以下、本発明を詳細に説明するため実施� ��を挙げるが、本発明は実施例に限定される� ��のではない。

 実施例1 活性化血管内皮細胞結合ファージ� ��スクリーニング
 <方法>
 1.腫瘍細胞培養上清の調製
 ヒト肝癌細胞株HuH-7を、5%ウシ胎児血清を含 むDMEM培地7mlに希釈し、25cm2培養フラスコに入 れて37℃、5%CO2存在下で24時間培養を行った。 細胞密度は、約70%コンフルエントの状態で培 養を行った。培養液を回収し、1000rpm、5分間� ��心して上清を回収した。回収した培養上清� ��使用時まで-30℃で保存した。

 2.活性化正常ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の� ��製
 ファージライブラリースクリーニングに用� ��る正常ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)(Cambrex Bi o Science社)は、あらかじめ2%ウシ胎児血清を� �むEBM-2培地(Cambrex Bio Science社、増殖因子含� �)中で1x104/ml、1ml/ウェルの密度で12ウェルプ� �ートに播種し、48時間培養を行った。PBSで3� �洗浄し、一方のウェルには上記で調製したHu H-7肝癌細胞培養上清0.5mlおよびEBM-2培地(増殖� ��子不含)0.5mlを、他方のウェルには5%FCSを含� �DMEM培地0.5mlおよびEBM-2培地(増殖因子不含)0.5m lを添加して、24時間培養を行った。HuH-7肝癌� ��胞培養上清を添加して培養した細胞を「HuH- 7上清培養HUVEC」、DMEM培地を添加して培養し� �細胞を「DMEM培養HUVEC」として以下のスクリ� �ニングに使用した。

 3.ファージライブラリーからのスクリーニ� �グ
 ファージペプチドライブラリーとしては、1 5merまたは12merのランダムアミノ酸配列をファ ージpIII蛋白の融合蛋白として呈示するM13系� �ァージライブラリーを使用した。上記2で調� ��したDMEM培養HUVECをPBSで3回洗浄し、1.2x1010TU(t ransformingunit)のファージを含む0.1%のウシ血清� ��ルブミン(BSA)/リン酸生理緩衝液(PBS)1mlを添� �して室温で30分間反応を行った。反応液(結� �しなかったファージ)を回収し、今度は上記2 で調製したHuH-7上清培養HUVEC(あらかじめPBSで3 回洗浄)に添加して、室温で30分間反応を行っ た。反応後の細胞はPBSで3回洗浄後、0.5mlの酸 性の溶離液(0.1%BSAを含有する0.1Mグリシン塩酸 pH2.4)を添加して1分間反応を行い、結合した� �ァージを解離させた。溶離液を回収し1200rpm5 分間遠心を行って上清を回収し、125μlの1Mト� ��ス塩酸(pH8.0)を添加して中和した。この溶液 を、DMEM培養HUVEC(あらかじめPBSで3回洗浄)に添 加し、室温で30分間反応後上清を回収するこ� ��で、HuH-7上清培養HUVECに選択的に結合するフ ァージを得た。

 得られたファージ溶液を対数増殖期の大� ��菌に感染し、培養を行うことでファージの� ��幅を行った。培養液中に産生されたファー� ��をPEG/NaCl溶液(2.5M塩化ナトリウムを含有する 20%PEG8000)添加により沈殿させて遠心回収する� ��とで、ファージの精製を行った。

 上述の一連の操作によるHuH-7上清培養HUVEC 結合性ファージの単離および大腸菌感染によ る増幅を1サイクルとして、計3サイクルのス� ��リーニングを行った。3サイクル後のファー ジ回収液を、LB-agarプレートにまき、37℃終夜 培養後に得られたコロニー(シングルクロー� �)から数十個をランダムに選んで個別に培養� ��、上清のファージを上述のPEG/NaCl沈殿法で� �製することで、精製ファージクローンを得� �。

