Vacuna para la prevención de la infección de Anaplasma phagocytophilum

(Rickettsiales: Anaplasmataceae)

La presente invención se encuentra dentro de los sectores biotecnológico, bioquímico y farmacéutico. La presente invención se refiere un antígeno quimérico recombinante que puede ser usado para la prevención o tratamiento de infecciones causadas por Anaplasma phagocytophilum.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Anaplasma phagocytophilum (Rickettsiales: Anaplasmataceae) es un patógeno bacteriano intracelular transmitido por garrapatas emergente en muchas regiones del mundo que causa la anaplasmosis granulocítica humana (HGA), la fiebre transmitida por garrapatas (TBF) y la anaplasmosis canina. Se ha documentado que la infección por A. phagocytophilum infecta a un amplio abanico de hospedadores, entre los que se encuentran el ganado bovino, el ovino, el caprino, el perro, el caballo, el ser humano, el ciervo rojo (Cervus elaphus), el corzo (Caperolus capreolus) y el ciervo de cola blanca (Odocoileus virginianus) y varios roedores (Woldehiwet, Z. 2010. Vet. Parasitol. 167, 108-122; Stuen, S., et al. 2013. Front Cell Infect Microbiol. 3, 31 ).

En los seres humanos, el hipoclorito de doxiciclina es el agente de elección para el tratamiento de la anaplasmosis con una mejora clínica en 24-48 h y la curación. En otras especies, el uso profiláctico de la tetraciclina junto con las aplicaciones de acaricidas, para el control de las garrapatas, son las principales medidas para controlar la infección por A. phagocytophilum en zonas endémicas. Sin embargo, estas medidas de control suscitan preocupación por su impacto en el medio ambiente y la salud humana, y la selección de patógenos y garrapatas resistentes (Bakken, J. S. and Dumler, J. S. 2006. Ann N Y Acad Sci. 1078, 236-247; Maurin, M., et al. 2003. Agents Chemother. 47, 413— 415).

Por el momento, no se dispone de vacunas para la prevención y el control de A. phagocytophilum, sin embargo, las vacunas que podrían desarrollarse estarían dirigidas a afectar a la garrapata, al patógeno que transmite o a ambos para el control de la anaplasmosis. El uso de vacunas incluiría además la ventaja de evitar la contaminación ambiental y la selección de artrópodos vectores resistentes a los plaguicidas, al tiempo que se mejoraría el bienestar de los animales, evitando la transmisión de garrapatas y patógenos para las enfermedades transmitidas por garrapatas. En el control de estos patógenos, el antígeno protector de garrapatas Subolesina (SUB) parece ser un antígeno candidato que puede contribuir al control de múltiples especies de garrapatas y como consecuencia reducir la transmisión de patógenos transmitidos por estas (de la Fuente J., et al. 2006. Parasitol Res 100:85-91 ).

Una de las principales limitaciones para el desarrollo de vacunas eficaces para la prevención y el control de la infección y la transmisión de A. phagocytophilum es la identificación de antígenos protectores eficaces. El estudio de las interacciones moleculares entre las garrapatas y los patógenos transmitidos posibilitaría la identificación de antígenos de garrapata candidatos para reducir la infección y la transmisión del patógeno, al tiempo que afectaría a las infestaciones de garrapatas. Resultados recientes han demostrado que la aplicación de un enfoque vacunómico a las interacciones entre la garrapata Ixodes scapularis y A. phagocytophilum permitió la identificación y caracterización de antígenos candidatos protectores de garrapatas para el control de las infestaciones por vectores y la infección por A. phagocytophilum (Contreras M., et al. 2016. Methods in Molecular Biology, vol. 1404, 275-286; Contreras M., et al. 2019. Front. Physiol. 10:977)

De esta misma forma estudiando las proteínas implicadas en las estrategias por las que A. phagocytophilum establece la infección, se ha encontrado que la proteína de superficie mayor 4 (MSP4 de sus siglas en inglés Major Surface protein 4) localizada en la membrana bacteriana, juega un posible papel durante la infección del patógeno en las garrapatas (Villar, M., et al. 2015. PLoS ONE 10:e0137237) y sería una posible diana vacunal, caracterizando su potencial capacidad protectora en animales inmunizados. Sin embargo, ensayos anteriores de vacunación en ovejas con el antígeno MSP4 de A. phagocytophilum (Contreras M., et al. 2017. Front. Cell. Infect. Microbiol. 7:307) mostraron sólo una protección parcial en corderos y diferencias entre las respuestas de anticuerpos de conejos y ovejas. De manera que existe la necesidad de proporcionar nuevas estrategias de vacunación que permitan desarrollar una respuesta protectora frente a A. phagocytophilum.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En los ensayos previos de vacunación (Contreras M., et al. 2017. Front. Cell. Infect. Microbiol. 7:307) en ovejas con el antígeno MSP4 (con número de acceso en GenBank: AFD54597) de A. phagocytophilum mostraron diferencias entre las respuestas de anticuerpos de conejos y ovejas, que pueden estar asociadas al reconocimiento de epítopos no protectores por parte de las IgG de los corderos inmunizados y protectores por parte de las IgG de los conejos inmunizados.

