NOUVELLES UTILISATIONS DE DéRIVéS DE D-MANNOPYRANOSE

La présente invention est relative à l'utilisation du mannose-6- phosphate (M6P) et de certains de ses dérivés pour le contrôle de l'angiogenèse et la régénération ligamentaire et/ou la reconstruction de cartilage. Le M6P et certains de ses dérivés peuvent notamment être utilisés pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la régénération ligamentaire et/ou la reconstruction de cartilages.

De nombreuses pathologies ont été décrites comme ayant une composante ou un stade lié au phénomène d'angiogénèse. On peut citer entre autres de très nombreux cancers, les rétinopathies liées au diabète, l'athérosclérose, l'arthrose, la polyarthrite rhumatoïde, le psoriasis, ainsi que les pathologies inflammatoires ou celles liées à une cicatrisation retardée.

L'angiogenèse est un mécanisme de néovascularisation prenant naissance à partir d'un réseau capillaire préexistant. Le bourgeonnement de petits vaisseaux, les capillaires, à partir de ceux préexistants, intervient pour le meilleur lors du développement embryonnaire et l'implantation du placenta, lorsqu'il s'agit de cicatriser une blessure, ou de pallier l'obstruction d'un vaisseau ; mais également pour le pire dans les cancers (croissance des tumeurs et développement des métastases), l'arthrite rhumatoïde, certaines maladies ophtalmologiques comme la rétinopathie diabétique ou la dégénérescence maculaire liée à l'âge... Pour l'ensemble de ces processus, le schéma général reste le même. L'activation des cellules endothéliales conduit à la dégradation de la membrane basale et de la matrice extracellulaire environnante. La migration orientée est suivie d'une phase proliférative. Les cellules se différencient ensuite en une structure de type capillaire pour former un réseau vasculaire nécessaire au développement des tissus. Au cours de ces dernières années, il est devenu clair que l'angiogenèse n'est pas contrôlée par un seul facteur, mais par une balance d'inducteurs et d'inhibiteurs produits par les cellules normales ou tumorales. Parmi ces facteurs, des polypeptides comme le facteur de croissance des fibroblastes-2 ("Fibroblast Growth Factor-2" : FGF-2) et le "facteur de croissance de l'endothélium vasculaire ("Vascular Endothelial Growth Factor" : VEGF) sont apparus comme étant des régulateurs clés de l'angiogenèse.

De nombreuses molécules ont été étudiées pour leur effet inhibiteur ou activateur de l'angiogénèse.

En ce qui concerne l'inhibition de l'angiogénèse, une révolution conceptuelle récente dans le traitement du cancer consiste à cibler le réseau vasculaire qui irrigue une tumeur. Il est maintenant bien établi que le développement d'une vascularisation intra ou péritumorale est un événement clé autant pour la croissance d'une tumeur que pour la dissémination métastatique par la voie sanguine. En décembre 2005, la revue scientifique anglaise Nature, qui consacrait son numéro à l'angiogénèse, dénombrait plus de 300 inhibiteurs, dont 80 en cours d'essais cliniques. Mais les premiers médicaments testés - angiostatine, endostatine, interférons, inhibiteurs de matrice métalloprotéinases... - furent décevants. Parmi des molécules plus récentes, on peut citer le bevacizumab. Injecté au patient, il neutralise un type de VEGF circulant dans les capillaires ou diffus dans la tumeur, le VEGF-A. Sa première indication fut en 2004 pour le cancer colorectal métastatique, en association avec une chimiothérapie. Il est aujourd'hui en essais cliniques contre les cancers du rein métastatiques, du poumon et du sein. Mais on observe qu'il accroît le risque d'hypertension et d'hémorragie. On peut également citer le sunitinib et le sorafenib qui présentent l'avantage de pouvoir autoriser une formulation sous forme de comprimés à absorber par voie orale et qui conduisent à des résultats thérapeutiques encourageants. Ils présentent également l'inconvénient d'engendrer quelques effets secondaires comme l'hypertension, la fatigue ou des problèmes de peau.

Ainsi, les Inventeurs ont découvert que le mannose-6-phosphate et certains dérivés sélectionnés de celui-ci et tels qu'ils vont être décrits ci-après (composés de formule (I)) présentaient une activité inhibitrice de l'angiogénèse, et permettaient la régénération ligamentaire et/ou la reconstruction de cartilages.

La présente invention a donc pour objet l'utilisation, à titre de principe actif, d'au moins un composé de formule (I) ci-après :

dans laquelle :

- Ri représente un radical alkyle linéaire ou ramifié en Ci-C ₄ ; un radical alkyle comportant un ou plusieurs groupements fonctionnels choisis parmi les groupements hydroxyle, aminé, thiol, carboxyle, azide et nitrile ; un cycle hydrocarboné, saturé ou insaturé, en C ₃ -C ₆ ; un cycle hydrocarboné, saturé ou insaturé, en C ₃ -C ₆ comportant un ou plusieurs groupements fonctionnels choisis parmi les groupements hydroxyle, aminé, alkyle en CpC ₄ , thiol, carboxyle, azide et nitrile ; un hétérocycle saturé ou insaturé comportant au moins un hétéroatome choisi parmi les atomes d'oxygène, d'azote et de souffre ;

- n est un nombre entier égal à 0 ou 1 ,

- R ₂ est choisi parmi les groupements (Gi) à (G ₄ ) suivants :

O OR,

R ₃ O- -P I — OR ¹ , 3 R ₃ OOC. XOOR'

O=S=O

R ₄

\

(G ₁ ) (G ₂ ) (G ₃ )

(G ₄ ) dans lesquels : * R ₃ et R' ₃ , identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou de sodium ;

* R ₄ représente un atome d'oxygène ou de soufre, et

* la flèche représente le point d'attachement du groupement sur l'atome de carbone porteur de R ₂ , pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la régénération ligamentaire et/ou la reconstruction d'un cartilage. Selon l'invention, parmi les radicaux alkyle en Ci-C ₄ mentionnés pour R ₁ , le radical méthyle est particulièrement préféré.