 4.Cell ELISA法によるファージクローンの細胞 結合性の解析
 HUVECを2%ウシ胎児血清を含むEBM-2培地中96ウ� �ルプラスチックプレートに3x10 ⁴ /mlの密度で0.1ml播種し、37℃で24時間培養し、 150μlPBSで洗浄後、活性化HUVEC調製ウェルにはH uH-7肝癌細胞培養上清0.05mlおよびEBM-2培地(増� �因子不含)0.05mlを、非活性化HUVEC調製ウェル� �は5%FCSを含むDMEM培地0.05mlおよびEBM-2培地(増� �因子不含)0.05mlを添加して37℃で24時間培養を 行った。細胞をPBSで洗浄後、0.1%BSAを含むPBS� �50倍に希釈したファージクローンを添加し、 室温で30分間反応を行った。反応後の細胞を1 50μlのPBSで3回洗浄し、0.5%パラホルムアルデ� �ドを含むPBS50μlを添加して室温で30分間固定� ��反応を行った。0.05%Tween20を含むPBSで3回洗浄 した後、0.1%BSAを含むPBSで5000倍に希釈したHRP� ��識抗M13ファージ抗体(アマシャム社)50μlを添 加し、室温で60分間反応させた。0.05%Tween20を� ��むPBSで3回洗浄した後、HRP酵素基質(0.2μl/ml� �酸化水素水および0.08mg/mlテトラメチルベン� �ジンを含む酢酸クエン酸緩衝液pH4.5)100μlを� �加し、室温で3~5分間反応させた後、1N硫酸50� �lを添加して反応を停止させた。マイクロプ� ��ートリーダーを用いて450nm(対象波長595nm)の� ��光度を測定した
 <結果>
 各ファージクローンの吸光度測定結果を図1 に示す。吸光度が大きいほど、HUVECへの結合� ��が高いことを示す。50クローンのうちの半� �以上のクローンが、非活性化HUVEC(図中、DMEM� ��地添加)に対する結合と比較して、活性化HUV EC(図中、HuH-7培養上清添加)への結合性が高い ことが認められた。

 5.ファージクローンの配列解析
 実施例1-1~4のスクリーニングを数回繰り返� �て実施し活性化HUVECへの高い結合性が認めら れた計68種のクローンを選択し、大腸菌に感� ��増幅させた後に、ファージpIII蛋白のランダ ムペプチド配列を含む領域の塩基配列を解析 することで、呈示するペプチド配列を決定し た。

 <結果>
 配列番号1~14および22~75に示す計68種類のペ� �チド配列が得られた(表1)。

 実施例2 共焦点蛍光顕微鏡によるHUVECへの� �ァージ結合の確認
 <方法>
 HUVECを2%ウシ胎児血清を含むEBM-2培地中96ウ� �ルガラスボトムプレート(あらかじめコラー� ��ン溶液を添加、洗浄してコーティングを行� ��たプレート)に3x10 ⁴ /mlの密度で0.1ml播種し、37℃で24時間培養し、 150μlPBS洗浄後、活性化HUVEC調製ウェルにはHuH- 7肝癌細胞培養上清0.05mlおよびEBM-2培地(増殖� �子不含)0.05mlを、非活性化HUVEC調製ウェルに� �5%FCSを含むDMEM培地0.05mlおよびEBM-2培地(増殖� �子不含)0.05mlを添加して37℃で24時間培養を行 った。使用する細胞をPBSで洗浄後、0.1%BSAを� �むPBSで希釈したファージクローン(ファージ� ��約2x10 ⁹ TU/ml)を添加し、室温で30分間反応を行った。� ��応後の細胞を150μlのPBSで3回洗浄後、4%パラ� ��ルムアルデヒドを含むPBS100μlを添加して37� �で10分間固定化反応を行った。PBSで3回洗浄� �た後、0.2%TritonX-100を含有するPBS100μlを添加� �て室温30分間反応させ、さらにPBSで3回洗浄� �、0.1%BSAを含むPBS100μlを添加して10分間ブロ� �キング反応を行った。PBSで3回洗浄後、0.1%BSA /PBSで1000倍希釈した抗M13ファージ抗体(アマシ ャム社、マウスモノクローナル抗体)100μl、0. 1%BSA/PBSで2000倍希釈したフルオレセイン標識� �マウスIgG抗体(ザイメッド社)100μl、0.1%BSA/PBS� ��1000倍希釈したAlexa488標識抗フルオレセイン� ��体(モレキュラープローブ社)50μlを、順次室 温でそれぞれ30分間、30分間、15分間反応させ た。各反応後は、細胞を150μlPBSで3回洗浄し� �。最終反応後の細胞を共焦点レーザー蛍光� �微鏡(オリンパスFV1000)で観察し、活性化HUVEC� ��非活性化HUVECそれぞれに結合したファージ� �由来する輝点の数を比較することで、細胞� �合性を評価した。

