ウイルスの塩基配列を含むベクターを宿� ��細胞内に導入したとき、宿主細胞の生育状� ��が低下することによってベクターの増殖効� ��が低下する。その結果、該ベクターを用い� ��、外来遺伝子がコードするタンパク質の生� ��量が低下する。

 本発明者らは、ウイルスの塩基配列を含み� ��宿主細胞の生育状態を低下させることがな� ��ベクターを構築することによって、効率的� ��タンパク質生産系を構築することを目的と� ��、その必要条件を検討した。
〔1:ウイルスの塩基配列を含むポリヌクレオ� ��ド、および当該ポリヌクレオチドを含むベ� ��ター〕
 本発明は、ウイルスの複製タンパク質をコ� ��ドする第1の塩基配列およびウイルスの移行 タンパク質をコードする第2の塩基配列を含� �ウイルスの塩基配列を含むポリヌクレオチ� �を提供する。

 本発明に係るウイルスの塩基配列を含む� ��リヌクレオチドは、ウイルスベクターとし� ��機能し得るポリヌクレオチドであることが� ��図される。本明細書中において使用される� ��合、「ウイルスベクター」は、ウイルスゲ� ��ム由来配列を含むポリヌクレオチドであっ� ��、外来遺伝子を発現可能に含むものが意図� ��れ、ウイルス由来RNA配列を含むRNA、または� ��イルス由来RNAのcDNA配列を含むDNAであって、 外来遺伝子を発現可能に含むもの、またはこ れから転写されたRNAであることが好ましい。

 本発明に係るポリヌクレオチドは、第1の 塩基配列の下流に第2の塩基配列を有してい� �。本発明に係るポリヌクレオチドは、ウイ� �ス由来のネイティブな塩基配列の一部また� �全部を含み、細胞に任意のタンパク質を生� �させるために使用し得る。

 本明細書中で使用される場合、「ウイル� ��の塩基配列」は、野生型ウイルスのゲノム� ��基配列であることが意図され、RNAウイルス� ��ゲノムRNA、または当該ゲノムRNAから得られ� ��cDNAであることが好ましい。

 本明細書中で使用される場合、「ウイル� ��の複製タンパク質」は、ウイルス由来のタ� ��パク質であって、ウイルスの複製に関与す� ��タンパク質が意図され、単に「複製タンパ� ��質」と称する場合もある。ウイルスの複製� ��関与するタンパク質は、ウイルスが感染し� ��細胞内において、ウイルスを複製するタン� ��ク質が意図され、例えば、従来公知の複製� ��ンパク質が挙げられ、具体的には、RNA依存� ��RNAポリメラーゼ(RNA dependent RNA polymerase:RdRP )、RNA複製酵素、タバコモザイクウイルス130K� ��ンパク質、タバコモザイクウイルス180Kタン パク質、トマトモザイクウイルス130Kタンパ� �質、トマトモザイクウイルス180Kタンパク質� ��を挙げることができる。

 ウイルスの複製タンパク質をコードする� ��基配列は、ウイルス由来のネイティブな塩� ��配列であることが好ましいが、ウイルス由� ��のネイティブな配列が変異したものであっ� ��、複製機能活性を有するタンパク質をコー� ��する塩基配列であり得る。本明細書中で使� ��される場合、「複製機能活性」は、ウイル� ��が感染した細胞内において、ウイルスを複� ��する機能活性が意図される。

 本明細書中で使用される場合、「ウイル� ��の移行タンパク質」は、ウイルス由来のタ� ��パク質であって、ウイルスの細胞間移行に� ��与するタンパク質が意図され、単に「移行� ��ンパク質」と称する場合もある。ウイルス� ��細胞間移行に関与するタンパク質は、ウイ� ��スが感染した細胞に隣接する細胞に、ウイ� ��スを移行することによるウイルスの感染拡� ��に寄与するタンパク質が意図され、例えば� ��従来公知の移行タンパク質が挙げられ、具� ��的には、タバコモザイクウイルス30Kタンパ� ��質、トマトモザイクウイルス30Kタンパク質� ��を挙げることができる。

