UTILISATION DU BAZEDOXIFENE POUR AUGMENTER LA SURVIE MUSCULAIRE

DOMAINE TECHNIQUE

La présente invention vise à améliorer la fonction musculaire chez l’homme ou l’animal, en préservant l’intégrité et la survie des cellules musculaires, y compris en conditions défavorables.

Plus précisément, elle préconise l’utilisation de bazédoxifène, un modulateur sélectif des récepteurs aux œstrogènes (ou SERM pour « Selective Estrogen Receptor Modulator ») pour assurer la protection de la fonction musculaire, notamment dans des conditions pathologiques telles que des dystrophies musculaires.

ETAT ANTERIEUR DE LA TECHNIQUE

Les maladies neuromusculaires regroupent des pathologies diverses qui sont généralement associées à une perte de force musculaire transitoire ou permanente. Cette perte de force s’accompagne le plus souvent d’une fonte musculaire, également appelée amyotrophie.

Parmi ces maladies musculaires, les myopathies constituent un groupe important correspondant à des atteintes de la fibre musculaire à proprement parler. Parmi elles, les dystrophies musculaires progressives se caractérisent par une diminution de la force musculaire avec généralement une atrophie des muscles, ainsi que par des anomalies à la biopsie musculaire révélant une modification du tissu. Appartiennent notamment à ce groupe la dystrophie musculaire de Duchenne (ou DMD), la dystrophie musculaire de Becker (ou DMB), ainsi que les myopathies des ceintures.

Pour certaines de ces pathologies, les anomalies génétiques associées ont pu être identifiées. Ainsi, les dystrophies musculaires de Duchenne ou de Becker sont liées à des altérations dans le gène codant la dystrophine, la dystrophie des ceintures de type 2A (LGMD 2A ou RI ou calpainopathie) à des altérations dans le gène de la calpaïne 3, la dysferlinopathie (LGMD 2B ou R2) à des altérations dans le gène de la dysferline, les sarcoglycanopathies ou myopathies des ceintures de type LGMD 2C (ou R5), LGMD 2D (ou R3), LGMD 2E (ou R4), LGMD 2F (ou R6), à des défauts dans les gènes des y-, a-, P- et ô-sarcoglycanes, respectivement (McNally EM, Pytel P, Annu Rev Pathol. 2007 ; Vol 2 :87-109).

En lien avec la dysferlinopathie, il a été montré que la mutation L1341P dans le gène de la dysferline se traduisait par une mauvaise configuration de la protéine résultante, associée à son agrégation au niveau du réticulum endoplasmique. L’absence de dysferline au sarcolemme entraine alors une fragilité membranaire qui entraine in fine la mort des cellules musculaires et participe donc à la dystrophie musculaire.

Pour ces pathologies, différentes stratégies de thérapie génique sont en cours de développement mais restent délicates à mettre en œuvre.

Toutefois et plus généralement dans tous les cas de faiblesse musculaire, il existe un besoin évident de développer des solutions techniques permettant de préserver la fonction musculaire, notamment à l’aide de composés chimiques plus facilement maîtrisés que la thérapie génique.

Ainsi, la présente invention repose sur la mise en évidence, par les inventeurs, de cette propriété du bazédoxifène.

Le document W02009/021750 décrit l’utilisation du composé (2-phényl-lH-indol-3- yl)m éthanol, qui n’est pas un SERM, en lien avec le traitement des dystrophies de Duchenne ou de Becker et de la cachéxie.

Le document WO2015/108988 décrit l’utilisation d’une combinaison d’un SERM (avantageusement le lasoxifène qui ne comprend pas de groupement 2-phénylindole) et d’un inhibiteur de 5a-réductase pour traiter toute pathologie liée à une modification des taux d’hormones sexuelles.

Le document XIA HUI et al. (PLOS ONE, 2017, Vol. 12(7)) décrit l’utilisation de bazédoxifène pour le traitement spécifique du rhabdomyosarcome.

Le document WANG JING et al. (FRONTIERS IN PHARMACOLOGY, 2021, Vol. 11, pages 1-13) décrit l’utilisation de bazédoxifène pour le traitement d’une cardiomyopathie inflammatoire spécifique, à savoir la myocardite auto-immune. Le document DORCHIES et al. (JOURNAL OF NEUROMUSCULAR DISEASES, 2014, Vol. 1(1)) rapporte l’effet bénéfique du tamoxifène et d’autres SERM de l ^ere ou 2 ^eme génération sur un modèle murin de la maladie de Duchenne.

Le document WU BO et al. (THE AMERICAN JOURNAL OF PATHOLOGY, 2018, Vol. 188(4), pages 1069-80) rapporte l’effet bénéfique de l’administration orale de tamoxifène (SERM de l ^ere génération) et de raloxifène (SERM de 2 ^eme génération) dans un modèle murin de dystroglycanopathie.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION

Les inventeurs ont montré que le bazédoxifène, un composé pharmacologique principalement connu dans la prévention et le traitement de l’ostéoporose postménopause en raison de son action en tant que modulateur sélectif des récepteurs aux œstrogènes (ou SERM), est un candidat prometteur pour traiter les dysferlinopathies. La présente application révèle qu'il est efficace pour un large spectre de conditions associés à une fragilité des cellules musculaires, en particulier liée à l’intégrité de leurs membranes.

Définitions

Les définitions ci-dessous donnent le sens généralement utilisé dans le cadre de l'invention et doivent être prises en compte sauf si une autre définition est explicitement indiquée.

Dans le cadre de l'invention, les articles « un » et « une » sont utilisés pour désigner un ou plusieurs (c'est-à-dire au moins un) des objets grammaticaux de l'article. A titre d'exemple, « un élément » désigne au moins un élément, c'est-à-dire un ou plusieurs éléments.