Parmi les radicaux alkyle fonctionnalisés cités pour R ₁ , on peut en particulier mentionner les radicaux mono et dihydroxyalkyle en Ci-C ₄ , mono et diaminoalkyle en C ₁ -C ₄ , mono et dithioalkyle en C]-C ₄ et mono et dicarboxyalkyle en C ₁ -C ₄

Parmi les cycles hydrocarbonés cités pour R ₁ , on peut en particulier mentionner les cycles cyclopropane, cyclobutane, cyclopentane, cyclohexane, phényle et benzyle.

Parmi les hétérocycles cités pour Ri, on peut en particulier mentionner les cycles oxadiazole, triazole, oxazole, isoxazole, imidazole, thiadiazole, pyrrole, tetrazole, furane, thiophène, pyrazole, pyrazoline, pyrazolidine, thiazole, isothiazole, pyridine, pyrimidine, pipéridine, pyranne, pyrazine et pyridazine. Dans les composés de formule (I) ci-dessus, lorsque n = 0, R ₂ est de préférence choisi parmi les groupements G ₃ et G ₄ et lorsque n = 1, R ₂ est de préférence choisi parmi les groupements Gi et G ₂ .

Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, les composés de formule (I) sont choisis parmi ceux dans lesquels R ₂ représente un groupement Gj ou G ₃ tels que définis ci-dessus dans lesquels R ₃ et R' ₃ sont identiques et représentent un atome de sodium et parmi ceux dans lesquels R ₂ représente un groupement G ₂ ou G ₄ tels que définis ci-dessus dans lesquels R ₃ représente un atome de sodium.

Parmi les composés de formule (I) ci-dessus, on peut en particulier citer :

- le 6-phosphate-D-manno-pyranoside de méthyle ; également connu sous la dénomination triviale mannose-6-phosphate (M6P) dans la littérature ;

- le (disodium)-6-phosphate-D-manno-pyranoside de méthyle ;

- le 6,7-didéoxy-7-sodiumsulfonato-D-manno-heptopyranoside

de méthyle ;

- l'acide (6,7-didésoxy-D-manno-heptopyranoside de méthyle) uronique ; et

- le 6-déoxy-6-malonate-D-mannopyranoside de méthyle. Parmi ces composés, le 6-phosphate-D-manno-pyranoside de méthyle (M6P), le (disodium)-6-phosphate-D-manno-pyranoside de méthyle et le 6,7- didéoxy-7-sodiumsulfonato-D-manno-heptopyranoside de méthyle sont particulièrement préférés.

Le mannose-6-phosphate, ainsi que certains des composés de formule (I) listés ci-dessus sont connus en tant que tels et ont déjà été proposés dans le domaine pharmaceutique, notamment pour améliorer la cicatrisation de la peau tout en diminuant la formation de cicatrices disgracieuses (Clavel, C. et al, II Farmaco, 2005, 60, 721-725). Ils n'y ont cependant encore jamais été utilisés et aucune activité de ces composés sur la régénération ligamentaire et/ou la reconstruction de cartilages n'a encore été décrite.

Ainsi qu'on l'a vu précédemment, les composés de formule (I) conformes à la présente invention, on une activité inhibitrice sur l'angiogenèse et une activité sur la régénération ligamentaire et/ou la reconstruction de cartilages. Ils peuvent par conséquent être utilisés pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la régénération ligamentaire et/ou à la reconstruction d'un cartilage. En effet, lors de la régénération ligamentaire ou de la reconstruction d'un cartilage, on utilise généralement des implants constitués de polymères biocompatibles contenant des cellules ad hoc. Dans ce cas, il est souhaitable d'empêcher la vascularisation de l'implant de façon à garder un matériau acellulaire. Aussi, pour cette application, la composition pharmaceutique se présente de préférence sous la forme d'un biomatériau polymérique renfermant au moins un composé de formule (I).

La composition pharmaceutique de l'invention telle que défini ci- dessus comprend, en plus du composé de formule (I), au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.

L'homme du métier choisira un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables en fonction de la voie d'administration de la

composition pharmaceutique. Bien entendu, l'homme de l'art veillera à cette occasion à ce que le ou les excipients utilisés soient compatibles avec les propriétés intrinsèques attachées à la composition conforme à la présente invention.

En outre, la forme du médicament ou de la composition pharmaceutique (par exemple, une solution, une suspension, une émulsion, des comprimés, des gélules, des suppositoires, un biomatériau polymérique, etc..) dépendra de la voie d'administration choisie.

Ainsi, au sens de la présente invention, le médicament ou la composition pharmaceutique peut être administré par n'importe quelle voie appropriée, par exemple par la voie orale, locale, systémique, intraveineuse, intramusculaire ou mucosale, ou bien en utilisant un patch ou un biomatériau polymérique.

