PLK-1 siRNAの最適化を示す図である。A:si Direct(商標)による、PLK-1 CDS領域にわたるsiRNA� ��設計の結果を示す。B:siRNA処理後の細胞増殖 阻害スクリーニング結果を示す。C:siChimera(商 標)技術によるsiRNAの調製を示す。 インビトロ実験におけるALG-00345活性を� ��す図および写真である。A:ALG-00345処理後のmR NAレベルを示す図である。B:ALG-00345処理後の� �ンパク質レベルを示す写真である。C:ALG-00345 処理後のDNA含量を示す図である。D:ALG-00345処� ��後のアネキシンV染色の結果を示す図である 。 様々な腫瘍細胞系および正常細胞におけるALG -00345活性を示す図である。A:ALG-00345処理後の� ��胞増殖阻害曲線である。B:相対的PLK-1 mRNA発 現レベル(腫瘍細胞系および正常細胞)を示す� ��C:IC ₅₀ およびGI ₃₀ 計算値を示す。 A:UM-UC-3含有異種移植片モデルの増殖に� ��するALG-00345の効果を示す図である。B:マウ� �におけるALG-00345の静注後の血液毒性を示す� �血液毒性を測定した。 サバイビンsiRNAの最適化を示す図であ� �。A:siDirect(商標)によるサバイビンCDS領域に� �たるsiRNA設計の結果を示す。B:siRNA処理後の� �胞増殖阻害スクリーニングの結果を示す図� �ある。C:siChimera(商標)技術によるsiRNAの調製� �示す。 インビトロ実験におけるALG-00322活性を� ��す図および写真である。ALG-00322をいくつか� ��濃度(最小濃度は10 pMであった)でUM-UC-3にト� ��ンスフェクションした。A:ALG-00322処理後のmR NAレベルを示す図である。B:ALG-00322処理後の� �ンパク質レベルを示す図である。C:ALG-00322処 理後のDNA含量を示す図である。D:ALG-00322処理� ��のアネキシンV染色の結果を示す図である。 様々な腫瘍細胞系および正常細胞におけるALG -00322活性を示す図である。A:ALG-00322処理後の� ��胞増殖阻害曲線である。B:相対的サバイビ� �mRNA発現レベル(腫瘍細胞系および正常細胞)� �示す。C:IC ₅₀ およびGI ₃₀ 計算値を示す。 A:UM-UC-3含有異種移植片モデルの増殖に� ��するALG-00322の効果を示す図である。B:マウ� �におけるALG-00322の静注後の血液毒性を示す� �である。血液毒性を測定した。 A:ヒト尿路上皮癌におけるSKP2、CKS1、お よびp27の発現を示す写真である。倍率×200。B :カプラン・マイヤーの原因別生存率曲線を� �す図である。C:遺伝子発現パターンおよび予 後を示す図である。NEDは、疾患の証拠がみら れないことを示す。 A:siRNAの標的位置を示す図である。B:siR NA処理後の細胞増殖阻害スクリーニングの結� ��を示す図である。C:siChimera(商標)技術による CKS1およびSKP2 siRNAの最適化を示す図である。 D:95%ヒト血清中でのsiRNA安定性を決定した結� �を示す写真である。 インビトロ実験におけるALG-00338または ALG-00371活性を示す図および写真である。A:ALG- 00338またはALG-00371処理後のmRNAレベルを示す図 である。B:ALG-00338またはALG-00371処理後のタン� ��ク質レベルを示す写真である。C:ALG-00338ま� �はALG-00371処理後のDNA含量を示す図である。D: siRNA処理後のアネキシンV染色の結果を示す図 である。 インビトロでの様々な腫瘍細胞型お� �び正常細胞におけるALG-00338またはALG-00371活� �を示す図である。A:ALG-00338またはALG-00371処理 後の細胞増殖阻害曲線を示す図である。 インビトロでの様々な腫瘍細胞型お� �び正常細胞におけるALG-00338またはALG-00371活� �を示す図である。B:相対的CKS1 mRNA発現レベ� �(腫瘍細胞系および正常細胞)(上)および相対� ��SKP2 mRNA発現レベル(腫瘍細胞系および正常� �胞)(下)を示す。 インビトロでの様々な腫瘍細胞型および正常 細胞におけるALG-00338またはALG-00371活性を示す 図である。C:IC ₅₀ およびGI ₃₀ 計算値を示す。

〔発明の実施の形態〕
 本発明は、癌遺伝子の発現を阻害するsiRNA� �含む、細胞の増殖を阻害するための組成物� �提供する。該組成物は例えば、医薬組成物� �たは試薬組成物として、さらに本発明のsiRNA の標的となる癌遺伝子に関連する生理状態の 解明のための試験研究用組成物としても使用 され得る。