Los inventores han desarrollado un antígeno quimérico que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 , de ahora en adelante “antígeno quimérico de la presente invención”, mediante la identificación y caracterización de los epítopos protectores de MSP4 frente a A. phagocytophilum, ya que el uso de la proteína completa MSP4 no induce una respuesta protectora completa.

Los inventores realizaron una búsqueda de epítopos de la proteína MSP4 mediante un enfoque basado en la vacunómica. El análisis de los epítopos reactivos distintivos mostró que los anticuerpos IgG protectores de conejos inmunizados con MSP4 reconocían 4 epítopos o regiones inmunogénicas de dicha proteína (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5). Por lo que el antígeno quimérico de la presente invención se construyó a partir de la identificación de estos 4 epítopos de la proteína MSP4 de A. phagocytophilum. Por lo tanto, el antígeno quimérico construido por los inventores comprende los péptidos inmunogénicos (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, y SEQ ID NO: 5) identificados por anticuerpos IgG protectores de conejo. Además, los inventores identificaron también mediante la misma aproximación un péptido de MSP4 reconocido por los anticuerpos IgG de ovejas inmunizadas con MSP4, pero que resultó no ser protector (SEQ ID NO: 6).

El antígeno objeto de la presente invención diseñado por los inventores comprende la siguiente secuencia:

SEQ ID NO: 1 :

Dicho antígeno comprende las secuencias de péptidos:

SEQ ID NO: 2:

El péptido utilizado como control negativo de inmunización comprende la secuencia:

Posteriormente se realizó un ensayo in vitro en el que se utilizaron anticuerpos IgG purificados procedentes de conejos y corderos inmunizados con la MSP4 de A. phagocytophilum para caracterizar la inhibición de la infección por el patógeno en las células HL60 e ISE6 en comparación con la capacidad protectora de las IgGs procedentes de ovejas inmunizadas con el nuevo antígeno quimérico de MSP4 (SEQ ID NO: 1 ) y un péptido no protector en oveja como control negativo (SEQ ID NO: 6) obtenidos a partir del análisis del microarray MSP4. Sorprendentemente se encontró que las IgG de ovejas inmunizadas con el péptido quimérico protector objeto de la invención produjeron una inhibición de la infección por el patógeno A. phagocytophilum en las células HL60 e ISE6 mayor que las IgG de ovejas inmunizadas con el péptido SEQ ID NO: 6 y las IgG de corderos inmunizados con MSP4 no protegieron contra la infección por A. phagocytophilum (Fig. 3).

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un antígeno quimérico protector frente a A. phagocytophilum que comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 ; donde la secuencia SEQ ID NO: 1 comprende las secuencias de aminoácidos de los péptidos SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 los cuales pertenecen a la secuencia de aminoácidos de la proteína MSP4 de A. phagocytophilum. El término “péptido”, tal como se usa en la presente invención, incluye tanto la proteína de longitud completa, como las secuencias de polipéptidos y péptidos más cortas.

En el contexto de la presente invención el término “secuencia de aminoácidos” o “secuencia polipeptídica”, usados de manera intercambiable, se refiere a la secuencia lineal de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos que conforman un péptido o proteína.

En la presente invención término “protector frente a” o “inmunogénico” hace referencia la capacidad de una molécula de generar una respuesta inmune protectora frente a un organismo patógeno, es decir, una respuesta del hospedador que conduce a la generación de moléculas efectoras inmunes, anticuerpos o células que esterilizan o reducen la tasa de reproducción del organismo invasor o lo dañan, inhiben o matan, “protegiendo” así al hospedador de una enfermedad clínica o subclínica y de una pérdida de productividad. Tal respuesta inmune protectora puede manifestarse comúnmente por la generación de anticuerpos que son capaces de inhibir la función metabólica del organismo invasor, conduciendo a un impedimento de su crecimiento normal, falta de reproducción y/o muerte. El término “inmunógeno” hace referencia a una molécula capaz de generar una respuesta tal y como se describe anteriormente, en la presente invención un inmunógeno puede ser un péptido, polipéptido, proteína, proteína de fusión, proteína quimérica o antígeno quimérico.

El término “antígeno” en este documento se refiere a una molécula que puede inducir la formación de anticuerpos generando así una respuesta protectora. Hay muchos tipos de moléculas diferentes que pueden actuar de antígenos, como las proteínas o péptidos, los polisacáridos y, más raramente, otras moléculas como los ácidos nucleicos. En el contexto de la presente invención el antígeno es una molécula seleccionada de la lista que comprende proteína, péptido, polipéptido, proteína de fusión o proteína quimérica. El término “antigénico” se refiere a la característica o capacidad de una molécula, de acuerdo con la presente invención, para inducir la formación de anticuerpos.

De acuerdo con la descripción, el término “antígeno quimérico”, “proteína quimérica” o “proteína de fusión”, usados de manera intercambiable, se entiende como un péptido o proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende dos o más secuencias de aminoácidos o péptidos de una misma o varias proteínas, donde la secuencia polipeptídica del “antígeno quimérico”, “proteína quimérica” o “proteína de fusión” no ocurre en una sola molécula en la naturaleza, o al menos las secuencias que lo componen no son linealmente contiguos en una sola molécula en naturaleza.