On peut notamment citer, à titre d'exemples non limitatifs d'excipients appropriés pour une administration par voie orale, le talc, le lactose, l'amidon et ses dérivés, la cellulose et ses dérivés, les polyéthylèneglycols, les polymères d'acide acrylique, la gélatine, le stéarate de magnésium, des matières grasses animales, végétales ou synthétiques, les dérivés de la paraffine, les glycols, les stabilisants, les conservateurs, les anti-oxydants, les agents mouillants, les anti- agglomérants, les dispersants, les émulsionnants, les agents modifiants du goût, les agents de pénétrations, de solubilisation, etc....

Les techniques de formulation et d'administration des médicaments et compositions pharmaceutiques sont bien connues dans la technique ici considérée, l'homme du métier pouvant notamment se référer à l'ouvrage Remington's Pharmaceutical Sciences, dernière édition. Les composés de formule (I) peuvent être aisément préparés, à partir d'un D-mannopyranoside de formule (II) définie ci-après, par déplacement nucléophile du précurseur sulfate cyclique de formule (IV) correspondant, par analogie à la méthode décrite par exemple par Van der Klein P.A.M. et al, Carbohydr. Res., 1992, 224, 193-200 suivi de la déprotection des radicaux hydroxyle portés par le motif saccharidique, selon le schéma réactionnel A suivant :

(V)

SCHEMA A dans lequel R ₁ , R ₂ et n ont la même signification que celle indiquée ci-dessus pour les composés de formule (I) et Nu représente un groupement nucléophile correspondant au groupement R ₂ que l'on souhaite introduire.

Cette méthode correspond à une adaptation de la méthode décrite dans l'article de Khanjin N. A. et al, Tetrahedr. Lett., 2002, 43, 4017-4020.

Le sulfate cyclique de formule (IV) préparé selon ce procédé peut être stocké plusieurs mois à température ambiante sous la forme d'une poudre blanche sans observer de décomposition. Les intermédiaires purs des sels de monosulfate peuvent être facilement séparés des groupements nucléophiles n'ayant pas réagi et des autres impuretés, par partition entre l'eau et un solvant tel que le dichlorométhane avant l'étape de déprotection. Le clivage simultané et quantitatif des groupes monosulfate cyclique et isopropylidène des composés de formule (V) peut être réalisé sur une résine échangeuse d'ions telle qu'une résine Amberlyst-15 (H+) qui permet la déprotection du groupement monosulfate cyclique en 10 à 30 minutes et celle du groupement isopropylidène en 3 à 5 heures à température ambiante dans un mélange méthanol/tetrahydrofuranne. Tous les composés de formule (I) préparés selon ce procédé peuvent être obtenus avec un rendement compris entre 60 et 95 %.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des

exemples de préparation des composés de formule (I) conformes à l'invention, ainsi qu'à un exemple de mise en évidence de l'activité d'inhibition de l'angiogénèse des composés de formule (I) par rapport à d'autres dérivés de D-mannopyranose ne répondant pas à la formule (I) et ne faisant donc pas partie de l'invention, ainsi qu'à la figure 1 annexée qui représente des photos de la vascularisation d'embryons de poulets après mise en culture en présence de 6 mg/ml de différents composés de formule (I) conformes à l'invention comparativement à trois dérivés de D-mannopyranoside (DM) ayant une activité pro-angiogénique et ne faisant donc pas partie de l'invention (DMl : 7-amino-6,7-didésoxy-α-D-mannopyranoside de méthyle ; DM2 : 6-azido-6-déoxy-α- D-mannopyranoside de méthyle et DM3 : 7-disodiumphosphonato-6,7-didésoxy-α-D- manno-heptopyranoside de méthyle).

Il doit être entendu toutefois que ces exemples ne sont donnés qu'à titre purement illustratif de l'invention dont ils ne constituent en aucune manière une quelconque limitation.

EXEMPLE 1 : PRéPARATION DU 6,7-DIDéOXY-7-SODIUMSULFONATO- α-D-MANNO-HEPTOPYRANOSIDE DE MéTHYLE (Composé de formule I I)

(M)

1) Première étape : Préparation du 2,3-O-Isopropylidène-4,6-O-(sulfate cycIique)-α-D-mannopyranoside de méthy.e (composé 3)

Le composé (3) a été obtenu en 2 sous-étapes, sans purification intermédiaire, via le sulfite correspondant (2). 1-a) Préparation du sulfite correspondant (2)

(1) (2)

3,79 g (16,18 mmol - 1 éq.) de 2,3-0-isopropylidène-α-D- mannopyranoside de méthyle (1) et 6,75 mL (48,54 mmol - 3 éq.) de triéthylamine ont été dissous dans 75 mL de dichlorométhane (CH ₂ Cl ₂ ). Le mélange a été refroidi à 0°C et 1,3 mL (17,80 mmol - 1,1 éq.) de chlorure de thionyle (SOCl ₂ ) ont été ajoutés lentement. Le précipité blanc de chlorure de triéthylammonium s'est formé instantanément, et le mélange réactionnel est devenu progressivement jaune, puis marron, en 5 à 10 minutes. Une chromatographie sur couche mince (CCM) a alors été réalisée en utilisant comme phase mobile un mélange d'éther de pétrole (EP) et d'acétate d'éthyle (AcOEt) (8/2 v/v). Les résultats de cette CCM ont indiqué alors qu'il ne restait plus de produit de départ (Rf = 0) et que le sulfite désiré avait été obtenu sous forme de 2 diastéréoisomères (Rf = 0,45 et 0,60). Le mélange réactionnel a alors été filtré, et la phase organique a été lavée avec de l'eau distillée, une solution d'acide chlorhydrique (HCl) IN, et de l'eau distillée à nouveau. Elle a été séchée sur sulfate de sodium (Na ₂ SO ₄ ), filtrée et concentrée pour donner un solide légèrement marron qui a été directement remis en réaction.

