Verwendung natriuretischer Peptide als antibiotisch wirksame Substanzen zur Behandlung von bakteriellen Infektionen Die Erfindung betrifft die Anwendung natriuretischer Peptide (ANP, BNP, CNP und Urodilatin), als antibiotisch wirksame Peptid-Präparate. Die Gewinnung erfolgt durch eine chemische Peptidsynthese oder biotechnologische Herstellung und Konfektionierung als galenisch zubereitete Substanz zur medizinischen und tiermedizinischen Verwendung als Medikament.

Bei den Peptiden, die Gegenstand dieser Erfindung sind, handelt es sich um Mitglieder der Familie der natriuretischen Peptide. Atriales natriuretisches Peptid (ANP) der Ratte (Flynn et al., 1983), des Schweins (Forssmann et al., 1983,1984), und des Menschen (Kangawa and Matsuo, 1984) wurde in seiner Primärstruktur be- schrieben. Die in der Niere auftretende Form des ANP, Urodilatin, wurde von Forssmann und Mitarbeitern zuerst 1988 isoliert (Schulz-Knappe et al., 1988). Das Homologe des atrialen natriuretischen Peptides (ANP), das Braintype natriuretische Peptid (BNP) wurde von Sudoh und Mitarbeitern 1988 erstmals isoliert. Eine anti- biotische Wirksamkeit wurde für natriuretische Peptide bislang nicht vermutet. Für den Nachweis einer antimikrobiellen Aktivität wird vorzugsweise ein Test durch- geführt, der für basische Peptide geeignet ist. Hier ist der Wachstumshemmtest von Lehrer und Mitarbeitern geeignet, um eine antibiotische Aktivität zu erkennen (Lehrer et al., J. Immun Methods, Vol. 137, S. 167 1991).

Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem bestand in der Bereitstel- lung antibiotisch wirksamer Mittel. Gelöst wird das Problem durch die Verwendung von natriuretischen Peptiden (Natriubiotika wie ANP, BNP, CNP und Urodilatin) gemäß Anspruch 1. Die Unteransprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verwendung.

Erfindungsgemäß werden die Natriubiotika verwendet zur Herstellung eines antibiotisch wirksamen Mittels zur Behandlung einer pathogen veränderten bakteriellen Flora im Magendarmtrakt, respiratorischem und urogenitalem System, der Haut sowie der Verwendung in der Lebensmitteltechnologie als Hilfsstoff bei Gärprozessen und als Konservierungsstoff.

Bei der Verwendung als Arzneimittel werden die Natriubiotika vorzugsweise in Mengen von 1 gag-1 mg pro Einheit in für Infusionen geeigneten Medien, Salben, Tabletten, Sprays,"slow release"-Kapseln formuliert.

Die erfindungsgemäße Verwendung der Natriubiotika umfasst auch die Behandlung von Veränderungen der Darmflora, die Behandlung mikrobiell ausgelöster Haut- erkrankungen, Behandlung von Abberationen der humanen Vaginalflora. Die erfin- dungsgemäße Verwendung von Natriubiotika in der Lebensmitteltechnologie um- fasst auch die Verwendung als Konservierungsstoff für Lebensmittel oder andere verderbliche Waren, als Hilfsstoff bei industriellen Gärprozessen, z. B. bei der Bier- herstellung, bei der Joghurtproduktion sowie der Sauerkrautherstellung.

Humanes ANP 99-126 und Urodilatin wirken überraschenderweise auf grampositive Bakterien wie B. subtils, M. luteus und S. carnosus, und auf gramnegative Bakterien wie E. coli, N. cinerea und P. fluorescens sowie die Hefe S. cerevisiae wachstumshemmend. Ebenso wirkt humanes BNP-312 in der gleichen Art auf grampositive Bakterien wie B. subtils, M. luteus und S. carnosus und gramnegative Bakterien wie E. coli, N. cinerea und P. fluorescens sowie die Hefe S. cerevisiae, wachstumshemmend. Die wachstumsmodulierende Eigenschaft dieser spezifischen natriuretischen Peptide auf bestimmte Keime wurde erstmals eindeutig nachge- wiesen.

