It ressort de t'étude de fart antérieur que de nombreux dérivés stéroïdes présentant le squelette suivant ont été synthétisés et que certains de ces dérivés présentent des propriétés pharmacologiques intéressantes.

Ainsi les brevets EP 57115, EP 156284 et EP 97572 décrivent des familles de dérivés stéroïdes qui déclinent de nombreuses possibilités dans le choix des groupes R1, R2, R3 et R4. Ces brevets constituent I'art antérieur de la présente invention.

Le brevet EP 262 188 décrit des dérivés stéroïdes comportant un cycle spirannique en position 17, néanmoins ce brevet ne décrit ni ne suggère la préparation des dérivés selon la présente invention.

L'objet de la présente invention est la synthèse de composés antagonistes de la progestérone.

La présente invention concerne les dérivés stéroïdes de formule :

Formule I dans laquelle OR est choisi dans le groupe formé par le radical hydroxyle (OH), les fonctions éthers dans lesquelles R, contenant de 1 à 8 atomes de carbone, est choisi parmi les groupes alkyle, alkényle, alkynyle linéaires ou ramifiés et les groupes comprenant un noyau aromatique, les fonctions esters dans lesquelles R est un radical acyle COR', dans lequel R'contenant de 1 à 8 atomes de carbone est choisi parmi les groupes alkyle, alkényle, alkynyle linéaires ou ramifiés et les groupes comprenant un noyau aromatique ainsi que leurs sels d'addition avec les acides.

La présente invention a pour objet les dérivés stéroïdes de formule I dans laquelle OR est choisi dans le groupe formé par le radical hydroxyle (OH), le radical méthoxyle et le radical 0-acétyle soit respectivement la (17R) 4', 5'-dihydro-5'hydroxy 11 ß/4 (diméthylamino) phényl/spiro (estra4,9- dien-17, 2'(3H)(3H) furan) 3one, la (17R) 4', 5'-dihydro-5'méthoxy 11ß/4 (diméthylamino) phényl/spiro (estra 4,9-dien-17, 2' (3H) furan) 3one et la (17R) 4', 5'-dihydro-5'acétoxy 11ß/4 (diméthylamino) phényl/spiro (estra 4,9- dien-17, 2' (3H) furan) 3one.

La présente invention a aussi pour objet les dérivés stéroïdes de formule A comprenant deux sites protégés par des groupements protecteurs de la fonction carbonyle. Le premier site correspond au groupement- C (OR1) (OR2), le deuxième correspond au groupement-C (OR3) (OR4) avec

Ri, R2, R3, R4 choisis parmi les groupes méthyle et éthyle ou encore Ri et R2 d'une part et R3 et R4 d'autre part forment ensemble un cycle comprenant 3 ou 4 atomes de carbone. De manière préférée Ri et R2 forment un cycle 1,3 dioxanne (à 4 atomes de carbone), R3 et R4 forment un cycle 1, 3 dioxolanne (à 3 atomes de carbone).

Dérivé A La présente invention concerne encore les procédés de synthèse de ces dérivés stéroïdes.

Le dérivé stéroïde A pour lequel-C (OR3) (OR4) est tel que R3 et R4 forment ensemble un cycle dioxolanne est obtenu par réaction dérivé magnésien du 3 bromopropionaldéhyde protégé

sur la cétone P.

P est alors le précurseur chimique de A

Dérivé P Parmi plusieurs voies de synthèse possibles du spirolactol B, la condensation du dérivé magnésien du 3 bromopropionaldéhyde protégé, sur la cétone en 17 du dérivé P a été retenue. L'hydrolyse acide permet ensuite en libérant les protections, 1) de générer la cétone conjuguée 3 one-4 ène par déshydratation, 2) de cycliser l'aldéhyde libéré, sur I'alcool tertiaire 17 (3, ce qui conduit au spirolactol B (2 anoméres) Le dérivé B est le lactol : (17R) 4', 5'-dihydro-5' hydroxy 11p/4 (diméthytamino) phényt/spiro (estra 4,9-dien-17,2' (3H) furan) 3one, de formule développée : Dérivé B

Pour illustrer les dérivés de formule I selon la présente invention dans laquelle OR est une fonction éther, il a été choisi de synthétiser le dérivé dans lequel R est un groupe méthyle.

Le dérivé stéroïde C (17R) 4', 5'-dihydro-5'methoxy 11ß/4 (diméthylamino) phenyl/spiro (estra 4,9-dien-17,2' (3H) furan) 3one est obtenu par réaction en milieu acide du méthanol sur le dérivé stéroïde B.

Dérivé C Pour illustrer les dérivés de formule I selon la présente invention dans laquelle OR est une fonction ester, la synthèse du dérivé pour lequel R est un groupe acétyle a été choisie.

Le dérivé stéroïde D (17R) 4', 5'-dihydro-5'acétoxv 11ß/4 (diméthylamino) phényl/spiro (estra 4,9-dien-17,2' (3H) furan) 3one est obtenu par réaction de I'anhydride acétique sur le dérivé stéroïde B.

Dérivé D

Les dérivés B, C, D exercent une activité antagoniste sur le récepteur de la progestérone. Ainsi, ces dérivés peuvent tre utilisés en tant que médicaments dans les domaines suivants : utilisation contraceptive, déclencheur de l'accouchement, dilatateur du col de l'utérus, modulation de la mobilité des spermatozoïdes, traitement de certaines maladies gynécologiques dont l'endométriose, les fibromes, les leïomyomes, les traitements des tumeurs dépendantes de la progestérone dont tumeurs du sein, des ovaires, des méninges, et d'une façon générale toutes les situations pathologiques liées à l'activité de la progestérone, comme par exemple certaines pathologies immunitaires.