1-b) Oxydation du sulfite (2) en sulfate (3)

(2) (3)

Le sulfite brut (2) obtenu ci-dessus à la sous-étape 1-a) (16,18 mmol - 1 éq., théoriquement) a été dissous dans 60 mL d'une solution composée d'un mélange de CH ₂ Cl ₂ et d'acétonitrile (CH ₃ CN) (1/1 v/v) avant d'ajouter

successivement 3,8 g (17,80 mmol - 1,1 éq.) de métapériodate de sodium, 20 mL d'eau et 14 mg (0,06 mmol - 0,004 éq.) de chlorure de ruthénium. La réaction a été exothermique, et la formation du précipité d'iodate de sodium (NaIO ₃ ) a été observée très rapidement. Après 1 heure de réaction, il ne restait plus de sulfite et seul le sulfate (3) a été observé sur CCM. Le mélange réactionnel a alors été filtré et dilué avec 100 mL de CH ₂ Cl ₂ . L'eau résiduelle de la réaction a été supprimée et la phase organique a été lavée 2 fois avec une solution de bicarbonate de sodium (NaHCO ₃ ) à 5%, puis avec de l'eau distillée. Elle a ensuite été séchée sur Na ₂ SO ₄ , filtrée et concentrée pour donner un solide légèrement marron. Ce solide a été dissous dans un minimum de CH ₂ Cl ₂ en présence de charbon actif, et filtré sur silice. La silice a été rincée avec 300 mL de CH ₂ Cl ₂ . Les impuretés marron, contenant les sels de ruthénium, sont restés à la surface. Le solide blanc obtenu a ensuite été engagé dans l'étape 2) sans aucune autre purification. Rendement : 84 % sur 2 étapes. Rf : 0,48 (EP/AcOEt 7/3 v/v).

SM : (ESI ⁺ MeOH) m/z : 297 [M+H] ⁺ , 319 [M+Na] ⁺ . RMN ¹ H (400,13 MHz, Acétone-d ₆ ) δ ppm : 1,38 et 1,53 (2s, 6H, H ₂ ) ; 3,46 (s, 3H, OCH ₃ ) ; 4,17 (td, IH, J _5-4 = J _5-6b = 10,6 Hz, J _5-6a = 5,5 Hz, H ₅ ) ; 4,32 (dd, IH, J _2-3 = 5,6 Hz, J _2-1 = 0,4 Hz, H ₂ ) ; 4,42 (dd, IH, J _3-2 = 5,6 Hz, J _3-4 = 7,7 Hz, H ₃ ) ; 4,59 (dd, IH, J _4-3 = 7,8 Hz, J _4-5 = 10,4 Hz, H ₄ ) ; 4,64 (t, IH, J _6b-5 = 10,7 Hz, J _6b - ₆ a = -10,7 Hz, H _6b ) ; 4,87 (dd, IH, J _6a-5 = 5,5 Hz, J _6a-6b = -10,5 Hz, H _6a ) ; 5,01 (d, IH, Ji _-2 = 0,5 Hz, H ₁ ).

RMN ¹³ C (100,62 MHz, CDCl ₃ ) δ ppm : 26,4 et 28,3 (2C, C ₂ ) ; 56,1 (IC, OCH ₃ ) ; 58,9 (IC, C ₅ ) ; 72,3 (IC, C ₆ ) ; 73,6 (IC, C ₃ ) ; 76,3 (IC, C ₂ ) ; 84,6 (IC, C ₄ ) ; 99,4 (IC, C ₁ ) ; 111,0 (IC, C ₁ -).

2) Deuxième étape : Préparation du 6,7-Didéoxy-7-sulfonato-α-D-manno- heptopyranoside de méthyle 2 (composé 1-1) 2-a) Attaque nucléophile

(3) (4)

On a dissous sous argon, 303 mg (2,19 mmol - 1,3 éq.) d'isopropyl méthylsulfonate et 3 gouttes de 1 , 1 -diphényléthylène (indicateur coloré) dans 2 mL de tétrahydrofuranne (THF) anhydre. Le mélange a été refroidi à une température de -70°C et on a ensuite ajouté goutte à goutte 2,19 mmol (1,3 éq.) de butyl lithium. Une couleur rouge (due au 1,1- diphénylhexyllithium) est apparue peu à peu. L'addition du butyl lithium a été stoppée, la couleur rouge foncée a persisté. Après 5 minutes sous agitation à la même température, 500 mg (1,69 mmol - 1 éq.) du composé (3) obtenu ci-dessus à l'étape 1), préalablement dissous dans 3 mL de THF anhydre, ont été ajoutés lentement au mélange. La couleur rouge a disparu rapidement. 580 μL (3,37 mmol - 2 éq.) d'hexaméthylphosphotriamide (HMPT) ont alors été ajoutés. On a ensuite laissé le mélange revenir à température ambiante. Après 15 minutes, tout le produit de départ a été consommé. Le milieu réactionnel a alors été dilué avec 20 mL de CH ₂ Cl ₂ . Le produit a été extrait par 2 x 10 mL d'eau distillée. Cette phase aqueuse a ensuite été lavée au CH ₂ Cl ₂ jusqu'à ce que les impuretés organiques, comme le diphényléthylène et le HMPT soient éliminées. Après lyophilisation, le solide obtenu a directement été remis en réaction, sans aucune autre purification.

