本发明涉及生物医药领域，具体地说， 涉及人 Nectin-2蛋白的应用。 背景技术

肥胖的发生是机体能量代谢失调的结果，即当 机体能量摄入超过 能量消耗时， 余下的能量几乎完全转化为脂肪， 储藏于全身白色脂肪 中。肥胖既是一种独立的疾病， 又是 Π型糖尿病、心血管病、高血压、 中风和多种癌症的诱发因素。肥胖在世界范围 内呈现出爆发性流行的 趋势， 目前我国超重人群 2.7亿以上， 肥胖者 9.6千万以上。 肥胖诱发 很多疾病包括： Π型糖尿病、 非酒精脂肪肝、 胆结石、 心血管病和老 年痴呆症， 有些甚至是癌症的主要诱发因素。 肥胖是指一定程度的明 显超重与脂肪层过厚， 由于食物摄入过多或机体代谢的改变而导致体 内脂肪积聚过多造成体重过度增长并引起人体 病理、生理改变的一种 表现。 与正常体质者相比， 肥胖本身并没有太多明显特征， 但是肥胖 会带来很多严重的并发症， 包括高血压、 脑卒中、 糖尿病、 心血管疾 病、 脂代谢异常、 肿瘤和其他代谢性疾病的发生率明显增加， 而且肥 胖与 II型糖尿病并存， 表现为胰岛素抵抗、 糖耐量减低。 肥胖已经成 为 21世纪影响人健康的主要危险因素之一，严重� ��害人的身体健康及 生活质量。

然而， 传统的减肥药物主要用来控制食欲和抑制营养 吸收， 而巿 面上的很多减肥药物大多副作用明显， 或者效果不稳定， 容易反弹。 因此利用行之有效的方法迅速控制肥胖的蔓延 已迫在眉睫。

人体内除了白色脂肪之外， 还存在棕色脂肪。 棕色脂肪中含有丰 富的线粒体， 以直接产生热量的方式来消耗能量。 研究结果表明， 棕 色脂肪的活性与身体质量指数呈显著性负相关 ，而且有活性的棕色脂 肪可以消耗大量的脂肪和血糖，进一步提示棕 色脂肪在能量代谢过程 中起着非常重要的作用。但迄今尚没有任何直 接的证据表明棕色脂肪 参与机体的能量代谢。 最新研究结果提示， 相对于控制食欲和抑制营 养吸收等传统的抗肥胖疗法，通过棕色脂肪增 加机体的能量消耗很可 能成为治疗肥胖和糖尿病的新方法。 棕色脂肪特异表达解偶联蛋白 1 ( UCP1 ), 是参与能量代谢的重要蛋白质。 棕色脂肪通过氧化磷酸化 解偶联， 氧化产生的能量全部变为热能， 是由解偶联蛋白 UCP1发挥 的关键作用。 UCP1是长链脂肪酸激活的蛋白， 存在于线粒体内膜。

UCP1可以消耗一部分氧化磷酸化过程中产生� �质子， 使三磷酸腺苷 的制造量下降， 能量以热的形式释放， 因此上调 UCP1的表达从理论 上可以治疗肥胖症。 目前尚没有将棕色脂肪分泌的蛋白用于治疗糖 尿 病、 胰岛素抵抗、 肥胖症及肥胖症相关疾病的相关报道。

Nectin-2是免疫球蛋白超家族成员 Nectin家族中的一员。 Nectin-2 与该家族的其它成员 Nectin-1、 Nectin-3和 Nectin-4结构相似， 均属于 单次跨膜蛋白， 其膜外具有 1个免疫球蛋白超家族 V样结构域和 2个免 疫球蛋白超家族 C样结构域。研究表明， Nectin-2在各种组织和细胞系 中广泛表达， 在内皮细胞和上皮细胞起黏附分子的作用， 参与细胞间 的相互作用和连接。 Nectm-2作为细胞黏附分子， 能够亲同种或与异 种相互作用， 即细胞膜上的 Nectin-2胞外域可与不同细胞表面上的同 类分子或不同类分子相互作用。 已有报道中， 对于与高血脂有关的 ApoE、 ApoCl和 Tomm40等基因研究较多， 而与这些基因位于同一个 染色体上， 且遗传距离与这些基因较近的、 并在棕色脂肪里高表达的 Nectin-2对脂肪代谢功能的研究尚未见报道。推� �� Nectin-2有可能参与 脂肪酸代谢。 发明内容