Les dérivés B, C, D selon la présente invention exercent aussi une activité anti-glucocorticoïde et peuvent ainsi tre utilisés en tant que médicament dans les situations suivantes : traitement et prévention des complications induites par corticothérapie, stress et sevrage morphinique, traitement destinés à contrecarrer certains effets du cortisol, traitement des symptômes fiés à l'hypersécrétion de cortisol, étude de I'axe hypothalamo- hypophyso-surrénalien.

De façon plus détaillée, ces dérivés peuvent ainsi tre utilisés en tant que médicaments dans les applications suivantes : -Blocage du cortisol exogène, ce qui présente un intért dans la prévention et le traitement des complications induites par la corticothérapie : troubles cutanés, musculaires, osseux, ophtalmologiques.

-Blocage du cortisol endogène, lorsque celui-ci est présent à des taux trop élevés comme dans les situations de stress et de sevrage morphinique, dans ce cas un anti-glucocorticoïde peut tre intéressant pour traiter ou prévenir les conséquences de cette élévation, comme par exemple les pathologies immunitaires, les hypercatabolismes protidiques, les troubles neuromusculaires, le cortisol endogène peut aussi tre normal, dans ce cas un anti-glucocorticoide peut tre intéressant pour contrecarrer certains

effets du cortisol, comme par exemple la baisse de la pression artérielle ou des résistances vasculaires.

-Blocage du cortisol dans le cas de tumeurs sécrétant du cortisol : dans ce cas, un anti-glucocorticoïde permet de traiter les symptômes liés à l'hypersécrétion de cortisol (syndrome de Cushing). Un anticortisol peut tre intéressant comme test de diagnostic lorsque l'on veut étudier I'axe hypotalomo-hypophyso-surrénalien.

EXEMPLES EXEMPLE 1 : Synthèse du produit intermédiaire A Le produit intermédiaire A est synthétisé à partir de la cétone correspondante P.

La synthèse de la cétone correspondante P est effectuée conformément au mode opératoire détaillé à l'exemple 7 (stade A) du brevet EP0057 115.

Préparation du produit intermédiaire A : 1) Réaction de Grionard : Magnésien : Sous atmosphère d'argon anhydre, 30g (154 mmoles) de 2-(2-Bromoéthyl)-1-3-dioxanne(2-Bromoéthyl)-1-3-dioxanne (96% Aldrich) en solution dans 70 ml de THF anhydre, sont additionnés à 4g (166 mmoles) de magnésium activé en 30 minutes, en maintenant sous agitation à 30-35°C dans un bain d'eau.

On agite le milieu maintenu à 30°C pendant 3 heures.

On refroidit à-10°C et on introduit sous agitation, en 30 minutes : 5g (11 mmoles) de 17-céto-stéroïde P (Ex : 7 de EP 0 057 115) en solution dans 40 ml de THF anhydre à-10°C.

On agite 1 heure à température ambiante.

On refroidit dans un bain de glace, traité avec précautions par une solution aqueuse saturée de NH4CI, extrait par de t'éther, lave à 1'eau, sèche sur Na2SO4 anhydre et on distille à siccité. Poids de l'extrait sec : 15g.

La chromatographie sur 600g de silice, gradient d'élution : CH2CI2- Acétone (de 95-5 à 70-30 VN), livre 3,4g (6mmoles) du produit A sous forme d'une mousse de couleur crème.

Analvse du produit A Spectre de masse : M+. 567 Les spectres RMN (RMN'H et RMN13C) sont en conformité avec la formule du dérivé A.

Exemple 2 : Synthèse du produit B (Lactol) (17R) 4', 5'-dihvdro-5'hvdroxy 11t3/4 (diméthvlamino) phénvllspiro (estra 4,9-dien-17. 2' (3H) furan) 3one Le lactol B est obtenu par hydrolyse acide du produit intermédiaire A.

Dans un mélange : HCI 0,2N-THF 50-50 VN, on dissout sous argon : 3,4g (6 mmoles) de 17-hydroxy-stéroïde A ; on agite à 50°C durant 4 H 30 (on suit l'évolution de la réaction au moyen de la chromatographie en couche mince).

On neutralise dans un bain de glace par ajouts successifs d'une solution aqueuse saturée de NaHCO3. L'extraction par du CH2CI2 donne, après distillation 6 siccité, 2,83g d'une gomme beige.

La chromatographie sur 130g de silice, éluant : CH2CI2 à 10% d'acétone, livre 2,3g (5,15 mmoles) de lactol B (mousse solide de couleur paille).

Analyse du produit B Spectre de masse : M+. 447 La formule brute du produit B est C29H37N03, I'analyse centésimale obtenue par spectre de masse à haute résolution est en conformité avec cette formule brute.

Les spectres RMN (RMN'H et RMN13C) sont en conformité avec la formule développée du dérivé B.

Synthèse du chlorhydrate du dérivé B 100mg de lactol A sont mis sous agitation dans 20ml d'eau à 25% VN d'acétonitrile.

Sous agitation, on ajoute goutte par goutte de l'HCI 2N : on amène à pH 2,9 (pH-mètre), ce qui est suffisant pour obtenir une solution limpide. On amène à sec sous vide, au bain < 40°C, dans un ballon assez grand pour éviter les mousses. On reprend ensuite par 20ml d'eau et filtre sur"Millipore".