 <結果>
 活性化HUVEC、非活性化HUVECに結合したファー ジを蛍光標識抗体で染色し、共焦点蛍光顕微 鏡で観察することにより、各ファージクロー ンのそれぞれの細胞への結合性をスコアリン グした結果を表2に示す。また代表的な結果� �して、クローン6の共焦点蛍光顕微鏡写真を� ��2に示す。多くのクローンにおいて、活性化 HUVECに特異的な結合が観察された。

 実施例3 ペプチドの合成と高分子複合体の� ��製
 実施例1で決定した塩基配列を持つペプチド を、Fmoc固相合成法により化学合成した。細� �への結合取込評価の指標となるよう、各ペ� �チドのアミノ末端には蛍光色素フルオレセ� �ンを結合した。また、各ペプチドのカルボ� �シル末端には、下記の高分子複合体を作製� �るための官能基としてチオール基を導入す� �目的でシステイン残基を付加した配列で合� �した。

 各ペプチドは、薬物キャリアとしての細� ��への結合取込機能を評価するため、以下の( 1)、(2)の方法により、蛍光標識ペプチド-高分 子複合体を作製した。

 (1)ペプチド-マルチアームPEG複合体の作製
 1分子あたり4個のマレイミド基を有するPEG(� ��本油脂製マルチアームPEG、SUNBRIGHT PTE-200MA)� ��2mMの濃度でDMSOに溶解し、この溶液20μlと等� ��(20μl)の10mMフルオレセイン標識ペプチドDMSO� ��液を混合して、室温で2時間反応させた。PBS 60μlを添加して総量を100μlに希釈した後、あ� ��かじめ500μlのPBSで3回洗浄して平衡化したス ピンカラム(バイオラッド社マイクロバイオ� �ピンカラム30)を用いて脱塩処理し、未結合� �ペプチドを分離除去し、ペプチド-マルチア� ��ムPEG複合体を得た。

 (2)ペプチド-ウシ血清アルブミン(BSA)複合体� ��作製
 20mgのBSAを1mlの50mM炭酸水素ナトリウム溶液� �溶解して、0.3mM溶液を作製した。この溶液全 量(1ml)に、PEG鎖スペーサーを有する2価性架橋 試薬であるNHS-PEO12-マレイミド(ピアス社製カ� ��ログNo.22112)の250mM溶液20μl(最終濃度5mM)を加� ��て室温で1時間反応させた。反応後の溶液100 μlを、あらかじめ500μlの0.1Mリン酸ナトリウ� �緩衝液(pH7.0)で3回線乗して平衡化したスピン カラム(バイオラッド社マイクロバイオスピ� �カラム30)を用いて脱塩処理し、未反応の架� �試薬を分離除去した。脱塩後の溶液50μlを等 量の0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)と混合� ��て希釈し、得られた溶液100μlに、フルオレ� ��イン標識ペプチドDMSO溶液10μlを添加して室� ��で1時間反応させた。反応後の溶液全量を、 あらかじめ500μlのPBSで3回洗浄して平衡化し� �スピンカラム(バイオラッド社マイクロバイ� ��スピンカラム30)を用いて脱塩処理すること� ��、未結合のペプチドを分離除去し、ペプチ� ��-BSA複合体溶液を得た。

