DESCRIPCIÓN

SECTOR TÉCNICO

La presente invención pertenece al campo de la medicina y microbiología. Refiere a principios activos contra la ameba Naegleria fowleri y al tratamiento y/o profilaxis de la infección y la enfermedad Meningoencefalitis Amebiana Primaria (MAP) que provoca.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Naegleria es un género protista de ameba de vida libre que pertenece a la familia Vahlkampfiidae y clase Heterolobosea. Se encuentra comúnmente en agua dulce templada entre 25 y 46°C de lagos, ríos, aguas termales, fuentes de agua industriales o suministros de agua domésticos, y en el suelo de todo el mundo.

La solicitud RU2649091 describe un método para combatir la proliferación de Naegleria fowleri en un medio por la aplicación de otro agente biológico, Willaertia magna.

Naegleria fowleri, también conocida como “ameba come cerebro”, es la única especie del género que es patógena para los humanos. El microbio accede al cerebro y causa una enfermedad del sistema nervioso central denominada Meningoencefalitis Amebiana Primaria (MAP). Es una infección aguda de muy difícil detección que produce edema cerebral, hemorragia, necrosis y una respuesta inflamatoria masiva y fulminante del tejido cerebral, que finalmente resulta en coma y muerte rápida del paciente.

La gestión de la MAP debida a N. fowleri es el principal desafío para todos los países con prevalencia de la enfermedad. Sin embargo, actualmente no existe un tratamiento eficaz adecuado que brinde seguridad para la supervivencia del paciente.

La mayor parte de la información sobre la eficacia terapéutica de fármacos contra N. fowleri se basa en informes de casos o estudios in vitro, con éxitos terapéuticos variables. La efectividad de los tratamientos no está clara, ya que casi todas las infecciones han sido fatales y los resultados de éxito son controvertidos. El tratamiento de la enfermedad está muy condicionado por el tiempo de actuación, es extremadamente limitado y no está bien definido - actualmente sólo es posible por una estrategia denominada "reutilización" de fármacos con un cóctel terapéutico combinado que incluye antifúngicos, antibióticos y microbicidas conocidos.

El fármaco antifúngico anfotericina B ha sido la base del tratamiento de la MAP (Gharpure R. y cols. “Epidemiology and Clinical Characteristics of Primary Amebic meningoencephalitis Caused by naegleria fowled: A Global Review”; Clinical Infectious Diseases, 2021 , Vol. 73, Issue 1). Se utiliza en todos los pacientes infectados sin tener en realidad una eficacia universal, ya que solo 8% se recuperan al menos de forma parcial después de su administración solo o en combinación con otros medicamentos, lo que hace difícil determinar su eficacia. El gran inconveniente de la anfotericina B es su elevada toxicidad, lo cual condiciona mucho su administración y la evolución del paciente.

La solicitud GB2592782 A describe la miltefosina para tratar infecciones amebianas en estado libre, entre ellas N. fowleri. Los autores confirman la supervivencia de tres pacientes en el mundo tras el tratamiento con miltefosina. De hecho, presenta resultados prometedores y exitosos en terapia combinada aunque las tasas de mortalidad siguen siendo muy altas incluso con los mejores regímenes disponibles.

W02022/008761 describe unos compuestos heterocíclicos sintéticos que presentan cierta actividad contra Naegleria fowleri, y la patente US10377733B1 encuentra actividad en compuestos con estructura de sesquiterpenos, en particular.

El uso y estudio de sustancias naturales, sobre todo de plantas y microorganismos, ha sido muy relevante para el tratamiento de enfermedades causadas por parásitos protozoarios. Recientemente, algunos trabajos han evaluado el potencial de compuestos extraídos de algas frente a ameba. En particular los sesquiterpenos del tipo laurano y ciclolaurano aislados de Laurencia johnstonii han demostrado buena actividad para Naegleria fowleri (Arberas-Jiménez I. y cols. “Laurinterol from Laurencia joshstonii eliminates Naegleria fowleri triggering PCD by inhibition of ATPases”; Scientific Reports, 10, 17731 , 2020). Sin embargo, sus índices de Selectividad (IS) no satisfacen los criterios establecidos para ser considerados antiparasitarios aptos para su administración.

Por desgracia, los tratamientos médicos administrados actualmente contra el MAP presentan poca eficacia terapéutica y múltiples efectos secundarios graves, muchas veces irreversibles en los pacientes que sobreviven. El gran inconveniente de todos los tratamientos utilizados hoy día para tratar una infección de Naeglería fowlerí es su alta toxicidad y baja efectividad, razón por la que su uso clínico es muy limitado.