Les termes « environ », « à peu près », « de l’ordre de » ou « approximativement » utilisés dans le présent document pour désigner une valeur mesurable telle qu’une quantité, une durée et autres, doivent être compris comme englobant des variations de ± 20 % ou ± 10 %, de préférence ± 5 %, plus préférablement ± 1 %, et encore plus avantageusement ± 0,1 % par rapport à la valeur spécifiée. Intervalles/plages : tout au long de cette divulgation, divers aspects de l'invention peuvent être présentés sous la forme d'un intervalle de valeurs (format de plage). Il faut comprendre que la description des valeurs sous la forme d'un intervalle n'est faite que par commodité et brièveté et ne doit pas être interprétée comme une limitation de la portée de l'invention. En conséquence, la description d’une gamme doit être considérée comme ayant spécifiquement divulgué toutes les sous-gammes possibles ainsi que les valeurs numériques individuelles dans cette gamme. Par exemple, la description d'une gamme telle que « de 1 à 6 » doit être considérée comme ayant spécifiquement divulgué des sous-gammes telles que de 1 à 3, de 1 à 4, de 1 à 5, de 2 à 4, de 2 à 6, de 3 à 6, etc. ainsi que les nombres individuels à l'intérieur de cette gamme, par exemple 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5.3 et 6. Ceci s'applique quelle que soit l'étendue de la plage.

« Isolé » signifie extrait ou retiré de son environnement ou état naturel. Par exemple, un acide nucléique ou un peptide isolé est un acide nucléique ou un peptide qui a été extrait de l’environnement naturel dans lequel il se trouve habituellement, que ce soit dans une plante ou un animal vivant par exemple. Un acide nucléique ou un peptide par exemple qui est naturellement présent dans un animal vivant n’est pas un acide nucléique ou un peptide isolé au sens de l'invention, alors que le même acide nucléique ou peptide partiellement ou complètement séparé des autres composants présents dans son environnement naturel est lui-même « isolé » au sens de l'invention. Un acide nucléique ou une protéine isolé peut exister sous une forme sensiblement purifiée, ou peut exister dans un environnement non natif tel que, par exemple, une cellule hôte.

Le terme « anormal », lorsqu’il est utilisé dans le contexte d’organismes, de tissus, de cellules ou de composants de ceux-ci, désigne les organismes, tissus, cellules ou composants de ceux-ci qui diffèrent par au moins une caractéristique observable ou détectable (par exemple, l'âge, le traitement, l'heure de la journée, etc.) des organismes, tissus, cellules ou composants de ceux-ci qui présentent la caractéristique respective « normale » (attendue). Les caractéristiques, qui sont normales ou attendues pour un type de cellule ou de tissu, peuvent être anormales pour un autre type de cellule ou de tissu.

Les termes « patient », « sujet », « individu » et autres sont utilisés de manière interchangeable dans le présent document et désignent tout animal ou cellule de celui- ci, in vitro ou in situ, pouvant être soumis aux méthodes décrites dans le présent document. Dans certains modes de réalisation non limitatifs, le patient, le sujet ou l’individu est un animal, de préférence un mammifère, plus avantageusement un humain, aussi bien de sexe féminin que masculin. Il peut également s'agir d’une souris, d’un rat, d’un porc, d’un chien ou d’un primate non humain (PNH), tel que le singe macaque.

Au sens de l'invention, une « maladie » ou « pathologie » est un état de santé d’un animal dans lequel son homéostasie est affectée négativement et qui, si la maladie n’est pas traitée, continue à se détériorer. A l’inverse, au sens de l’invention, un « trouble » ou « dysfonctionnement » est un état de santé dans lequel l’animal est capable de maintenir son homéostasie mais dans lequel l’état de santé de l’animal est moins favorable qu’il ne le serait en l’absence du trouble. En l’absence de traitement, un trouble n’entraîne pas nécessairement une détérioration de l’état de santé de l’animal dans le temps.

Une maladie ou un trouble est « atténué » (« réduit ») ou « amélioré » si la gravité d'un symptôme de la maladie ou du trouble, la fréquence à laquelle ce symptôme est ressenti par le sujet, ou les deux, sont réduits. Cela inclut également la disparition de la progression de la maladie, c'est-à-dire l'arrêt de la progression de la maladie ou du trouble. Une maladie ou un trouble est « guéri » (« rétabli ») si la gravité d'un symptôme de la maladie ou du trouble, la fréquence à laquelle un tel symptôme est ressenti par le patient, ou les deux, sont éliminés.

Dans le contexte de l’invention, un traitement « thérapeutique » est un traitement administré à un sujet qui présente les symptômes (signes) d’une pathologie, dans le but de réduire ou de supprimer ces symptômes. Dans le cadre de l’invention, le « traitement d’une maladie ou d’un trouble » signifie la réduction de la fréquence ou de la gravité d’au moins un signe ou symptôme d’une maladie ou d’un trouble ressenti par le sujet. Un traitement est dit prophylactique lorsqu’il est administré pour prévenir le développement, la propagation ou l’aggravation d'une maladie, notamment si le sujet ne présente pas ou pas encore les symptômes de la maladie et/ou pour laquelle la maladie n’a pas été diagnostiquée.

Tel qu'utilisé ici, « traiter une maladie ou un trouble » signifie réduire la fréquence ou la gravité d’au moins un signe ou symptôme d'une maladie ou d'un trouble ressenti par un sujet. Maladie et trouble sont utilisés de manière interchangeable dans le contexte du traitement selon l’invention. Au sens de l'invention, une « quantité efficace » ou une « quantité effective » d’un composé est la quantité de composé qui est suffisante pour fournir un effet bénéfique au sujet auquel le composé est administré. L’expression « quantité thérapeutiquement efficace » se réfère à une quantité qui est suffisante ou efficace pour prévenir ou traiter (en d’autres termes retarder ou empêcher le développement, empêcher la progression, inhiber, réduire, diminuer ou inverser) une maladie ou un trouble, y compris le soulagement des symptômes de cette maladie ou de ce trouble.

La présente invention concerne donc l’utilisation d’un modulateur spécifique des récepteurs aux œstrogènes (SERM), avantageusement de troisième génération c’est-à- dire comprenant un groupement 2-phénylindole, encore plus avantageusement le bazédoxifène ou ses dérivés, pour lutter contre la fragilité voire la mort des cellules musculaires, et donc pour augmenter la survie musculaire.