En el contexto de la presente invención, el término “antígeno quimérico”, “proteína quimérica” o “proteína de fusión” de la presente invención, términos usados de manera intercambiable, se entiende por la secuencia de aminoácidos que forma el péptido, polipéptido o proteína objeto de la presente invención, donde dicha secuencia comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y es capaz de generar una respuesta inmunogénica o antigénica frente a A. phagocytophilum.

Los inventores observaron que los péptidos con secuencias SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 conforman epítopos de la proteína MSP4 que fueron específicamente reconocidos por las IgG de sueros de conejos y corderos previamente vacunados con la proteína recombinante MSP4.

En una realización preferida, antígeno quimérico de la presente invención se encuentra unido por uno de sus extremos N o C terminal a una secuencia de aminoácidos de una proteína o fragmento de proteína de anclaje a membrana bacteriana. Dicha proteína o fragmento de proteína de anclaje a membrana bacteriana permite expresar péptidos en la membrana de una célula huésped para su posterior aislamiento y purificación. Preferiblemente la secuencia de aminoácidos de una proteína o fragmento de proteína de anclaje a membrana bacteriana presenta una identidad de al menos un 80 %, 90%, 95% o un 98% con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7, más preferiblemente donde dicha secuencia de aminoácidos comprende, aún más preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO:7. Dicha secuencia corresponde a un fragmento de la proteína MSP1 a de Anaplasma margínale. La proteína MSP1 a (por sus siglas del inglés Major Surface Protein 1 a) es una de las cinco proteínas principales de superficie conocidas de A. margínale y está involucrada en la adhesión del patógeno a los hospedadores y en las interacciones del patógeno con las garrapatas.

SEQ ID NO: 7:

La secuencia SEQ ID NO: 7 corresponde a una porción o fragmento de la proteína MSP1 a de A. marginale para dirigir la exposición de otros péptidos sobre la superficie celular, mediante su fusión N-terminal con esta proteína. Teniendo en cuenta el rango de tamaño natural de los péptidos repetidos en la región N-terminal de MSP1 a (28-289 aminoácidos) y los ejemplos de realización expuestos en esta memoria, una ventaja de usar la proteína MSP1 a en lugar de otros motivos de anclaje de proteínas de membrana para exponer péptidos sobre la superficie celular, es la posibilidad de exponer polipéptidos de diferentes tamaños y composición de aminoácidos. En la presente descripción la SEQ ID NO: 7 se referencia como proteína mutante de MSP1 a. El antígeno quimérico con SEQ ID NO: 1 se encuentra preferiblemente unido a la región N-terminal del fragmento de la proteína MSP1 a (SEQ ID NO: 7).

En una realización preferida el antígeno quimérico de la presente invención comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8.

SEQ ID NO: 8:

La secuencia SEQ ID NO: 8: corresponde a un polipéptido o proteína de fusión que comprende el antígeno quimérico conformado por los fragmentos o péptidos antigénicos de MSP4 (SEQ ID NO: 1 ) con un residuo de metionina en el extremo N-terminal, fusionado al fragmento de la proteína MSP1 a (SEQ ID NO: 7), donde la secuencia del antígeno quimérico SEQ ID NO: 1 se encuentra unida al extremo N-terminal del fragmento de la proteína MSP1 a (SEQ ID NO: 7).

Un segundo aspecto de la invención se refiere a une secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno quimérico de acuerdo con el primer aspecto de la invención, donde la secuencia de nucleótidos comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 9.

SEQ ID NO: 9:

La secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 9 codifica una secuencia polipeptídica que comprende la secuencia del antígeno quimérico del primer aspecto, donde dicha secuencia polipeptídica además comprende un aminoácido de metionina en el extremo N-terminal.

El término “ácido nucleico”, “secuencia de nucleótidos”, “polinucleótido” o “secuencia polinucleotídica”, como aquí se usa, se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, bien ribonucleótidos o bien desoxirribonucleótidos. Este término sólo se refiere a la estructura primaria de la molécula. Así, este término incluye ADN de cadena doble o sencilla, al igual que ARN de cadena doble o sencilla. También incluye todos los tipos de modificaciones conocidas (marcadores conocidos en la técnica, metilación, remates, sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones internucleótidas como, por ejemplo, aquellas con uniones sin carga (por ejemplo, fosfonatos de metilo, triésteres de fósforo, amidatos de fósforo, carbamatos, etc.) y con uniones cargadas (por ejemplo, tioatos de fósforo, ditioatos de fósforo, etc.), aquellos que contienen mitades colgantes, como, por ejemplo, proteínas (incluyendo por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L- lisina, etc.), aquellos con intercalantes (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellos que contienen alquilantes, aquellos con uniones modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos,etc.), al igual que formas no modificadas del polinucleótido.

Un tercer aspecto de la invención se refiere a un plásmido, de ahora en adelante plásmido de la presente invención, que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, donde dicho plásmido comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 10.

