Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao uso de compostos piranonaftoquinônicos incluídos nas famílias de compostos das quinonas, seus sais, suas formas esteriosoméricas e suas misturas racêmicas como um agente antiviral.

A invenção destina-se a área médica por tratar-se de uma composição farmacêutica contento os compostos piranonaftoquinônicos e o uso desta composição no tratamento de inflamações causadas por agentes virais em animais mamíferos humanos e não humanos.

Antecedentes da Invenção

As piranonaftoquinonas, um grupo de moléculas incluídas na família das quinonas, podem ser de origem natural ou sintética com múltiplas propriedades biológicas. Na natureza suas fontes mais frequentes são plantas superiores, artrópodes, fungos, liquens, bactérias, algas e vírus, conforme descrito por

Thompson, R. U.(Naturally Occuring Quinones IV: Recents Advances; Champman & Hall, Londres, 1997), com funções biológicas múltiplas nos mais diversos ciclos metabólicos destes organismos {Barreiro, E. J; da Silva, J. E. M.; Fraga, C. A. M.; Noções Básicas do Metabolismo dos Fármacos; Quím. Nova 1996, 19, 641). Um grande número de quinonas naturais possui aplicações biológicas práticas, algumas chegaram à produção industrial, como por exemplo, as vitaminas do tipo K, mitomicinas e antraciclinas, entre outras conforme descrito (M. N. da Silva, V. F. Ferreira, M. C. B. V. de Souza; Um panorama atual da química e da farmacologia de naftoquinonas, com ênfase na β-lapachona e derivados; Quim. Nova 2003, 26, 407).

Algumas quinonas, como as do grupo da β-lapachona, são bons agentes bacterianos e antifúngicos como são relatadas (Guiraud, P.; Steiman, R.; Campos Takaki, G.M.; Seigle-Murandi, E.; Simeon B.M.; Comparison of antibacterial and Antifungal Activities of Lapachol and β-Lapachone; Planta Medica 1994, 60, 373). Além disso, estudos comprovam que além de serem agentes bacterianos e antifúngicos, atuam no processo da prevenção da esquistossomose, por inibirem o processo de penetração das cercarias do Schistosoma mansoni em camundongos, como visto (Pinto, A. V.; Gilbert, B.; Pinto, M. C; ln Vitro and In Vivo Evaluation of the toxocity of 1 ,4-Naphthoquinone and 1 ,2-Naphthoquinone Derivatives against Trypanosoma cruzi; Ann. Trop. Med. Parasitei. 1978, 72, 523).

A ação das quinonas sobre os vírus está relacionada com a inibição das enzimas da família das polimerases, mais preciso das DNA polimerases, e também com a inibição da enzima transcriptase reversa. A ação sobre esta última enzima foi demonstrada sobre os vírus da mieloblastose aviária (AMV) e da leucemia murínica de Raucher(RLV). A ação inibitória da enzima DNA polimerase foi específica, pois comparada com outros inibidores, as quinonas apresentaram característica distintas e ineditismo em comparação com outros como relatado (Schuerch, A. R; Wehrli, W.; β-Lapachone, an Inhibitor of Oncornavirus Reverse Transcriptase and Eukariotic DNA Polymerase-a: Inhibitory Effect, Thiol Dependence and Specificity; Eur. J. Biochem. 1978, 84, 197) ou também relatado por outro grupo de pesquisadores (Chau, Y. P.; Shiah, S. G.; Don, M. J.; M. L. Kuo; Involvement of Hydrogen Peroxide in Topoisomerase Inhibitor beta-Lapachone-Induced Apoptosis and

Differentiation in Human Leukemia Celis, Free Radical Biol. Med. 1998, 24, 660).