本发明的目的是从促进能量代谢的全新角度出 发， 提供人 Nectm-2蛋白在促进机体能量消耗中的功能， 从而达到治疗糖尿病、 胰岛素抵抗、 肥胖以及相关疾病的全新用途。 为了实现本发明目的， 本发明首先提供一种融合蛋白， 所述融合 蛋白由三个连续的免疫球蛋白样结构域 （ Immunologlobin-like domain, Ig-like domain )组成 （图 1 )， 分别是 N端的一个 Ig-like V结 构域和 C端的两个 Ig-like C2-type 1和 Ig-like C2-type 2结构域， 三个结 构域之间由两段 Linker ( Linkerl和 Linker2 )连接。 其中， N端的 Ig-like V结构域、 中间的 Ig-like C2-type 1结构域以及 C端的 Ig-like C2-type 2 结构域的氨基酸序列分别如 SEQ ID No.1-3所示。 每段 Linker由 1-10个 氨基酸串联而成。 例如， Linkerl的氨基酸序列为 RVIAK， Linker2的 氨基酸序列为 VRYP。 Linker也可为其他柔性氨基酸序列， 例如 GGGGS或 GGGGS的重复片段等。

前述的融合蛋白为人 Nectin-2蛋白的 ECD区 （即胞外区， 图 1 )， 其为：

1 ) 由 SEQ ID No.4所示的氨基酸序列构成的蛋白； 或

2 ) SEQ ID No.4所示氨基酸序列经取代、 缺失和 /或添加一个或 几个氨基酸且同等功能的由 1 )衍生的蛋白； 或

3 )与 SEQ ID No.4所示氨基酸序列的同源性在 90%以上的氨基酸 序列构成的蛋白。

本发明还提供编码上述融合蛋白的基因。

本发明还提供含有编码上述融合蛋白的基因的 载体、工程菌或转 基因细胞系。

本发明还提供人 Nectin-2蛋白（包含人 Nectin-2蛋白的 ECD区 )在 制备用于治疗糖尿病、胰岛素抵抗、 肥胖或肥胖相关疾病的药物中的 应用。

本发明还提供人 Nectin-2蛋白（包含人 Nectin-2蛋白的 ECD区 )在 制备用于提高能量代谢或促进发热的药物中的 应用。

本发明还提供一种用于治疗糖尿病、肥胖或肥 胖相关疾病的药物 组合物， 所述药物组合物包括所述融合蛋白或人 Nectin-2蛋白， 或它 们经过修饰或改造的蛋白， 任选包括药学上可接受的微载体、 纳米颗 粒和 /或辅料等。

本发明还提供一种用于提高能量代谢或促进发 热的药物组合物， 所述药物组合物包括有效量的所述融合蛋白或 人 Nectin-2蛋白， 或它 们经过修饰或改造的蛋白， 任选包括药学上可接受的微载体、 纳米颗 粒和 /或辅料等。

本发明中所述经过修饰的蛋白包括但不限于， 所述融合蛋白或人 Nectin-2蛋白经过乙酰化、 聚乙二醇化、 糖基化或与 BSA结合等。

本发明中所述经过改造的蛋白包括但不限于， 所述融合蛋白或人 Nectin-2蛋白与免疫球蛋白 Fc片段或与其他蛋白融合构成的不改变 Nectin-2蛋白活性的融合蛋白。