SEQ ID NO: 10:

El plásmido de la presente invención consta de un sistema de replicación para E. coli y marcador de selección mediante resistencia a antibiótico, preferiblemente ampicilina. En este plásmido se inserta un promotor eficiente en E. coli, como los derivados del operón lactosa (lac) y triptófano (trip). Frente al promotor se inserta el gen codificante para un mutante de MSP1 a que carece de seis aminoácidos que preceden a los péptidos repetidos y los propios péptidos repetidos, pero que contiene los diez aminoácidos anteriores a la primera región transmembranal de la proteína comenzando con un codón de iniciación ATG. Finalmente se insertan los sitios de restricción Xhol y EcoRI para el clonaje de polipéptidos en fase con MSP1 a para la expresión expuesta sobre la membrana de E. coli.

En el contexto de la presente invención, el término “plásmido” “plásmido de expresión” o "vector de expresión", utilizados indistintamente a lo largo del presente documento, se refiere a un fragmento de ADN que tiene la capacidad de replicarse en un determinado huésped y puede servir de vehículo para llevar a cabo la transcripción de una secuencia de interés que haya sido insertada en el mismo.

Un cuarto aspecto de la invención se refiere a una célula huésped que comprende el antígeno quimérico de acuerdo con el primer aspecto, la secuencia de nucleótidos de acuerdo con el segundo aspecto y/o el plásmido de acuerdo con el tercer aspecto.

En el contexto de la presente invención, el término "célula huésped” incluye cualquier tipo de célula que sea susceptible a transformación, transfección, transducción y similares con una construcción de ácido nucleico o vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos o polinucleótido que codifica la proteína de fusión de la invención. La célula huésped puede ser eucariota o procariota. Las células eucariotas incluyen, entre otras, levaduras, células de insectos, células de mamífero, células de planta o fúngicas. Entre las procariotas se incluyen organismos Gram negativos (por ejemplo, Escherichia coli) o Gram positivos (por ejemplo, bacterias del género Bacillus).

En una realización preferida la célula huésped es una célula procariota. En una realización más preferida la célula huésped es Escherichia coli.

Un quinto aspecto de la invención se refiere a un péptido aislado que se selecciona de la lista que consiste en los péptidos con secuencias SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5. De acuerdo con los resultados obtenidos por los inventores, estos péptidos conforman los epítopos reconocidos por IgG de conejos inmunizados con la proteína completa MSP4, por lo que estos péptidos presentan actividad inmunogénica.

El término “aislado” se refiere a que el péptido no se encuentra formando parte de una cadena de aminoácidos mayor, por ejemplo el antígeno quimérico de la presente invención o la proteína MSP4.

Un sexto aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante “composición de la invención”, que comprende el antígeno quimérico de acuerdo con el primer aspecto, la secuencia de nucleótidos de acuerdo con el segundo aspecto, el plásmido de acuerdo con el tercer aspecto, o al menos un péptido asilado de acuerdo con el quinto aspecto de la invención, y al menos un excipiente, vehículo y/o adyuvante En una realización preferida, la composición de la presente invención se encuentra en forma líquida, semisólida, liofilizado, sólida, tableta, cápsulas o píldoras.

En una realización preferida, la composición de la presente invención se encuentra en forma líquida y comprende el antígeno quimérico de acuerdo con el primer aspecto en una concentración de 1 -1000 pg/ml; en una realización preferida el antígeno quimérico se encuentra en una concentración de 1 -500 pg/ml; en una realización más preferida el antígeno quimérico se encuentra en una concentración de 50-200 pg/ml; en una realización más preferida el antígeno quimérico se encuentra en una concentración de 100 μg/ml.

El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de cualquiera de los componentes de la composición de la presente invención, estabiliza dichos componentes o ayuda a la preparación de la composición. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los componentes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo. Por tanto, el término "excipiente" se define como aquella materia que, incluida en las "formas galénicas", se añade a los principios activos o a sus asociaciones para posibilitar su preparación y estabilidad, modificar sus propiedades organolépticas o determinar las propiedades físico-químicas de la composición farmacéutica o veterinaria y su biodisponibilidad. Además, el excipiente es farmacológica o veterinariamente aceptable, es decir, que el excipiente está permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.

El "vehículo" o portador, es preferiblemente una sustancia inerte. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Por tanto, el vehículo es una sustancia que se emplea en el medicamento o composición farmacéutica o veterinaria para diluir cualquiera de los componentes de la misma hasta un volumen o peso determinado; o bien que aún sin diluir dichos componentes es capaz de permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma al medicamento o composición. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacéuticamente aceptable es el diluyente.

El término “adyuvante” se refiere a es una sustancia que aumenta o modula la respuesta inmunitaria a una vacuna. En una realización preferida, el adyuvante puede ser, sin limitación, poly-iCLC, 1018 ISS, sales de aluminio, Amplivax, ASI5, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC3 I, Imiquimod, ImuFact IMP321 , IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, Juv Immune, LipoVae, F59, monofosforil lípido A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA. 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA 50 V2, Montanide ISA- 51 , O -432. OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PEPTEL, micropartículas de PLGA , resiquimod, SRL172, Virosomas, YF-17D, VEGF trap, 848, beta-glucano, Pam3Cys, and Aquifa's QS2.1 . En una realización preferida el adyuvante es Montanide ISA 50 V2.

En cada caso la forma de presentación del medicamento o composición se adaptará al tipo de administración utilizada, por ello, la composición de la presente invención se puede presentar bajo la forma de soluciones o cualquier otra forma de administración farmacológica o veteñnariamente permitida y en una cantidad terapéuticamente efectiva. Así, la composición se puede presentar en una forma adaptada a la administración oral, sublingual, nasal, intramuscular, bronquial, linfática, rectal, intradérmica, intravenosa, subcutánea o inhalada, pero sin limitarse a estas formas.