Los sesquiterpenos de origen marino son una famila de compuestos de una amplia variabilidad que pueden ser aislados de algas del genero Laurencia e invertebrados. Constituyen actualmente más de 575 estructuras (Cikos, A. M. y cols. “Update on sesquiterpenes from red macroalgae of the Laurencia genus and their biological activities (2015-2020)”; Algal Research, 56, 102330, 2021). Entre ellos, los de tipo chamigreno son muy representativos y suponen aproximadamente un 30% de todos los sesquiterpenos aislados. Se caracterizan por presentar un esqueleto spiro [5.5]undecano en que un carbono cuaternario estereogénico (C-6) une los spirociclos, con mucha variabilidad de sustitución con grupos funcionales.

Los a-chamigrenos, p-chamigrenos y nor-chamigrenos no son funcionalmente equivalentes entre ellos, aparte que se han descrito además otros tipos de funcionalización (Harizani, M. y cois. “The Laurencia paradox: An endless source of chemodiversity”; Progress in the Chemistry of Organic Natural Products 102, 91-252, 2016).

La familia de chamigrenos muestra un amplio espectro biológico, con actividad antibacteriana, antifúngica, antiviral, antinflamatoria, citotóxica y antiparasitaria. Actividad antiparasitaria específica presentarían los p-chamigrenos, nor-chamigrenos y chamigrenos con capacidad de oxigenación en C-7, chamigrenos que presentan un anillo 5,10-epóxido o un carbociclo con la migración previa de un metilo de C-11 a C-10.

De muchos de estos compuestos ya se ha logrado con éxito su síntesis parcial o total. Igualmente, los esqueletos chamigrenos naturales sirven de modelo en la síntesis de muchos otros compuestos sintéticos. Entre otros, el chamigreno (+)-elatol presenta diversas propiedades farmacológicas, mostrando actividad acaricida y repelente, larviciada, antimicrobiana contra bacterias y hongos patógenos humanos, antiproliferativa, antileishmania, antitripanocida y antiviral.

El problema de la técnica es encontrar nuevos principios activos para desarrollar fármacos eficaces en el tratamiento de la MAP provocada por Naegleria fowleri. La presente invención propone los compuestos sesquiterpenos de tipo chamigreno como principios activos.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención es el uso de un compuesto sesquiterpeno chamigreno para el tratamiento o la prevención de una infección por Naegleria fowleri en un sujeto, preferiblemente meningoencefalitis amebiana primaria (MAP).

En un aspecto preferible, dicho sesquiterpeno chamigreno está seleccionado de entre (+)-elatol, (-)-elatol y (-)-rogiolol, más preferiblemente aún (+)-elatol.

En otro aspecto preferible, dicho compuesto chamigreno está seleccionado del grupo compuesto por -chamigrenos, nor-chamigrenos, chamigrenos con capacidad de oxigenación en C-7, o chamigrenos que presentan un anillo 5,10-epóxido o un carbociclo con la migración previa de un metilo de C-11 a C-10.

Se han reportado infecciones por N. fowleri tanto en humanos como en animales como carnívoros, caballos, rumiantes y algunos animales salvajes. De modo que un aspecto de la invención es que el sujeto infectado sea un animal y un aspecto más preferible es que dicho sujeto sea humano.

Los compuestos chamigrenos muestran unos valores de citotoxicidad IC50 frente a N. fowleri muy bajos y, en concreto, el (+)-elatol equivalente al de la anfotericina B; por tanto, resulta una alternativa posible en el tratamiento de una infección por el microbio. A pesar de que la anfotericina B muestra valores bajos de IC50 frente a las células de mamíferos, lo cual ha recomendado su uso, en realidad no resulta una referencia válida por la elevada toxicidad que presenta ¡n vivo. Es por esta razón por la que la presente invención propone los compuestos chamigrenos como principios activos eficaces que pueden servir de base para desarrollar fármacos con valor terapéutico contra la infección en un paciente.

De modo que otro aspecto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un compuesto sesquiterpeno chamigreno junto con excipientes farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente otro ingrediente activo, preferiblemente un antifúngico. En otro aspecto preferible más, dicha composición es para administración intravenosa o nasal.

Otro aspecto de la invención es un método que comprende la administración de al menos una composición adicional que incluye al menos otro agente o fármaco, más preferiblemente un antifúngico, más preferiblemente aún caspofungina, natarnicina, miconazol, voriconazol, fluconazol, o sus derivados o una combinación de ellos.