本发明中所述肥胖相关疾病为糖尿病或胰岛素 抵抗。 优选地， 所 述糖尿病为 I型或 II型糖尿病。

本发明中所述药物组合物可为缓释剂型。

本发明中所述药学上可接受的载体或辅料包括 但不限于， 微载 体、 纳米颗粒和 /或辅料等。

本发明提供的融合蛋白和 /或人 Nectin-2蛋白， 以及它们的衍生蛋 白或它们经过修饰的蛋白可以有效地抑制肥胖 或用于与肥胖相关疾 病的治疗， 降低血糖， 通过增加机体的能量代谢水平， 提高机体的葡 萄糖耐受量， 增强组织的胰岛素灵敏性， 并通过激活机体产热来增强 机体对寒冷刺激的适应性， 从而为糖尿病、 胰岛素抵抗、 肥胖以及肥 胖相关疾病的治疗开辟了新途径。 附图说明

图 1为本发明 Nectin-2蛋白 ECD区 （即胞外区） 的结构示意图。 图 2为本发明实施例 1中在 HEK293细胞中分别过表达人 Nectin-2 蛋白与免疫球蛋白 Fc片段的融合蛋白、 免疫球蛋白 Fc (对照）， 蛋白 纯化后的 SDS-PAGE凝胶电泳结果。 图 3为本发明实施例 2中 Nectin-2蛋白对小鼠体重的影响； 其中， IgG代表肥胖小鼠注射免疫球蛋白 Fc对照蛋白组， Nectm-2代表肥胖小 鼠注射人 Nectm-2蛋白与免疫球蛋白 Fc片段的融合蛋白组。

图 4为本发明实施例 3中 Nectin-2蛋白对小鼠空腹血糖的影响； 其 中， IgG代表肥胖小鼠注射免疫球蛋白 Fc对照蛋白组， Nectm-2代表肥 胖小鼠注射人 Nectm-2蛋白与免疫球蛋白 Fc片段的融合蛋白组。

图 5为本发明实施例 4中 Nectin-2蛋白对小鼠能量代谢的影响； 其 中， IgG代表肥胖小鼠注射免疫球蛋白 Fc对照蛋白组， Nectm-2代表肥 胖小鼠注射人 Nectm-2蛋白与免疫球蛋白 Fc片段的融合蛋白组。

图 6为本发明实施例 4中 Nectin-2蛋白对小鼠饮食量的影响；其中， IgG代表肥胖小鼠注射免疫球蛋白 Fc对照蛋白组， Nectm-2代表肥胖小 鼠注射人 Nectm-2蛋白与免疫球蛋白 Fc片段的融合蛋白组。

图 7为本发明实施例 4中 Nectin-2蛋白对小鼠运动量的影响；其中， IgG代表肥胖小鼠注射免疫球蛋白 Fc对照蛋白组， Nectm-2代表肥胖小 鼠注射人 Nectm-2蛋白与免疫球蛋白 Fc片段的融合蛋白组。

图 8为本发明实施例 5中人 Nectm-2蛋白上调棕色脂肪细胞特异性 基因 UCPl ( A )、 PPARa ( B ) 的表达； 其中， IgG为人免疫球蛋白 Fc 对照蛋白组， Nectin-2为人 Nectin-2蛋白与免疫球蛋白 Fc片段的融合蛋 白组； 纵坐标为相对表达量， IgG的相对表达量定义为 1。 具体实施方式

以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 若未 特别指明， 实施例均按照常规实验条件， 如 Sambrook等分子克隆实验 手册 ( Sambrook J & Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual 2001 )， 或按照制造厂商说明书建议的条件。

除非特别指明，以下实施例中使用的 C57BL/6J小鼠均购自北京维 通利华实验动物技术有限公司。 所用试剂均为分析纯级别的试剂， 且 可从正规渠道商购获得。 胰岛素购自诺和诺德制药有限公司。 实施例 1 人 Nectin-2蛋白的获得

根据 GenBank中公布的人 Nectin-2mRNA序歹 'J ( Accession No.： C 456818.1 )， 将第 1-1035位的核苷酸序列与免疫球蛋白 Fc片段的基 因序列进行拼接， 拼接后的基因序列如 SEQ ID No .5所示。