Rendement : Quantitatif.

Rf : 0,35 (CH ₂ Cl ₂ /Me0H 85/15 v/v).

Le produit révélé à l'anisaldéhyde était de couleur kaki.

2-b) Déprotection

(4) (5)

744 mg (1,69 mmol - 1 éq.) de 6,7-didéoxy-7-sulfonate-4- lithiumsulfate-2,3-(9-isopropylidène-α-D-manno-heptopyrano side de méthyle (4) ont été dissous dans 10 mL d'eau distillée, avant d'ajouter 500 mg d'une résine échangeuse de cations, vendue sous la référence Amberlyst-15 H ⁺ par la société Aldrich. Après 3 heures de réaction, les résines ont été filtrées et la phase aqueuse a été lyophilisée. Le solide obtenu a été purifié par chromatographie sur gel de silice en utilisant comme phase mobile un mélange isopropanol (IPrOH) ammoniaque (NH ₄ OH) dans un rapport 8/2 (v/v) pour donner une mousse transparente. L'échange du proton de l'acide sulfonique par un contre ion sodium a ensuite effectué, dans l'eau, à l'aide de résines Dowex Na ⁺ commercialisées par la société Dow Corning.

Rendement : 95%. Rf : 0,40 (IPrOHZNH ₄ OH 6/4 v/v).

SM (FAB ⁺ /NBA) m/z : 273 [M+H] ⁺ , 242 [M-OMe] ⁺ . SM (FABTNBA) m/z : 271 [M-H] ^' .

RMN ¹ H (400,13 MHz, D ₂ O) δ ppm : 1,97 (m, IH, H _7a ) ; 2,36 (m, IH, H _7b ) ; 2,99 (m, IH, H _6a ) ; 3,13 (m, IH, H _6b ) ; 3,37 (s, 3H, OCH ₃ ) ; 3,78 (m, IH, H ₅ ) ; 3,89-3,96 (m, 2H, H ₃ et H ₂ ) ; 4,45 (t, IH, J _4-5 = J _4-3 = 9,4 Hz, H ₄ ) ; 4,70 (s, IH, H ₁ ).

RMN ¹³ C (100,62 MHz, D ₂ O) δ ppm : 26,8 (IC, C ₇ ) ; 47,6 (IC, C ₆ ) ; 55,4 (IC, OCH ₃ ) ; 69,1 (IC, C ₅ ) ; 69,9 (IC, C ₃ ) ; 70,4 (IC, C ₂ ) ; 79,0 (IC, C ₄ ) ; 100,9 (IC C ₁ ).

EXEMPLE 2 : PRéPARATION DE L'ACIDE (6,7-DIDESOXY-α-D-MANNO- HEPTOPYRANOSINE DE MéTHYLE) URONIQUE (Composé de formule 1-2)

1) Première étape : Préparation 6-cvano-6-déoxy-4-O-sodiumsulfate-2,3-O- isopropylidène-α-D-manno-pyranoside de méthyle (composé 6).

1 g (3,38 mmol - 1 éq.) de 2,3-0-isopropylidène-4,6-0-(sulfate cyclique)-α-D-mannopyranoside de méthyle (composé 3) tel qu'obtenu ci-dessus à l'issue de l'étape 1) de l'exemple 1 a été dissous dans 3 mL de diméthylformamide (DMF), avant d'ajouter 331 mg (6,75 mmol - 2 éq.) de cyanure de sodium. Le mélange a été laissé sous agitation magnétique à température ambiante pendant 20 heures. Le milieu réactionnel a alors été dilué avec 20 mL de NaHCO ₃ à 1% (pour éviter un éventuel dégagement de cyanure d'hydrogène (HCN), et lavé avec 10 mL de CH ₂ Cl ₂ .

Le produit a encore été extrait de la phase organique avec 2 x 10 mL d'eau distillée. Les phases aqueuses rassemblées ont été lyophilisées pour donner un solide un peu jaune, qui était assez pur pour être remis en réaction directement. Cependant, ce produit peut également être purifié par chromatographie sur gel de silice avec un gradient d'élution (CH ₂ Cl ₂ jusqu'à CH ₂ Cl ₂ /Me0H 91/9 v/v) pour donner une mousse très légèrement jaune. Rendement : Quantitatif.

Rf : 0,49 (CH ₂ Cl ₂ MeOH 85/15 v/v).

Le produit s'est révélé de couleur bordeaux à Panisaldéhyde.

SM (ESI ⁺ /MeOH) m/z : 384 [M+Na] ⁺ .

SM (ESITMeOH) m/z : 322 [M-Na]-.

RMN ¹ H (400,13 MHz, Acétone-d ₆ ) δ ppm : 1,24 et 1,41 (2s, 6H, H ₂ .) ; 2,76 (dd, IH, J _6a-5 = 9,3 Hz, J _6a-6b = -17,3 Hz, H _6a ) ; 3,18 (dd, IH, J _6b-5 = 2,8 Hz, J _6b-6a = -17,3 Hz, H _6b ) ; 3,46 (s, 3H, OCH ₃ ) ; 3,86 (td, IH, J _5-6a = J _5-4 = 9,6 Hz, J _5-6b = 2,8 Hz, H ₅ ) ; 4,15 (d, IH, J _2-3 = 7,4 Hz, H ₂ ) ; 4,21 (dd, IH, J _4-5 = 9,9 Hz, J _4-3 = 7,0 Hz, H ₄ ) ; 4,44 (dd _{mal résolu} , IH, H ₄ ); 4,93 (s, IH, H ₁ ).

