +10%胎牛血清 +100ug/ml青霉素及 100μ /ιιι1链霉素； ②模 型对照组： 正常组培养基 +2mm ₀ l/l 30%半乳糖； ③阳性对照组： 正常组培养基 +2mm ₀ l/l 30% 半乳糖 +10%吡诺克辛钠滴眼液（白内停， 1-羟 -5-氧 -5H-吡啶并 - [3， 2-a] -吩恶嗪 -3-羧酸钠- 水合物）； ④ gigantol组： 模型组培养基 +3mg/ml gigantol ,

2. 2 观察并照相记录晶状体混浊度

加药培养后， 每 6 h更换 1次培养液以保持 H ₂ 0 ₂ 浓度不变。 观察记录各组晶状体混浊度。 晶状体混浊度的分级方法分为四级： 在黑色背景下设计 1 mmX l mm的黑色方格图， 将被检晶 状体置于 "+ " 字交叉的黑色线条之上， 在解剖显微镜下观察晶状体， 按透过晶状体所能看 到的线条清晰度进行分级。 "一" 表示线条清晰可见，为完全透明， 即 0级； 晶状体 "+ "混 浊： 线条模糊， 但轮廓尚可辨， 即 I级； "++"混浊： 线条轮廓不清， 仅中央部隐约可见， 即 II级； "+++"混浊：线条完全不见，晶状体全部混浊，� �� III级。最后以各组晶状体混浊度.即 "+ " 出现量的多少进行统计学处理。 培养后 24 h， 拍照。

2. 3 晶状体水溶性蛋白 GSH含量及 S0D、 MDA活性检测

晶状体拍照后， 用冷 PBS液洗涤 2遍， 尽量洗净培养液， 再用滤纸吸干水分。 称质量。 按 质量与体积比为 1 : 10的量加入冷 PBS液，在冰浴上充分匀浆后倒人 2 mL 离心管中. 4°C、 12 000 r / min离心 20 min, 取上清即为晶状体水溶性蛋白， 采用 Bradford法检测定蛋白含量。 取剩 余上清， 分别采用二硫代二硝基苯甲酸法检测 GSH含量， 采用黄嘌呤氧化酶法测定总超氧化物 歧化酶（T-S0D)活性， 采用硫代巴比妥酸 (thibabituricacid, TBA)法检测 MDA活性， 以上操作方 法均严格按照试剂盒说明书进行。

2. 4 统计学方法 应用统计软件 SPSS 16. 0进行统计处理分析。

3.结果

3. 1 gigantol对晶状体混浊度的影响

晶状体分组培养后 6 h， 模型组晶状体均出现 "+ " 度浑浊， 其他各组均透明； 继续培养 6 h， 可见正常对照组晶状体均保持透明， 模型组晶状体为 "++"〜 "+++" 度混浊， 其他 各组晶状体混浊度在 "+ " 〜 "++" 度不等； 培养后 24 h， 正常对照组晶状体均保持透明； 模型组晶状体均为 "+++" 度混浊， 肉眼观察为乳白色， 且晶状体体积明显縮小； 阳性对照 组、 gigantol组的晶状体混浊度较模型组显著减轻； gigantol组晶状体混浊度与阳性对照组 比较有显著性差异 (P〉0. 05)。 结果见表 1。 表 1 不同时段各组晶状体混浊度量化比较 - 组别 晶状体 t=6h 12 h t=18h t=24h

正常对照组 10 0 0 0 0

模型组 10 10 17① 24® 30®

阳性对照组 10 0 6 13 17

Gigantol高齐 U量组 10 0 5② 8② 14②

统计方法: t检验;① P<0.05，与正常对照组比较;② P<0.05， 与阳性对照组比较

3.2 gigantol对晶状体水溶性蛋白、 GSH含量及 MDA、 T-SOD活性的影响

由表 2可见， 模型组与正常对照组比较， 水溶性蛋白含量、 GSH含量、 T-S0D活性均显著 降低， MDA活性显著升高 (均 P〈0. 05)， 而阳性对照组、 gigantol组可显著升高水溶性蛋白、 GSH的含量以及 T-S0D活性， 降低 MDA活性， 与模型组比较， 差异显著 (P〈0. 05)； gigantol 组与阳性对照组对比， 其水溶性蛋白含量、 GSH含量没有显著差异， 但 MDA活性显著降低、 T-SOD活性显著升高 (P〈0. 05)。 表 2 各组晶状体水溶性蛋白、 GSH含量及 MDA、 T-SOD活性变化比较