通过人工合成上述序列成后， 克隆到哺乳动物表达载体 pcDNA3.1中， 构建好的表达载体瞬时转入 HEK293细胞中， 实现融合 蛋白的表达， 纯化目的蛋白。 蛋白纯化后的 SDS-PAGE凝胶电泳结果 如图 2所示。

细胞转染、细胞培养及蛋白纯化的具体过程如 下：首先将 HEK293 细胞悬浮培养于 293 FreeStyle培养基中 （GIBCO ), 在 5%C0 ₂ 条件下 培养， 二氧化碳摇床（INFORS ) 的转速为 125-135 rpm。 转染表达时 细胞的终浓度为 1 X 10 ⁶ 个细胞 /mL，转染试剂为 293Fectin (Invitrogen)。 转染后 48h和 96h，补加原始转染总体积 30%的 293FreeStyle培养基。 转 染后 6-7天， 2500rpm离心收集培养液上清， 向其中加入 NaCl至终浓度 为 3M，然后加入 Tris使其终浓度为 50mM，充分溶解后调节 pH值至 8.5， 然后 6000rpm离心 10min， 最后将上清液用 0.22μπι滤膜过滤， 然后用 5mL的 Protein A (ToyoScreen AF-rProtein A-650F, TOSOH)在 AKTA Purifier (GE)蛋白纯化系统上进行纯化。先用平衡液（ 50mM Tris/HCl， 3.0M NaCl， pH 8.5 )平衡柱子 5个柱体积后， 上样并继续用平衡液洗 柱子直至紫外吸收到基线， 然后用洗脱液（25mM柠檬酸， 4.5mM柠 檬酸钠， pH 3.0 ) 洗脱， 在紫外吸收大于 5mAU时收集流出液。 然后 加入 5%v/v中和液（ 2M Tris-HCl, pH 9.0 )进行中和， 对纯化的目的 蛋白进行 SDS-PAGE凝胶电泳。

实施例 2 人 Nectin-2蛋白在抑制肥胖中的应用

为了验证实施例 1中制备的 Nectin-2蛋白的抗肥胖作用，在本实施 例中构建如下高脂饲料诱导肥胖组小鼠模型：

取 6周龄的 C57BL/6J雄性小鼠， 饲喂 60 Kcal%的高脂饲料 ( esearch diet, D12451 ), 每周记录体重。 诱导 8周待其肥胖后将高 脂饮食诱导肥胖组随机分为对照组（IgG， 10只）和实验组组（Nectm-2， 10只）； 然后将实验组， 用 Nectin-2 (实施例 1中制备）处理， 以 5mg/kg 体重 /周的剂量皮下注射； 并将对照组用同样剂量的 IgG (免疫球蛋白 Fc作为对照蛋白）处理， 以皮下注射的方式给药， 每周给药， 给药前 2周检测各实验组动物每天平均摄食量， 并在给药的每周记录体重。 连续给药 14周后， 断颈处死小鼠， 取出肝脏、 附睾脂肪和皮下脂肪， 称重。

从图 3可以看出， Nectm-2处理可以有效地抑制肥胖， 具体为对照 组 50.85±0.5g， 实验组 46.85士 l .lg ( p<0.05 )。

实施例 3 人 Nectin-2蛋白在降低空腹血糖中的应用

已有研究结果表明， 肥胖往往伴随着严重的胰岛素抵抗。 在本实 施例中， 进一步对实施例 2中给药第 9周的小鼠， 进行了以下试验： 将实施例 2中给药 9周后的小鼠禁食过夜测空腹血糖水平。

结果如图 4所示， 高脂饮食诱导的对照组 （IgG ) 的空腹血糖 ( 5.84mmol ) 显著高于 Nectin-2处理的实验组空腹血糖 （ 5.2mmol， p<0.05 )。