La composición de la invención contendrá una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de antígeno quimérico de acuerdo con el primer aspecto, la secuencia de nucleótidos de acuerdo con el segundo aspecto, el plásmido de acuerdo con el tercer aspecto, o al menos un péptido asilado de acuerdo con el quinto aspecto de la invención. Tal como se usa en la presente descripción, el término "cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad antígeno quimérico de acuerdo con el primer aspecto, la secuencia de nucleótidos de acuerdo con el segundo aspecto, el plásmido de acuerdo con el tercer aspecto, o al menos un péptido asilado de acuerdo con el quinto aspecto de la invención contenida en la composición que es capaz de producir el efecto terapéutico deseado. En general, la cantidad efectiva que debe administrarse dependerá, entre otros factores, de las propias características del sujeto, la gravedad de la enfermedad, la forma de administración, etc.

En una realización preferida, la composición de la presente invención es una composición farmacéutica o veterinaria. En una realización más preferida la composición farmacéutica o veterinaria se encuentra en forma de vacuna.

En el contexto de la presente invención el término “vacuna” se refiere a una preparación antigénica empleada para establecer la respuesta del sistema inmune a una enfermedad. Son preparados de antígenos que una vez dentro del organismo provocan la respuesta del sistema inmunitario, mediante la producción de anticuerpos, y generan memoria inmunológica produciendo inmunidad permanente o transitoria.

Un séptimo aspecto de la invención se refiere al antígeno quimérico del primer aspecto la secuencia de nucleótidos de acuerdo con el segundo aspecto, o plásmido de acuerdo con el tercer aspecto, o al menos un péptido asilado de acuerdo con el quinto aspecto de la invención, o la composición de acuerdo con el sexto aspecto para su uso como medicamento.

Una realización preferida, se refiere al antígeno quimérico del primer aspecto la secuencia de nucleótidos de acuerdo con el segundo aspecto, o plásmido de acuerdo con el tercer aspecto, o al menos un péptido asilado de acuerdo con el quinto aspecto de la invención, o la composición de acuerdo con el sexto aspecto para su uso en la prevención y/o tratamiento de infecciones causadas por bacterias pertenecientes a la familia Anaplasmataceae en un sujeto.

El término “sujeto” se refiere a un humano o animal no humano susceptible de padecer una infección por bacterias pertenecientes a la familia Anaplasmataceae.

En una realización preferida las infecciones son causadas por bacterias pertenecientes al género Anaplasma, preferiblemente A. phagocytophilum, donde la infección es anaplasmosis.

En una realización preferida el sujeto es humano y la infección es anaplasmosis granulocítica humana (HGA).

En otra realización preferida el sujeto es un animal y la infección es anaplasmosis. En una realización más preferida el animal es un animal no humano, más preferiblemente es un mamífero no humano que puede ser, sin limitación, oveja (Ovis orientalis aries) y otros ungulados, gato (Felis catus), perro (Canis lupus), conejo (Oryctolagus cuniculus). En una realización más preferida el animal es oveja (Ovis orientalis aries).

En una realización preferida del séptimo aspecto, la vía de administración puede ser, sin limitación, oral, sublingual, nasal, intramuscular, bronquial, linfática, rectal, intradérmica, intravenosa, subcutánea o inhalada, preferiblemente la vía de administración es subcutánea. Más preferiblemente, la vía de administración es subcutánea cuando la composición de la invención se encuentra en forma de vacuna.

En el contexto de la presente invención “anaplasmosis” se refiere a la enfermedad infecciosa causada por bacterias del género Anaplasma, donde el sujeto que sufre dicha infección padece fiebre, dolor de cabeza, mialgia, escalofríos y temblores, y en su forma más severa puede causar fallo respiratorios, problemas de sangrado, fallo orgánico e incluso la muerte. En el contexto de la presente invención, el término “anaplasmosis granulocítica humana” se refiere la enfermedad infecciosa causada por bacterias del género Anaplasma o “anaplasmosis” específicamente donde el sujeto afectado es humano, particularmente por Anaplasma phagocytophilum, que causa fiebre, dolor de cabeza, mialgia, escalofríos y temblores, trombocitopenia, leucopenia y una elevación de la transaminasa en sangre. Un octavo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de anticuerpos frente a infecciones causadas por bacterias pertenecientes a la familia Anaplasmataceae en un sujeto, preferiblemente pertenecientes al género Anaplasma, más preferiblemente A. phagocytophilum, donde dicho método comprende los siguientes pasos: a) Inmunización de un animal con el antígeno quimérico del primer aspecto la secuencia de nucleótidos de acuerdo con el segundo aspecto, o plásmido de acuerdo con el tercer aspecto, o al menos un péptido asilado de acuerdo con el quinto aspecto de la invención, o la composición de acuerdo con el sexto aspecto; b) Aislar y purificar los anticuerpos específicos frente bacterias pertenecientes a la familia Anaplasmataceae en un sujeto, preferiblemente pertenecientes al género Anaplasma, más preferiblemente A. phagocytophilum, a partir de una muestra aislada del animal de la etapa a). c) Opcionalmente humanizar los anticuerpos de la etapa b) para su uso como medicamento, preferiblemente para el tratamiento y/o prevención de infecciones causadas por bacterias pertenecientes a la familia Anaplasmataceae en un sujeto, preferiblemente pertenecientes al género Anaplasma, más preferiblemente A. phagocytophilum.