组别 N 水溶性蛋白 ^ω GSH/(mg/g) JMDA/(U/mg) JT-soD/(U/mg)

/(mg/ml)

正常对照组 10 15.932±0.298 189.343 ±3.526 0.242 ±0.0452 4.238±0.1102 模型组 10 5.7871 ±0.6527® 120.213 ±6.397' 2.159±0.0521' 2.333 ±0.399®

10 ② ② ② 阳性对照组 10.566±0.185 190.235 ±6.346® 2.368±0.637' 3.222±0.301

②③ ②③ gigantol组 10 9.332 ±0.30 199.34± 11.821 0.506±0.278 3.854±0.152 统计方法: t检验： ① P<0.05，与正常对照组比较；② P<0.05，与模型组比较； ③ P<0.05，与阳 注对照组比较

4.讨论

氧化损伤是诱发白内障的主要机制之一。 本实验采用体外构建氧化损伤晶状体的方法制 成白内障模型， 探讨 gigantol的抗白内障作用。 结果显示， gigantol可显著缓解晶状体可溶 性蛋白的减少， 降低 MDA活性， 提高 T-SOD活性， 即通过提高晶状体抗氧化能力而达到治疗白 内障的作用。

实验二 gigantol对人晶状体上皮细胞 （HLEC) 的保护作用

实验目的：探讨 gigantol对氧化条件下人晶状体上皮细胞（HLEC)� �形态及生长的影响。 1.实验材料

1.1 细胞株 人晶状体上皮细胞株 SRA01/04 (HLEC)o 1.2 药材、 试剂和仪器 新生小牛血清及 DMEM培养基 (Gibco公司） ； DMS0 (广州市康 洋化工有限公司） ， M193863MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 （北京中西远大科技有限公 司） ； 胰蛋白酶 （美国 DIFC0公司； 上海生工生物工程公司代理） 。 Olympus PM-6倒置显微 镜 （日本 OLYMPUS公司） ； BioTek ELx800酶标仪 （美国 BioTek公司） ； E-52AA旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂）； SHZ-D ( III)循环水式真空泵 (河南巩义市英峪予华仪器厂）； BP221S 电子分析天平 （上海精密仪器表有限公司） ； gigantol为实施例 1得到的化合物。

2.方法

2.1 HLEC的培养

取冻存的 HLEC冻存管立即置于 37°C水中， 将细胞悬液用 10倍体积的培养液稀释， 离 心， 除去上清， 反复洗涤 3次， 以 5 X 10 ⁸ 个 /L接种于培养瓶中， 37°C、 50 ml/ 5%C0 ₂ 培养 箱内培养， 细胞形态呈多角形或不规则形， 3〜4d 可融合。 融合成片的细胞， 中央部分细胞 呈六边形， 大小较一致。 细胞生长接近融合时及时传代或冻存， 按 1 : 3或 1 : 4分瓶传代培养。

2. 2 分组与给药及 HLEC形态观察

实验分为 3组， 取对数生长的 HLEC, 采用含 10%的胎牛血清的 DMEM培养基进行培养， 分 为三组。 正常对照组： HLEC+DMEM; 模型组： 正常对照组 +500 Hmol/L ¾0 ₂ (双氧水）； gigantol 组： 模型组 +1 g/L gigantol ; 在倒置显微镜下观察 HPLEC的形态及特征并及时照相记录。