On concentre à 10mol et lyophilise. On isole 100mg de poudre beige.

II est à noter que le sel est très soluble dans ! 'eau, mais aussi dans les solvants chlorés.

Exemple 3 : Synthèse du produit C (éther méthylique du lactol) (17R) 4'. 5'- dihvdro-5'méthoxy 11t3/4 (diméthylamino) phénvl/spiro (estra 4,9-dien-17. 2' (3H) furan) 3one Ethérification : 100mg de lactol B sont mis sous agitation dans 1ml de méthanol en milieu acide. Au bout d'une nuit, on amène à sec sous vide et triture sous agitation magnétique durant 1 heure dans 3ml d'amoniaque 0,1 N. On essore, lave à )'eau et sèche sous vide pour obtenir une poudre.

Analvse du produit C Spectre de masse : M+. 461 La formule brute du produit C est C3H39NO3, I'analyse centésimale obtenue par spectre de masse à haute résolution est en conformité avec cette formule brute.

Les spectres RMN (RMN'H et RMN'3C) sont en conformité avec la formule développée du dérivé C.

EXEMPLE 4 : Synthèse du produit D (dérivé acétvlé du lactol) (17R) 4'. 5'- dihvdro-5'acétoxv 11 a/4 (diméthvlamino) phénvl/spiro (estra 4.9-dien-17,2' (3H) furan) 3one Acétylation : 100mg de lactol B sont mis sous agitation dans 1ml de pyridine + 1ml d'anhydride acétique. Au bout d'une nuit, on amène à sec sous vide et triture sous agitation magnétique durant 1 heure dans 3ml d'eau, on essore, lave à !'eau et sèche sous vide pour obtenir une poudre crème : 100mg.

On ne peut pas analyser la pureté en Chromatographie Couche Mince (CCM), le produit s'hydrolyse sur silice ou sur alumine. Le seul contrôle est la RMN1H. Le spectre RMN'H de ce produit acétylé permet de conclure qu'il est pur.

Analvse du produit D Spectre de masse : M+. 489 La formule brute du produit D est C29H37NO4, I'analyse centésimale obtenue par spectre de masse à haute résolution est en conformité avec cette formule brute.

Les spectres RMN (RMN'H et RMN13C) sont en conformité avec la formule développée du dérivé D.

ETUDE DE L'ACTIVITE DES PRODUITS SELON L'INVENTION SUR LES RECEPTEURS STEROIDIENS I Récepteur otucocorticoïde humain Matériel -Biomek 1000 Beckman couplé à un IBM PC modèle 50Z et à une imprimante papier Hewlett Packard Quiet Jet -Agitateur (Girotory shaker model G2 New Brunswick)

-Centrifugeuse Heraeus minifuge 2 type 4123 ou centrifugeuse Jouan GR4.11 -Scintillateur Pharmacia 1450 MicroBeta Réactifs -Tampon Tris 10 mM, Saccharose 0,25 M, Gélatine 1% o HCI qsp pH 7,4 auquel on ajoute extemporanément 2 mM de DTT et 20 mN de Molybdate de sodium Tris = Hydroxyméthylaminométhane (Merck) Saccharose (Merck) HCI 1 N (Merck ou Roussel-Uclaf) DTT = DL Dithiotreitol (Sigma) Molybdate de sodium 2H2O (Merck) -Suspension de charbon 1,25%-dextran T70 0,625% en tampon Tris 10 mM, Saccharose 0,25 M, HCI pH 7,4 Charbon = Noir Norit « SX » (Roussel-Ucla Dextran T70 (Pharmacia Fine Chemicals) -Scintillant Optiphase'Hisafe'3 (LKB Scintillation products) -Ethanol 99,9% (Roussel-Uclaf) -RU 28362 tritié, préparé par le sevice des radiomolécules RU (activité spécifique : 2,75 TBq/mmole-activité volumique : 18,5 MBq/ml).

Les résultats selon l'invention ont été testés à différentes concentrations en présence d'un véhicule.

Produits à tester * Véhicule : Tampon Tris 10 mM, saccharose 0,25 M, HCI qsp pH 7,4 et contenant 10% d'éthanol.

* Concentration (s) : variables de 1 nM à 25 000 nM Courbe 1 : 1-2,5-5-10-25-50-100-250-1000-2500-10000-25000 nM Courbe 2 : 10-25-50-100-250-1000-2500-10000-25 000 nM

Produit de référence <BR> <BR> <BR> <BR> * Dexamethasone : Courbe référence : 0-1-2,5-5-10-25-50-100-250-1000 nM Préparation et incubation du récepteur 1. Préparation du récepteur Préparation du récepteur réalisée par le laboratoire du Professeur Chambon (LGME de Strasbourg), selon le principe suivant : Le récepteur glucocorticoïde entier humain clone dans le Baculovirus est exprimé dans des cellules SF9 d'insecte.

Après infection par le Baculovirus recombinant, les cellules SF9 sont recueillies dans un tampon contenant 50 mM de Phosphate de Potassium, 5 mM de DTT, 20% de Glycérol et 20 mM de Molybdate de sodium.

Puis les cellules sont Iysées pour obtenir le récepteur. Après séparation en petits aliquots de 0,5 ml, I'extrait protéique est conservé dans azote liquide.

La dilution de travail de t'extrait protéique est déterminée par la méthode de Scatchard.