 ウイルスの移行タンパク質をコードする� ��基配列は、ウイルス由来のネイティブな塩� ��配列であることが好ましいが、ウイルス由� ��のネイティブな配列が変異したものであっ� ��、移行機能活性を有するタンパク質をコー� ��する塩基配列であり得る。また、ウイルス� ��来のネイティブな配列が変異したものであ� ��て、変異により移行機能活性を喪失したタ� ��パク質をコードする塩基配列であってもよ� ��。本明細書中で使用される場合、「移行機� ��活性」は、ウイルスが感染した細胞に隣接� ��る細胞に、ウイルスを移行する機能活性が� ��図される。

 上記ウイルスは、トバモウイルス属に属� ��るウイルスであることが好ましいが、これ� ��限定されない。また、上記ウイルスとして� ��、タバコモザイクウイルス(TMV)、タバコモ� �イクウイルス普通系(TMV-OM)、タバコモザイク ウイルスCg系(TMV-Cg)、トマトモザイクウイル� �(ToMV)、およびSunn-hempモザイクウイルス(SHMV)� �挙げられるが、これらに限定されない。

 ウイルスの複製タンパク質および移行タ� ��パク質について、トマトモザイクウイルス� ��例に挙げて説明する。トマトモザイクウイ� ��スは、トバモウイルス属に属するウイルス� ��ある。

 トマトモザイクウイルスの複製タンパク� ��を構成するポリペプチドは、配列番号1およ び2に示される、各アミノ酸配列として提供� �れ、これらのポリペプチドをコードするポ� �ヌクレオチドを構成する塩基配列は、配列� �号18および19に示される、各塩基配列として� ��供される。

 1つの局面において、トマトモザイクウイ ルスの複製タンパク質は、配列番号1および2� ��示される、各アミノ酸配列からなるポリペ� ��チド、あるいはこれらのポリペプチドをコ� ��ドする各アミノ酸配列の少なくとも一方が� ��異したアミノ酸配列からなり、かつウイル� ��ゲノムを複製する機能活性を有するポリペ� ��チドであり得る。

 他の局面において、トマトモザイクウイ� ��スの複製タンパク質は、配列番号18および19 に示される、各塩基配列からなるポリヌクレ オチド、あるいはこれらのポリヌクレオチド の少なくとも一方が変異した塩基配列によっ てコードされるポリペプチドであって、ウイ ルスゲノムを複製する機能活性を有するポリ ペプチドであり得る。

 すなわち、トマトモザイクウイルスの複� ��タンパク質は、配列番号1に示されるアミノ 酸配列からなる130Kタンパク質(126Kタンパク質 と称されることもある)、および配列番号2に� ��されるアミノ酸配列からなる180Kタンパク質 (183Kタンパク質と称されることもある)の2つ� �タンパク質によって構成される。この130Kタ� ��パク質は、配列番号35に示されるトマトモ� �イクウイルスのゲノム配列の直接翻訳産物� �あり、配列番号18に示される塩基配列からな るポリヌクレオチドによってコードされてい る。180Kタンパク質は、配列番号35に示される トマトモザイクウイルスのゲノム配列のリー ドスルー翻訳産物であり、配列番号19に示さ� ��る塩基配列からなるポリヌクレオチドによ� ��てコードされている。

 トマトモザイクウイルスの移行タンパク� ��を構成するポリペプチドは、配列番号3に示 されるアミノ酸配列として提供され、当該ポ リペプチドをコードするポリヌクレオチドを 構成する塩基配列は、配列番号20に示される� ��基配列として提供される。

 1つの局面において、トマトモザイクウイ ルスの移行タンパク質は、配列番号3に示さ� �るアミノ酸配列からなるポリペプチド、ま� �は当該ポリペプチドの変異体でありかつ細� �間においてウイルスゲノムを移行する機能� �性を有するポリペプチドであり得る。また� �当該ポリペプチドの変異体であって、変異� �より移行機能活性を喪失したポリペプチド� �あってもよい。

 他の局面において、トマトモザイクウイ� ��スの移行タンパク質は、配列番号20に示さ� �る塩基配列からなるポリヌクレオチド、ま� �は当該ポリヌクレオチドの変異体によって� �ードされるポリペプチドであって、ウイル� �ゲノムを細胞間において移行する機能活性� �有するポリペプチドであり得る。また、当� �ポリヌクレオチドの変異体によってコード� �れるポリペプチドであって、変異により移� �機能活性を喪失したポリペプチドであって� �よい。