2. 3 匪 T法检测 HLEC生长情况

消化并收集生长良好、 呈对数生长的 HLEC,以含有 10%胎牛血清的 DMEM培养液制成细胞 悬液。 接种于 96孔板培养板中， 每孔 200 μΐ, 细胞浓度为 8 10 ³ 个/1^，置于 37°C、 5%C0 ₂ 培养箱中培养 24h后， 弃去培养液， 加入无血清的 DMEM液， 继续培养 24h， 使细胞同步化， 24h后按照上述实验分组， 分别加入各药物， 继续培养 24h后， 弃去培养液， 在各组培养板 分别加入 200 μΐ的 ΜΤΤ试剂 （至终浓度为 0. 5 g/L) ,继续培养 4h终止培养， 吸去 MTT溶液， 加入 150 μΐ DMS0溶液， 室温下轻轻振荡 lOmin后， 于全自动酶标仪上 490nm波长测各组的 吸光值 （A)， 观察 gigantol组合对 HLEC生长情况的影响， 并计算细胞存活率和细胞抑制率 (细胞存活率％=药物组平均吸光度值 /正常对照组平均值吸光值 X 100%), 细胞抑制率 =100%- 细胞存活率）。 以上实验在同样条件下重复 3次， 取平均值。

运用 SPSS 16. 0进行统计处理。

3.结果

3. 1 gigantol对氧化条件下 HLEC形态的影响

结果显示， 正常对照组 HLEC为克隆性贴附生长， 细胞形态为扁平的多角形或星形， 其生 长特点为细胞之间紧密相靠、 互相衔接， 呈 "铺路石"状连接成片。 细胞多为单层， 一般互 不重叠， 细胞透亮， 胞浆丰富， 胞膜清晰， 且具有接触抑制和密度抑制现象， 形成内密外疏 的细胞群落， 增殖明显且部分呈现跳跃式生长， 与文献报道一致。

各模型组和 gigantol组的 HLEC培育 24 h后， 模型组在 ¾0 ₂ 的作用下， 细胞形态表现多 样， 不规则细胞增多， 逐渐变得肿胀， 出现空泡和颗粒， 逐渐死亡， 细胞变得稀疏； gigantol 组在 gigantol的干预下， HLEC较好地保持了原有细胞形态，细胞之间紧� �相靠，互相衔接， 排列规则， 较少出现肿胀， 空泡和颗粒等， 细胞未见稀疏。 从细胞形态上来看， gigantol能 拮抗 ¾0 ₂ 对 HLEC的氧化损伤。

3.2 gigantol对 HLEC生长情况的影响

结果见表 3。 表 3显示， 各组 HLEC培育 24h后， 加入 MTT, 再培养 4h， 模型组 HLEC的 增殖被 ¾0 ₂ 抑制增殖， 抑制率为 52. 99%， 与其他组比较差异显著 （p<0.05 ); gigantol组的 存活率达到 74. 38%， 与模型组比较差异显著 （p<0.05 )， 说明 gigantol能较好地防止 HLEC 的凋亡。 表 3 gigantol对 HLEC的增殖情况 组别 n A (x 士 s)— 存活率 (%) 抑制率 (%)

正常对照组 6 0. 5545 ± 0. 0029 100 0

模型组 6 0. 2606 ± 0. 0029 ^Θ 47. 01' 52. 99'

gigantol组 6 0. 472 ± 0. 0032 ② 74. 38 25. 62 统计方法： t检验； ① p<0.05， 与 gigantol组及正常对照组比较； ② P<0. 05， 与 gigantol组之间比较

4.讨论

晶状体上皮细胞（LEC)是白内障损伤的主要靶� �， 氧化应激是其发病的重要机制之一； 白内障病人出现混浊之前， LEC先出现凋亡； ¾0 ₂ 白内障患者房水和晶状体内升高， 干扰细 胞结构蛋白质和 DNA的功能， 致 LEC的细胞核和线粒体结构和功能损伤， 从而出发凋亡机 制， 细胞出现明显的凋亡现象。本试验通过体外培 养的人晶状体上皮细胞， 利用 ¾0 ₂ 模拟机 体氧化损伤病理生理特点， 造成模型组， 24h HLEC出现形态和数量的异常改变， 生长受到抑 制， 细胞形态逐渐丧失原有特征， 变得不规则、 不均一、 肿胀直至死亡， 生长受到抑制， 传 代后容易老化， 说明体外 ¾0 ₂ 培养的晶状体上皮细胞具有类似于白内障 的晶状体细胞改变。

Gigantol为酚性联苄类化合物， gigantol干预氧化条件的人晶状体上皮细胞， 保持了上 皮细胞的形态特征， 细胞之间紧密相靠， 排列规则， 呈 "铺路石"状连接成片， 细胞死亡率 明显下降， 传代未见老化， 从而证明其对晶状体上皮细胞具有良好的保护 作用， 其机制与 .