实施例 4 人 Nectin-2蛋白在促进能量消耗中的应用

取实施例 2中给药第 10周后的小鼠， 用 T SE公司的 LabMaster检测 其耗氧量。从图 5可以看出， Nectin-2蛋白增加机体的耗氧量（p<0.05 )， 说明 Nectin-2蛋白能够提高机体的整体能量代谢。但� �� Nectin-2对采食 量 （图 6 )和运动量（图 7 ) 没有显著影响。

由此可见， Nectin-2蛋白能够增加机体的能量代谢水平。

实施例 5 人 Nectin-2蛋白在上调椋色脂肪细胞特异性基因 UCP1、 PPARa表达中的应用

利用棕色脂肪细胞分化培养基（DMEM+10% FBS+20nM胰岛素 +1ηΜ Τ3 )培养 C3H10T1/2细胞 3天， 等细胞长满之后， 利用诱导培养 基 （ DMEM+10% FBS+0.125mM indomethacin+2 g/ml dexamethasone+0.125mM IBMX )诱导 2天。 第 6天重新将棕色脂肪细 胞置于上述分化培养基中培养， 第 10天收获培养的细胞。 人 Nectin蛋 白和人 IgG对照蛋白从细胞培养第 1天开始添加， 直至最后 1天。 从收 获的细胞样品中提取 RNA反转录成 cDNA， 然后利用荧光定量 PCR检 测 Nectin蛋白处理对棕色脂肪特异性基因 UCP1、 PPARa的影响。 图 8 结果显示， 相对于对照的 IgG处理， 不同浓度的 Nectin ( 100ng/ml、 lOOOng/ml )可显著上调 UCP1、 PPARa基因的表达量（*表示 p<0.05 )。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方 案对本发明作了详 尽的描述， 但在本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本 领域技术人员而言是显而易见的。 因此， 在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 工业实用性 本发明提供人 Nectin-2蛋白的新用途。 Nectin-2蛋白及其衍生蛋 白或其经过修饰的蛋白可以有效地抑制肥胖和 糖尿病，或用于与肥胖 相关疾病的治疗， 包括但不限于高血压、 高脂血症等。 Nectm-2不仅 可以降低血糖， 还通过增加机体的能量代谢水平， 提高机体的葡萄糖 代谢， 增强组织的胰岛素灵敏性， 并通过激活机体脂肪酸代谢来增强 机体对寒冷刺激的适应性， 为糖尿病、 胰岛素抵抗、 肥胖以及相关疾 病的治疗开辟了新途径。

参考文献

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2、 Samanta D , Ramagopal UA , Rubinstein R , et al. Structure of Nectin-2 reveals determinants of homophilic and heterophilic interactions that control cell -cell adhesion [J]. Proc Natl Acad Sci U S A , 2012 , 109 ( 37 )： 14836-14840.

3、 Lopez M ,Aoubala M Jordier F ,et al. The human poliovirus receptor related 2 protein is a new hematopoietic/endothelial homophilic adhesion molecule [J]. Blood , 1998 , 92 ( 12 )： 4602-4611.

4、 Takahashi K , Nakanishi H , Miyahara M , et al. Nectin PRR: an immunoglobulin-like cell adhesion molecule recruited to cadherin-based adherens junctions through interaction with Afadin , a PDZ domain-containing protein [J]. J Cell Biol , 1999 , 145 ( 3 )： 539-549.