2. Incubation Des aliquots de 125 PI de t'extrait protéique des cellules SF9 (dilué de façon à obtenir 1 site de liaison, en tampon Tris 10 mM, saccharose 0,25 M, Gélatine 1% o HCI qsp pH 7,4 auquel on ajoute extemporanément 2 mM de DTT et 20 mM de Molybdate de sodium), sont incubées 24 heures à 0°C (en plaques polypropylène de 96 puits à fond U de chez Costar), avec 10 pLI de RU 28362 tritié à une concentration constante de 2,5 nM et 10, ul de concentrations croissantes (distribution par le Biomek 1000, soit de Dexamethasone froide (Courbe de référence), soit de concentrations croissantes des produits à tester (Courbes 1 et 2).

Les solutions mères des produits froids sont solubilisées dans l'méthanol absolu à la concentration de 3,625 mM. Les dilutions de ces solutions sont réalisées avec l'automate Biomek 1000.

La concentration de RU 28362 tritié lié est ensuite mesurée dans chaque incubat par la méthode d'absorption au charbon-dextran :

A 100 pI d'incubat (distribution par le Biomek 1000 en plaques de 96 puits à fond U de chez Greiner), on ajoute 100 ptl de la suspension de charbon- dextran. Après 10 minutes d'agitation à 350 rpm, la suspension est centrifugée 10 minutes à 2 500 rpm.

Un aliquot de 100 pI de surnageant (distribution par le Biomek 1000), est ajoutée à 225 d de Scintillant Optiphase'Hisafe'3 (distribution par le Biomek 1000) dans des plaques polyéthylène de 96 puits à fond U de chez Pharmacia.

Puis le comptage de la radioactivité de chaque échantillon est effectué sur 4 minutes.

3. Expression des résultats de méthodes de calcul Calcul de t'affinité relative de liaison (ARL) On trace les 2 courbes suivantes : pourcentage de l'hormone tritiée liée 100xB/BO en fonction du logarithme de la concentration de l'hormone de référence froide ou en fonction du logarithme de la concentration du produit froidtesté.

On détermine la droite d'équation suivante : Iso = 100 (BO/BO + Bmin/BO)/2 soit Iso = 100 (1 + Bmin/BO)/2 = 50 (I + Bmin/BO).

BO = concentration de l'hormone tritiée liée en l'absence de tout produit froid.

B = concentration de l'hormone tritiée liée en présence d'une concentration X de produit froid.

Bmin = concentration de t'hormone tritiée liée en présence d'un grand excès de l'hormone froide de référence (500 nM).

Les intersections de la droite Iso et des courbes, permettent d'évaluer les concentrations de l'hormone de référence froide (CH) et du produit froid testé (CX) qui inhibent de 50% la liaison spécifique de t'hormone tritiée sur le récepteur.

L'affinité relative de liaison (ARL) du produit testé est déterminée par t'équation : ARL = 100 (CH)/ (CX).

Les résultats de cette étude sont consignés dans le tableau ci- dessous.

II Récepteur progestérone humain Matériel -Biomek 1000 Beckman couplé à un IBM PC modèle 50Z et à une imprimante papier Hewlett Packard Quiet Jet -Agitateur (Girotory shaker model G2 New Brunswick) -Centrifugeuse Heraeus minifuge 2 type 4123 ou centrifugeuse Jouan GR4.11 -Scintillateur Pharmacia 1450 MicroBeta Réactifs -Tampon Tris 10 mM, Saccharose 0,25 M, Gélatine 1% o HCI qsp pH 7,4 Tris = Hydroxyméthylaminométhane (Merck) Saccharose (Merck) Gélatine from swine skin Type 1 (Sigma) HCI 1 N (Merck ou Roussel-Uclaf) -Suspension de charbon 1,25%-dextran T70 0,625% en tampon Tris 10 mM, Saccharose 0,25 M, Gélatine 1% o, HCI pH 7,4 Charbon = Noir Norit « SX » (Roussel-Ucla Dextran T70 (Pharmacia Fine Chemicals) -Scintillant Optiphase'Hisafe'3 (LKB Scintillation products) -Ethanol 99,9% (Roussel-Uclaf) -RU 5020 tritié, préparé par le sevice des radiomolécules RU (activité spécifique : 2,07 TBq/mmole-activité volumique : 18,5 MBq/ml).

Les résultats selon l'invention ont été testés à différentes concentrations en présence d'un véhicule.

Produits à tester * Véhicule : Tampon Tris 10 mM, saccharose 0,25 M, HCI qsp pH 7,4 et contenant 10% d'éthanol.

* Concentration (s) : variables de 1 nM à 25 000 nM Courbe 1 : 1-2,5-5-10-25-50-100-250-1000-2500-10000-25000 nM Courbe 2 : 10-25-50-100-250-1000-2500-10000-25000 nM Produit de référence * Progestérone : Courbe référence : 0-2,5-5-10-25-50-100-250-1000-2500nM Préparation et incubation du récepteur 1. Préparation du récepteur Préparation du récepteur réalisée par le laboratoire du Professeur Chambon (LGME de Strasbourg), selon le principe suivant : Le récepteur progestérone entier humain clone dans le Baculovirus, est exprimé dans des cellules SF9 d'insecte.

Après infection par le Baculovirus recombinant, les celluies SF9 sont recueillies dans un tampon contenant une concentration élevée en sel (Tris 20mM-HCI pH 8, EDTA 0,5 mM, DTT 2mM, glycérol 20%, KCI 400 mM), puis Iysées pour obtenir le récepteur.

Après séparation en petits aliquots de 0,5 ml, I'extrait protéique est conservé dans 1'azote liquide.

La dilution de travail de l'extrait protéique est déterminée par la méthode de Scatchard.