gigantol的酚性羟基抗氧化有关。 实验三 以 gigantol制成的各制剂对在体动物 （大鼠） 白内障的治疗作用

实验目的： 研究前述 gigantol制备的滴眼液和眼膏 （例 2〜例 5 ) 在整体动物水平上对 白内障治疗作用， 并与市场上应用较广泛的抗白内障药物白内停 （西药）、 石斛夜光丸（中药 复方） 进行药效比较。

1 材料

1.1 动物

Wistar 大鼠 160 只 （由广州中医药大学实验动物中心提供； 实验动物生产许可证号： scxk (粤) 2003-0001粤临证字 2007A025 ) 雌雄各半， 5〜6周龄， 体重 80〜120 g。

1.2 药物及试剂

D-半乳糖（AMRESCO产品， 纯度〉 99%)， 复方托吡卡胺眼药水（北京双鹤现代医药技 术有限责任公司， 批号： 060902)， 其他试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器设备

玻璃匀桨器 （陕西化学玻璃器械有限公司）； TGL-16G-A高速冷冻离心机 （上海安亭科 学仪器厂）； YZ-5E型裂隙灯显微系统 （苏州医疗器械厂）。 电热恒温水浴锅 （北京化玻联医 疗仪器有限公司）； 旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂， 型号： E-52AA); 循环水式真空泵 (巩 义市英峪予华仪器厂， 型号： SHZ-DIII); 电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司， 型号： BS110S); pH计 （北京 HA NA, 型号： HI-98128); 解剖显微镜 （日本 OLYMPUS, 型号： ST-PT); 低温高速离心机 （德国 eppendorf, 型号： 5810-R )； 分光光度计 （上海尤尼柯仪器 有限公司，型号： 7200型）， UV- 1600紫外可见光光度计（上海安亭科学仪器厂� �， Real time PCR 仪 （Bio-Rad)， DYY-10型电泳仪 （北京六一仪器厂）， A30型荧光分光光度计 （上海三科仪 器有限公司） 等。

2.方法

2.1 分组与模型制备

实验前， 用复方托吡卡胺眼药水滴大鼠双眼， 用裂隙灯显微镜检查晶状体透明的 160只 投入实验， 适应性喂养一周后， 按体重、 性别随机分为以下 8组 （每组 20只）： 白内停阳性 组、 石斛夜光丸阳性组、 模型组、 正常对照组和 gigantol组 1〜4， 其中， gigantol组 1的 受试药物为实施例 2的滴眼液， gigantol组 2的受试药物为实施例 3的滴眼液， gigantol组

3的受试药物为实施例 4的滴眼液， gigantol组 4的受试药物为实施例 5的眼膏。 正常对照 组， 每天予以 10 ml/kg生理盐水腹腔注射并给饮用水； 其余大鼠用于制造白内障模型， 造 模方法为： 自由饮用 10 % (w/v) D-半乳糖溶液， 并予以腹腔注射 50% (w/v) D-半乳糖溶液 lO mL/kg ( g卩 5g / kg)， 2次 /日 （10g/kg * d D-半乳糖）， 晶状体混浊度的分级方法参照文献， 待模型组晶状体发混浊度达到 I〜 II级时， 30天时， 再将半乳糖处理的模型大鼠随机分成 7 组： 模型组， 每天予以 10 mL/kg生理盐水腹腔注射并给饮用水； gigantol组， 按照前述用 法用量给药； 白内停阳性组， 每次滴一滴白内停， 3次 /日； 石斛夜光丸阳性组， 每天予以 0.22 g/kg石斛夜光丸灌胃； 药物处理 10天后用裂隙灯观察记录大鼠晶状体浑浊度。