Outros estudos demonstram que mesmo em baixas concentrações essas substâncias foram capazes de induzirem à morte de células cancerosas da próstata humana, com características de processo apoptótico. Este novo modo de atuação biodinâmica vem tornar esta quinona um grande potencial como droga de valor para a quimioterapia de câncer, particularmente no câncer de próstata (Li, J. C; Wang, C; Pardee B. A.; Induction of Apoptosis by β-Lapachone in Human Prostate Câncer Celis; Câncer Res. 1995, 55, 3712).

Muitas patentes foram concedidas para o uso das lapachonas como quimioterápicos, porém, até o presente momento nenhuma patente apresentou o uso das lapachonas como agentes antivirais do vírus da dengue. A patente internacional WO0977797 menciona um grupo de moléculas da família das lapachonas que são utilizadas para tratamento do câncer de próstata em mamíferos. Tais moléculas induzem, de forma seletiva, a morte das células cancerosas do epitélio da próstata de mamíferos. Outro pedido internacional WO96033988 diz respeito ao uso de lapachonas e seus análogos sozinhos ou com quimioterapia ou radioterapia para indução da morte programada de células cancerosas. Principal fator para essa induzir a morte nas células cancerosas, está no fato dessas lapachonas e seus análogos, quando associados com um tratamento quimioterápico ou radioterápico, são inibidores irreversíveis da enzima topoisomerase freando o processo de replicação celular.

Descrição das Figuras

Figura 1 -Curva dose-resposta da replicação do vírus da Dengue (sorotipo 2) na presença do composto LVM138. A produção virai para cada concentração do composto utilizada foi medida por PCR quantitativo e apresentada como porcentagem de inibição em relação ao controle virai sem a adição do composto. Para o cálculo do IC50% foi utilizada a regressão não linear de Hill.

Figura 2- Curva dose-resposta da replicação do vírus da Dengue (sorotipo 2) na presença do composto LVM137. A produção virai para cada concentração do composto utilizada foi medida por PCR quantitativo e apresentada como porcentagem de inibição em relação ao controle virai sem a adição do composto. Para o cálculo do IC50% foi utilizada a regressão não linear de Hill.

Sumário da Invenção

O principal objeto dessa invenção trata-se do uso das piranonaftoquinonas de fórmula geral I, II e III, assim como seus derivados, seus isômeros e seus sais como um agente antiviral,

O segundo objeto desta invenção trata-se da ação inibitória das pironaftoquinonas, de formula geral I, II e III, assim como seus derivados, seus isômeros e seus sais.

O último objeto desta invenção trata-se de uma composição farmacêutica que contêm as piranonaftoquinonas, de fórmula geral I, II e III, assim como seus derivados, seus isômeros e seus sais.

O último objeto desta invenção trata-se de um medicamento para tratamento das infecções causadas por vírus, em animais mamíferos humanos e não humanos.

Descrição Detalhada da Invenção

O principal objeto desta invenção é o uso das piranonaftoquinonas de fórmula geral I, II e III abaixo, assim como seus derivados, seus isômeros e sais, como agente contra infecções causadas por vírus em animais mamíferos humanos e não humanos.

Os radicais RI, R2, R3, R4, R5 e R6 das fórmulas moleculares acima, podem apresentar como substituintes grupos funcionais conjugados, ou independentes, alquilícos variados, dos tipos lineares, cíclicos, arílicos simples. Ainda podem apresentar grupos funcionalizados como amínicos, guanidínicos, sulfâmico, hidroxílicos, ésteres, éteres, tioésteres, tioéteres, halogênios, sendo preferencialmente, os grupos substituintes apresentados na tabela abaixo.

As piranonaftoquinonas desta invenção são usadas como agentes contra infecções causadas por vírus em animais mamíferos humanos e não humanos. Para fins dessa invenção, as piranonaftoquinonas são agentes contra infecções causadas por qualquer tipo de vírus, porém, sendo preferencialmente infecções causadas por vírus da família fl viviridae. Sendo as piranonaftoquinonas agentes contra infecções causadas por vírus da Hepatite A, hepatite B, hepatite C, contra infecções causadas por vírus da febre amarela, vírus do Oeste do Nilo e outros causadores de encefalite, vírus da diarréia bovina, vírus da febre suína. Porém, para fins desta invenção, as piranonaftoquinonas são agentes contra infecções causadas preferencialmente por vírus da dengue e seus diferentes sorotipos.