RMN ¹³ C (100,62 MHz, Acétone-d ₆ ) δ ppm : 20,6 (IC, C ₆ ) ; 25,5 et 27,1 (2C, Cr) ; 54,5 (IC, OCH ₃ ) ; 64,9 (IC, C ₅ ) ; 75,6 (IC, C ₂ ) ; 76,3 (IC, C ₄ ) ; 76,9 (IC, C ₃ ) ; 98,1 (IC, C ₁ ) ; 109,8 (IC, C ₁ -) ; 118,1 (IC, C ₇ ).

2) Deuxième étape : Préparation du 6-cvano-6-déoxy-α-D-mannopyranoside de méthyle (composé 7)

873 mg (2,53 mmol - 1 éq.) de 6-déoxy-6-cyano-4-sodiumsulfate- 2,3-0-isopropylidène-α-D-manno-heptopyranoside de méthyle (6) obtenu ci-dessus à l'étape précédente ont été dissous dans 20 mL d'une solution constituée d'un mélange de méthanol (MeOH) et de THF (1/1 ; v/v), puis 1 g de résine Amberlyst-15 H ⁺ a été ajouté. Après 1 heure et 15 minutes de réaction, les résines ont été filtrées et le milieu réactionnel a été neutralisé avec une solution de NaHCO ₃ à 5% jusqu'à pH = 8. Les solvants organiques ont été éliminés à l'évaporateur rotatif et l'eau restante a été lyophilisée. Le mélange a été repris au MeOH, et le NaHCO ₃ insoluble a été filtré. Le produit a ensuite été purifié par chromatographie sur gel de silice avec un gradient d'élution (CH ₂ Cl ₂ jusqu'à CH ₂ Cl ₂ /Me0H 92/8 v/v) pour donner une mousse blanche.

Rendement : 72 %.

Rf : 0,56 (CH ₂ Cl ₂ /Me0H 85/15 v/v).

SM : (ESI ⁺ /MeOH) m/z : 226 [M+Na] ⁺ , 242 [M+K] ⁺ , 429 [2M+Na] ⁺ .

RMN ¹ H (400,13 MHz, D ₂ O) δ ppm : 2,86 (dd, IH, J _6a-5 = 7,4 Hz,

J _6a - _6b = -17,3 Hz, H _6a ) ; 3,04 (dd, IH, J _6b-5 = 3,6 Hz, J _6b-6a = -17,3 Hz, H _6b ) ; 3,44 (s,

3H, OCH ₃ ) ; 3,60 (t, IH, J _4-5 = J _4-3 = 9,7 Hz, H ₄ ); 3,76 (dd, IH, J _3-4 = 9,6 Hz, J _3-2 = 3,4

Hz, H ₃ ) ; 3,84 (ddd, IH, J _5-63 = 7,1 Hz, J _5-6b = 3,2 Hz, J _5-4 = 10,1 Hz, H ₅ ) ; 3,96 (dd, IH, J _2-3 = 3,4 Hz, J _2-1 = 1 ,7 Hz, H ₂ ) ; 4,78 (d, IH, J _1-2 = 1,5 Hz, H ₁ ).

RMN ¹³ C (100,62 MHz, D ₂ O) δ ppm : 51,4 (IC, C ₆ ) ; 55,2 (IC, OCH ₃ ) ; 67,8 (IC, C ₅ ) ; 70,2 (IC, C ₂ ) ; 70,7 (IC, C ₃ ) ; 71,6 (IC, C ₄ ) ; 101,4 (IC, C ₁ ). 3) Troisième étape : Préparation de l'acide (6,7-Didésoxy-α-D-manno- heptopyranoside de méthyle) uronique (1-2) 200 mg (0,98 mmol - 1 éq.) du 6-déoxy-6-cyano-α-D-manno- heptopyranoside de méthyle (7), obtenus ci-dessus à l'étape précédente, ont été dissous dans 2 mL d'une solution aqueuse de peroxyde d'hydrogène (H ₂ O ₂ ) à 30%, avant d'ajouter 60 mg (1,46 mmol, 1,5 éq) de soude (NaOH). La solution a été laissée à température ambiante. Au bout de 12 heures puis de 24 heures de réaction, on a à nouveau ajouté au milieu réactionnel 1 mL de la solution de peroxyde d'hydrogène et 30 mg de soude.

Après 48 heures, le milieu réactionnel a été neutralisé par des résines Amberlites H ⁺ , avant d'être filtré et lyophilisé. Le produit obtenu a ensuite été purifié par chromatographie sur gel de silice avec un gradient d'élution (CH ₂ Cl ₂ jusqu'à CH ₂ Cl ₂ MeOH 85/15 v/v).

Rf : 0,25 (isopropanol /NH ₄ OH 85/15 v/v).

Rendement : 80%.

SM : (ESI ⁺ /MeOH) m/z : 245 [M+Na] ⁺ .