2.2 晶状体混浊度在体观察

注射半乳糖后， 每天观察记录大鼠体重、 精神、 食欲、 毛色、 反应、 运动、 尿量等， 每 天用裂隙灯显微镜观察各组大鼠晶状体： 先用复方托吡卡胺眼药水滴大鼠双眼， 约 5min后， 用裂隙灯显微镜观察各组大鼠晶状体， 将晶状体混浊程度按下列标准分级， 0级： 无混浊， 晶 状体透明清亮； I级： 轻度混浊， 仅赤道部有空泡， 以一个 "+ "表示； II级： 明显混浊， 空 泡扩展到中央，用两个 "++"表示； III级：核混浊， 晶状体中央呈现核性白内障， 以三个 "+++" 表示； IV级： 整个晶状体呈完全混浊， 以四个 "++++"表示。 最后以各组晶状体混浊度， 即 "+ " 出现量的多少进行统计学处理。 运用 SPSS 16. 0进行统计处理。

90天后， 上述各组大鼠颈椎脱白处死， 取出眼球， 剔除虹膜、 玻璃体， 分离出晶状体， 用冷生理盐水洗涤 2遍， 再用滤纸吸干水分， 称质量， 组织切片及电镜制片， 形态观察。

3.结果

结果如表 4。模型组的大鼠注射 D-半乳糖 23天后开始形成白内障， 即晶状体周边出现散 在点状混浊， 随着时间的延长， 混浊度持续加重， 成为 II级〜 IV混浊； 正常组大鼠晶状体始 终保持透明； 30天后， 模型组停止腹腔注射和饮用 D-半乳糖， 白内障继续严重， 与其他各组 比较差异显著 （P<0.01 ); 各药物组干预 10天后， 晶状体浑浊开始发生逆转， 46天后大都转 变为 I级混浊或 0级透明清晰， 且 gigantol各组明显优于白内障停及石斛夜光丸（P O.05 ); 而在 gigantol各组中， gigantol组 1与 gigantol组 2、 gigantol组 3、 gigantol组 4相 比， 晶状体混浊度最低 （P<0.01 )， 药效最高， 大部分晶状体保持清亮透明。 通过组织病理切 片光学显微镜观察， 正常对照组的大鼠晶状体前囊上皮细胞排列整 齐， 细胞密度均匀； 模型 组的大鼠晶状体前囊上皮细胞排列相对紊乱， 细胞异常增殖， 细胞密度不均； gigantol各组 大鼠的晶状体前囊上皮细胞排列整齐， 少许增殖和凋亡。 电镜观察， 正常组对照晶状体纤维 细胞的细胞核、 细胞器均消失、 胞质均匀， 充满微管和微丝； 模型组晶状体纤维破坏， 指状 突起和球形突起体积增大， 胞质充满大小不等的空泡样物质； gigantol各组的指状突起和球 形突起体形态正常， 细胞内偶见空泡， 胞质电子密度均匀。 - 表 4 给药后不同时段各组大鼠晶状体混浊度量化比 较

组别 晶状体 t=20d t=30d t=40d (给药 t=60d (给药 t=90 h (给药

(给药前） (给药） 后第 10天) 后第 30天） 后第 60天） 正常对照组 40 0 0 0 0 0

模型组 40 77 92 98① 110① 130® 白内停组 40 77 92 65 33 23

石斛夜光丸组 40 77 92 72 39 31

40 77 92 54②③ 11②③

Gigantol组 1 (滴眼液） 26②③

Gigantol组 2 (滴眼液） 40 77 92 73② 32② 27②

Gigantol组 3 (滴眼液） 40 77 92 63② 29② 20②

Gigantol组 4 (眼膏） 40 77 92 70② 30② 26②

统计方法： t检验； ① P<0.01， 与正常对照组及其它各药物组比较； ② P<0.05， 与白内停 组、 石斛夜光丸组比较； ③ P<0.01， 与滴眼液 2组、 3组、 眼膏组比较。 实验四 gigantol对醛糖还原酶的抑制作用及其机制研究

实验目的： 研究 gigantol抗白内障的作用机理。

1 材料与方法

1. 1 材料、 试剂与仪器 gigantol为实施例 1得到的化合物。 醛糖还原酶 （AR) ， 批号 809AKR1B101 , 购自 PR0SPEC-TANY TECHNOGENE LTD; DL-甘油醛， 批号 1405930 23908264， 为 美国 Sigma公司产品； NADPH (还原型）， 批号 10041939， 为意大利 Roth公司产品； DMS0 (广州 市康洋化工有限公司） ； 磷酸盐缓冲液， 批号 20100203， （广州威佳科技有限公司） ； 全波 长酶标仪， BioTek (power wave XS2 ) ； 涡旋器（V0RTEX-T GENIE2产品） ； 离心机， ( Thermo elecTRON CORPORATION PIC017) 。 应用软件版本： Sybyl7. 3， Gaussian03W (中山大学药学 院） 。