Les modulateurs sélectifs des récepteurs aux œstrogènes (ou SERM) sont des molécules non stéroïdiennes capables de se fixer sur les récepteurs des œstrogènes. Ils possèdent des propriétés à la fois agonistes et antagonistes des œstrogènes. De telles molécules peuvent être identifiées grâce à des tests bien connus tels que le test « estrogen response element (ERE) transactivation assay » ou comme décrit par Nelson (2016, Methods Mol Biol: 431-443).

En pratique, différents composés présentant une telle activité sont disponibles :

Les SERM dits de première génération sont des dérivés de triphényléthylène.

De tels composés peuvent par exemple être choisis parmi : le tamoxifène de formule :

- le citrate de tamoxifène le clomifène ou l’enclomifène ou le citrate de clomifène (CLOMID)

- le toremifène ou le citrate de toremifène l’afimoxifène (4-hydroxy tamoxifène) le levormeloxifène ou l’ormeloxifène le droloxifène l’idoxifène

- le fispemifène

- l’ospemifène ((deaminohydroxy)toremifène) de formule :

Les SERM dits de deuxième génération sont des dérivés de benzothiophène par exemple ; e formule : l’arzoxifène Les SERM dits de troisième génération sont des dérivés de 2-phénylindole de formule : De tels composés peuvent par exemple être choisis parmi : le bazédoxifène (numéro CAS : 198481-32-2) de formule :

- l’acétate de bazédoxifène de formule : le zindoxifène de formule : le pipendoxifène de formule :

D’autres SERM potentiellement d’intérêt sont :

- la nafoxidine de formule :

- le lasofoxifène de formule :

De manière préféré, le composé mis en œuvre dans le cadre de la présente invention est un SERM et/ou comprend un groupement 2-phénylindole de formule : Avantageusement, il est choisi dans le groupe constitué de : le bazédoxifène, l’acétate de bazédoxifène, le zindoxifène, le pipendoxifène, leurs dérivés et/ou leurs combinaisons. Alternativement, il peut s’agir de l’ospemifène, de l’endoxifène ou du raloxifène.

Selon un mode de réalisation particulier, il ne s’agit pas du tamoxifène, ni du fispémifène ni même du raloxifène..

Encore plus avantageusement, il s’agit du bazédoxifène ou de l’acétate de bazédoxifène.

Le bazédoxifène a été approuvé par la FDA et l’ANSM pour la prévention de l’ostéoporose postménopause. Ce médicament, commercialisé sous la dénomination Conbriza®, se présente sous la forme de comprimés comprenant 20 mg d’acétate de bazédoxifène (avec un noyau du comprimé contenant : Lactose monohydraté (142,8 mg) + Cellulose microcristalline + Amidon prégélatinisé (maïs) + Glycolate sodique d’amidon + Laurylsulfate de sodium + Silice colloïdale anhydre + Stéarate de magnésium + Acide ascorbique et un pelliculage contenant : Hypromellose + Dioxyde de titane (E171) + Macrogol 400), avec une prise quotidienne par voie orale de 1 comprimé.

Sont également visés par la présente invention les dérivés de ces composés, notamment du bazédoxifène, ayant la même activité biologique, notamment celle de SERM ou celle rapportée dans les exemples, par exemple sur la survie des cellules musculaires en conditions de choc osmotique.

Le terme « dérivés » englobe les dérivés et les métabolites, ainsi que les sels pharmaceutiquement acceptables. Un dérivé est un composé provenant d'un autre (le précurseur, avec une structure chimique typiquement similaire) après transformation de ce dernier. Le dérivé peut différer par un ou plusieurs atomes ou groupes fonctionnels. Un métabolite est un composé intermédiaire stable ou un composé résultant de la transformation biochimique d'une molécule initiale par métabolisme.

Par « sels pharmaceutiquement acceptables », on entend les sels d'addition du composé, qui peuvent être obtenus par réaction de ce composé avec un acide minéral ou organique selon une méthode connue en soi. Parmi les acides qui peuvent être utilisés à cet effet, on peut citer les acides chlorhydrique (HCl), bromhydrique, sulfurique, phosphorique, 4-toluène sulfonique, méthane sulfonique, cyclohexyl sulfamique, oxalique, succinique, formique, fumarique, maléique, citrique, aspartique, cinnamique, lactique, glutamique. Les acides N-acétyl-aspartique, N-acétyl- glutamique, ascorbique, malique, benzoïque, nicotinique et acétique. A titre d’exemple, l’acétate de bazédoxifène est couramment utilisé dans le domaine pharmaceutique.

Parmi les esters sur la fonction hydroxy, on peut citer les esters d'acide carboxylique ayant de 1 à 6 atomes de carbone.

Lesdits composés, notamment le bazédoxifène, peuvent être modifiés pour augmenter leur stabilité, leur biodisponibilité et/ou leur capacité à atteindre les tissus cibles, notamment les tissus et les cellules musculaires.

De manière connue par l’homme du métier, lesdits composés, notamment le bazédoxifène, peuvent être présents dans la composition sous une forme nue (libre) ou contenus dans des systèmes de délivrance qui augmentent la stabilité, le ciblage et/ou la biodisponibilité, tels que des liposomes, ou incorporés dans des supports tels que des hydrogels, des cyclodextrines, des nanocapsules biodégradables, des microsphères bioadhésives, des vecteurs ou en combinaison avec un peptide cationique.

La présente invention concerne également les compositions pharmaceutiques contenant en tant que principe actif au moins un composé tel que défini ci-dessus, ainsi que l'utilisation de ce composé ou de cette composition en tant que médicament ou produit médicinal. Selon un mode de réalisation particulier, le composé selon l’invention est le seul actif thérapeutique présent dans la composition pharmaceutique.