La muestra de la etapa b) es una muestra de fluido biológico. Preferiblemente la muestra de fluido biológico puede sangre completa, suero o plasma.

El aislamiento y purificación de la etapa b) mediante un método conocido por una persona experta en la materia tales como métodos cromatográficos o por afinidad.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Producción de las proteínas recombinantes. Se realizó un western blot con anticuerpos IgG de conejos inmunizados con el antígeno quimérico recombinante para confirmar el tamaño de los antígenos quiméricos MSP4. SEQ ID NO: 1 , el antígeno quimérico que contenía los epítopos o regiones que mostraron protección contra A. phagocytophilum en conejos y mostró un peso molecular de 69KDa. El recuadro indica la posición de los antígenos recombinantes.

Figura 2. Reconocimiento de la proteína quimérica por anticuerpos producidos en ovejas previamente inmunizadas con dicha proteína. Muestras equivalentes a 10 pg de proteínas totales se cargaron en un gel de poliacrilamida al 12%. Para el análisis de Western-blot, las proteínas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa, expuestas a anticuerpos de oveja contra la proteína quimérica de MSP4 y reveladas con el conjugado anti-oveja acoplado a peroxidasa de rábano. La posición de la proteína quimérica recombinante se indica con una caja. En la electroforesis de proteínas se usó como marcador de peso molecular Spectra (Thermo Fisher Scientific)

Figura 3. Ensayo de inhibición de anticuerpos. Papel de los anticuerpos contra las proteínas recombinantes quiméricas de ovejas inmunizadas en la inhibición de la infección por A. phagocytophilum de las células HL60 e ISE6. Dichos anticuerpos se compararon con la capacidad protectora de las IgGs de ovejas inmunizadas con el nuevo antígeno quimérico de MSP4 objeto de esta patente (SEQ ID NO: 1 ) obtenido a partir del análisis del microarray MSP4. Como control negativo se utilizó SEQ ID NO: 6. Los niveles de infección se determinaron mediante la PCR en tiempo real de MSP4, normalizándose frente a la β-actina humana para las células HL60 y frente a la rpS4 de la garrapata para las células ISE6. Los resultados se compararon entre los grupos tratados con anticuerpos preinmunes/control y con proteínas recombinantes mediante la prueba t de Student con varianza desigual (*P < 0,05; N = 3 réplicas por tratamiento). Péptido (+): proteína de fusión que comprende antígeno quimérico con secuencia SEQ ID NO: 1 . Péptido (-): proteína de fusión que comprende el péptido no inmunogénico con secuencia SEQ ID NO: 6.

EJEMPLOS

A continuación, se ¡lustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del producto de la invención.

Ejemplo 1. Microarray de unión de anticuerpos IgG a epítopos de MSP4 y análisis de datos. El microarray contenía péptidos de la proteína MSP4 alargados con enlazadores neutros GSGSGSG en los extremos C y N terminal y traducidos en 282 péptidos diferentes de 15 aa superpuestos e impresos por duplicado (564 puntos de péptidos en cada copia del array). Se agruparon los sueros de un ensayo de vacunación con MSP4 anterior (n=3) que se juntaron para cada grupo y se utilizaron para identificar regiones protectoras o epítopos candidatos en el MSP4 de dicho patógeno. Se realizó un mapeo de epítopos de alta resolución de la proteína MSP4 de A. phagocytophilum (PEPperCHIP® Immunoassay, PEPperPRINT, Alemania). El microarray de péptidos se montó en una bandeja de incubación y se bloqueó con 1% (p/v) de albúmina de suero bovino (BSA) en 1 X PBS 7.4 con 0,005% (v/v) de Tween-20 (PBST) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavarla con PBST tres veces, la matriz se incubó con los sueros durante la noche a 4 ^ο C. Al día siguiente, se lavó de nuevo y se incubó el array con un anticuerpo anti-lgG de conejo (H+L)-Alexa Fluor 532nm (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) y un anticuerpo anti-lgG de oveja (H+L)-Cy3 (Sigma- Aldrich), durante 45 minutos a temperatura ambiente. El array se lavó, se desmontó de la bandeja y se secó con centrifugación durante 1 min a 2000 rpm. El array resultante se escaneó con un escáner de microarrays GenePix personal 4100a (Molecular Devices). La mediana de la intensidad de la señal fluorescente de cada punto se extrajo utilizando el software MAPIX (Molecular Devices). Los epítopos protectores fueron reconocidos por las IgG de sueros de conejos y corderos previamente vacunados con la proteína recombinante MSP4 utilizando este método.