 実施例4 蛍光標識ペプチド-PEG複合体の内皮 細胞への取込(定量解析)
 <方法>
 96ウェルマイクロプレート(ガラスボトムプ� ��ート、Nunc社No.164588)をあらかじめ1%酸性コラ ーゲン溶液100μlで10分間処理し、PBS120μlで1回 洗浄後、1x10 ⁵ 個/mlのHUVEC細胞100μlを播種して37℃5%CO2条件下 で2日間培養を行った。使用時に、細胞を150μ lの培地(2%ウシ胎児血清を含むEBM-2培地(Cambrex� �Bio Science社、増殖因子含有)で1回洗浄し、同 じ培地50μlと、実施例3(1)で調製したペプチド -マルチアームPEG複合体(配列番号12、13、16(配 列番号14の部分配列)、77)を培地で希釈してペ プチド濃度20μMとした溶液50μlを順次添加し� �、37℃5%CO2条件下で8時間培養を行った。(細� �と反応時のペプチド濃度10μM。)培養後の細� �をHBSS(+)緩衝液150μlで3回洗浄して未結合のペ プチド-マルチアームPEG複合体を除去した後� �1%SDSを含有するHBSS(+)100μlを加えて細胞に結� �または取り込まれたペプチドを抽出した。� �出液を別の96ウェルマイクロプレート(黒色� �レート)に写し、蛍光光度計を用いて励起波� ��490nm、検出波長530nmでの蛍光を測定した。添 加したそれぞれのペプチド-マルチアームPEG� �合体の蛍光強度を100%として、細胞から回収� ��れた蛍光量から細胞へのペプチド取込量(%)� ��計算した。

 <結果>
 各ペプチド-マルチアームPEG複合体の回収率 を表3に示す。ネガティブコントロールであ� �ランダム配列ペプチド(配列番号77)と比較し� ��、本発明の3種のペプチド(配列番号12、13、1 6)はいずれも高い回収率を示した。

 実施例5 蛍光標識したペプチド-BSA複合体の 内皮細胞への取込(定量解析)
 <方法>
 96ウェルマイクロプレート(Corning社No.3595)に1 x10 ⁵ 個/mlのHUVEC細胞100μlを播種し、37℃5%CO2条件下 で2日間培養を行った。使用時に、細胞を150μ lの培地(2%ウシ胎児血清を含むEBM-2培地(Cambrex� �Bio Science社、増殖因子含有)で1回洗浄し、同 じ培地50μlと、実施例3(2)で調製したペプチド -BSA複合体(配列番号12、13、16、77)を培地で希� ��してペプチド濃度20μMとした溶液50μlを順次 添加して、37℃5%CO2条件下で8時間培養を行っ� ��(細胞と反応時のペプチド濃度10μM。)。反応 後の細胞に結合または取り込まれたペプチド -BSA複合体の回収および蛍光定量を、実施例3� ��同じ方法で行った。

 <結果>
 各ペプチド-BSA複合体の回収率を表4に示す� �ネガティブコントロールのランダム配列ペ� �チド(配列番号77)と比較して、本発明の3種の ペプチド(配列番号12、13、16)はいずれも高い� ��収率を示した。

 実施例6 蛍光標識したペプチド-BSA複合体の 内皮細胞(HUVEC)およびHeLa細胞への取込(画像解 析)
 <方法>
 96ウェルマイクロプレート(ガラスボトムプ� ��ート、Nunc社No.164588)をあらかじめ1%酸性コラ ーゲン溶液100μlで10分間処理し、PBS120μlで1回 洗浄後、1x10 ⁵ 個/mlのHUVEC細胞100μlを播種して37℃5%CO2条件下 で2日間培養を行った。使用時に、細胞を150μ lの培地(2%ウシ胎児血清を含むEBM-2培地(Cambrex� �Bio Science社、増殖因子含有)で1回洗浄し、同 じ培地50μlと、実施例3(2)で調製したペプチド -BSA複合体(配列番号12、13、16、77)を培地で希� ��してペプチド濃度20μMとした溶液50μlを順次 添加して、37℃5%CO2条件下で8時間培養を行っ� ��(細胞と反応時のペプチド濃度10μM。)。反応 後の細胞を、共焦点レーザー顕微鏡(オリン� �ス社FV1000)を用いて観察した。

 <結果>
 各ペプチド-BSA複合体を反応させた細胞の共 焦点レーザー顕微鏡画像を図3に示す。HUVEC細 胞については、本発明の3種のペプチド(配列� ��号12,13,16)はいずれも細胞内に明るい輝点が� ��数観察され、細胞内にペプチドが取り込ま� ��ていることが示された。ネガティブコント� ��ールのランダム配列ペプチド(配列番号77)は 、細胞内のペプチドは全く観察されなかった 。

