Glvcokon jugate von 20fS)-CamPtothecin Die vorliegende Erfindung betrifft Glycokonjugate von 20(S)-Camptothecin, in denen ein 3-O-methylierter -L-Fucose-Baustein über Thioharnstoff-modifizierte Peptid- spacer mit der 20-Hydroxylgruppe eines Camptothecin-Derivats verknüpft ist. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemä en Ver- bindungen sowie deren Verwendung als Arzneimittel, insbesondere im Zusammen- hang mit Krebserkrankungen.

20(S)-Camptothecin ist ein pentacyclisches Alkaloid, das 1966 von Wall et al. isoliert wurde (J.Am.Chem.Soc. 88, 3888 (1966)). Es besitzt ein hohes Antitumor-Wirk- potential in zahlreichen In-vitro- und In-vivo-Tests. Leider scheiterte jedoch die Reali- sierung des vielversprechenden Potentials in der Klinik an Toxizitäts- und Löslich- keitsproblemen.

Durch Öffnung des E-Ring-Lactons und Bildung des Natriumsalzes wurde eine wasserlösliche Verbindung erhalten, die in einem pH-abhängigen Gleichgewicht mit der ringgeschlossenen Form steht. Klinische Studien führten auch hier bisher nicht zum Erfolg.

Etwa 20 Jahre später wurde gefunden, da die biologische Aktivität auf eine Enzym- inhibition der Topoisomerase I zurückzuführen ist. Seither wurden die Forschungs- aktivitäten wieder verstärkt, um verträglichere und in-vivo wirksame Camptothecin- Derivate zu finden.

Zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit wurden Salze von A-Ring- und B-Ring- modifizierten Camptothecin-Derivaten sowie von 20-O-Acyl-Derivaten mit ionisier- baren Gruppen beschrieben (Vishnuvajjala et al. US 4943579). Letzteres Prodrug- Konzept wurde später auch auf modifizierte Camptothecin-Derivate übertragen (Wani et al. WO 9602546). Die beschriebenen 20-O-Acyl-Prodrugs haben allerdings in-vivo eine sehr kurze Halbwertszeit und werden sehr schnell zum Grundkörper gespalten.

In WO 963 1532 Al wurden zuckermodifizierte Cytostatika beschrieben, bei denen die Verknüpfung von verschiedenen cytotoxischen oder cytostatisch aktiven Verbin- dungen mit z.B. regioselektiv modifizierten Kohlenhydratbausteinen über bestimmte Spacer zu einer Verbesserung der Tumorselektivität führte. Aus den dort breit beschriebenen Kombinationen von Kohlenhydrat, Spacer und Wirkstoff fanden wir nun überraschend, da die Anknüpfung von in 3-Stellung modifizierten -L-Fucose- bausteinen über einen Thioharnstoff-modifizierten Peptid-Spacer, bestehend aus einer sterisch anpruchsvollen unpolaren und einer basischen Aminosäure an die 20- Hydroxyl-Gruppe von 20(S)-Camptothecin zu ganz besonders bevorzugten Konju- gaten mit folgenden Eigenschaften führt: - Durch die esterartige Anknüpfung des Carrier-Rests an die 20-Hydroxyl- gruppe wird der für die Wirkung wichtige Lactonring im Camptothecin-Teil stabilisiert.

- Durch die spezielle Konstellation der Dipeptid-Spacer weisen die Konjugate in extrazellulärem Medium und in Blut eine im Vergleich zu ähnlichen, zuvor in WO 9631532 beschriebenen Konjugaten mit anderen Spacern nochmals deutlich verbesserte Stabilität auf. Insbesondere sind die erfindungsgemä en Konjugate stabiler als die in US 4943579 beschriebenen 20-O-Acyl-Prodrugs von Camptothecin.

- Die erfindungsgemä en Konjugate sind im Vergleich zu ähnlichen Konjugaten aus WO 963 1532 besser wasserlöslich.

- Die erfindungsgemä en Konjugate zeigen in-vitro eine hohe Aktivität gegen- über Tumorzellinien und Tumorxenografts.

- Die erfindungsgemä en Konjugate zeigen in-vivo nach i.v.-Applikation exzellente therapeutische Wirksamkeit über mehrere Dosisstufen gegenüber verschiedenen Tumoren.

- Sie weisen gegenüber dem zugrundeliegenden Toxophor eine deutlich höhere Verträglichkeit und Tumorselektivität insbesondere im Hinblick auf Knochen- marktoxizität auf.