Über die chemische und biotechnologische Synthese können die natriuretischen Peptide in hochreiner und biologisch aktiver Form hergestellt, und als Medikament eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäB verwendbaren Stoffe, bestehend aus den synthetischen und rekombinanten Produkten, können die bakterielle Flora des Darms, der Haut und anderer bakteriell besiedelter Körperzonen verändern und bei einer bakteriellen Fehlbesiedlung zu einer Verbesserung der Keimflora führen. Die dargestellten Reinstoffe lassen sich daher zur Bekämpfung von Durchfällen, insbesondere Säuglingsdurchfällen, also Infektionen des Magendarmtraktes, zusätzlich aber auch des Respirationssystems, des Urogenitalapparates und bei Hautinfektionen, verwendcn. Die Präparate sind als Zusatzstoffe für Lebensmittel--oder als Therapeutika verwendbar und dienen bei der Herstellung von Lebensmitteln als Hilfsstoffe, insbesondere bei Lebensmitteln, die durch Gärung und andere bakterielle Prozesse hergestellt werden. Bei diesen Präparaten handelt es sich um natürliche Konservierungsmittel.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen und den folgenden Figuren, auf die in den Beispielen Bezug genommen wird, erläutert : Es zeigen Fig. 1 Wachstumshemmtest von ANP Radialer Diffusions-Wachstumshemmtest mit Streptococcus carnosus und N. cinerea nach Lehrer und Mitarbeitern (Lehrer et al., J Immun Methods, Vol 137, S.

167 1991). Der Wachstumshemmtest ist für den Nachweis antibiotischer Peptide besonders geeignet, da als Trägermaterial statt des sonst üblichen Agar-Agars eine spezielle Agarose verwendet wurde, die keine fixierten Ladungszentren enthält.

Nachweisbar sind Hemmhöfe nach Auftrag von 1 zig ANP (beide Keime).

Fig. 2 Wachstumshemmtest von Urodilatin Radialer Diffusions-Wachstumshemmtest mit Streptococcus carnosus und N. cinerea nach Lehrer und Mitarbeitern (Lehrer et al., J Immun Methods, Vol 137, S.

167 1991). Der Wachstumshemmtest ist für den Nachweis antibiotischer Peptide besonders geeignet, da als Trägermaterial statt des sonst üblichen Agar-Agars eine spezielle Agarose verwendet wurde, die keine fixierten Ladungszentren enthält.

Nachweisbar sind Hemmhöfe nach Auftrag von 1 ig ANP (beide Keime).

Fig. 3 Wachstumshemmtest von BNP-32 Radialer Diffusions-Wachstumshemmtest mit Streptococcus carnosus und N. cinerea niach Lehrer und Mitarbeitern (Lehrer et al., J Immun Methods, Vol 137, S.

167 1991). Der Wachstumshemmtest ist für den Nachweis antibiotischer Peptide besonders geeignet, da als Trägermaterial statt des sonst üblichen Agar-Agars eine spezielle Agarose verwendet wurde, die keine fixierten Ladungszentren enthält.

Nachweisbar sind Hemmhöfe nach Auftrag von 0,1 ug BNP (beide Keime).

Fig. 4 Wachstumshemmtest von CNP Radialer Diffusions-Wachstumshemmtest mit Streptococcus carnosus und N. cinera nach Lehrer und Mitarbeitern (Lehrer et al., J Immun Methods, Vol 137, S. 167 1991). Der Wachstumshemmtest ist für den Nachweis antibiotischer Peptide besonders geeignet, da als Trägermaterial statt des sonst üblichen Agar-Agars eine spezielle Agarose verwendet wurde, die keine filierten Ladungszentren enthält.

Nachweisbar sind Hemmhöfe nach Auftrag von 7 ll9 (S. carnosus) und 11 gg (N. cinera) CNP.