 本発明において発現が阻害される癌遺伝子� ��言い換えれば本発明のsiRNAの標的となる癌� �伝子としては、以下の(1)~(4)のいずれかに記� ��の遺伝子を挙げることができる。
(1)Plk1遺伝子。ヒトPlk1のcDNA配列およびアミノ 酸配列は公知であり、例えばGenBankアクセッ� �ョン番号X75932に記載のcDNAおよびGenBankアクセ ッション番号CAA5356に記載のアミノ酸配列を� �いることができる。
(2)サバイビン遺伝子。ヒトサバイビンのcDNA� �列およびアミノ酸配列は公知である。
(3)Cks1遺伝子。ヒトCks1のcDNA配列およびアミノ 酸配列は公知である。
(4)Skp2遺伝子。ヒトSkp2のcDNA配列およびアミノ 酸配列は公知である。

 本明細書における「癌遺伝子の発現を阻� ��」には、遺伝子の転写の阻害およびタンパ� ��質への翻訳の阻害が含まれる。また、DNAの� ��現の完全な停止のみならず発現の減少も含� ��れる。

 本願のsiRNAは、上記標的となる癌遺伝子� �相補的な塩基配列を含むRNAが有する、遺伝� �発現の抑制効果であるRNAi効果を有するもの� ��ある。一般的にRNAiとは、標的遺伝子のmRNA� �列と相同な配列からなるセンスRNAおよびこ� �と相補的な配列からなるアンチセンスRNAと� �らなる二本鎖RNAを細胞内に導入することに� �り、標的遺伝子mRNAの破壊を誘導し、標的遺� ��子の発現が阻害される現象を言う。

 RNAi機構の詳細については未だに不明な部 分もあるが、DICERといわれる酵素(RNase III核� �分解酵素ファミリーの一種)が二本鎖RNAと接� ��し、二本鎖RNAがsmall interfering RNAまたはsiRNA と呼ばれる小さな断片に分解されるものと考 えられている。本発明におけるRNAi効果を有� �る二本鎖RNAには、このようにDICERによって分 解される前の二本鎖RNAも含まれる。

 RNAiによる遺伝子抑制実験を行う際には、 標的遺伝子特異的に遺伝子抑制を起こさせる 必要があるため、siRNA配列は対象遺伝子に特� ��的な配列であることが重要となる(Jackson AL,  et al., Nat Biotechnol. 21: 635-637, 2003)。RNAiに 用いるDNAは、標的遺伝子と完全に同一である 必要はないが、少なくとも70%以上、好ましく は80%以上、さらに好ましくは90%以上、最も好 ましくは95%以上の配列の相同性を有する。該 DNAは、相同性が高くなるにつれて、そのsiRNA� ��遺伝子発現抑制効果は増加する。

 本発明において、RNAi効果を有する2本鎖RN Aは、通常、標的遺伝子のmRNAにおける任意の� ��続する塩基配列と相同な配列からなるセン� ��RNA、および該センスRNAに相補的な配列から� ��るアンチセンスRNAからなる2本鎖RNAである。 上記「任意の連続する塩基配列」の長さは、 通常20~30塩基であり、好ましくは21~23塩基で� �る。しかしながら、そのままの長さではRNAi� ��果を有さないような長鎖のRNAであっても、� ��胞においてRNAi効果を有するsiRNAへ分解され� ��ため、本発明における2本鎖RNAの長さは、特 に制限されない。

 また、標的遺伝子のmRNAの全長もしくはほ ぼ全長の領域に対応する長鎖二本鎖RNAを、例 えば、予めDICERで分解させ、その分解産物をR NAi効果を有するRNAとして利用することもでき る。このような分解産物には、RNAi効果を有� �る二本鎖RNA分子(siRNA)が含まれることが期待� ��れる。この方法によれば、RNAi効果を有する ことが期待されるmRNA上の領域を、特に選択� �なくともよい。

 また、末端に数塩基のオーバーハングを� ��する二本鎖RNAは、RNAi効果が高いことが知ら れている。したがってRNAi効果を有する二本� �RNAは、末端に数塩基のオーバーハングを有� �ることが望ましい。このオーバーハングを� �成する塩基の長さは特に制限されない。オ� �バーハングの塩基の数は、好ましくは、2塩� ��である。本発明においては例えば、TT(チミ� ��が2個)、UU(ウラシルが2個)、その他の塩基の オーバーハングを有する二本鎖RNAが好ましい 。たとえばヒトにおいては、19塩基の二本鎖R NAと2塩基(TT)のオーバーハングを有する分子� �、RNAi効果が高いといわれている。RNAi効果を 有する二本鎖RNAには、オーバーハングを形成 する塩基がDNAであるようなキメラ分子も含ま れる。