2. Incubation Des aliquots de 1,25 pl de l'extrait protéique des cellules SF9 (dilué en tampon Tris 10 mM, Saccharose 0,25 M, Gélatine 1% o, HCI pH 7,4 de façon à obtenir 1 site de liaison), sont incubées 24 heures à 0°C (en plaques polyéthylène de 96 puits à fond U de chez Costar), avec 10 1ll de RU 5020 tritié à une concentration constante de 2,5 mM et 10 ksi de concentrations croissantes (distribution par le Biomek 1000), soit de progestérone froide (Courbe de référence), soit de concentrations croissantes des produits à tester (Courbes 1 et 2).

Les solutions mères des produits froids sont solubilisées dans I'éthanol absolu à la concentration de 3,625 mM. Les dilutions de ces solutions sont réalisées avec I'automate Biomek 1000.

La concentration de RU 5020 tritié lié est ensuite mesurée dans chaque incubat par la méthode d'absorption au charbon-dextran : A 100 d d'incubat (distribution par le Biomek 1000 en plaques de 96 puits à fond U de chez Greiner), on ajoute 100 pil de la suspension de charbon- dextran. Après 10 minutes d'agitation à 350 rpm, la suspension est centrifugée 10 minutes à 2 500 rpm.

Un aliquot de 100 Kll de surnageant (distribution par le Biomek 1000), est ajoutée à 225 gui de Scintillant Optiphase'Hisafe'3 (distribution par le Biomek 1000) dans des plaques polyéthylène de 96 puits à fond U de chez Pharmacia.

Puis le comptage de la radioactivité de chaque échantillon est effectué sur 4 minutes.

3. Expression des résultats et méthodes de calcul Calcul de t'affinité relative de liaison (ARL) On trace les 2 courbes suivantes : pourcentage de l'hormone tritiée liée 100xB/BO en fonction du logarithme de la concentration de l'hormone de référence froide ou en fonction du logarithme de la concentration du produit froidtesté.

On détermine la droite d'équation suivante : Iso = 100 (BO/BO + Bmin/BO)/2 soit Iso = 100 (1 + Bmin/BO)/2 = 50 (1 + Bmin/BO).

BO = concentration de l'hormone tritiee liée en l'absence de tout produit froid.

B = concentration de l'hormone tritiée liée en présence d'une concentration X de produit froid.

Bmin = concentration de l'hormone tritiée liée en présence d'un grand excès de l'hormone froide de référence (500 nM).

Les intersections de la droite Iso et des courbes permettent d'évaluer les concentrations de l'hormone de référence froide (CH) et du produit froid testé (CX) qui inhibent de 50% la liaison spécifique de l'hormone tritiée sur le récepteur.

L'affinité relative de liaison (ARL) du produit testé est déterminée par t'équation : ARL = 100 (CH)/ (CX).

Les résultats de cette étude sont consignés dans le tableau ci-dessus.

Ut Récepteur estrogène humain Matériel -Biomek 1000 Beckman couplé à un IBM PC modèle 50Z et à une imprimante papier Hewlett Packard Quiet Jet -Agitateur (Girotory shaker model G2 New Brunswick) -Centrifugeuse Heraeus minifuge 2 type 4123 ou centrifu-geuse Jouan GR4.11 -Scintillateur Pharmacia 1450 MicroBeta Réactifs -Tampon Tris 10 mM, Saccharose 0,25 M, Gélatine 1% HCI qsp pH 7,4 Tris = Hydroxyméthylaminométhane (Merck) Saccharose (Merck) Gélatine from swine skin Type 1 (Sigma) HCI 1 N (Merck ou Roussel-Uclafl -Suspension de charbon 1,25%-dextran T70 0,625% en tampon Tris 10 mM, Saccharose 0,25 M, Gélatine 1% o, HCI pH 7,4 Charbon = Noir Norit « SX » (Roussel-Uclaf) Dextran T70 (Pharmacia Fine Chemicals) -Scintillant Optiphase'Hisafe'3 (LKB Scintillation products) -Ethanol 99,9% (Roussel-Uclaf) -Estradiol tritié, préparé par le service des radiomolécules RU (activité spécifique : 1,48 TBq/mmole-activité volumique : 37 MBq/ml).

Les résultats selon l'invention ont été testés à différentes concentrations en présence d'un véhicule.

Produits à tester * Véhicule : Tampon Tris 10 mM, saccharose 0,25 M, HCI qsp pH 7,4 et contenant 10% d'éthanol.

* Concentration (s) : variables de 1 nM à 25 000 nM

Courbe 1 : 1-2,5-5-10-25-50-100-250-1000-2500-10000-25000 nM Courbe 2 : 10-25-50-100-250-1000-2500-10000-25000 nM Produit de référence * Estradiol : Courbe référence : 0-1-2,5-5-10-25-50-100-250-1000 nM Préparation et incubation du récepteur 1. Préparation du récepteur Préparation du récepteur réalisée par le laboratoire du Professeur Chambon (LGME de Strasbourg), selon le principe suivant : Le récepteur estrogène entier humain cloné dans le Baculovirus est exprimé dans des cellules SF9 d'insecte.

Après infection par Baculovirus, les cellules SF9 sont recueillies dans un tampon contenant une concentration élevée en sel (Tris 20mM-HCI pH 8, EDTA 0,5 mM, DTT 2mM, glycérol 20%, KCI 400 mM), puis Iysées pour obtenir le récepteur.