Ainsi, la présente invention vise des compositions pharmaceutiques comprenant un composé selon l'invention. Avantageusement, ces compositions comprennent une quantité thérapeutiquement efficace dudit composé, et un support pharmaceutiquement acceptable. Dans un mode de réalisation particulier, le terme « pharmaceutiquement acceptable » signifie approuvé par un organisme de réglementation du gouvernement fédéral ou d'un État ou inscrit dans la pharmacopée américaine ou européenne ou dans une autre pharmacopée généralement reconnue pour une utilisation chez les animaux et les humains. Le terme « support » désigne un diluant, un adjuvant, un excipient ou un véhicule avec lequel le produit thérapeutique est administré. Ces supports pharmaceutiques peuvent être des liquides stériles, comme l’eau et les huiles, y compris celles d’origine pétrolière, animale, végétale ou synthétique, comme l'huile d'arachide, l'huile de soja, l'huile minérale, l'huile de sésame et autres. Les solutions salines et les solutions aqueuses de dextrose et de glycérol peuvent également être employées comme supports liquides, notamment pour les solutions injectables. Les excipients pharmaceutiques appropriés comprennent l'amidon, le glucose, le lactose, le saccharose, le stéarate de sodium, le monostéarate de glycérol, le talc, le chlorure de sodium, le lait écrémé en poudre, le glycérol, le propylèneglycol, l’eau, l’éthanol et autres.

La composition, le cas échéant, peut également contenir des quantités mineures d'agents mouillants ou émulsifiants, ou d’agents tampons du pH. Ces compositions peuvent prendre la forme de solutions, de suspensions, d'émulsions, de formulations à libération prolongée et autres. Des exemples de supports pharmaceutiques appropriés sont décrits dans « Remington’s Pharmaceutical Sciences » de E. W. Martin. Ces compositions contiennent une quantité thérapeutiquement efficace de l’agent thérapeutique, de préférence sous forme purifiée, ainsi qu'une quantité appropriée de support de manière à fournir la forme permettant une administration adéquate au sujet.

Dans un mode de réalisation préféré, la composition est formulée conformément aux procédures de routine comme une composition pharmaceutique adaptée, par exemple, à l'administration orale à des êtres humains. Typiquement, les compositions pour l'administration orale sont sous la forme de comprimés, éventuellement de comprimés sécables ou de comprimés effervescents, contenant en outre des excipients adaptés à la forme posologique solide et à l’administration chez l’homme. À titre d'exemple, les formes commerciales disponibles de bazédoxifène sont des comprimés qui contiennent en outre du lactose monohydraté, de la cellulose microcristalline, de l’amidon prégélatinisé (maïs), du glycolate sodique d’amidon, du laurylsulfate de sodium, de la silice colloïdale anhydre, du stéarate de magnésium et de l’acide ascorbique. Ces comprimés peuvent être écrasés et mélangés à des liquides.

Alternativement, la composition peut être sous une forme liquide, avantageusement une composition aqueuse. Tout autre solvant approprié peut être utilisé.

La quantité de l'agent thérapeutique de l’invention, c’est-à-dire un composé tel que décrit ci-dessus, qui sera efficace dans le traitement d'une maladie peut être déterminée par des techniques cliniques standard. En outre, des essais in vivo et/ou in vitro, tels que ceux décrits dans les exemples ci-dessous, peuvent éventuellement être utilisés pour aider à prédire les plages de dosage optimales. La dose précise à employer dans la formulation dépendra également de la voie d’administration, du poids et de la gravité de la maladie, et doit être décidée selon le jugement du praticien et les conditions de chaque patient.

Selon un mode de réalisation particulier, la composition de l'invention se présente sous une forme solide, avantageusement un comprimé, comprenant 20 mg du composé actif, notamment du bazédoxifène ou de l’acétate de bazédoxifène, voire moins. De préférence, la composition comprend une quantité égale ou inférieure à 20 mg, 15 mg, 10 mg, voire égale ou inférieure à 5 mg.

Selon un autre mode de réalisation, la composition de l'invention se présente sous une forme liquide et comprend avantageusement moins de 30 pM ou 10 pM du composé actif, notamment du bazédoxifène ou de l’acétate de bazédoxifène, plus avantageusement entre 30 nM et 10 pM, encore plus avantageusement entre 100 nM et 5 pM, voire entre 300 nM et 2 pM.

Une voie d’administration appropriée doit permettre la délivrance d'une quantité thérapeutiquement efficace du produit thérapeutique aux tissus cibles, en fonction de la maladie.

Les voies d’administration disponibles sont les suivantes : topique (locale), entérale (action systémique, mais délivrée par le tractus gastro-intestinal (GI)), ou parentérale (action systémique, mais délivrée par des voies autres que le tractus GI). Dans le cas spécifique des maladies musculaires, la voie d'administration préférée des compositions divulguées ici est généralement entérale, ce qui inclut l'administration orale. Selon d'autres modes de réalisation, il peut s'agir d'une administration parentérale, notamment par voie intramusculaire (c'est-à-dire dans le muscle) ou systémique (c'est-à-dire dans le système circulant). Dans ce contexte, le terme « injection » (ou « perfusion » ou « infusion ») englobe l’administration intravasculaire, en particulier intraveineuse (IV), et intramusculaire (IM). Les injections sont généralement réalisées à l'aide de seringues ou de cathéters.

Selon un mode de réalisation, la composition est administrée par voie orale, intramusculaire, intrapéritonéale, sous-cutanée, topique, locale ou intravasculaire, avantageusement par voie orale. Selon un mode de réalisation préféré, la composition est destinée à une administration orale. Comme déjà mentionné, une composition selon l'invention se présente de préférence sous une forme galénique solide adaptée à l'administration orale, avantageusement sous la forme d’une ou plusieurs capsules ou comprimés. Ainsi, ils peuvent être pris avec un peu d’eau avant ou pendant le repas principal. Selon un mode de réalisation préféré, la composition selon l'invention est administrée quotidiennement, par exemple une fois par jour. Le traitement peut durer plusieurs semaines, plusieurs mois, plusieurs années ou même toute la vie.