As piranonaftoquinonas, já descritas anteriormente, de fórmula geral I, II e III, assim como seus derivados, seus isômeros e sais são usadas para preparação de uma composição farmacêutica destinada para o tratamento de infecções causadas por vírus da família flaviviridae, principalmente, para infecções causadas por vírus da dengue e suas isoformas. A eficácia no tratamento das piranonaftoquinonas já descrita está no fato de assumirem uma ação inibitória sobre as enzimas ATPase dos vírus, principalmente sobre a enzima NS3 dos vírus da família flaviviridade.

Uma composição farmacêutica pode conter as piranonaftoquinonas de fórmula geral (I), (II), (III), assim como seus derivados, seus isômeros e sais. Além dessas piranonaftoquinonas, a composição farmacêutica apresenta substâncias inativas, como corantes, dispersantes, edulcorantes, emolientes, antioxidantes, conservantes, estabilizadores de ph, flavorizantes e outros conhecidos por um técnico na arte.

As substâncias ativas nessa composição são as piranonaftoquinonas de fórmula geral I, II e III já descritas anteriormente, assim como seus derivados, seus isômeros e sais. Tais substâncias devem apresentar uma quantidade farmaceuticamente aceitável, que para fins desta invenção compreende uma faixa 5 a ΙΟΟμΜ, sendo preferencialmente 12 a 50μΜ.

A composição farmacêutica aqui descrita é utilizada para a preparação de um medicamento utilizado no tratamento de infecções em animais mamíferos humanos e não humanos, causadas por vírus, sendo este da família flaviviridae, sendo preferencialmente o vírus da dengue e seus diferentes sorotipos. Esse medicamento apresenta as piranonaftoquinonas, já descritas anteriormente, pode ainda apresentar seus derivados ou seus isômeros ou seus sais.

O medicamento desta invenção pode estar na forma de cápsula, comprimido de liberação lenta, comprimidos de liberação controlada, pastilhas, xaropes, formas farmacêuticas encapsuladas em sistemas de nanopartículas ou micropartículas, formas farmacêuticas injetáveis.

Os seguintes exemplos experimentais servem para ilustrar a presente invenção sem, contudo, limitar o escopo da invenção apresentada. As nomenclaturas dadas nos experimentos as pirononaftoquinonas, possuem finalidade ilustrativa, todas estão compreendidas dentro das fórmulas gerais de pirononaftoquinonas, que são objetos da patente, assim como seus radicais.

Exemplo 1) Ensaios Inibidores do Vírus da Dengue

Para realização dos testes das substâncias I a III frente ao vírus da dengue, comparativos com a Ribavirina, se utilizou um método de triagem onde células VERO eram colocadas em contato com estoques do vírus da dengue, em uma proporção de uma partícula virai infecciosa para 10 células por uma hora para a adsorção e entrada das partículas virais nas células. Após este tempo as células eram lavadas com solução salina e meio de cultura contendo 100 μΜ de cada um dos compostos e 200 μΜ de Ribavirina como controle positivo. Estas culturas eram incubadas a 37 °C por 72 h. Após este tempo uma alíquota do meio livre de células (sobrenadante) era coletada e processado para extração de RNA, seguido de transcrição reversa e reação de PCR em Tempo-Real utilizando iniciadores e sonda específicos para dengue do tipo 2. Aqueles compostos que mostravam inibição de pelo menos 10X na quantidade de RNA virai (progénie virai liberada no sobrenadante) em relação ao controle sem droga, seguiam para um ensaio de dose-resposta. Para este ensaio o procedimento era equivalente ao descrito acima, sendo que eram adicionadas diferentes concentrações dos compostos. Os resultados deste ensaio serviram para calcular a maior e menor porcentagem de inibição para cada composto. Desta forma, para as naftoquinonas do tipo II, LVM0137 e LVM0138 obteve-se, respectivamente 99 > 99,99% (nas concentrações de 25 e 12,5 μΜ, respectivamente). Exemplo2) Ensaios de replicação viral.