序列表

<110> 北京伟德杰生物科技有限公司

<120> 人 Nectin-2蛋白的应用

<130> KHP143115307

<160> 5

<170> Patentln version 3. 5

<210> 1

<211> 125

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 1

Gin Asp Val Arg Val Gin Val Leu Pro Glu Val Arg Gly Gin Leu Gly 1 5 10 15

Gly Thr Val Glu Leu Pro CCyyss HHiiss LLeeuu Leu Pro Pro Val Pro Gly Leu

20 25 30

Tyr lie Ser Leu Val Thr Trp Gin Arg Pro Asp Ala Pro Ala Asn His

35 40 45

Gin Asn Val Ala Ala Phe His Pro Lys Met Gly Pro Ser Phe Pro Ser

50 55 60

Pro Lys Pro Gly Ser Glu Arg Leu Ser Phe Val Ser Ala Lys Gin Ser

65 70 75 80

Thr Gly Gin Asp Thr Glu Ala Glu Leu Gin Asp Ala Thr Leu Ala Leu

85 90 95

His Gly Leu Thr Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Phe Ala

100 105 110

Thr Phe Pro Lys Gly Ser Val Arg Gly Met Thr Trp Leu

115 120 125

<210> 2

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 2

Pro Lys Asn Gin Ala Glu Ala Gin Lys Val Thr Phe Ser Gin Asp Pro 1 5 10 15

Thr Thr Val Ala Leu Cys lie Ser Lys Glu Gly Arg Pro Pro Ala Arg

20 25 30 lie Ser Trp Leu Ser Ser Leu Asp Trp Glu Ala Lys Glu Thr Gin Val 35 40 45

Ser Gly Thr Leu Ala Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Arg Phe Thr Leu 50 55 60

Val Pro Ser Gly Arg Ala Asp Gly Val Thr Val Thr Cys Lys Val Glu 65 70 75 80 His Glu Ser Phe Glu Glu Pro Ala Leu lie Pro Val Thr Leu Ser

85 90 95

<210> 3

<211> 85

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 3

Pro Glu Val Ser lie Ser Gly Tyr Asp Asp Asn Trp Tyr Leu Gly Arg 1 5 10 15

Thr Asp Ala Thr Leu Ser Cys Asp Val Arg Ser Asn Pro Glu Pro Thr

20 25 30

Gly Tyr Asp Trp Ser Thr Thr Ser Gly Thr Phe Pro Thr Ser Ala Val 35 40 45

Ala Gin Gly Ser Gin Leu Val lie His Ala Val Asp Ser Leu Phe Asn 50 55 60

Thr Thr Phe Val Cys Thr Val Thr Asn Ala Val Gly Met Gly Arg Ala 65 70 75 80

Glu Gin Val lie Phe

85

<210> 4

<211> 329

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 4

Gin Asp Val Arg Val Gin Val Leu Pro Glu Val Arg Gly Gin Leu Gly 1 5 10 15

Gly Thr Val Glu Leu Pro Cys His Leu Leu Pro Pro Val Pro Gly Leu

20 25 30

Tyr lie Ser Leu Val Thr Trp Gin Arg Pro Asp Ala Pro Ala Asn His

35 40 45

Gin Asn Val Ala Ala Phe His Pro Lys Met Gly Pro Ser Phe Pro Ser

50 55 60

Pro Lys Pro Gly Ser Glu Arg Leu Ser Phe Val Ser Ala Lys Gin Ser

65 70 75 80

Thr Gly Gin Asp Thr Glu Ala Glu Leu Gin Asp Ala Thr Leu Ala Leu

85 90 95

His Gly Leu Thr Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Phe Ala

100 105 110

Thr Phe Pro Lys Gly Ser Val Arg Gly Met Thr Trp Leu Arg Val lie 115 120 125

Ala Lys Pro Lys Asn Gin Ala Glu Ala Gin Lys Val Thr Phe Ser Gin 130 135 140 Asp Pro Thr Thr Val Ala Leu Cys lie Ser Lys Glu Gly Arg Pro Pro

145 150 155 160

Ala Arg lie Ser Trp Leu Ser Ser Leu Asp Trp Glu Ala Lys Glu Thr

165 170 175

Gin Val Ser Gly Thr Leu Ala Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Arg Phe