Comme déjà indiqué, le patient est avantageusement un humain, notamment un nouveau-né, un jeune enfant, un enfant, un adolescent ou un adulte, quel que soit son sexe. L'outil thérapeutique selon l'invention peut toutefois être adapté et utile pour le traitement d'autres animaux, notamment le porc, la souris, le chien ou le singe macaque.

De manière générale, la présente invention a pour but de lutter contre (ou réduire ou atténuer ou préserver) la mortalité et/ou la fragilité des cellules, fibres ou tissus musculaires, en d’autres termes à améliorer (ou augmenter ou préserver) la survie et/ou la force et/ou la fonction musculaire. En effet et comme démontré dans la présente demande, les composés décrits ci-dessus améliorent la résistance membranaire notamment au stress, par exemple en conditions de choc osmotique ou après irradiation laser.

Dans le cadre de l’invention, les termes « muscle » et « musculaire » ont avantageusement trait aux muscles striés, encore plus avantageusement aux muscles squelettiques. Selon un mode de réalisation particulier, le muscle cardiaque n’est pas visé.

Ainsi et comme déjà mentionné, la présente invention concerne le traitement des maladies associées à une fragilité musculaire, notamment une instabilité de la membrane des cellules musculaires. En d’autres termes, la présente invention peut contribuer à améliorer la survie musculaire, et par conséquent la fonction musculaire, en particulier la force musculaire.

Selon un mode de réalisation particulier, les muscles squelettiques sont majoritairement voire exclusivement affectés. Ainsi, le muscle cardiaque peut être épargné par la maladie. Comme illustré dans les exemples, la fragilité musculaire, notamment des membranes des cellules musculaires, peut être évaluée à l’aide de tests in vitro en conditions de choc osmotique.

Ainsi et de manière plus précise, l’invention vise aussi bien :

- une composition comprenant un composé tel que décrit ci-dessus, en particulier du bazédoxifène comme représentant des SERM de troisième génération, à savoir des composés comprenant un groupement 2-phénylindole, pour traiter des pathologies associées à une fragilité musculaire ; l’utilisation d’un composé tel que décrit ci-dessus, en particulier du bazédoxifène comme représentant des SERM de troisième génération, à savoir des composés comprenant un groupement 2-phénylindole, pour la préparation d’un médicament destiné à traiter des pathologies associées à une fragilité musculaire ;

- une méthode de traitement de pathologies associées à une fragilité musculaire comprenant l’administration d’un composé tel que décrit ci-dessus, en particulier de bazédoxifène comme représentant des SERM de troisième génération, à savoir des composés comprenant un groupement 2-phénylindole;

- une composition comprenant un composé tel que décrit ci-dessus, en particulier du bazédoxifène comme représentant des SERM de troisième génération, à savoir des composés comprenant un groupement 2-phénylindole, pour augmenter la survie/fonction/force musculaire ; l’utilisation d’un composé tel que décrit ci-dessus, en particulier du bazédoxifène comme représentant des SERM de troisième génération, à savoir des composés comprenant un groupement 2-phénylindole, pour augmenter la survie/fonction/force musculaire ;

- une méthode pour augmenter la survie/fonction/force musculaire comprenant l’administration d’un composé tel que décrit ci-dessus, en particulier de bazédoxifène comme représentant des SERM de troisième génération, à savoir des composés comprenant un groupement 2-phénylindole.

En pratique, il existe un certain nombre de conditions dans lesquelles la fonction musculaire est affaiblie.

Il peut tout d’abord s’agir de conditions pathologiques, en particulier dans le cas des maladies neuromusculaires. Selon un mode de réalisation, la maladie visée est d’origine génétique, en particulier causée par une ou plusieurs mutations dans un ou plusieurs gènes responsables de ladite maladie.

Ainsi, les dystrophies musculaires causées par des mutations dans le gène de la dysferline (DYSF) telles que la dysferlinopathie (LGMD 2B ou R2), la myopathie distale de type Miyoshi et la myopathie du compartiment distal antérieur sont des pathologies particulièrement visées mais toutes les formes de maladies neuromusculaires, en particulier les dystrophies musculaires, peuvent être traitées.

Comme démontré dans les exemples, la dysferlinopathie (LGMD 2B ou R2) liée à la mutation L1341P, G299R ou SI 173X peut ainsi être prise en charge.

Dans certains modes de réalisation, un composé tel que décrit ou une composition pharmaceutique le comprenant est destiné à être utilisé pour traiter des maladies musculaires (c'est-à-dire, myopathies) ou des lésions musculaires, en particulier des troubles génétiques neuromusculaires, sans atteinte hépatique voire sans atteinte cardiaque, comme par exemple : les dystrophies musculaires, les dystrophies musculaires congénitales, les myopathies congénitales, les myopathies distales, les autres myopathies, les syndromes myotoniques, les maladies musculaires à canal ionique, l’hyperthermie maligne, les myopathies métaboliques et les autres troubles neuromusculaires, avantageusement les dystrophies musculaires, les dystrophies musculaires congénitales, les myopathies congénitales, les myopathies distales et les autres myopathies.

Les dystrophies musculaires qui peuvent ainsi être prises en charge comprennent notamment :

- Les dystrophinopathies, un spectre de maladies musculaires liées au chromosome X, causées par des variants pathogènes du gène DMD, qui code pour la protéine dystrophine. Les dystrophinopathies comprennent la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), la dystrophie musculaire de Becker (BMD) et la cardiomyopathie dilatée associée à la DMD ;

- Les dystrophies musculaires des ceintures (LGMD), qui sont un groupe de troubles cliniquement similaires à la DMD, mais qui surviennent chez les deux sexes en raison d'une transmission autosomique récessive ou autosomique dominante. Les dystrophies des ceintures sont causées par la mutation de gènes qui codent pour les sarcoglycanes et d’autres protéines associées à la membrane des cellules musculaires, qui interagissent avec la dystrophine. Le terme LGMD1 désigne les types génétiques présentant une hérédité dominante (autosomique dominante), tandis que le terme LGMD2 désigne les types présentant une hérédité autosomique récessive. Des variants pathogènes ont été signalés sur plus de 50 loci (LGMD1A à LGMD1H ; LGMD2A à LGMD2Y) ;

- La calpaïnopathie (LGMD2A/R1) est causée par une mutation du gène CAPN3, avec plus de 450 variantes pathogènes décrites.