 一方、内皮細胞以外の比較細胞として用� ��たHeLaの場合には、配列番号12,13,16で表され� ��本発明のペプチドとともに、HUVECへの取り� �みと比較してごく少量のペプチドしか細胞� �に観察されず、取り込みが内皮細胞特異的� �あることが示された。

 実施例7 蛍光標識したペプチド-マルチアー ムPEG複合体の内皮細胞への取込(画像解析ス� �アリング)
 <方法>
 96ウェルマイクロプレート(ガラスボトムプ� ��ート、Nunc社No.164588)をあらかじめ1%酸性コラ ーゲン溶液100μlで10分間処理し、PBS120μlで1回 洗浄後、1x10 ⁵ 個/mlのHUVEC細胞100μlを播種して37℃5%CO2条件下 で2日間培養を行った。使用時に、細胞を150μ lの培地(2%ウシ胎児血清を含むEBM-2培地(Cambrex� �Bio Science社、増殖因子含有)で1回洗浄し、同 じ培地50μlと、実施例3(1)で調製したマルチア ームPEG-ペプチド複合体(配列番号12のペプチ� �とその部分ペプチド(配列番号17、18、19)、配 列番号13のペプチドとその部分ペプチド(配列 番号15、20、21)、ランダム配列ペプチド(配列� ��号77))を培地で希釈してペプチド濃度32μMと� ��た溶液50μlを順次添加して、37℃5%CO2条件下� ��8時間培養を行った(細胞と反応時のペプチ� �濃度16μM。)。反応後の細胞を、共焦点レー� �ー顕微鏡(オリンパス社FV1000)を用いて観察し た。細胞内に認められるペプチド由来の蛍光 輝点の量を以下の通りスコアリングした。

 スコア0: 細胞内の蛍光輝点は認められない
 スコア1: 細胞内に、かすかな蛍光輝点が認 められる
 スコア2: 細胞内に、スコア1よりも明瞭な� �光輝点が認められる
 スコア3: 細胞内に、スコア2よりもさらに� �るい蛍光輝点が多数見られる。

 <結果>
 スコアリングの結果を表5に示す。配列番号 12のペプチド由来の部分ペプチド(配列番号17, 18,19)は、もとの配列番号12のペプチドよりも� ��いながらもいずれも細胞内の蛍光が認めら� ��、細胞内への取り込みが確認された。配列� ��号13のペプチド由来の部分ペプチド(配列番� ��15、20、21)もいずれも細胞内の蛍光が認めら れ、細胞内への取り込みが確認された。特に 配列番号13のペプチドの12merペプチドの5-12ア� ��ノ酸残基に相当するペプチド(配列番号15)は 、配列番号13のペプチドと同等の蛍光が認め� ��れた。

 一方、ネガティブコントロールのランダ� ��配列ペプチド(配列番号77)は、細胞内の蛍光 は全く観察されなかった。

 実施例8 蛍光標識したペプチド-マルチアー ムPEG複合体の腫瘍への集積評価
 <方法>
 8週齢のBALB/cマウス(雄)(日本SLCより購入)に� �PBSに懸濁したマウス大腸癌細胞(colon26細胞)� �1.5×10 ⁶ 個/匹で皮下移植した。1ヵ月後、腫瘍直径が� ��1.5cmになった状態で、実施例3(1)で調製した� ��ルチアームPEG-ペプチド(配列番号12および13) 複合体のPBS懸濁液200uLを尾静脈投与した。投� ��24時間後、マウスを安楽死させ、腫瘍塊を� �出した。摘出した腫瘍隗はOCTコンパウンド(� ��クラファインテック社)を用いて包埋し凍結 ブロックを作製した。この凍結ブロックから クリオスタット(ブライト社製)を用いて腫瘍� ��織の凍結切片を作製した。得られた組織切� ��は冷風で1時間風乾した。この組織切片をPBS で洗浄しOCTコンパウンドを除去した後、アセ トンに5分間浸漬することで固定処理を行っ� �。固定処理後、10%牛胎児血清を含むPBSを室� �で30分間作用させることでブロッキング処理 を行った。ここにペプチドに修飾されている 蛍光色素フルオレセインに対する抗体(anti-flu orescein/Oregon Green rabbit IgG fraction Alexa Fluor� �488 conjugate、Molecular Probes社)と血管内皮細胞 に発現していることが知られている表面抗原 CD31に対する抗体(Biotinanti-mouse CD31、BD Pharming en社)を100倍の希釈率で作用させ室温で2時間� �ンキュベーションすることで1次抗体反応を� ��った。反応終了後、PBSで洗浄を行い、続い� ��それぞれの1次抗体に対する蛍光標識抗体(Al exa Fluor 488 conjugate goat anti-rabbitIgG、Molecular  Probes社と、Streptavidin Alexa Fluor 594 conjugate� ��Invitrogen社)を作用させることで2次抗体反応� ��行った。2次抗体反応終了後、PBSで十分に洗 浄を行いカバーガラスにて封入し、蛍光顕微 鏡(IX-70、オリンパス社製)を用いて観察を行� �ペプチドの腫瘍組織への集積を評価した。