Para el análisis de los datos, se consideró la intensidad de la señal de fluorescencia bruta que correspondía a la mediana de la intensidad de la señal restada por la mediana de la intensidad de fondo de cada spot y luego se hizo el promedio entre los spots duplicados. Los epítopos se definieron como aminoácidos centrales compartidos por péptidos superpuestos con intensidades de señal superiores a un umbral de 150 unidades luminosas relativas (RLU) y se utilizaron para construir dos antígenos quiméricos de MSP4 para el control de la anaplasmosis, uno de ellos contenía 4 péptidos que mostraron protección contra el patógeno en conejos (SEQ ID NO: 1 ) y el otro contenía la región no protectora encontrada en corderos inmunizados con MSP4 (SEQ ID NO: 6 ) y se usó como control negativo.

Ejemplo 2. Producción y caracterización del antígeno quimérico recombinante.

Las secuencias codificantes de los nuevos antígenos quiméricos protectores candidatos se amplificaron a partir de genes sintéticos optimizados para el uso de codones en Escherichia coli (Genscript Corporation, Piscataway, NJ, EE.UU.) con cebadores específicos para la secuencia, utilizando para su expresión el sistema de expresión en membrana basado en la quimera MSP1 a, previamente reportado en ES2352946B1 . La E. coli recombinante BL21 previamente transformada con el plásmido que contiene la secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 (plásmido con secuencia SEQ ID NO: 10) se propagó en frascos de 1 L que contenían 250 mi de caldo Luria-Bertani (LB) suplementado con 10 g de triptonel- 1 , 5 g de extracto de levadura 1-1 , 10 g de NaCI 1-1 , 50 μg/ml de ampicilina y 0,4% de glucosa (Laboratorios CONDA S.A., Madrid, España) durante 2 h a 37°C y 200 rpm y después durante 5,0 h tras la adición de 0,5 mM de concentración final de isopropil-B-D-tiogalactopiranósido (IPTG) para la inducción de la expresión de la proteína recombinante. El crecimiento celular se monitorizó midiendo la densidad óptica (DO) a 600 nm. Las células se colectaron por centrifugación a 3900 x g durante 15 minutos a 4°C y, a continuación, se resuspendió 1 g de pellet celular en 5 mi de tampón de disrupción (100 mM Tris-HCI, pH 7,5,150 mM NaCI, 1 mM PMSF, 5 mM MgCI2-6H2O y 0,1% (v/v) TritonX-100) y se disolvió utilizando un sonicador celular (Modelo MS73; Bandelin Sonopuls, Berlín, Alemania). Después de la disrupción, las fracciones de proteínas insolubles y solubles que contenían los antígenos de la quimera MSP1 a unidos a la membrana se recogieron por centrifugación a 21 .500 x g durante 15 minutos a 4°C y se almacenaron a -20°C hasta que se utilizaron para la caracterización y las formulaciones de la vacuna. La concentración de proteínas se determinó mediante ensayo con ácido bicinconínico (BCA) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Para la expresión y caracterización de la proteína quimérica recombinante, se realizó un western blot. Se cargaron diez microgramos de cada proteína recombinante en un gel pre-hecho de SDS-poliachlamida al 12% (Life Science, Hercules, CA, USA) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. En la electroforesis de proteínas se usó como marcador de peso molecular Spectra (Thermo Fisher Scientific). La membrana se bloqueó con albúmina de suero bovino (BSA) al 5% (Sigma-Aldrich, St. Louis, Ml, EE.UU.) durante 2 horas a temperatura ambiente (RT) y se lavó tres veces con TBS (50 mM Tris-CI, pH 7,5, 150 mM NaCI, 0,5% Tween 20). Se utilizaron IgG purificadas de conejos inmunizados con MSP1 a a una dilución de 1 :500 en TBS, y la membrana se incubó durante la noche a 4 ^ο C y se lavó cuatro veces con TBS al día siguiente. A continuación, se incubó la membrana con un conjugado anti-lgG-conejo-peroxidasa (HRP) (Sigma-Aldrich) diluido 1 :1.000 en TBS con 3% de BSA. La membrana se lavó cuatro veces con TBS y finalmente se reveló con TMB (3,3', 5,5'- tetrametilbencidina) sustrato estabilizado para HRP (Promega, Madrid, España) según las recomendaciones del fabricante.

El peso molecular de la proteína quimérica fusionada a MSP1 a se estimó entre 65 y 70 kDa por SDS-PAGE (Fig. 1 ). Este valor estuvo en concordancia con la estimación teórica de 69 kDa, de los cuales, y 12 kDa corresponden al antígeno quimérico objeto de la invención y los kDa restantes corresponden a MSP1 a.

Ejemplo 3. Formulación de la vacuna e inmunización de las ovejas.

Para la formulación de la vacuna se adyuvaron las proteínas recombinantes en Montanide ISA 50 V2 (Seppic, París, Francia), hasta una concentración proteica final de 100 μg/ml.

Por un lado, se formuló una vacuna con la proteína de fusión con la secuencia SEQ ID NO: 8 la cual corresponde a un polipéptido o proteína de fusión que comprende el antígeno quimérico conformado por los fragmentos o péptidos antigénicos de MSP4 (SEQ ID NO: 1 ), fusionado al fragmento de la proteína MSP1 a (SEQ ID NO: 7).

Por otro lado, se formuló una vacuna con una proteína de fusión con una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 1 , la cual corresponde a un polipéptido o proteína de fusión que comprende el antígeno quimérico que comprende el péptido de secuencia SEQ ID NO: 6, fusionado al fragmento de la proteína MSP1 a (SEQ ID NO: 7).