SM : (ESITMeOH) m/z : 221 [M-H] ^"

EXEMPLE 3 PREPARATION DU 6-DEOXY-6-MALONATE-α-D-

MANNOPYRANOSIDE DE METHYLE (Composé 1-3)

1) Première étape : Préparation du 2,3 _^ 4-tri-O-benzyl-6-Déoxy-6-fbis(2,2,2- trifluoroéthvDmalonatel-α-D-mannopyranoside de méthyle (Composé 8)

765 mg (1,65 mmol - 1 éq.) de 2,3,4-tri-O-benzyl-α-D- mannopyranoside de méthyle, 530 mg (1,98 mmol - 1,2 éq.) de bis(2,2,2- trifluoroéthyl)malonate et 866 mg (3,3 mmol - 2 éq.) de triphénylphosphine ont été dissous dans 10 mL de toluène. 833 mg (3,3 mmol - 2 éq.) de 1 , r-(azodicarbonyl)dipipéridine (ADDP) ont ensuite été ajoutés par fraction (pendant 30 minutes). Le mélange a été laissé sous agitation magnétique à température ambiante et la réaction a été suivie par CCM (Et ₂ O/EP 4/6 v/v). Après 48 heures, le milieu réactionnel a été filtré sur silice, concentré et déposé directement sur colonne. Le produit a été purifié par chromatographie sur gel de silice avec un gradient d'élution (EP jusqu'à EP/Et ₂ O 85/15 v/v) pour donner une huile incolore. Rendement : 55 %. Rf : 0,79 (Et ₂ CVEP 6/4 v/v). SM : (ESI ⁺ /MeOH) m/z : 713 [M+Na] ⁺ . SM : (ESITMeOH) m/z : 737 [M-H] ^" .

RMN ¹ H (400,13 MHz, CDCl ₃ ) δ ppm : 2,45 (ddd, IH, J _6a-5 = 10,0 Hz, J _6a - _6b = -14,4 Hz, J _63-7 = 4,9 Hz, H _6a ) ; 2,87 (ddd, lH,J _6b-5 = 2,6 Hz, J _6b-6a - -14,1 Hz, J _6b-7 = 9,0 Hz, H _6b ) ; 3,51 (s, 3H, OCH ₃ ) ; 3,84 (td, IH ₅ J _5-4 = J _5-6a = 9,7 Hz, J _5-6b = 2,6 Hz, H ₅ ) ; 3,96 (t, IH, J _4-3 = J _4-5 = 9,3 Hz, H ₄ ) ; 4,02 (dd, IH, J _2- , = 1,9 Hz, J _2-3 = 2,9 Hz, H ₂ ) ; 4,11 (dd, IH, J _3-2 = 3,1 Hz, J _3-4 = 9,2 Hz, H ₃ ) ; 4,11 (dd, IH, J _7-63 = 5,0 Hz, J _7-6b = 9,2 Hz, H ₇ ) ; 4,72 (m, 4H, H ₃ O ; 4,84 (s, 2H, H ₁ -) ; 4,87 (d, IH, J _1-2 = 1,7 Hz, H ₁ ) ; v ₀ = 4,96 (ABq, 2H, v _A = 4,93, v _B = 4,99, δv = 24,8 Hz, J _AB = 12,2 Hz, H ₁ ) ; V ₀ = 5,06 (ABq, 2H, v _A = 4,90, v _B = 5,21, δv = 121,8 Hz, J _A3 = 11,0 Hz, H _r ) ; 7,50-7,62 (m, 15H, H _Ph ). RMN ¹³ C (100,62 MHz, CDCl ₃ ) δ ppm : 31,5 (IC, C ₆ ) ; 48,4 (IC,

C ₇ ) ; 55,3 (IC, OCH ₃ ) ; 61,5 (q, IC, J _C . _F = 37,2 Hz, C ₃ -) ; 69,5 (IC, C ₅ ) ; 72,6, 73,4 et 75,7 (3C, Cr) ; 75,1 (IC, C ₂ ) ; 78,7 (IC, C ₄ ) ; 80,5 (IC, C ₃ ) ; 99,7 (IC, C ₁ ) ; 123,1 (q, IC, Jc _-F = 276,9 Hz, C ₄ ) ; 127,3-128,9 (15C, CH _Ph ) ; 138,7, 138,8 et 138,9 (3C, CIVp _h ) ; 167,4 et 167,7 (2C, C ₈ ). RMN ¹⁹ F (188,31 MHz, CDCl ₃ ) δ ppm : -74,14 (dd, J _F - _H = 8,5 Hz).

2) Deuxième étape : Préparation du 6-Déoxy-6-malonate-α-D-mannopyranoside de méthyle (Composé 1-3).

2-a) Hydrogénolyse des benzyle

(8) (9)

380 mg i (0,53 mmol - 1 éq.) de 6-déoxy-6-[bis(2,2,2- trifluoroéthyl)malonate]-2,3,4-tri-O-benzyl-α-D-mannopyran oside de méthyle (8) tel qu'obtenu ci-dessus à l'étape précédente ont été dissous dans 20 mL de MeOH avant d'ajouter 130 mg de palladium sur charbon (Pd/C). Le milieu réactionnel a été placé sous atmosphère d'hydrogène pendant 12 heures, puis filtré sur silice et concentré pour donner une mousse blanche, directement remise en réaction.