1. 2 gigantol对 AR抑制的 IC ₅ 。测定 酶活力用试验条件下单位时间转化 NADi¾为 NADP+ 的量 来计算， 1单位酶活力（U)定义为在试验条件下， 酶催化氧化 1 μ πιοΐ NADra为 NADP ⁺ 。 参照

Prasanta Kumar Sahoo的方法， 测定温度为 25 °C ， 酶反应总体积为 200 μ L， 包括： 酶液 20 μ L, 0. 04 隱 ol I L ADPH 50 μ L, 10 隱 ol I L DL-甘油醛 50 μ L, 0. 1 mol I L憐酸盐缓冲液

(pH 6. 2)以及不同浓度的 gigantol溶液 （浓度设定通过测定抑制率在 0〜100 %范围内， 抑制 率为 50%的 gigantol浓度） 。 加入底物 DL-甘油醛开始反应， 以 340 nm处每分钟 NADi¾吸光值的 下降来表示 AR的活性， 每 10 s测定 1次， 反应时间记录 10 min。 gigantol用 DMS0溶解 ，涡旋，

DMS0在测试的反应体积中不能超过 1 %。 AR先离心后， 用 PBS稀释 100倍。取不同浓度 gigantol 作为样品组， 其他试剂加入顺序方法同空白组。每个样品进 行 3个复孔检测。样品对 AR的抑制 率计算如下: 抑制率（％) = [ 1—（^一 ） / ( 一^) ] 100%， 式中 A。表示未加酶、 底物和样品， 即每分钟 NADra自然氧化吸光值的下降； 表示未加样品每分钟 NADi¾吸光值的下降； A ₂ 表示 加样品后每分钟 NADra吸光值的下降。以样品浓度为横坐标，抑� ��率为纵坐标，绘制抑制曲线， 由曲线计算各样品对 AR的半数抑制浓度（IC ₅ 。）。

1. 3 gigantol对 AR抑制类型的测定 反应温度为 25°C， 酶反应总体积 200 μ L, 包括： 酶 ¾20 μ L, 0. 104 mmol / L NADPH 50 μ L, 不同浓度 gigantol ( 0， 1， 3， 5 mmol/L) 80 μ L, 然后分别加入不同浓度 DL-甘油醛（5， 10, 20, 40 mmol/L) 50 启动反应， 记录每分钟 NADi¾ 吸光值的下降。采用双倒数作图法， 确定抑制剂的抑制类型， 根据米氏方程计算动力学常数。

1. 4 分子对接 采用 Sybyl l7. 3中柔性对接模块 Flex X, 首先在配体分子中选取一个核心 部分， 将其对接到受体活性部位， 然后再通过树搜寻方法连接其余的片段； 配体和受体之间 结合情况的评价采用类似 BShm提出的半经验的自由能得分方程； 靶酶结构来源于 PDB数据库 (PDB 编号： 1US0)。 把晶体结构中配体所在位置周围 6. 5 A范围定义为活性口袋， 将 gigantol 与 AR进行对接。

1US0晶体结构的准备： 对接中采用晶体结构中的配体结构作为参考； 保留辅酶的存在； 氨 基酸侧链各氨基酸的角度按默认的值进行计算 ； 删除水分子； 最后计算配体表面。

gigantol配体的准备：建立 gigantol的配体文件（. sdf ),然后用 M0E (Molecular Operating Environment ) 药物设计软件的 ¾¾sh及 Energy Minimize模块处理 gigantol； 用 Gaussian03W 进行最低能量优化， 基本设置为 B3LYP/6_31+G (d)， 得到最佳能量构象。