 ここでいう2本鎖RNAは、相補配列が互いに ハイブリダイズした構造を含むRNAを言う。し たがって、先に述べたように1本鎖RNA中に相� �的な塩基配列を含み、それが互いにハイブ� �ダイズすることによって2本鎖構造を取った� ��合には、2本鎖RNAに含まれる。すなわちステ ムループ構造を取る1本鎖RNAは、2本鎖構造(ス テム部分)を含むため、2本鎖RNAに含まれる。

 siRNAは、単一の転写物が標的遺伝子由来� �センス配列及び相補的アンチセンス配列の� �方を有するよう、例えばヘアピンとして構� �される。

 当業者は、標的遺伝子に対してRNAi効果を 有する二本鎖RNAを、その塩基配列をもとに、 適宜デザインすることができる。すなわち、 標的遺伝子の塩基配列をもとに、該配列の転 写産物であるmRNAの任意の連続するRNA領域を� �択し、この領域に対応する二本鎖RNAを作製� �ることができる。また、該配列の転写産物� �あるmRNA配列から、より強いRNAi効果を有する siRNA配列を選択する方法も公知である。例え� ��、Reynoldsらが発表した論文(Reynold et al. Natu re biotechnology 22. 326-330 (2004))や、Ui-Teiらが� �表した論文(Ui-Tei et al. Nucleic Acids Res. 32.� �936-948 (2004))等に基づいて、siRNAに必要な塩� �配列を予測することができる。

 siRNAは、遺伝子の部分的な塩基配列に基� �いてデザインすることもできる。siRNAの塩基 配列を特定するためには、選択すべき任意の 連続する塩基配列が判明していればよい。必 要な塩基配列の長さは、たとえば、少なくと も20~30塩基である。つまり、全長配列が明ら� ��でない標的遺伝子に対して、siRNAをデザイ� �することもできる。従って、EST(Expressed Seque nce Tag)等のようにmRNAの一部は判明している� �、全長が判明していない遺伝子断片からも� �該断片の塩基配列を基に当該遺伝子の発現� �抑制する二本鎖RNAを作製することができる� �

 本発明の組成物に配合されるsiRNAには、DN Aとハイブリダイズした分子、あるいはヌク� �オチドの誘導体を含むRNAなども含まれる。� �とえば、ヌクレアーゼ耐性を付与するため� �末端を修飾したRNAが公知である。あるいは� �蛍光性の分子を導入したRNAも公知である。� �れらの人工的に合成されたRNAも、本発明のRN Aに含まれる。

 本発明に使用されるRNAは、天然のRNAを構成� ��るリボヌクレオチド核酸に加え、人工的な� ��基に置換したものや、その誘導体を含む。� ��たがって、天然の塩基であるa、u、c、およ� ��gに代えて、イノシン(i)を有するRNAを複合体 形成に用いることができる。あるいはリン酸 結合をチオエート結合やボラノフォスフェー ト結合に置換した核酸誘導体を人工的に合成 する方法も公知である。リボヌクレオチド核 酸の糖構造を修飾することもできる。糖構造 の修飾方法として、2’-O-メチル修飾、2’-フ ルオロ修飾、あるいはlocked nucleic acid (LNA)� �飾等を用いることもできる。また、部分的� �DNAを導入したDNA-RNAキメラ分子も公知である� ��

 本発明のsiRNAは、具体的には以下の方法� �作成デザインできる。まず、siDirect(商標)シ� ��テムにより、癌遺伝子CDS領域にわたるsiRNA� �設計を行う。次に設計されたsiRNAについて、 siChimera(商標)技術によって一部配列をDNAに変� ��、キメラ型siRNAを作製する。本発明におい� �、好ましいsiRNAの例としては、以下の表1に� �載のsiRNAが挙げられる。

 本発明は、本願のsiRNAを有効成分として� �有する、細胞の増殖を阻害するための組成� �に関する。あるいは本発明は、siRNAの細胞の 増殖を阻害するための組成物の製造における 使用に関する。