 <結果>
 蛍光顕微鏡による観察像を図4に示す。観察 の結果、腫瘍組織内にペプチドに由来する蛍 光が観察され、静脈内投与した蛍光標識ペプ チド-PEG複合体が腫瘍部に集積することが示� �れた。また、ペプチド由来の蛍光の位置とCD 31で染色される位置が一致したことより、蛍� ��標識したペプチド-マルチアームPEG複合体は 腫瘍組織内の血管部位に局在していることが 示された。

 実施例9 ドキソルビシンを内封したペプチ� ��修飾リポソームの調製
<方法>
 水素化大豆ホスファチジルコリン(10mg)、コ� ��ステロール(3.4mg)、ジステアロイルホスファ チジルエタノールアミン-ポリエチレングリ� �ール5000(3.5mg)、ジステアロイルホスファチジ ルエタノールアミン-ポリエチレングリコー� �5000-マレイミド(3.1mg)をクロロフォルムに溶� �させ、エバポレータを用いてフラスコ内で� �媒を除去し薄膜を形成させた。このものに� �250mMアンモニウム硫酸水溶液1.7mLを添加し、6 5℃で過熱した。得られたベシクルを、ポア� �イズ1.0μm、0.4μm、0.2μmの多孔膜を順次用い� �エクストルーダーで整粒した。調製した粒� �約200nmのリポソームに、リモートローディン グ法によりドキソルビシンを封入した。カラ ムにより未封入ドキソルビシンを除いた後、 マレイミドに対して1/5量にあたるペプチド(� �列番号12、13、76(配列番号7の部分配列)、78)� �それぞれ添加し、各種ペプチドが導入され� �リポソームを調製した。未反応のマレイミ� �は、3倍量の2-メルカプトエタノール添加し� �活化した。

 実施例10 ドキソルビシンを内封したペプチ ド修飾リポソームのHUVECへの取り込み(定量解 析)
<方法>
24ウェルプレートで培養した50-60%コンフルエ� ��トの正常ヒト臍帯静脈内皮細胞について、� ��地を交換後、培地の半量のドキソルビシン� ��封ペプチド修飾リポソーム分散液を添加し� ��。6時間後リン酸緩衝液で洗浄後、トリプシ ン処理し、遠心操作で細胞を回収した。細胞 ペレットに10%Triton X-100を50μL添加し、細胞及 びドキソルビシン内封ペプチドリポソームを 溶解させた後、0.75MHClを10%加えたイソプロパ� ��ールを350μL添加し、一晩-20℃で静置した。� ��心操作後上澄みをODSカラムで分析し細胞に� ��り込まれたドキソルビシンを定量した。
<結果>
結果を図5に示す。配列番号12、13、76を導入� �たリポソームでは、ランダム配列(配列番号7 8)のペプチドを導入したリポソームおよびペ� ��チドを導入していないリポソームと比較し� ��、ドキソルビシンの取り込み量が顕著に上� ��した。特に、配列番号13を導入したリポソ� �ムでのドキソルビシン取り込み量は、配列� �号12、76を導入した場合よりも高く、ペプチ� ��導入していないものの約3倍であった。