分子对接： 将准备好的 AR晶体结构和配体 gigantol导入到 Sybyl中的 FlexX模块， 运行对 接。

1. 5 统计学处理 采用 SPSS 16. 0数据统计软件进行数据处理。

2 结果与分析

2. 1 gigantol对 AR的 IC ₅ 。测定 不同浓度的 gigantol对 AR的抑制作用见表 5。 可以看出， gigantol对 AR的抑制作用与其浓度存在明显的剂量一效应� ��系。 gigantol对 AR半数抑制浓度 为 IC ₅₀ =2. 12mmol/l o 表 5 gigantol不同浓度对 AR的抑制作用

Gigantol (m mol/L) 抑制率（％)

0. 5 21. 25 ± 7. 216878

1 29. 125 ± 7. 216878

5 62· 5 ± 12· 500000 ■

10 71. 25 ± 19. 094070

15 87· 5 ± 0· 000000

2. 2 gigantol对 AR的抑制类型 采用双倒数作图法， gigantol对 AR的抑制类型为非竞 争性抑制， 随着浓度的增大， 其抑制作用随之增强。

2. 3 gigantol与 AR分子对接 分子对接结果保留 10个对接构象， 用于对接结果分析。 选 取对接结果 RMSD最小 （值为 -25. 1020)、 打分最高的进行分析。

AR抑制剂的热点残基为 Trpl l l，His l lO，Tyr48。 在对接结果的二维作用图中可得出由 Trpl l l. His l lO, Tyr 48三种氨基酸残基与 gigantol发生作用， His l lO, Tyr 48与 3'位的羟基 形成氢键， Trpl 11与左苯环形成 IT - II共轭， 为范德华力作用， Trp 20与 gigantol 5'位上的 甲氧基形成氢键， 这些氢键的存在对于抑制剂的结合是非常重要 的， 且小分子和残基之间有 广泛的疏水作用。 由此可见， 芳环部分与活性口袋的残基侧链形成的范德华 力， 氢键作用和 疏水相互作用， 是 gigantol与 AR结合的主要驱动力。

3.结论

本研究首次发现 gigantol具有抑制醛糖还原酶 (AR)的活性， 其抑制作用与提取物浓度之 间存在明显的剂量 -效应关系， 随着 gigantol浓度的增大， 其抑制 AR的能力增强； 采用分子对 接预测 gigantol和 AR的相互作用模式， 得到的复合物结构表明， gigantol的羟基与 AR对接的 氨基酸残基含有文献报道的热点残基 Trpl 11, His l lO, Tyr48, Trpl l l与苯环形成的 n - π共轭 加强了 gigantol与 AR的对接， gigantol和 AR之间的主要结合方式是疏水相互作用、 氢键和范 德华力。 本研究阐明了 gigantol抗白内障的作用机理。 实验五 gigantol对诱导型一氧化氮合酶的抑制活性及其� ��制研究

实验目的： 进一步阐明 gigantol抗白内障的作用机理。

1 材料与方法

1. 1 药物、试剂与仪器 将实施例 1得到的 gigantol在临用前用 DMS0溶解； iNOS (重组酶， 表达于大肠杆菌， 每个亚单位同源二聚体的分子质量为 130 kD， 美国 Cayman Chemical公司）； BH4 (二盐酸盐， 纯度大于 99 %， 美国 Cayman Chemical公司）； iNOS试剂盒（南京建成生物工程 研究所）； 电热恒温水浴箱 (江苏省东台市电器厂）； 电子分析天平 (德国塞多利斯公司， 型号 SHZ-DI I I) ; 全波长酶标仪 （美国 BioTek公司， 型号 PowerWave XS2 ) ，涡旋震荡器 （美国 SI， 型号 VORTEX GENIE2 ) ，离心机 (美国 Thermo Electron，型号 PIC017)。 对接程序及版本： M0E 分子模拟软件 （中山大学药学院） 。 1. 2 gigantol对 iNOS抑制作用 IC ₅ 。的测定

按照试剂盒说明进行。 在试管中分别加入试剂 1、 2、 3、 iNOS样品、 BH4和受试药物， 混 匀， 37°C水浴 15min， 加入试剂 4终止反应， 取 200ul于 530 nm处， 蒸馏水调零， 用全波长酶标 仪测定其吸光度 (D)。