 本明細書中においてタンパク質またはポ� ��ペプチドに関して用いられる場合、用語「� ��異体」は、具体的なアミノ酸配列が異なっ� ��いても、野生型ポリペプチドの有する活性� ��保持するポリペプチドが意図される。すな� ��ち、本明細書中において使用される場合、� ��リペプチドの変異体は、特定のアミノ酸配� ��において、1個もしくは数個のアミノ酸が欠 失、置換または付加されたアミノ酸配列を含 む変異体であり得る。

 ポリペプチドのアミノ酸配列におけるい� ��つかのアミノ酸が、このポリペプチドの構� ��または機能に有意に影響することなく容易� ��改変し得ることは、当該分野において周知� ��ある。さらに人為的に改変させるだけでは� ��く、天然のタンパク質において、当該タン� ��ク質の構造または機能を有意に変化させな� ��変異体が存在することもまた周知である。� ��業者は、周知技術を使用してポリペプチド� ��アミノ酸配列において1または数個のアミノ 酸を容易に変異させることができる。

 このように、ウイルスの複製タンパク質� ��よび移行タンパク質を具体的に説明するた� ��に、トマトモザイクウイルスを例に挙げて� ��明したが、本発明において、上記ウイルス� ��トマトモザイクウイルスに限定されないこ� ��を、本明細書を読んだ当業者は容易に理解� ��る。

 なお、本明細書中で使用される場合、用� ��「タンパク質」は、「ペプチド」または「� ��リペプチド」と交換可能に使用される。ま� ��、用語「塩基配列」は、「核酸配列」また� ��「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用さ� ��、デオキシリボヌクレオチド(A、G、Cおよび Tと省略される)、またはリボヌクレオチド(A� �G、CおよびUと省略される)の配列として示さ� ��る。

 本発明に係るポリヌクレオチドは、発現� ��せるべきポリペプチドをコードする外来塩� ��配列を連結するための連結部位を、第2の塩 基配列の下流に有しており、第2の塩基配列� �、ウイルス由来のネイティブな配列に対し� �さらなる塩基配列が挿入、置換または付加� �れていることを特徴としている。すなわち� �第1の塩基配列の下流であって、外来塩基配� ��を連結するための連結部位の上流に位置す� ��、ウイルスの移行タンパク質をコードする� ��2の塩基配列にさらなる塩基配列が挿入、置 換または付加されている。

 本発明に係るポリヌクレオチドにおいて� ��第2の塩基配列は、配列番号4~17に示される� �リヌクレオチド、または当該ポリヌクレオ� �ドの変異体として提供される。

 本明細書中において遺伝子またはポリヌ� ��レオチドに関して用いられる場合、用語「� ��異体」は、具体的な塩基配列が異なっても� ��野生型ポリヌクレオチドがコードするポリ� ��プチドの有する活性を保持したポリペプチ� ��をコードするポリヌクレオチドが意図され� ��。すなわち、本明細書中において使用され� ��場合、ポリヌクレオチドの変異体は、(I)特� ��の塩基配列において、1個もしくは数個の塩 基が欠失、置換または付加された塩基配列か らなるポリヌクレオチド;(II)特定の塩基配列� ��たはその相補配列からなるポリヌクレオチ� ��とストリンジェントな条件下でハイブリダ� ��ズするポリヌクレオチド;または(III)特定の� ��基配列と少なくとも80%同一な塩基配列から� ��るポリヌクレオチド、であることが意図さ� ��る。

 ハイブリダイゼーションは、「Molecular Cl oning:A Laboratory Manual 第3版,J.SambrookおよびD.W. Russll編,Cold Spring Harbor Laboratory,NY(2001)」(本� �細書中に参考として援用される)に記載され� ��いる方法のような周知の方法で行うことが� ��きる。

 本明細書中で使用される場合、用語「ス� ��リンジェントなハイブリダイゼーション条� ��」は、ハイブリダイゼーション溶液(50%ホル ムアミド、5×SSC(150mMのNaCl、15mMのクエン酸三� ��トリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.6)、5 ×デンハート液、10%硫酸デキストラン、およ� ��20μg/mlの変性剪断サケ精子DNAを含む)中にて4 2℃で一晩インキュベーションした後、約65℃ にて0.1×SSC中でフィルターを洗浄することが� ��図される。