Après séparation en petits aliquots de 0,5 ml, I'extrait protéique est conservé dans I'azote liquide.

La dilution de travail de l'extrait protéique est déterminée par la méthode de Scatchard.

2. Incubation Des aliquots de 1,25 pI de l'extrait protéique des cellules SF9 (dilué en tampon Tris 10 mM, saccharose 0,25 M, Gélatine 1% o, HCI pH 7,4 de façon à obtenir 1 site de liaison), sont incubées 24 heures à 0°C (en plaques polyéthylène de 96 puits à fond U de chez Costar), avec 10 zI d'estradiol tritié à une concentration constante de 2,5 mM et 10 1ll de concentrations croissantes (distribution par le Biomek 1000), soit d'estradiol froid (Courbe de référence), soit de concentrations croissantes des produits à tester (Courbes 1 et 2).

Les solutions mères des produits froids sont solubilisées dans t'éthanot absolu à la concentration de 3,625 mM. Les dilutions de ces solutions sont réalisées avec l'automate Biomek 1000.

La concentration d'estradiol tritié lié est ensuite mesurée dans chaque incubat par la méthode d'absorption au charbon-dextran : A 100 Fll d'incubat (distribution par le Biomek 1000 en plaques de 96 puits à fond U de chez Greiner), on ajoute 100 t. d de ta suspension de charbon- dextran. Après 10 minutes d'agitation à 350 rpm, la suspension est centrifugée 10 minutes à 2 500 rpm.

Un aliquot de 100 1ll de sumageant (distribution par le Biomek 1000), est ajoutée à 225 pI de Scintillant Optiphase'Hisafe'3 (distribution par le Biomek 1000) dans des plaques polyéthylène de 96 puits à fond U de chez Pharmacia.

Puis le comptage de la radioactivité de chaque échantillon est effectué sur 4 minutes.

3. Expression des résultats et méthodes de calcul Calcul de l'affinité relative de liaison (ARL) On trace les 2 courbes suivantes : pourcentage de l'hormone tritiée liée 100xB/BO en fonction du logarithme de la concentration de l'hormone de référence froide ou en fonction du logarithme de la concentration du produit froid testé.

On détermine la droite d'équation suivante : Iso = 100 (BO/BO + Bmin/BO)/2 soit Iso = 100 (1 + Bmin/BO)/2 = 50 (1 + Bmin/BO).

BO = concentration de t'hormone tritiée liée en l'absence de tout produit froid.

B = concentration de l'hormone tritiée liée en présence d'une concentration X de produit froid.

Bmin = concentration de t'hormone tritiée liée en présence d'un grand excès de l'hormone froide de référence (500 nM).

Les intersections de la droite Iso et des courbes, permettent d'évaluer les concentrations de l'hormone de référence froide (CH) et du produit froid testé (CX) qui inhibent de 50% la liaison spécifique de t'hormone tritiée sur le récepteur.

L'affinité relative de liaison (ARL) du produit testé est déterminée par t'équation : ARL = 100 (CH)/ (CX).

Les résultats de cette étude sont consignés dans le tableau ci- dessous.

IV Récepteur androgène Ce récepteur à été testé sur des animaux : Espèce : Rats castrés de 24 heures Souche : Sprague-Dawley Eleveur : Iffa Credo-Les Oncins (France) Sexe : Mâle Poids : 180-200 g Nbre d'animaux/dose : 20 à 30/expérience Tissu : Prostate Matériel -Broyeur potter Heidolph type 201 (verre/téflon)/moteur d'agitation Heidolph -Biomek 1000 Beckman coup) à un IBM PC modèle 50Z et à une imprimante papier Hewlett Packard Quiet Jet -Ultracentrifugeuse Beckman L8-70 ou ultracentrifugeuse Kontron Centrikon T-2070 -Agitateur (Girotory shaker model G2 New Brunswick) -Centrifugeuse Heraeus minifuge 2 type 4123 ou centrifugeuse Jouan GR4.11 -Scintillateur Pharmacia 1450 MicroBeta Réactifs -Tampon Tris 10 mM, Saccharose 0,25 M, HCI qsp pH 7,4 auquel on ajoute extemporanément 0,1 mM de PMSF, 20 mM de Molybdate de sodium et 2 mM de DTT Tris = Hydroxyméthyiaminométhane (Merck) Saccharose (Merck)

HCI 1 N (Merck ou Roussel-Uclaf) DTT = DL Dithiotréitol (Sigma) PMSF = Phénylméthansulfonylfluorid (Fluka) Molybdate de sodium 2H20 (Merck) -Solution de charbon 1,25%-dextran T70 0,625% en tampon Tris 10 mM, Saccharose 0,25 M, HCI pH 7,4 Charbon = Noir Norit « SX » (Roussel-Uclaf) Dextran T70 (Pharmacia Fine Chemicals) -Scintillant Optiphase'Hisafe'3 (LKB Scintillation products) -Ethanol 99,9% (Roussel-Uclaf) -Testostérone tritiée, préparée par le service des radiomolécules RU (activité spécifique : 2 TBq/mmole-activité volumique : 18,5 MBq/ml).

Les résultats selon l'invention ont été testés à différentes concentrations en présence d'un véhicule.

Produits à tester * Véhicule : Tampon Tris 10 mM, saccharose 0,25 M, HCI qsp pH 7,4 et contenant 10% d'éthanol.