SEQ ID NO: 1 1 :

La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 11 corresponde a una proteína de fusión que comprende un péptido no inmunógeno de MSP4 fusionado, por medio del extremo N- terminal, al fragmento de MSP1 a (secuencia SEQ ID NO: 6 + SEQ ID NO: 7).

De manera que las proteínas quiméricas de ambas formulaciones de vacunas comprendían la secuencia SEQ ID NO: 7, diferenciándose en la secuencia SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 6.

Se formaron dos grupos de 3 ovejas con un peso vivo similar, uno de los grupos fue inmunizado con el antígeno quimérico protector que contenía los epítopos reconocidos por las IgG de los conejos inmunizados con MSP4 (SEQ ID NO: 1 ) el otro grupo de las ovejas fue inmunizado con el péptido reconocido por las IgG no protectoras de los corderos inmunizados previamente con MSP4 (SEQ ID NO: 6). Las ovejas de cada grupo fueron inyectadas por vía subcutánea con 100 pg de los antígenos en la piel suelta de la axila (sobaco) utilizando una jeringa estéril con aguja extraíble 20G x 1" (9,0 x 25mm) y tomando precauciones asépticas. Las ovejas fueron inmunizadas tres veces en los días 0, 20 y 55 y se tomaron muestras de sangre de la vena yugular de cada oveja antes de cada inmunización.

Los sueros de las ovejas inmunizadas con la proteína quimérica recombinante con la secuencia SEQ ID NO:1 reconocieron a la proteína fusionada (antígeno quimérico de MSP4-fragmento de MSP1 a) mediante Western-blot (Fig. 2). Estos resultados indicaron que los epítopos protectores identificados en conejo mantuvieron su antigenicidad en las ovejas inmunizadas con la proteína quimérica.

Ejemplo 4. Ensayo de inhibición de anticuerpos.

Las muestras se prepararon a partir del cultivo de la línea celular de garrapata de Ixodes scapularis ISE6 en medio L15B300 y las células promielocíticas humanas HL-60 se cultivaron en medio RPMI1640 suplementado con 10% de suero fetal de ternera inactivado por calor, 2 mM de L-glutamina y 25 mM de tampón Hepes a 36, 5C con 5% de CO2 (3 repeticiones cada una). La determinación del efecto inhibidor de los anticuerpos IgG de corderos y conejos inmunizados (las IgG proceden del estudio anterior Contreras M., et al. 2017. Front. Cell. Infect. Microbiol. 7:307) y de ovejas inmunizadas con el antígeno quimérico protector y el péptido control negativo 15 días después de la tercera inmunización se llevó a cabo utilizando IgG purificadas a partir de los sueros mediante el kit de centrifugación de NAb Protein G (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Como control se utilizó también anticuerpos IgG de oveja procedentes de sueros preinmunizados. Se agruparon células ISE6 y se utilizaron para sembrar placas de 24 pocilios y cada pocilio recibió 1 x 106 células 48 h antes de la inoculación con el aislado humano NY18 de A. phagocytophilum. Las IgG purificadas de conejo o de oveja (2 mg/ml) se mezclaron con el inoculo (1 :1 ) durante 60 min antes de colocarlas en las monocapas celulares. Cada monocapa recibió entonces 100pl del inoculo más la mezcla de IgG y las placas se incubaron a 34°C durante 30min. El inoculo se retiró de los pocilios y las monocapas celulares se lavaron tres veces con PBS. Se añadió medio completo (1 ml) a cada pocilio y las placas se incubaron a 34°C. El control de cada ensayo incluyó un inoculo incubado con IgG preinmune de conejo u oveja. Al cabo de 7 días, se recuperaron las células de todos los pocilios y se congelaron a -80°C hasta la detección de A. phagocytophilum por PCR tras la extracción de ADN con TriReagent (Sigma-Aldrich) según las recomendaciones del fabricante. Los niveles de infección por A. phagocytophilum se determinaron mediante la PCR en tiempo real de la proteína principal de superficie 4 (msp4), como se ha descrito previamente (Contreras M., et al. 2017. Front. Cell. Infect. Microbiol. 7:307). Los resultados se compararon entre tratamientos mediante la prueba t de student con varianza desigual (P = 0,05; N = 3 réplicas biológicas).

Mientras que los anticuerpos IgG de conejo contra la proteína recombinante MSP4 de A. phagocytophilum inhibieron la infección por el patógeno de las células HL60 e ISE6 como en estudios anteriores, las IgG de ovejas inmunizadas con el péptido quimérico protector objeto de esta invención (SEQ ID NO: 1 , péptido (+)) afectan a la infección por el patógeno, pero las IgG de ovejas inmunizadas con el péptido SEQ ID NO: 6 (péptido (-)) y las IgG de corderos inmunizados con MSP4 del estudio anterior no protegieron contra la infección por A. phagocytophilum (Fig. 3).

Estos resultados evidenciaron diferencias en la respuesta de las IgG entre los conejos y los corderos inmunizados y proporcionaron apoyo a que el diseño del nuevo antígeno quimérico protector mejora la capacidad protectora del antígeno MSP4.