 本発明に係るポリヌクレオチドにおいて� ��発現させるべきポリペプチドをコードする� ��来塩基配列を連結するための連結部位は、� ��1の塩基配列の下流に存在する第2の塩基配� �の、さらに下流に位置している。そして、� �記連結部位に外来塩基配列を連結し、外来� �基配列を含むポリヌクレオチドを用いて細� �を形質転換することによって、外来塩基配� �がコードするポリペプチドを細胞内にて発� �させることが可能である。なお、本発明に� �るポリヌクレオチドに連結される外来塩基� �列は、上記連結部位において、第2の塩基配� ��に隣接して配置される必要はない。

 また、本発明に係るポリヌクレオチドが� ��する外来塩基配列を連結するための連結部� ��は、具体的なカセットとして本発明のポリ� ��クレオチドの塩基配列中に存在している必� ��はなく、本発明に係るポリヌクレオチドの� ��基配列に、外来塩基配列を挿入かつ連結し� ��る構成であればよい。本発明に係るポリヌ� ��レオチドは、上記連結部位に連結した外来� ��基配列からなる遺伝子を増幅し、当該遺伝� ��産物の生産を可能にするものである。

 本発明に係るポリヌクレオチドにおいて� ��第2の塩基配列は、ウイルス由来のネイティ ブな配列に対してさらなる塩基配列が挿入、 置換または付加されていることを特徴として いる。本明細書中で使用される場合、「ウイ ルス由来のネイティブな配列」は、野生型ウ イルス固有の配列であることが意図され、野 生型ウイルスから得られる配列に変異が加え られていない、天然の配列であり得る。

 また、本発明に係る第2の塩基配列は、ウ イルス由来のネイティブな塩基配列の変異体 であって、移行機能活性を有するポリペプチ ドをコードする塩基配列に対して、さらなる 塩基配列が挿入、置換または付加されていて もよい。さらに、本発明に係る第2の塩基配� �は、ウイルス由来のネイティブな塩基配列� �変異体であって、変異により移行機能活性� �喪失したポリペプチドをコードする塩基配� �に対して、さらなる塩基配列が挿入、置換� �たは付加されていてもよい。

 本発明に係るポリヌクレオチドにおいて� ��第2の塩基配列に対して挿入、置換または付 加されるさらなる塩基配列は、一定の塩基長 からなる塩基配列であればよく、その配列ま たは由来は問わない。本明細書中で使用され る場合、第2の塩基配列に対して挿入、置換� �たは付加されるさらなる塩基配列は、単に� �挿入配列」と称する場合もある。後述する� �発明の一実施例においては、挿入配列とし� �大腸菌トランスポゾンIS2由来配列およびGUS� �伝子の逆相補鎖由来配列を採用したが、好� �に用いることができた。

 一実施形態において、本発明に係るポリ� ��クレオチドにおいて使用される挿入配列は� ��100塩基以上であり得、100~1609塩基であるこ� �が好ましく、300~1609塩基であることがより好 ましい。本発明に係るポリヌクレオチドの第 2の塩基配列に対して、100塩基長以上の挿入� �列を挿入、置換または付加することによっ� �、後述する実施例に示すように、当該ポリ� �クレオチドが導入された宿主細胞の生育状� �をさらに改善することができる。これによ� �、細胞内におけるベクターの複製効率が向� �し、ベクターの収量をさらに増加させるこ� �が可能である。

 本発明に係るポリヌクレオチドにおいて� ��用される第2の塩基配列は、ウイルス由来の ネイティブな配列中のいずれかの位置に上記 挿入配列が挿入されていればよい。好ましい 挿入位置は、第1の塩基配列のC末端領域と、� ��結部位に連結される外来塩基配列の開始コ� ��ン領域との間に存在する、第2の塩基配列領 域であり、より好ましくは、第1の塩基配列� �終止コドンと外被タンパク質をコードする� �基配列のサブゲノムプロモーターの間であ� �が、これに限定されない。また第2の塩基配� ��は、ウイルス由来のネイティブな配列に上� ��挿入配列が付加されていてもよく、ウイル� ��由来のネイティブな配列の一部が、挿入配� ��によって置換された配列であってよい。さ� ��に第2の塩基配列は、ウイルス由来のネイテ ィブな配列の一部を除去し、配列が除去され た部位に挿入配列が挿入された配列であって もよい。

 すなわち本発明に係る第2の塩基配列は、 ウイルスゲノムの細胞間移行に関する機能を 保持したタンパク質をコードする配列に対し て、上述したような変異が加えられた配列が 意図される。