Beispiel 1 : Chemische Synthese der antibiotisch aktiven Peptide ANP, BNP, Urodilatin und CNP Strategie der Synthese humaner natriuretischer Peptide : Für die Synthese der Peptide mit den Sequenzen : Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile- Gly- Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly- Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr (ANP/CDD) Ser-Phe-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met- Asp-Arg- Ile-Ser-Ser-SerSer-Giy-Leu-Gly-Cys-Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His (BNP) Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly- Ser-Met- Ser-Gly-LeuGly-Cys (CNP) Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg- Met-Asp-<BR> Arg-Ile-Gly-Ala-Gin-<BR> Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr (Urodilatin) wird die Durchflussmethode (Atherton und Sheppard, in"Solid Phase Peptide Synthesis", IRL-Press, Oxford 1989) angewendet. Die genannte Peptidsequenz wird mit Hilfe einer automatischen Peptid-Syntheseapparatur (Minigen 9050) unter Verwendung von FmocAminosäuren synthetisiert. Die Fmoc-Aminosäuren waren L-konfiguriert und in vierfachem Überschuss eingesetzt.

Folgende Aminosäurederviate wurden für die Synthese verwendet : Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Arg (Pmc), Fmoc-His (Trt), Fmoc-Glu (OtBu), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Gln (Trt), Fmoc-Leu, Fmoc-Phe, Fmoc-Ile, Fmoc-Val.

Es fehlen Cys, Gly, Met, Asp Die Synthese wird mit trägergebundener C-terminaler Aminosäure (0,091 mmol Alanin/g Harz) an Fmoc-L-Ala-PEG-PS (Millipore) durchgeführt. Alle Kopplungen von Aminosäurederivaten werden in Anwesenheit von 0- (lH-Benzotriazol- -1-yl)-N, N, N', N'tetramethyluronium-tetrafluorborat (TBTU), 1-Hydroxybenzotriazol, Diisopropylethylamin durchgeführt. Folgende Synthesezyklen werden verwendet : -Fmoc-Abspaltung mit 20% Piperidin in DMF für 10 min -Waschen mit DMF für 12 min -Acylierung für 30 min -Waschen mit DMF für 8 min Die Synthese wird durch kontinuierliche UV-Detektion verfolgt. Die Synthese wird mit der Abspaltung des N-terminalen Fmoc-Restes abgeschlossen. Das harzgebundene Peptid wird dreimal mit je 50 ml Isopropanol, Eisessig, Isopropanol und Diethylether gewaschen und getrocknet.

Die Peptide werden vom Trägerharz durch Zugabe einer Mischung von TFA-EthandithiolWasser 94 : 3 : 3 (v/v/v) abgespalten und mit Ether gefällt.

Die Reinigung des Peptides erfolgt mittels Reversed-Phase-HPLC mit einer C18-Säule (Vydac, 10 pmm 300 A, 20 x 250 mm, Detektion bei 230 nm). Als Laufmittel wurden verwendet : Eluent A : 0,06 % Trifluoressigsäure (TFA), Eluent B : 0,06% TFA in Acetonitril/Wasser (4 : 1). Die Flussrate ist 10 ml/min, der Gradient ist folgendermaßen : von 20 % B bis 80 % B innerhalb von 70 min. Die reinen Fraktionen werden gepoolt und lyophilisiert.

Die Reinheit und Identität der Peptide wird mit Hilfe der Massenspektrometrie (QuadrupolElektrospraymassenspektrometrie, Sciex API 111, Perkin Elmer) und Sequenzierung in einem Gasphasensequenator (Model 470, Applied Biosystems, Weiterstadt) durchgeführt sowie mit Kapillarzonenelektrophorese überprüft. Die biologische Aktivität wird durch den Wachstumshemmtest kontrolliert.

Beispiel 2 : Rekombinante Herstellung Die rekombinante Herstellung erfolgt nach üblichen Methoden und führt zu gleichartig reinem Peptid zur galenischen Verwendung.