Un aspecto de la invención es un método de tratamiento de una infección causada por N. fowleri que comprende administrar un sequiterpeno chamigreno a un paciente en necesidad de ello. Otro aspecto comprende combinar dicho sequiterpeno chamigreno con una segunda formulación que comprende un segundo agente activo con actividad fungicida en combinación.

Otro aspecto preferible es un kit que comprende una formulación de un compuesto sesquiterpeno chamigreno, y opcionalmente un segundo compuesto donde dicho compuesto es un fungicida, e instrucciones de preparación del agente activo y de uso frente a una infección por N. fowleri.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Aislamiento de los compuestos chamigreno

Se llevó a cabo el aislamiento de compuestos chamigrenos a partir de muestras liofilizadas de la macroalga roja Laurencia dendroidea

A partir de las muestras liofilizadas se obtuvieron diferentes extractos en metanol: acetato de etilo (1 :1), cloroforno:metanol (1 :1) y diclorometano, por maceración a temperatura ambiente asistida por ultrasonido durante 15 min, seguido de filtración y concentración a vacío usando un rotavapor a 40°C. Los extractos resultantes fueron cromatografiados en una columna de exclusión molecular Sephadex® LH-20 utilizando una mezcla de hexano:diclorometano:metanol (2:1 :1) como eluyente o en columna flash de sílice eluidas con mezclas de polaridad creciente de n-hexano, diclorometano, acetato de etila y metanol, obteniéndose entre siete a doce fracciones dependiendo del extracto. A partir del análisis de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) ¹ H las fracciones enriquecidas con sesquiterpenos se procesaron posteriormente por cromatografía en columna abierta de silica gel, Lobar LiChroprep Si-60 de media presión (40-63 pm, MERCK®) y/o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con una columna semi- preparativa de sílice utilizando mezclas de n-hexano: acetato de etilo de polaridad creciente adecuadas a la naturaleza de la muestra. Se aislaron un total de 12 chamigrenos conocidos: (+)-elatol; (-)-elatol; (+)-debromoelatol; (-)-IO-bromochamigra- 3,7(14)-dien-9-ol; (+)-obtusol; (-)-dendroidiol; (+)-obtusano; (-)-3,10-dibromo-4-cloro- alfa-chamigreno; (-)-cartilagineol; (-)-rogiolol; (+)-¡soobtusol y nifediceno.

Las estructuras químicas de los compuestos aislados se establecieron por RMN de ¹ H y ¹³ C, espectroscopia de correlación (COSY), correlación de enlace múltiple heteronuclear (HMBC) y correlación cuántica simple heteronuclear (HSQC) en un sistema Bruker® Avance de 600 MHz utilizando CDCL. Los desplazamientos químicos se informaron en ppm con referencia a las señales del solvente (CDCh: 5H 7,26, 5c 77,16). Los datos de espectrometría de masas se adquirieron usando un sistema VG- Autospec Fisons en modo de ionización por electropulvehzación. Las rotaciones específicas [O]D se determinaron utilizando un Polarímetro Perkin-Elmer® (modelo 241), en condiciones de 20°C, línea D de sodio A = 589 nm y longitud de paso celular 1 dm. Los compuestos se identificaron comparando sus datos espectroscópicos con la literatura disponible.

Ejemplo 2. Cultivos celulares

Se utilizaron dos cepas de Naegleria fowleri obtenidas del American Type Culture Collection (ATCC® 30808™ y ATCC® 30215™) (LG Promochem, Barcelona, España). Ambas cepas fueron cultivadas en Bactocasitona al 2% (p/v) (Thermo Fisher Scientific, Madrid, España) suplementada con un 10% (v/v) de suero bovino fetal, 0,3 pg/ml de penicilina G sal sódica y 0,5 mg/ml de sulfato de estreptomicina (Sigma-Aldrich, Madrid, España) a 37°C.

Para los ensayos de citotoxicidad se utilizó una línea celular de macrófagos murinos J774A.1 (ATCC # TIB-67, LG Promochem, Barcelona, España). Las células fueron cultivadas en medio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's médium) suplementado con un 10% de suero bovino fetal y 10 pg/ml de gentamicina (Sigma-Aldrich, Madrid, España). El cultivo se mantuvo a 37°C en una atmósfera del 5% de CO2.