 一実施形態において、本発明に係るポリ� ��クレオチドにおいて使用される第2の塩基配 列の任意の位置に挿入配列が挿入され得る。 挿入配列の挿入位置は特に限定されないが、 配列番号20に示される塩基配列の第17位~第795� ��のいずれかの位置であることが好ましく、� ��17位~第620位のいずれかの位置であることが� ��り好ましい。

 また、本発明に係るポリヌクレオチドに� ��いて使用される第2の塩基配列は、配列番号 20に示される塩基配列の5’または3’末端に� �記挿入配列が付加された配列であってもよ� �、配列番号20に示される塩基配列の一部が、 上記挿入配列によって置換された配列であっ てもよい。

 本発明はさらに、任意のポリペプチドを� ��産するためのベクターを提供する。本発明� ��係るベクターは、ウイルスの複製タンパク� ��をコードする第1の塩基配列およびウイルス の移行タンパク質をコードする第2の塩基配� �を含むウイルスの塩基配列を含み、第2の塩� ��配列は第1の塩基配列の下流に位置しており 、かつ発現させるべきポリペプチドをコード する外来塩基配列を連結するための連結部位 を、第2の塩基配列の下流に有しており、第2� ��塩基配列は、ウイルス由来のネイティブな� ��列に対してさらなる塩基配列が挿入、置換� ��たは付加されているポリヌクレオチドを含� ��、本ベクターを組み込む宿主細胞内におい� ��当該ポリヌクレオチドを発現させることが� ��能なベクターであり得る。

 ウイルスの塩基配列を含むベクターは変� ��が生じやすく、構築するのが非常に困難で� ��り、発現させるべき外来遺伝子との組み合� ��せによっては、ベクターを構築するのが不� ��能であった。本発明のポリヌクレオチドを� ��いれば、これまで作製することができなか� ��た外来遺伝子を含むベクターであっても、� ��築することが可能であった。このことから� ��本発明のポリヌクレオチドを用いて構築し� ��ベクターは、変異の発生が抑制され、安定� ��ていると推測される。

 また、本発明に係るベクターは、導入さ� ��た宿主細胞の生育状態を改善し、宿主細胞� ��における複製効率を向上させることが可能� ��ある。このため、複製されたベクターを用� ��て外来遺伝子がコードする有用タンパク質� ��効率よく生産することが可能である。

 本発明に係るポリヌクレオチドを含むベ� ��ターとしては、例えば、導入したポリヌク� ��オチドを発現させることが可能な適当なpBR� ��、pUC系等の発現ベクター(ファージベクター 或いはプラスミドベクター等)を使用するこ� �が可能であり、の本発明に係るベクターを� �み込む宿主細胞中において上記ポリヌクレ� �チドを発現することが可能なベクターを適� �選択し得る。また、植物細胞のゲノムに組� �込まれる性質を有するベクターとして、pBI� �、pCAMBIA系等のベクタ―を使用することが可� ��であり、例えば、のTiプラスミドベクター� �使用してもよい。

 なお、本発明に係るポリヌクレオチドお� ��びベクターの構築方法は特に限定されるも� ��ではなく、公知の遺伝子工学的手法を用い� ��ばよい。

 本発明のポリヌクレオチドを用いて構築� ��たベクターは、外来遺伝子がコードするタ� ��パク質の生産に好適に使用し得る。すなわ� ��、本発明に係るポリヌクレオチドを含むベ� ��ターを用いて宿主細胞を形質転換すること� ��よって、宿主細胞の生育状態を低下させる� ��となく、効率よくベクターを複製し得、複� ��されたベクターを用いて、外来遺伝子がコ� ��ドするタンパク質を効率よく生産すること� ��可能である。

 なお、本発明に係るポリヌクレオチドま� ��はベクターに含まれる連結部位に連結され� ��外来遺伝子の種類は特に限定されず、例え� ��GFP遺伝子、ヒト由来ガンマインターフェロ� ��遺伝子、アルファインターフェロン遺伝子� ��カルモジュリン遺伝子、ミオシンフォスフ� ��ターゼ阻害タンパク質(CPI-17)機能ドメイン� �伝子(アミノ酸残基22から120)、一本鎖抗体遺� ��子等を連結することが可能である。本発明� ��係るポリヌクレオチドまたはベクターを用� ��れば、これらの遺伝子を含むベクターを容� ��に作製し、効率よくベクターを複製し得、� ��製されたベクターを用いて、これらの遺伝� ��がコードするタンパク質を効率よく生産す� ��ことが可能である。