Une liste non limitative de ces maladies comprend : myopathie centronucléaire, avantageusement myopathie myotubulaire liée à l’X (XLMTM) et maladie de Charcot-Mari e-Tooth, dystrophie musculaire des ceintures, avantageusement LGMD2A/R1, LGMD2B/R2, LGMD2D/R3 ou LGMD2I/R9, LGMD1D/D1, LGMD2L/R12, dystrophie musculaire congénitale de type IC (MDC1C), syndrome de Walker-Warburg (WWS), maladie muscle-œil-cerveau (MEB), dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) ou de Becker (BMD), dystrophie musculaire congénitale avec déficit en sélénoprotéine N, dystrophie musculaire congénitale avec déficience en sélénoprotéine N, dystrophie musculaire congénitale avec déficience en mérosine primaire, dystrophie musculaire congénitale d'Ullrich, myopathie congénitale à noyau central, myopathie congénitale multi-minicore, myopathie autosomale centronucléaire, myopathie avec disproportion de fibres, myopathie némaline, syndromes myasthéniques congénitaux, myopathie distale de Miyoshi, dysferlinopathies, dystroglycanopathies et sarcoglycanopathies. Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique de l'invention est destinée à être utilisée pour traiter la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) ou de Becker (BMD), la dystrophie musculaire congénitale des ceintures, avantageusement LGMD2A/R1, LGMD2B/R2, LGMD2D/R3, LGMD2I/R9, LGMD1D/D1 ou LGMD2L/R12.

En outre, la cachexie ou marasme est également un état pathologique visé par la présente invention. Cet état se caractérise par une maigreur extrême, en particulier au niveau des muscles squelettiques, provoquée par une longue maladie ou un apport protéinique ou calorique insuffisant.

Cet état pathologique est notamment observé dans les cas de maladies chroniques telles que le cancer ou le SIDA ou chez les personnes souffrant soit d’insuffisance cardiaque - il y a une atrophie des muscles squelettiques chez 68% des patients -, soit d’incontinence urinaire. Sans être considérées comme pathologiques à proprement parler, certaines situations sont associées à une perte ou détérioration de la fonction ou force musculaire : vieillissement, immobilisation prolongée.... Il existe donc là encore un intérêt à améliorer la survie musculaire et ainsi à augmenter la fonction ou la force musculaire.

Ainsi, la présente invention repose sur la mise en évidence de propriétés protectrices du bazédoxifène comme représentant des SERM en particulier de troisième génération, à savoir des composés comprenant un groupement 2-phénylindole, sur les membranes des cellules musculaires notamment.

Selon un mode de réalisation particulier, la pathologie traitée dans le cadre de la présente invention n’est pas le rhabdomyosarcome. Selon un autre mode de réalisation particulier, la pathologie traitée dans le cadre de la présente invention n’est pas une cardiomyopathie, en particulier la myocardite auto-immune.

Comme déjà dit, une composition comprenant un composé selon l’invention, destinée au traitement des pathologies associées à une fragilité musculaire ou destinée à l’amélioration de la survie musculaire, peut en outre contenir tout composé ou excipient acceptable, notamment pharmaceutique.

Ce traitement peut également être associé à d’autres traitements, destinés à traiter la même pathologie ou le même état.

Pour favoriser la prise de greffe de cellules précurseurs ou cellules souches, il peut être avantageux d’associer l’administration de bazédoxifène comme représentant des SERM de troisième génération, à savoir des composés comprenant un groupement 2- phénylindole, à la greffe de cellules (myoblastes, cellules souches, ....). Cette administration peut se faire de manière simultanée ou décalée dans le temps.

Il peut aussi être avantageux de combiner une thérapie génique, destinée au traitement d’une maladie neuromusculaire, avec l’administration d’un composé tel que décrit ci- dessus, en particulier de bazédoxifène comme représentant des SERM de troisième génération, à savoir des composés comprenant un groupement 2-phénylindole. Ainsi et selon un mode de réalisation privilégié, un gène thérapeutique, tel que le gène natif de la dysferline, est associé au traitement par un composé tel que décrit ci-dessus, en particulier le bazédoxifène comme représentant des SERM de troisième génération, à savoir des composés comprenant un groupement 2-phénylindole. L’administration des 2 traitements peut se faire de manière simultanée ou décalée dans le temps.

Ce traitement peut également être combiné à des traitements permettant une augmentation de la masse musculaire tels que l’administration de décorine (W02010/106295), de lumican ou de fibromoduline (WO2013/072587).

Les effets avantageux du bazédoxifène comme représentant des composés tels que décrits ci-dessus, en particulier des SERM de troisième génération, à savoir des composés comprenant un groupement 2-phénylindole, se traduisent par une augmentation de la survie des cellules musculaires notamment en conditions de choc osmotique. Ces effets positifs peuvent être observés pour les différents muscles squelettiques, aussi bien chez un organisme atteint d’une pathologie associée à une fragilité musculaire que chez un individu sain. A priori, aucun effet secondaire, ni aucune réaction immunologique n’est à déplorer.

Une autre application possible des composés tels que décrits ci-dessus, en particulier du bazédoxifène comme représentant des SERM de troisième génération, à savoir des composés comprenant un groupement 2-phénylindole, est la culture in vitro ou ex vivo des myoblastes, des myotubes ou des fibres musculaires (ou myofibres), par exemple comme décrit par Tominaga et al. (i Science ; 2021 Dec 20 ;25(1) : 103667). Ces cellules ou tissus peuvent aussi bien provenir d’organismes sains qu’atteints des pathologies susmentionnées.