 本発明のsiRNAを含有する組成物が増殖を阻� �する細胞としては癌細胞、好ましくは膀胱� �、尿路上皮癌、肺癌、平滑筋肉腫、結腸癌� �非ホジキンリンパ腫、乳癌、肝臓癌、胃癌� �食道癌、子宮頸癌、黒色腫、口腔扁平上皮� �、前立腺癌、卵巣癌、脳腫瘍、腎臓癌、皮� �癌、頭頸部癌、骨肉種、咽頭癌、リンパ腺� �、膵臓癌、精巣癌、リンパ腫、白血病やこ� �らの転移癌などから採取された細胞が挙げ� �れるがこれに限定されない。
これら細胞には対象生物(ヒト含む)の体内に� ��ける細胞、あるいは一定に安定化した細胞� ��して株化された細胞等が含まれるがこれら� ��限定されない。

 本発明の好ましい例として、Plk1遺伝子を 標的遺伝子とするsiRNAを含有する組成物によ� ��て膀胱癌、肺癌、平滑筋肉腫、結腸癌、非� ��ジキンリンパ腫、乳癌、肝臓癌、胃癌、食� ��癌、子宮頸癌から採取された細胞の増殖を� ��害することができる。また、サバイビン遺� ��子を標的遺伝子とするsiRNAを含有する組成� �によって膀胱癌から採取された細胞の増殖� �阻害することができる。また、Cks1遺伝子を� ��的遺伝子とするsiRNAを含有する組成物によ� �て尿路上皮癌、口腔扁平上皮癌から採取さ� �た細胞の増殖を阻害することができる。さ� �に、Skp2遺伝子を標的遺伝子とするsiRNAを含� �する組成物によって尿路上皮癌、黒色腫か� �採取された細胞の増殖を阻害することがで� �る。

 本発明は、癌遺伝子の発現を阻害するsiRN Aを含む癌を治療または予防するための組成� �に関する。また、本発明は癌遺伝子の発現� �阻害するsiRNA組成物を対象に投与する工程を 含む、癌を治療または予防する方法に関する 。

 また、本発明は、癌を治療または予防す� ��ための組成物を製造するための癌遺伝子の� ��現を阻害するsiRNAの使用に関する。さらに� �本発明は、癌を治療または予防するための� �法に使用するための癌遺伝子の発現を阻害� �るsiRNAに関する。

 本発明の治療または予防の対象となる癌� ��しては、上記に挙げられた癌を挙げること� ��できる。

 本発明のsiRNAを遺伝子治療剤として使用� �る場合は、本発明のsiRNAを含む組成物を注射 により直接投与する方法のほか、核酸が組込 まれたベクターを投与する方法が挙げられる 。上記ベクターとしては、アデノウイルスベ クター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘル ペスウイルスベクター、ワクシニアウイルス ベクター、レトロウイルスベクター、レンチ ウイルスベクター等が挙げられ、これらのウ イルスベクターを用いることにより効率よく 投与することができる。

 また、本発明のsiRNAをリポソームなどの� �ン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与� �ることも可能である。siRNAやshRNAを保持させ� ��小胞体をリポフェクション法により所定の� ��胞に導入する。そして、得られる細胞を例� ��ば静脈内、動脈内等に全身投与する。また� ��組織等に局所的に投与することもできる。s iRNAはin vitroにおいては非常に優れた特異的� �写後抑制効果を示すが、in vivoにおいては血 清中のヌクレアーゼ活性により速やかに分解 されてしまうため持続時間が限られるためよ り最適で効果的なデリバリーシステム開発が 求められてきた。一つの例としては、Ochiya T らのNature Med. 5: 707-710,1999、Curr.Gene Ther. 1:� �31-52, 2001より生体親和性材料であるアテロ� �ラーゲンが核酸と混合し複合体を形成させ� �と、生体中の分解酵素から核酸を保護する� �用がありsiRNAのキャリアーとして非常に適し ているキャリアーであると報告されているが 、本発明の薬剤の導入の方法はこれには限ら れない。また、RNAの一部をDNAに変えてキメラ 型のsiRNAとすることで、血中での安定性を向� ��させることもできる。

 本発明の薬剤は、安全とされている投与量� ��範囲内において、ヒトを含む哺乳動物に対� ��て、必要量(有効量)が投与される。本発明� �薬剤の投与量は、剤型の種類、投与方法、� �者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して� �最終的には医師または獣医師の判断により� �宜決定することができる。一例を示せば、� �齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤� �によって異なるが、例えばアデノウイルス� �場合の投与量は1日1回あたり10 ⁶ ~10 ¹³ 個程度であり、1週~8週間隔で投与される。

 また、siRNAを目的の組織または器官に導� �するために、市販の遺伝子導入キット(例え� ��アデノエクスプレス:クローンテック社)を� �いることもできる。

 なお、本明細書において引用された全て� ��先行技術文献は、参照として本明細書に組� ��入れられる。