 〔2.ウイルスの塩基配列を含む植物〕
 本発明はさらに、ウイルスの塩基配列を含� ��植物を提供する。本明細書中で使用される� ��合、用語「植物」は、植物細胞および植物� ��体を含むことが意図され、例えばアラビド� ��シス、タバコ、ベンサミアーナ等の植物、� ��バコBY2細胞、アラビドプシスmm2d細胞等の植 物細胞であり得る。

 本発明に係る植物は、ウイルスの複製タ� ��パク質をコードする第1の塩基配列およびウ イルスの移行タンパク質をコードする第2の� �基配列が導入されており、第2の塩基配列は� ��1の塩基配列の下流に位置し、かつ発現させ るべきポリペプチドをコードする外来塩基配 列を連結するための連結部位を、第2の塩基� �列の下流に有しており、第2の塩基配列は、� ��イルス由来のネイティブな配列に対してさ� ��なる塩基配列が挿入、置換または付加され� ��いることを特徴としており、上記ポリペプ� ��ドを効率よく発現し得る。

 一実施形態において、本発明に係る植物� ��、ウイルスの複製タンパク質をコードする� ��1の塩基配列およびウイルスの移行タンパク 質をコードする第2の塩基配列を含むウイル� �の塩基配列を含むポリヌクレオチドであっ� �、第2の塩基配列は第1の塩基配列の下流に位 置し、かつ発現させるべきポリペプチドをコ ードする外来塩基配列を連結するための連結 部位を、第2の塩基配列の下流に有しており� �第2の塩基配列は、ウイルス由来のネイティ� ��な配列に対してさらなる塩基配列が挿入ま� ��は付加されているポリヌクレオチド、また� ��当該ポリヌクレオチドを含んでいるベクタ� ��を生物中に取り込ませることによって取得� ��れ得る。

 1つの局面において、本発明に係る植物は 、本発明に係るポリヌクレオチド、または本 発明に係るポリヌクレオチドを含むベクター を用いて植物または植物細胞を形質転換する ことによって取得され得る。例えば、本発明 に係るポリヌクレオチドを、エレクトロポレ ーション等によって植物細胞に導入すること によって、本発明に係る植物を取得すること が可能である。

 他の局面において、本発明に係る植物は� ��本発明に係るポリヌクレオチド、または本� ��明に係るポリヌクレオチドを含むベクター� ��、植物または植物細胞にトランスフェクト� ��ることによって取得され得る。例えば本発� ��に係るポリヌクレオチドを、植物または植� ��細胞に感染させることによって、本発明に� ��る植物を取得することが可能である。また� ��本発明に係るポリヌクレオチドにプロモー� ��ーを付加したcDNAが組み込まれたプラスミド を植物細胞にトランスフェクトし、細胞内に おいてcDNAを転写させることによっても、本� �明に係る植物を取得し得る。さらに、本発� �に係るポリヌクレオチドのcDNAを植物細胞に� ��ランスフェクトし、細胞内においてcDNAを転 写させることによっても、本発明に係る植物 を作製することが可能である。

 また、本発明に係る植物は、例えば、本� ��明に係るポリヌクレオチドを含むプラスミ� ��ベクターが導入されたアグロバクテリウム� ��植物細胞に感染させることによっても、取� ��することが可能である。さらに、アグロバ� ��テリウムを利用した、アグロインフィルト� ��ーション法によっても、本発明に係る植物� ��作製することが可能である。具体的には、� ��発明に係るポリヌクレオチドを含むアグロ� ��クテリウムを培養した培養液を、植物体の� ��胞間隙に浸潤させることによって、植物体� ��対して局所的に本発明に係るポリヌクレオ� ��ドを導入する。