1. 3 gigantol对 iNOS的抑制率测定

按照 1. 2方法， 在试管中加入 3种试剂和 BH4, 不加入 iNOS和受试药物， 反应后测得空白管 吸光度； 另取数个试管， 各试管中分别加入 3种试剂、 iNOS样品和不同浓度的 BH4, 不加入受 试药物， 反应后测定各管吸光度， 计算 iNOS活性达到最大时所需 BH4最适有效浓度为 0. 07957 mmol/L, 此浓度下所测得的吸光度为标准管吸光度。

根据文献， 在试管中加入 3种试剂、 iNOS样品、 BH4 (最适有效浓度）和 gigantol (BH4最小 有效浓度的 60倍， 即 4. 77 mmol/L)， 反应后所测得的吸光度为测定管吸光度， 按公式： 计算 抑制率： P抑制 （％) = (D标准管一 D测定管） I (D标准管一 D空白管）X 100 %， 计算出 gigantol 在此浓度下对 iNOS抑制的百分率为 100 %。

1. 4 gigantol对 iNOS的半数抑制量 ( IC ₆ „) 测定

按照 1. 2方法，取数个试管，每个试管中均加入 3种试剂以及固定浓度的 iNOS样品和 BH4 (最 适有效浓度）， 并根据 1. 3所测结果， 向各试管中分别加入浓度为 BH4最适有效浓度的 30、 20、 18、 6. 5、 2. 4倍的^ ₁ ^ ₀ 1， 反应后测定各管吸光度， 再按 1. 3的方法和公式计算出各浓度下 gigantol对 iNOS的抑制率。

1. 5分子对接

1. 5. 1 受体（iNOS)的准备 目前， 主要的 iNOS抑制剂为胍类， iNOS酶与配体晶体结构 复合物 (ID号 2N0,配体是氨基胍），取自蛋白数据库 (http： //www. rcsb. org/pdb/home/home. do)。 该晶体结构的分辨率为 2. 30 A， 符合对接的精度要求。 在 M0E对接软件中删去水分子， 然后 选择 MMFF94X力场进行质子化， 构建原始模型， 测出配体受体相互作用， 对接选择氨基胍分 子为参照物。

1. 5. 2 配体（gigantol)的准备 构建配体数据库，包括 gigantol、氨基胍在内（主要用于 检测模型的可靠性） ， 然后给配体加氢， 用 MMFF94X力场计算部分电荷及最低能量构象优化� � 优化后的分子构象用于对接。

1. 5. 3 设定对接参数 设置除 refinement : forcefield, MMFF94X, 其它均为默认值。 2 结果与分析

2. 1 gigantol对 iNOS的抑制作用

不同浓度的 gigantol对 iNOS的抑制作用见表 6。 可以看出， gigantol对 iNOS的抑制作用与 - . - 其浓度存在明显的剂量-效应关系 <

表 6 gigantol在不同浓度下对 iNOS的抑制率

gigantol ( g/1 ) 抑制率 (%)

0. 74 74

0. 493 60. 20

0. 164 33. 33

0. 0596 22. 22

由表 6可见， gigantol实验浓度与抑制率有良好的线性关系。 以抑制率（y)对 iNOS浓度（x) 进行线性回归， 得回归方程： y= 0. 761½+0. 1971。 按此回归方程计算， 当 x=0. 39782时， y = 50%, 即 gigantol对 iNOS的 IC ₅ 。=32. 227 ± 5. 73 umol/L o

2. 2 gigantol与 iNOS分子对接

对接结果的选取主要依据结合自由能的大小， 同时参考打分的高低以及构象的合理性。 根据对各个构象的打分情况， 取打分最高的对接。

gigantol酚 4位的 -OH及 3'位甲氧基和 Ilel95，与形成分子间氢键， gigantol 5'位甲氧基和 Gln257 残基形成分子间氢键， 由于各种分子间的作用使 gigantol表现出对 iNOS酶的抑制活 性。

3.结论

gigantol除了能抑制 AR的活性外， 还能抑制 iNOS的活性， 从而表现良好的抗白内障作用。 其抑制作用与其浓度之间存在明显的剂量 -效应关系， 随着 gigantol浓度增大， 其抑制 iNOS 的能力增强； 采用 M0E分子模拟软件初步模拟了 gigantol与 iNOS的结合方式， gigantol的羟基 和 iNOS之间的主要结合方式是氢键相互作用。