La mise en œuvre de la présente invention emploie, sauf indication contraire, des techniques conventionnelles de biologie moléculaire (y compris les techniques de recombinaison), de microbiologie, de biologie cellulaire, de biochimie et d'immunologie, connues de l’homme du métier. Ces techniques sont expliquées en détail dans la littérature, notamment dans « Molecular Cloning : A Laboratory Manual », quatrième édition (Sambrook, 2012); « Oligonucleotide Synthesis » (Gait, 1984); « Culture of Animal Cells » (Freshney, 2010); « Methods in Enzymology » « Handbook of Experimental Immunology » (Weir, 1997) ; « Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells » (Miller and Calos, 1987); « Short Protocols in Molecular Biology » (Ausubel, 2002); « Polymerase Chain Reaction : Principles, Applications and Troubleshooting » (Babar, 2011); « Current Protocols in Immunology » (Coligan, 2002). Des techniques particulièrement utiles pour des modes de réalisation particuliers seront discutées dans les sections qui suivent. Les divulgations de chaque brevet, demande de brevet et publication cités dans la présente demande sont incorporées par référence dans leur intégralité.

Sans autre description, il est considéré que l’homme du métier peut, en utilisant la description et les exemples illustratifs suivants, produire et utiliser les composés de la présente invention et mettre en œuvre les méthodes revendiquées.

EXEMPLES DE REALISATION

L’invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation suivants, à l’appui des figures annexées. Ceux-ci n’ont toutefois aucune portée limitative.

L’invention est illustrée plus avant à l’aide de bazédoxifène, noté Bazedoxifene, ou d’acétate de bazédoxifène, noté Bazedoxifene acetate, testé sur des myoblastes immortalisés.

LEGENDES DES FIGURES

Effet du Bazedoxifene sur la quantité et la localisation de la dysferline

L1341P

(A) Quantification du nombre de cellules positives à la dysferline (•) et de la viabilité (■) après traitement des myoblastes immortalisés L1341P avec des concentrations croissantes de Bazedoxifene. Les valeurs sont normalisées par le traitement avec 0,1% DMSO et chaque point représente la moyenne ± déviation standard de quatre réplicats d’une expérience représentative (N=3).

(B) Analyse par immunofluorescence de la localisation de la dysferline après traitement avec 0,1% DMSO ou la dose maximale effective (5pM) de Bazedoxifene. Le réticulum endoplasmique, l’appareil de golgi, les lysosomes et les autophagosomes sont également identifiés avec les marquages KDEL, GM 130, Lampl et LC3B. Les noyaux sont marqués au Hoechst (bleu). Barre d’échelle = 10 pM. 2. Mesure de la protection du Bazedoxifene contre le choc osmotique

(A) Visualisation et (B) quantification de la mortalité induite par le choc osmotique des myoblastes immortalisés L1341P après traitement avec des concentrations croissantes de Bazedoxifene ou 0,03% DMSO.

(C) Détermination de la durée nécessaire (heures) de choc osmotique pour induire 50% de mortalité des cellules.

Chaque point ou barre représente la moyenne ± déviation standard de quatre réplicats d’une expérience représentative.

BZA = Bazedoxifene.

Effet protecteur du Bazedoxifene indépendant de la mutation.

Mesure de l’effet du Bazedoxifene et/ou du Bazedoxifene acetate à 2pM sur la viabilité cellulaire en réponse au choc osmotique dans différentes lignées de myoblastes immortalisés portant les mutations (A) L1341P (missense 1), (B) G299R (missense 2), (C) S1173X (ko) ou (D) aucune mutation de la dysferline. Chaque point représente la moyenne ± déviation standard de quatre réplicats d’une expérience représentative.

I) MATERIELS ET METHODES

Culture cellulaire et traitement pharmacologique

Les myoblastes immortalisés utilisés dans cette étude sont issus de patients atteint de la LGMDR2.

La principale lignée cellulaire utilisée (814) provient d’une biopsie du muscle vaste latéral d’un patient masculin de 57 ans porteur de la mutation suivante : homozygote c.4022T>C ; p.L1341P. Les cellules ont été isolées par l’équipe du Dr Simone Spuler (Université de médecine - Charité, Berlin) puis immortalisées par l’équipe du Dr Vincent Mouly (Institut de Myologie, Paris). Pour les expériences de choc osmotique, les lignées de myoblastes immortalisés 107 et AB320 utilisées sont porteuses des mutations suivantes : hétérozygote c.855+ldelG, c.895G>A ; mRNA decay, p.G299R et hétérozygote c.342-lG>A, c.3516_3517delTT ; / , p.Serl l73X.

Les cellules ont été cultivées dans un milieu de prolifération de cellules musculaires : 1 volume de milieu 199 (Invitrogen, 41150020) pour 4 volumes de DMEM (Invitrogen, 61965-025), supplémentés par 20% de SVF, 25 pg/ml de Fétuine (Life Technologies, 10344026), 5 ng/ml de hEGF (Life Technologies, PHG0311), 0.5 ng/ml bFGF (Life Technologies, PHG0026), 0.2 pg/ml Dexamethasone (Sigma, D4902) et 5 pg/ml Insuline (Sigma, 91077). Les cellules ont été ensemencées sur plaques préalablement revêtues de 0.1% gélatine et maintenues sous atmosphère contrôlée à 37°C et 5% CO2.

Soixante-douze heures après l’ensemencement, les cellules ont été traitées avec le composé bazédoxifène HCl ou acétate de bazédoxifène (Selleckchem) ou le diméthyl sulfoxyde (DMSO, VWR) comme contrôle négatif. Les cellules ont été analysées après 24 heures de traitement.