180 185 190

Thr Leu Val Pro Ser Gly Arg Ala Asp Gly Val Thr Val Thr Cys Lys

195 200 205

Val Glu His Glu Ser Phe Glu Glu Pro Ala Leu lie Pro Val Thr Leu

210 215 220

Ser Val Arg Tyr Pro Pro Glu Val Ser lie Ser Gly Tyr Asp Asp Asn

225 230 235 240

Trp Tyr Leu Gly Arg Thr Asp Ala Thr Leu Ser Cys Asp Val Arg Ser

245 250 255

Asn Pro Glu Pro Thr Gly Tyr Asp Trp Ser Thr Thr Ser Gly Thr Phe

260 265 270

Pro Thr Ser Ala Val Ala Gin Gly Ser Gin Leu Val lie His Ala Val

275 280 285

Asp Ser Leu Phe Asn Thr Thr Phe Val Cys Thr Val Thr Asn Ala Val

290 295 300

Gly Met Gly Arg Ala Glu Gin Val lie Phe Val Arg Glu Thr Pro Asn

305 310 315 320

Thr Ala Gly Ala Gly Ala Thr Gly Gly

325

<210> 5

<211> 1725

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggcccggg ccgctgccct cctgccgtcg agatcgccgc cgacgccgct gctgtggccg 60 ctgctgctgc tgctgctcct ggaaaccgga gcccaggatg tgcgagttca agtgctaccc 120 gaggtgcgag gccagctcgg gggcaccgtg gagctgccgt gccacctgct gccacctgtt 180 cctggactgt acatctccct ggtgacctgg cagcgcccag atgcacctgc gaaccaccag 240 aatgtggccg ccttccaccc taagatgggt cccagcttcc ccagcccgaa gcctggcagc 300 gagcggctgt ccttcgtctc tgccaagcag agcactgggc aagacacaga ggcagagctc 360 caggacgcca cgctggccct ccacgggctc acggtggagg acgagggcaa ctacacttgc 420 gagtttgcca ccttccccaa ggggtccgtc cgagggatga cctggctcag agtcatagcc 480 aagcccaaga accaagctga ggcccagaag gtcacgttca gccaggaccc tacgacagtg 540 gccctctgca tctccaaaga gggccgccca cctgcccgga tctcctggct ctcatccctg 600 gactgggaag ccaaagagac tcaggtgtca gggaccctgg ccggaactgt cactgtcacc 660 agccgcttca ccttggtgcc ctcgggccga gcagatggtg tcacggtcac ctgcaaagtg 720 gagcatgaga gcttcgagga accagccctg atacctgtga ccctttctgt acgctaccct 780 cctgaagtgt ccatctccgg ctatgatgac aactggtacc tcggccgtac tgatgccacc 840 ctgagctgtg acgtccgcag caacccagag cccacgggct atgactggag cacgacctca 900 ggcaccttcc cgacctccgc agtggcccag ggctcccagc tggtcatcca cgcagtggac 960 agtctgttca ataccacctt cgtctgcaca gtcaccaatg ccgtgggcat gggccgcgct 1020 gagcaggtca tctttcccac aatcaagccc tgtcctccat gcaaatgccc agcacctaac 1080 ctcttgggtg gaccatccgt cttcatcttc cctccaaaga tcaaggatgt actcatgatc 1140 tccctgagcc ccatagtcac atgtgtggtg gtggatgtga gcgaggatga cccagatgtc 1200 cagatcagct ggtttgtgaa caacgtggaa gtacacacag ctcagacaca aacccataga 1260 gaggattaca acagtactct ccgggtggtc agtgccctcc ccatccagca ccaggactgg 1320 atgagtggca aggagttcaa atgcaaggtc aacaacaaag acctcccagc gcccatcgag 1380 agaaccatct caaaacccaa agggtcagta agagctccac aggtatatgt cttgcctcca 1440 ccagaagaag agatgactaa gaaacaggtc actctgacct gcatggtcac agacttcatg 1500 cctgaagaca tttacgtgga gtggaccaac aacgggaaaa cagagctaaa ctacaagaac 1560 actgaaccag tcctggactc tgatggttct tacttcatgt acagcaagct gagagtggaa 1620 aagaagaact gggtggaaag aaatagctac tcctgttcag tggtccacga gggtctgcac 1680 aat caccaca cgactaagag cttctcccgg actccgggta aatga 1725