* Concentration (s) : variables de 1 nM à 25 000 nM Courbe 1 : 1-2,5-5-10-25-50-100-250-1000-2500-10000-25 000 nM Courbe 2 : 10-25-50-100-250-1000-2500-10000-25000 nM Produit de référence * Testostérone : Courbe référence : 0-1-2,5-5-10-25-50-100-250-1000 nM Préparation et incubation du tissu 1. Préparation du tissu Les animaux sont sacrifiés et les prostates sont prélevées, pesées et homogénéisées à 0°C par un potter Kontes Dwall verre-verre, à I'aide du broyeur, à raison de 1 g de tissu pour 8 ml de tampon.

L'homogénat est ensuite ultracentrifugé à 4°C, 30 minutes à 209000 g.

En fin de centrifugation, le surnageant (cytosol) est récupéré.

2. Incubation

Des aliquots de 1,25 1ll de cytosol sont incubés 24 heures à 0°C (en plaques polyéthylène de 96 puits à fond U de chez Costar), avec 10 Kll de Testostérone tritiée à une concentration constante de 5 mM et 10 ll de concentrations croissantes (distribution par le Biomek 1000), soit de testostérone froide (Courbe de référence), soit de concentrations croissantes des produits à tester (Courbes 1 et 2).

Les produits froids sont solubilisés dans I'éthanol à la concentration de 3,625 mM. Les dilutions de cette solution mère sont réalisées avec un Biomek 1000.

La concentration de testostérone tritiee liée est ensuite mesurée dans chaque incubat par la méthode d'absorption au charbon-dextran : A 100 MI d'incubat (distribution par le Biomek 1000 en plaques de 96 puits à fond U de chez Greiner), on ajoute 100 pI de la suspension de charbon- dextran. Après 10 minutes d'agitation à 350 rpm, la suspension est centrifugée 10 minutes à 2500 rpm.

Un aliquot de 100 Ll de surnageant (distribution par le Biomek 1000), est ajoutée à 225 lli de Scintillant Optiphase'Hisafe'3 (distribution par le Biomek 1000) dans des plaques polyéthylène de 96 puits à fond U de chez Pharmacia.

Puis le comptage de la radioactivité de chaque échantillon est effectué sur 4 minutes.

3. Expression des résultats et méthodes de calcul Calcul de l'affinité relative de liaison (ARL) On trace les 2 courbes suivantes : pourcentage de t'hormone tritiée liée 100xB/BO en fonction du logarithme de la concentration de l'hormone de référence froide ou en fonction du logarithme de la concentration du produit froid testé.

On détermine la droite d'équation suivante : I50 = 100 (BO/BO + Bmin/BO)/2 soit Iso = 100 (1 + Bmin/BO)/2 = 50 (1 + Bmin/BO).

BO = concentration de t'hormone tritiee liée en l'absence de tout produit froid.

B = concentration de l'hormone tritiée liée en présence d'une concentration X de produit froid.

Bmin = concentration de t'hormone tritiée liée en présence d'un grand excès de t'hormone froide de référence (500 nM).

Les intersections de la droite 150 et des courbes, permettent d'évaluer les concentrations de l'hormone de référence froide (CH) et du produit froid testé (CX) qui inhibent de 50% la liaison spécifique de t'hormone tritiée sur le récepteur.

L'affinité relative de liaison (ARL) du produit testé est déterminée par l'équation : ARL = 100 (CH)/ (CX).

Les résultats de cette étude sont consignés dans le tableau ci- dessous.

V Récepteur minéralcorticolde Ce récepteur à été testé sur des animaux : Espèce : Rats surrénalectomisés de 5 à 8 jours Souche : Sprague-Dawley Eleveur : Iffa Credo-Les Oncins (France) Sexe : Mâle Poids : 140-160 g Nbre d'animaux/dose : 10/expérience (100 à 150 points) Tissu : Rein Matériel -Broyeur potter Heidolph type 201 (verre/téflon)/moteur d'agitation Heidolph -Biomek 1000 Beckman couplé à un IBM PC modèle 50Z et à une imprimante papier Hewlett Packard Quiet Jet -Ultracentrifugeuse Beckman L8-70 ou ultracentrifugeuse Kontron Centrikon T-2070 -Agitateur (Girotory shaker model G2 New Brunswick)

-Centrifugeuse Heraeus minifuge 2 type 4123 ou centrifugeuse Jouan GR4.11 -Scintillateur Beckman LS 1801 ou Scintillateur Beckman LS 5000 td Réactifs -Tampon Tris 10 mM, Saccharose 0,25 M, HCI qsp pH 7,4 Tris = Hydroxyméthylaminométhane (Merck) Saccharose (Merck) HCI 1 N (Merck ou Roussel-Uclaf) -Solution de charbon 1, 25%-dextran T70 0,625% en tampon Tris 10 mM, saccharose 0,25 M, HCI pH 7,4 Charbon = Noir Norit « SX » (Roussel-Ucla Dextran T70 (Pharmacia Fine Chemicals) -Aqualite (JT Baker) -Ethanol 99,9% (Roussel-Uclaf) -Aldostérone tritiée, préparée par le service des radiomolécules RU (activité spécifique : 1,85 TBq/mmole-activité volumique : 37 MBq/ml).

Les résultats selon l'invention ont été testés à différentes concentrations en présence d'un véhicule.

Produits à tester * Véhicule : Tampon Tris 10 mM, saccharose 0,25 M, HCI qsp pH 7,4 et contenant 10% d'éthanol.