 すなわち、本発明に係る植物は、本発明� ��係るポリヌクレオチドまたはベクターを用� ��て形質転換された形質転換植物であっても� ��く、本発明に係るポリヌクレオチドまたは� ��クターに感染した感染植物であってもよい� ��本発明に係る植物が、形質転換植物である� ��合、本発明に係るポリヌクレオチドが、植� ��のゲノムに組み込まれていない状態で一過� ��の発現をする、一過性形質転換体であって� ��よく、植物内に取り込まれた本発明に係る� ��リヌクレオチドが、植物細胞のゲノムに組� ��込まれ安定的に発現しつづける、安定形質� ��換体であってもよい。また、形質転換植物� ��、導入された本発明に係るポリヌクレオチ� ��を恒常的に発現するものであってもよく、� ��テロイドホルモン等によって誘導的に発現� ��るものであってもよい。本発明に係る植物� ��、感染植物である場合、植物全体が本発明� ��係るポリヌクレオチドに感染していてもよ� ��、局所的に感染していてもよい。

 このように、本発明に係る植物を用いれ� ��、植物内に本発明に係るポリヌクレオチド� ��含んでいるため、本発明のポリヌクレオチ� ��またはベクターに任意の外来遺伝子が組み� ��まれたとき、当該遺伝子がコードするタン� ��ク質を効率よく生産することができる。

 〔3.ウイルスの塩基配列を含む形質転換体� �
 本発明はさらに、ウイルスの塩基配列を含� ��形質転換体を提供する。用語「形質転換体� ��は、細胞、組織または器官だけでなく、生� ��個体をも含むことが意図されるが、細胞(特 に、原核生物細胞、菌類など)であることが� �ましい。本発明に係る形質転換体は、例え� �、大腸菌、アグロバクテリウム、酵母等で� �り得る。

 本発明に係る形質転換体は、ウイルスの� ��製タンパク質をコードする第1の塩基配列お よびウイルスの移行タンパク質をコードする 第2の塩基配列が導入されており、第2の塩基� ��列は第1の塩基配列の下流に位置し、かつ発 現させるべきポリペプチドをコードする外来 塩基配列を連結するための連結部位を、第2� �塩基配列の下流に有しており、第2の塩基配� ��は、ウイルス由来のネイティブな配列に対� ��てさらなる塩基配列が挿入、置換または付� ��されているポリヌクレオチドを含むことを� ��徴としており、上記ポリペプチドの効率よ� ��発現に利用し得る。

 一実施形態において、本発明に係る形質� ��換体は、ウイルスの複製タンパク質をコー� ��する第1の塩基配列およびウイルスの移行タ ンパク質をコードする第2の塩基配列を含む� �イルスの塩基配列を含むポリヌクレオチド� �あって、第2の塩基配列は第1の塩基配列の下 流に位置し、かつ発現させるべきポリペプチ ドをコードする外来塩基配列を連結するため の連結部位を、第2の塩基配列の下流に有し� �おり、第2の塩基配列は、ウイルス由来のネ� ��ティブな配列に対してさらなる塩基配列が� ��入または付加されているポリヌクレオチド� ��または当該ポリヌクレオチドを含んでいる� ��クターを生物中に取り込ませることによっ� ��取得され得る。

 1つの局面において、本発明に係る形質転 換体は、本発明に係るポリヌクレオチド、ま たは本発明に係るポリヌクレオチドを含むベ クターを用いて、生物体を形質転換すること によって取得され得る。例えば、本発明に係 るポリヌクレオチドが組み込まれたプラスミ ドを塩化カルシウム法等によって大腸菌に導 入することによって、本発明に係る形質転換 体を取得し得る。

 このように、本発明に係る形質転換体を� ��いれば、例えば宿主内に導入された本発明� ��係るベクターの収量が向上するため、当該� ��クターに任意の外来遺伝子が組み込まれた� ��き、当該遺伝子がコードするタンパク質を� ��産するためのベクターを容易にかつ効率よ� ��生産することができる。また、例えば形質� ��換体の生育が改善されるため、本発明にか� ��るベクターに任意の外来遺伝子が組み込ま� ��たとき、上記形質転換体を用いて当該遺伝� ��がコードするタンパク質を効率よく生産す� ��ことができる。

 〔4.細胞に任意のポリペプチドを生産させ� �ための方法およびキット〕
 本発明は、上記ポリヌクレオチド、ベクタ� ��、植物または形質転換体を用いるポリペプ� ��ドの生産方法、上記ポリヌクレオチド、ベ� ��ター、植物または形質転換体を備えている� ��リペプチド生産用キットもまた提供する。