Ejemplo 3. Actividad in vitro contra Naegleria fowlerí y citotoxicidad

Todos los compuestos testados fueron disueltos en dimetilsulfóxido (DMSO). La actividad in vitro de los compuestos seleccionados se evaluó por un ensayo coloñmétñco basado en el reactivo alamaBlue®. Las amebas fueron sembradas en placas de 96 pocilios a una concentración de 2 x 10 ⁵ células/mL (50 mL). A continuación, se prepararon diluciones señadas (en el mismo medio en el que se encuentran las amebas) del compuesto y se añadieron (50 mL) a los pocilios donde se encuentras las células de Naegleria fowleri. Por último, se añadió un 10% del volumen total de alamarBIue® a los pocilios y se dejó incubar en agitación suave a 37°C durante 48 horas. Pasado ese tiempo, se realizó la lectura de la fluorescencia emitida en un lector de placas Enspire® Multimode Plate Reader (Perkin Elmer, España) utilizando una longitud de onda de emisión de 570 nm y una longitud de onda de excitación de 585 nm (Rizo-Liendo A. y cols. “In Vitro Activity of Statins against Naegleria fowleri."', Pathog., vol. 8, no. 3, p. 122, 2019, doi: 10.3390/ pathogens8030122).

Para evaluar la citotoxicidad se llevó a cabo un ensayo basado en el reactivo alamarBIue®. Brevemente, los macrófagos muñnos (2 x 10 ⁵ células/ml) se incubaron con diluciones señadas del compuesto a evaluar realizadas en el mismo medio de cultivo. Por último, se añadió el alamarBIue® a cada pocilio y se mantuvo a 37°C y un 5% de CO2 durante 24 horas. Pasado ese tiempo, se realizó la lectura de la fluorescencia emitida en un lector de placas Enspire® Multimode Plate Reader (Perkin Elmer, España) utilizando una longitud de onda de emisión de 570 nm y una longitud de onda de excitación de 585 nm (Arberas-Jiménez I. y cols. “Lauñnterol from Laurencia johnstonii eliminates Naegleria fowleri triggering PCD by inhibition of ATPases,” Sci. Rep., vol. 10, no. 1 , pp. 1-13, 2020, doi: 10.1038/s41598-020-74729-y).

Ejemplo 4. Evaluación de la inducción de mecanismos de muerte celular programada en Naegleria fowleri

Se evaluó la presencia de diferentes eventos metabólicos característicos del proceso de muerte celular programada con el uso de kits comerciales. Para la realización de los ensayos se utilizó la cepa ATCC® 30808™. Las células (5 x 10 ⁵ células/mL) fueron incubadas con la concentración inhibitoria 90 del producto durante 24 horas a 37°C. Todos los resultados obtenidos fueron comparados con células sanas como control negativo (Rizo-Liendo, A. y cols. “The type 2 statins, cerivastatin, rosuvastatin and pitavastatin eliminate Naegleria fowleri at low concentrations and by induction of programmed cell death (PCD)”; Bioorg. Chem., vol. 110, p. 104784, 2021, doi: 10.1016/j.bioorg.2021.104784.)

Ejemplo 5. Actividad in vitro frente a la meningoencefalitis amebiana primaria de la colección de chamigrenos

Los valores de actividad in vitro frente a Naegleria fowleri ATCC® 30808™ de la colección de compuestos aislados están representados en la Tabla 1.

Tabla 1. Valores de concentración inhibitoria 50 (ICso) frente a la cepa ATCC® 30808™ de Naegleria fowleri. Los resultados se expresan como media + desviación estándar y en pg/mL.

Los estudios de actividad con la colección de compuestos disponibles han permitido identificar que los chamigrenos, con destaque para el compuesto (+)-elatol, muestran unos excelentes resultados para el tratamiento de la N. fowleri.

Ejemplo 6. Comparación de la actividad in vitro de chamigrenos marinos con fármacos de referencia frente a la meningoencefalitis amebiana primaria Se evaluó frente a Naegleria fowleri in vitro la actividad y citotoxicidad de (+)-elatol, (-)- elatol y (-)-rogiolol como chamigrenos marinos frente a otros compuestos similares como lauriterol y debromolauriterol, con referencia a anfotericina B y miltefosina. Tabla 2. Valores de concentración Inhibitoria 50 (IC50) frente a las cepas ATCC® 30808™ y ATCC® 30215™ de Naegleria fowleri y concentración citotóxica 50 (CC50) frente a macrófagos murinos J774A.1. Los resultados se expresan como media + desviación estándar y en pg/mL. IS= índice de selectividad.

Los valores de actividad de los chamigrenos activos, y en particular el (+)-elatol, se muestran comparables al fármaco de referencia Anfotericina B. Además, todos se muestran mucho más activos que el compuesto de referencia Miltefosina.