Afim de confirmar o resultado do exemplo 1 , outros dois ensaios de medida da replicação virai foram realizados (TCID50 % e Ensaio de redução de plaque virai). No ensaio de TCID50 %, células VERO eram colocadas em contato com estoques do vírus da dengue. Após este tempo as células eram lavadas e meio de cultura contendo 50 μΜ de cada um dos compostos e 200 μΜ de Ribavirina era adicionado como controle positivo do ensaio. Estas culturas eram incubadas a 37 °C por 72 h. Após este tempo o sobrenadante era coletado e utilizado para infecção de nova cultura de células VERO em sextuplicata. O efeito citopático virai era observado diariamente e anotados os poços que apresentavam 50 % de efeito em relação ao controle sem vírus. Estes dados eram utilizados para o cálculo do título virai conforme descrito por Reed e Munch. Observou- se inibição de mais de 99 % do título virai para ambos os compostos, conforme descrito (tabela abaixo). O ensaio de redução de plaque virai é realizado a partir da infecção de monocamadas de células Vero em Placas de 6 poços, com cerca de 50 unidades infecciosas virais. Após a etapa de adsorção as monocamadas são lavadas e é acrescentado meio semi-sólido acrescido de diferentes concentrações dos compostos. As células são cultivadas por sete dias. Após este período as células são fixadas e coradas com o corante cristal violeta. As plaques virais são contadas manualmente. Calcula-se a porcentagem de inibição em relação ao controle de vírus. Para o composto LVM0137 houve inibição de 50 % do número de plaques na concentração de 6,2 μΜ e para o composto LVM0138 houve inibição de mais de 50 % na concentração de 3,1 μΜ, conforme demonstrado na tabela abaixo.

Exemplo 3 ) teste de inibição das enzimas ATPases

Para a realização da triagem dos compostos contra a atividade ATPásica, foi utilizado o ensaio colorimétrico de Fiske, C. H.; Subbarow, Y. ; "The Nature of the inorganic phosphate in voluntary muscle"; Science 1927, 65, 401-403, que mede a extensão de hidrólise do ATP para ADP, à partir da quantidade de Pi (fosfato inorgânico) liberada na reação. A triagem dos compostos foi realizada utilizando 0,6 μΜ de NS3 íntegra em reações contendo 40 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM de DTT, 100 mM de KCl, 5 mM de

MgC e 1 mM de ATP. A enzima foi pré-incubada com os compostos por 10 minutos a 30 °C, e a atividade cinética foi iniciada pela adição de 1 mM de ATP seguido de incubação a 30 °C por 15 minutos. As densidades óticas das amostras foram medidas a 660 nm no EspectraMax M2e (Molecular Devices) . Os parâmetros cinéticos de velocidade inicial (Vi), foram calculados por regressões linear e/ou polinomial de 3 ^a ordem utilizando-se o programa SigmaPlot versão 10.0 e Excel 2007, respectivamente, sendo os valores de Vi convertidos em atividade relativa (%). Os compostos que apresentaram a média da atividade relativa <90% foram convertidos para percentual de inibição e selecionados para a testagem in vivo.

Foram testados as piranonaftoquinonas abaixo contra a atividade ATPase da NS3 íntegra do DENV-2. Nessa triagem inicial foram identificados 14 compostos capazes de inibir a atividade

ATPásica da NS3 íntegra, sendo o composto 2TIOPMeB (LVM 142) o que apresentou maior efeito inibitório.