* Concentration (s) : variables de 1 nM à 25 000 nM Courbe 1 : 1-2,5-10-25-100-250-1000-2500-10000-25000 nM Courbe 2 : 10-25-100-250-1000-2500-10000-25000 nM Produit de référence * Aldostérone : Courbe référence : 0-1-2,5-5-10-25-50-100-250-1000 nM Préparation et incubation du tissu 1. Préparation du tissu Les animaux sont sacrifiés par décapitation et les reins sont prélevés après perfusion in situ avec 50 ml de tampon Tris 10 mM, saccharose 0,25

M, HCI pH 7,4, pesés et homogénéisés à 0°C par un potter Thomas Téflon- verre, à I'aide du broyeur, à raison de 1 g de tissu pour 3 ml de tampon.

L'homogénat centrifugé à 0°C, 10 minutes à 800 g, puis du RU 28362 (stéroïde se fixant uniquement sur le récepteur glucocorticoïde), est ajouté au surnageant à la concentration finale de 10'6M afin d'éliminer la fixation de l'aldostérone tritiée sur le récepteur glucocorticoïde.

Ce surnageant est ensuite ultacentrifuge a 0°C, 30 minutes à 209 000 g. En fin de centrifugation, le surnageant (cytosol) est récupéré.

2. Incubation Des aliquots de 1,251ll de cytosol sont incubés -1 heure à 0°C dans le cas de molécules non stéroïdes -24 heures à 0°C dans le cas de molécules stéroïdes avec 10 gli d'aldostérone tritiée à une concentration constante de 5 nM et 10 lil de concentrations croissantes (distribution par le Biomek 1000), soit d'aldostérone froide (Courbe de référence), soit de concentrations croissantes des produits à tester (Courbes 1 et 2).

Les produits froids sont solubilisés dans I'éthanol à la concentration de 3,625 mM. Les dilutions de cette solution mère sont réalisées avec un Biomek 1000.

La concentration d'aldostérone tritiée liée est ensuite mesurée dans chaque incubat par la méthode d'absorption au charbon-dextran : A 100 lli d'incubat, on ajoute 100 FI de la suspension de charbon-dextran.

Après 10 minutes d'agitation à 350 rpm, la suspension est centrifugée 10 minutes à 2 500 rpm.

Un aliquot de 125 pI de sumageant est mise dans un flacon à scintillation Packard, auquel on ajoute 5 mi de scintillant Aqualite.

Le comptage de la radioactivité de chaque échantillon est effectué sur 4 minutes.

3. Expression des résultats et méthodes de calcul Calcul de l'affinité relative de liaison (ARL)

On trace les 2 courbes suivantes : pourcentage de l'hormone tritiée tiée 100xB/BO en fonction du logarithme de la concentration de t'hormone de référence froide ou en fonction du logarithme de la concentration du produit froid testé. <BR> <BR> <BR> <P>On détermine la droite d'équation suivante :<BR> <BR> <BR> 150 = 100 (BO/BO + Bmin/BO)/2 soit Iso = 100 (1 + Bmin/BO)/2 = 50 (1 +<BR> <BR> <BR> Bmin/BO).

BO = concentration de l'hormone tritiée liée en l'absence de tout produit froid.

B = concentration de l'hormone tritiée liée en présence d'une concentration X de produit froid.

Bmin = concentration de t'hormone tritiée liée en présence d'un grand excès de t'hormone froide de référence (500 nM).

Les intersections de la droite Iso et des courbes, permettent d'évaluer les concentrations de t'hormone de référence froide (CH) et du produit froid testé (CX) qui inhibent de 50% la liaison spécifique de l'hormone tritiée sur le récepteur.

L'affinité relative de liaison (ARL) du produit testé est déterminée par t'équation : ARL = 100 (CH)/ (CX).

Les résultats de cette étude sont consignés dans le tableau ci- dessous.

Tableau Affinité des produits pour les récepteurs hormonaux Produit test6 Produit B Produit B'Produit C Témoin sous Ether mifépristone, Récepteur (lactol forme de méthylique sel soluble (en % du produit base) sel (sel de référence) soluble) Glucocorticoïde 75 23 15 63 75 23 15 63 (dexamethasone) Progestérone 303 92 104 140 Estrogène 0 NT NT NT 0 NT (Estradiol) Androgène 32 NT NT NT (Testostérone) wMineralcorticoïde NT NT NT (Aldostérone)

NT signifie que le dérivé n'a pas été testé sur le récepteur considéré.

Activités abortives : Produit B (lactol) : 3mg/kg p. o. =0% ; 10mg/kg = 75% Produit B' (sel soluble) : 3mg/kg i. v. =75% ; 3mg/kg p. o. = 25% Produit C (Ether méthylique, sel soluble) : 3mg/kg i. v. =50% ; 3mg/kg p. o. =<BR> 0% Produit D (Ether acétyl base) : 3mg/kg p. o. = 0% Témoin mifépristone, sel soluble : 3mg/kg i. v. =100% ; 1 mg/kg i v. = 33% ; 3mg/kg p. o. = 25% Témoin mifépristone 1mg/kg i. v. =25% ; 3mg/kg i. v. = 100% ; 1mg/kg p. o. = 0%, 10mg/kg p. o. = 100%

Les dérivés étudiés présentent une affinité pour le récepteur progestérone, lteffet abortif du lactol permet de conclure que cette activité est de nature antagoniste. Ces dérivés, et notamment le lactol peut donc tre utilisé en tant que médicament anti-progestérone.

Ces dérivés exercent en outre une affinité pour le récepteur glucocorticoïde.

Dans la mesure où un dérivé anti-progestérone est aussi un anti- glucocorticoïde, on peut prévoir ces dérivés exercent une activité anti- glucocorticoïde.