 本発明に係るポリペプチド生産方法は、� ��述したポリヌクレオチド、ベクター、植物� ��たは形質転換体を用いることを特徴として� ��る。また、本発明に係るポリペプチド生産� ��キットは、上述したポリヌクレオチド、ベ� ��ター、植物または形質転換体を備えている� ��とを特徴としている。なお、本明細書中で� ��用される場合、「キット」は各種成分の少� ��くとも1つが別物質(例えば、容器)中に含有� ��れている状態であることが意図される。

 本発明は、任意のポリペプチドを効率よ� ��生産する方法およびキットを提供する。本� ��明に係る細胞に任意のポリペプチドを生産� ��せる方法を用いれば、ウイルスの塩基配列� ��導入された細胞であっても、その生育状態� ��低下しないため、ポリペプチドを効率よく� ��産し得る。

 一実施形態において、本発明に係るポリ� ��プチドの生産方法は、本発明に係るポリヌ� ��レオチド、または当該ポリヌクレオチドを� ��むベクターを用いることを特徴としており� ��本発明に係るポリヌクレオチドまたはベク� ��ーを用いて、植物体および植物細胞を含む� ��物体を形質転換またはトランスフェクトす� ��工程を包含する。上記の工程により形質転� ��またはトランスフェクトされた生物体内に� ��いて、本発明に係るポリヌクレオチドまた� ��ベクターに含まれる外来塩基配列がコード� ��るポリペプチドが発現される。

 他の実施形態において、本発明に係るポ� ��ペプチド生産方法は、本発明に係る植物ま� ��は形質転換体を用いることを特徴としてお� ��、本発明に係る植物または形質転換体を、� ��リペプチドを発現し得る条件下で生育また� ��培養する工程を包含する。上記の工程によ� ��植物または形質転換体内において、これら� ��生物体内に含まれる外来塩基配列がコード� ��るポリペプチドが発現される。

 上述したように、本発明に係るポリペプ� ��ド生産方法を用いれば、任意のポリペプチ� ��を生産させる生物体の生育状態を低下させ� ��ことがないため、ポリペプチドを効率よく� ��産し得る。

 本発明に係るポリヌクレオチドまたはベ� ��ターを宿主に導入する方法としては、特に� ��定されず、アグロバクテリウム法、電気穿� ��法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、D EAEデキストラン法等の従来公知の方法を好適 に用いることができる。また、本発明に係る ベクターを用いて形質転換またはトランスフ ェクトされる生物体の種類は特に限定される ものではなく、動物由来細胞であっても、植 物由来細胞であってもよい。また、枯草菌、 大腸菌、菌類、酵母等の微生物を宿主として 用いてもよい。

 本発明に係るポリヌクレオチドまたはベ� ��ターを、植物体または植物由来細胞に導入� ��るときの導入方法もまた特に限定されない� ��、アグロバクテリウム法、アグロインフィ� ��トレーション法、ポリエチレングリコール� ��、電気穿孔法、パーティクルガン法等を好� ��に用いることができる。

 本発明に係るポリペプチド生産用キット� ��、本発明に係るポリヌクレオチド、ベクタ� ��、植物または形質転換体を備えていること� ��特徴としている。好ましい実施形態におい� ��、本発明に係るポリヌクレオチドまたはベ� ��ターを備えたポリペプチド生産用キットは� ��形質転換またはトランスフェクトすべき植� ��体または生物体をさらに備えていることが� ��ましい。これにより、本発明に係るポリヌ� ��レオチドまたはベクターを用いて細胞を形� ��転換またはトランスフェクトし、導入され� ��植物体内または生物体内において本発明に� ��るポリヌクレオチドまたはベクターに含ま� ��る外来塩基配列がコードするポリペプチド� ��発現することが可能である。

 なお、細胞に任意のポリペプチドを生産� ��せる方法およびキットは、上述した態様に� ��定される必要はなく、上述した以外のポリ� ��プチド生産方法およびポリペプチド生産用� ��ットの具体的な態様を、本明細書を読んだ� ��業者は容易に理解する。

 以下に、本発明を実施例によってさらに� ��細に説明するが、本発明はこれらの実施例� ��限定されるものではなく、請求項および上� ��実施形態に示した範囲で種々の変更が可能� ��あり、異なる実施形態にそれぞれ開示され� ��技術的手段を適宜組み合わせて得られる実� ��形態についても本発明の技術的範囲に含ま� ��る。