Rendement : 90 %. Rf : 0,34 (Et ₂ O). 2-b) Hydrolyse du motif malonate

(9) (1-3)

211 mg de 6-déoxy-6-[bis(2,2,2-trifluoroéthyl)malonate]-α-D- mannopyranoside de méthyle (9) ont été dissous dans 5 mL d'une solution de méthanol ammoniacal saturée et laissés pendant 5 heures à 5°C. Le milieu réactionnel a ensuite été concentré, puis le produit a été purifié par chromatographie sur gel de silice avec un gradient d'élution (CH ₂ Cl ₂ /Me0H 9/1 v/v jusqu'à CH ₂ Cl ₂ MeOH 65/45 v/v) pour donner un solide blanc.

Rendement : 90 %. Rf : 0,28 (CH ₂ Cl ₂ MeOH 75/25 v/v). SM : (ESITMeOH) m/z : 279 [M-H]\ RMN ¹ H (400,13 MHz, D ₂ O) δ ppm : 1,96 (m, IH, H _6a ) ; 2,49 (m,

IH, H _6b ) ; 3,41 (s, 3H, OCH ₃ ) ; 3,49 (m, 2H, H ₃ et H ₄ ) ; 3,61 (dd, IH, J _7-6a = 5,75 Hz, J _7-6b = 9,68 Hz, H ₇ ) ; 3,71 (m, IH, H ₅ ) ; 3,92 (dd, IH, J _2-1 = 1,68 Hz, J _2-3 = 3,26 Hz, H ₂ ) ; 4,72 (s, IH ₅ H ₁ ).

RMN ¹³ C (100,62 MHz, D ₂ O) δ ppm : 31,8 (IC, C ₆ ) ; 49,9 (IC, C ₇ ) ; 55,5 (IC, OCH ₃ ) ; 70,2, 70,6 et 71,0 (4C, C ₂ , C ₃ , C ₄ et C ₅ ) ; 101,3 (IC, C ₁ ) ; 174,1 et 174,9 (2C ₅ C ₈ ).

EXEMPLE 4 : MISE EN éVIDENCE DE L'ACTIVITé INHIBITRICE DU M6P ET DE TROIS DE SES DéRIVéS SUR L'ANGIOGéNèSE - COMPARATIF AVEC TROIS DéRIVéS DE D-MANNOPYRANOSIDE NE FAISANT PAS PARTIE DE L'INVENTION

Dans cet exemple on a étudié l'activité du mannose-6-phosphate (M6P) et des composés de formule (1-1), (1-2) et (1-3) tels que préparés

respectivement aux exemples 1 à 3 ci-dessus sur l'inhibition de l'angiogénèse, comparativement à trois dérivés de D-mannopyranoside (DM) ayant une activité pro- angiogénique et ne faisant donc pas partie de l'invention (DMl : 7-amino-6,7- didésoxy-α-D-mannopyranoside de méthyle ; DM2 : 6-azido-6-déoxy-α-D- mannopyranoside de méthyle et DM3 : 7-disodiumphosphonato-6,7-didésoxy-α-D- manno-heptopyranoside de méthyle). Cette étude a été réalisée sur des embryons de poulet selon la méthode décrite par Ribatti D. et al, Nat. Protoc, 2006, 1(1), 85-91 avec quelques modifications mineures. 1) Matériel et Méthode Cette étude a été réalisée sur la membrane chorioallantoïdienne

(CAM) d'embryon de poulet. La CAM est une membrane extra-embryonnaire formée le 4 ^eme jour de l'incubation par la fusion du chorion et de l'allantoïde. Elle permet d'assurer les échanges gazeux entre l'embryon de poulet et l'environnement extra embryonnaire jusqu'à la naissance. Cette CAM est composée d'un réseau capillaire très épais qui forme une surface continue en contact direct avec la coquille. La prolifération capillaire rapide de cette membrane continue jusqu'au l l ^eme jour ; l'index mitotique diminue alors rapidement et le système vasculaire atteint son organisation finale au 18 ^eme jour, juste avant la naissance (éclosion le 21 ^eme jour).

Des œufs fertilisés de poulet de race Leghorn blanche ont été placés dans un incubateur dès le début de l'embryogenèse où ils ont été conservés sous humidité constante à une température de 38°C. Au deuxième jour de l'incubation, une fenêtre a été ouverte dans la coquille après élimination de 2 à 3 mL d'albumine afin de détacher la CAM de la coquille. La fenêtre a ensuite été scellée avec du ruban adhésif et l'œuf a été remis dans l'incubateur pour poursuivre son développement jusqu'au jour de l'expérience. Au 7 ^eme jour, des morceaux de polymères synthétiques inertes (disques filtres de nitrocellulose de 0,4 cm de diamètre) ont été imbibés par 20 μL de chacune des solutions des composés à tester (6 mg/mL dans du PBS) puis positionnés sur la CAM. L'impact des substances testées sur l'angiogenèse a alors été observé au 12 ^eme jour et l'évaluation quantitative de la réponse pro- ou anti-angiogénique a été estimée visuellement.

2) Résultats

Les résultats obtenus ont été photographiés et sont donnés sur la figure 1 annexée sur laquelle on peut observer que le M6P ainsi que les composés (1-1) (1-2) et (1-3) ont un effet inhibiteur sur la vascularisation des embryons de poulet. A l'inverse, les dérivés DMl, DM2 et DM3 ne faisant pas partie de l'invention ont un effet d'activation sur la vascularisation des embryons de poulets. Ces résultats démontrent que malgré une structure chimique très proche des dérivés de D-mannopyranose peuvent avoir des comportements totalement opposés sur la modulation de l'angiogenèse. L'ensemble de ces résultats démontre clairement que les composés de formule (I) conformes à l'invention ont une action d'inhibition de l'angiogenèse.