Quantification de l’expression de la dysferline et test de viabilité

Après 24 heures de traitement, les cellules ont été fixées avec 4% de paraformaldéhyde (10 minutes, température ambiante). L’immunofluorescence a été réalisée dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) supplémentée avec 0.1% de Triton pour la perméabilisation (5min, température ambiante) puis 1% d’albumine de sérum bovin (BSA ; Sigma) pour le blocage (1 heure, température ambiante). Pour la première étape d’hybridation les cellules ont été incubées (sur la nuit, 4°C) avec les anticorps lapin anti-Dysferline (abeam, ab 124684) et chèvre anti Desmine (R&D, AF3844). Les marquages ont ensuite été révélés pendant la deuxième étape d’hybridation par incubation (1 heure, température ambiante) avec des anticorps secondaires conjugués avec un fluorochrome (Invitrogen, anti lapin vert et anti chèvre rouge) et les noyaux ont été marqués au Hoechst (Invitrogen, 33342). L’expression de la dysferline a été analysée par l’imageur Celllnsight CX7 (Cellomics Inc). Le premier canal est utilisé pour l’identification des noyaux, le second pour la segmentation des cellules et le troisième pour l’identification et la quantification des agrégats de dysferline. Les images ont été acquises avec un objectif 20x à haute résolution et ont été analysées avec une bioapplication de colocalisation. A l’aide d’un seuillage sur le niveau d’intensité de la dysferline, le nombre de cellules positive à un marquage dysferline (minimum un agrégat de dysferline dans la cellule) a pu être calculé de sorte à ce qu’il soit inférieur à 10% avec le contrôle négatif. Le nombre de cellules total a été déterminé en comptant les cellules colorées par le Hoechst par puit, ce qui a permis de quantifier la viabilité cellulaire en normalisant avec le contrôle négatif. Localisation de la dysferline

Après 24 heures de traitement au Bazedoxifène (EC50=5pM) les cellules ont été fixées et marquées (sur la nuit, 4°C) avec les anticorps primaires suivants : anti Dysferline (Novocastra), Kdel (EnzoLife), GM130 (BD Bioscineces), LAMP (Abeam) et LC3 A/B (ThermoScientific). Après lavages, les marquages ont ensuite été révélés à l’aide d’anticorps secondaires couplés à des fluorochromes (1 heure, température ambiante) et analysés à l’aide d’un microscope confocal (LSM 880, Cari Zeiss). Les images ont été acquises avec un objectif 63x à huile.

Choc Osmotique

Les cellules ont été ensemencées en plaques 96 puits et traitées avec différentes concentrations de Bazédoxifene, comme indiqué, pendant 24 heures. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 3 heures avec une sonde rouge de viabilité (1/3000, Incucyte® Nuclight Rapid Red Dye - Sartorius). Une fois la sonde incorporée par les noyaux des cellules vivantes (vérification incuCyte), un choc osmotique composé de 25% de PBS et 75% d’eau a été appliqué en présence d’une sonde verte de mortalité (1/3000, Incucyte® Caspase-3/7 Green Dye - Sartorius). Les marquages rouge et vert ont été acquis toutes les 90 minutes pendant 72 heures avec un IncuCyte® S3 Live- Cell Analysis, permettant ainsi de mesurer la résistance des cellules au choc osmotique (ratio vert sur rouge) après traitement pharmacologique en comparaison au contrôle négatif (DMSO).

II) RESULTATS

1/ Identification du Bazedoxifene comme un inhibiteur de la dégradation de la protéine dysferline mal conformée

Comme démontré dans la Figure IA, l’utilisation de doses croissantes de Bazédoxifène entraîne une augmentation du nombre de myoblastes immortalisés mutés L1341P exprimant au moins un agrégat de dysferline, sans révéler de toxicité significative, hormis à très hautes doses. Cet effet est confirmé par l’analyse histologique présentée dans la Figure IB : en présence de la dose maximale effective de Bazédoxifène (5pM), la quantité de dysferline détectée dans les myoblastes immortalisés L1341P est augmentée en comparaison au traitement contrôle DMSO. Il a été démontré que la mutation L1341P entraîne la mauvaise conformation de la dysferline, son absence au sarcolemme et son agrégation au niveau du réticulum endoplasmique ; entraînant ainsi une fragilité membranaire et in fine la mort des cellules musculaires. L’analyse de la localisation de la dysferline L1341P, par le marquage de différents compartiments cellulaires en Figure IB, démontre la sortie de la protéine du réticulum endoplasmique après traitement au Bazedoxifene.

Sur la base de ces expériences l’hypothèse formulée peut être que le Bazédoxifène empêche la dégradation par le système de l’ERAD de la protéine mal conformée, augmentant ainsi la quantité de dysferline fonctionnelle dans les cellules musculaires et potentiellement sa fonctionnalité à la membrane et la survie cellulaire.

2/ Le Bazedoxifene améliore la survie cellulaire

Afin de démontrer une fonctionnalité du Bazédoxifène sur la fragilité des cellules musculaires, la survie des myoblastes immortalisés L1341P traités a été évaluée après un choc osmotique déstabilisateur des membranes cellulaires. Les Figures 2A et 2B démontrent qu’à des doses adaptées de Bazédoxifène, le traitement des myoblastes immortalisés L1341P se traduit par une augmentation de la viabilité cellulaire en conditions de choc osmotique. De plus, d’après la Figure 2C, la survie des cellules musculaires est fortement améliorée après traitement avec une dose équivalente à FEC50 de Bazédoxifène qui entraîne notamment une augmentation de plus de 40% du nombre de myoblastes positifs à la dysferline (Figure 1).

La Figure 3 confirme que l’effet protecteur du Bazédoxifène (HCl ou acétate) sur la survie cellulaire en conditions de choc osmotique, et donc sur la viabilité des cellules musculaires, résulte d’un effet plus général sur les cellules et non uniquement sur la dysferline agrégée. En effet, les myoblastes immortalisés résistent de façon similaire au choc osmotique après traitement au Bazédoxifène qu’ils soient porteurs des mutations L1341P (missense 1), G299R (missense 2), S1173X (ko) de la dysferline. De manière surprenante, ce même effet est observé dans des cellules WT, c’est-à-dire des myoblastes immortalisés non mutés dans le gène de la dysferline.

La présente application révèle ainsi que le Bazédoxifène est efficace pour un large spectre de conditions associées à une fragilité des cellules musculaires, en particulier liées à l’intégrité de leurs membranes.