Die Erfindung betrifft Verbindungen der Formel (I) worin R1 für eine sterisch anspuchsvolle unpolare Seitenkette einer Aminosäure steht und R2 für eine basische Seitenkette einer Aminosäure steht

sowie deren Salze, Stereoisomere und Stereoisomerengemische.

Bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), worin R1 für einen verzweigten Alkylrest mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen steht und R2 für einen Rest der Formel -(CH2)n-R3 steht, wobei R3 -NH2, bedeutet und n für eine Zahl 1 bis 4 steht.

Besonders bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel (I), worin R1 für einen verzweigten Alkylrest der Formeln steht und R2 für einen Rest der Formeln

cHMNH -(CH2)2-NH2, -(CH2)3-NH2, -(CH2)4-NH2, CH2 2 oder NH -(CH2)uNHNH2 steht.

Der Camptothecin-Baustein kann in der 20(R)- oder in der 20(S)-Konfiguration oder als Gemisch dieser beiden steroisomeren Formen vorliegen. Bevorzugt ist die 20(S)- Konfiguration.

Die Aminosäuren können in der L- oder in der D-Konfiguration auftreten oder auch als Gemisch von D- und L-Form.

Der Begriff ,,Aminosäuren" bezeichnet insbesondere die in der Natur vorkommenden ot-Aminosäuren, umfa t darüber hinaus aber auch deren Homologe, Isomere und Derivate. Als Beispiel fur Isomere können Enantiomere genannt werden. Derivate können beispielsweise mit Schutzgruppen versehene Aminosäuren sein.

Unter Aminosäuren mit "sterisch anspruchsvollen" Seitenketten werden solche Aminosäuren verstanden, deren Seitenkette in der - oder y-Position eine Verzwei- gung aufweist; als Beispiele seien Valin und Isoleucin bzw. Leucin genannt.

Als typische Beispiele für Aminosäuren mit unpolaren Seitenketten seien genannt: Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Tryptophan, Phenylalanin, Methionin.

Als typische Beispiele für Aminosäure mit basischen Seitenketten seien genannt: Lysin, Arginin, Histidin, Ornithin, Diaminobuttersäure.

Die erfindungsgemä en Verbindungen liegen bevorzugt in Form ihrer Salze vor. Im allgemeinen seien hier Salze mit organischen oder anorganischen Säuren genannt.

Zu den Säuren, die addiert werden können, gehören vorzugsweise Halogenwasser- stoffsäuren, wie z.B. die Chlorwasserstoffsäure und die Bromwasserstoffsäure, insbe- sondere die Chlorwasserstoffsäure, ferner Phosphorsäure, Salpetersäure, Schwe- felsäure, mono- und bifunktionelle Carbonsäuren und Hydroxycarbonsäuren, wie z.B.

Essigsäure, Trifluoressigsäure, Maleinsäure, Malonsäure, Oxalsäure, Gluconsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Salizylsäure, Sorbinsäure und Milchsäure sowie Sulfonsäuren, wie z.B. p-Toluolsulfonsäure, 1,5-Naphthalindi sulfonsäure oder Camphersulfonsäure.

Die erfindungsgemä en Glycokonjugate können beispielsweise hergestellt werden durch Verknüpfung von 20(S)-Camptothecin mit aktivierten Carboxylkomponenten, die ihrerseits Teile von geschützten Aminosäuren, Peptiden oder kohlenhydratmodifi- zierten Peptiden darstellen können.

Bevorzugt erfolgt der Aufbau des Glycokonjugats sequentiell, beginnend mit der Acylierung von 20(S)-Camptothecin mit einem N-geschützten carboxyl-aktivierten Baustein einer unpolaren sterisch anspruchsvollen Aminosäure in einem geeigneten Lösungsmittel, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, nach üblichen Methoden.

Anschlie end wird mittels bekannter Methoden selektiv die Aminoschutzgruppe abgespalten. Dann wird ein falls notwendig geeignet geschützter Baustein einer basischen Aminosäure angeknüpft und anschlie end gegebenenfalls unter Erhalt der Seitenkettenschutzgruppe an der o-Aminofunktion deblockiert. Im Schlüsselschritt erfolgt die Verknüpfung mit dem Kohlenhydratrest durch Überführung von p-Amino- phenyl-3-O-methyl- -L-fucopyranosid in das entsprechende Isothiocyanat und an- schlie ende Verknüpfung mit der deblockierten oe-Aminogruppe des Peptidyl- Camptothecins. Gegebenenfalls noch vorhandene Seitenkettenschutzgruppen werden abgelöst und die freie Aminogruppe wird gegebenenfalls in ein geeignetes Ammo- niumsalz überführt.

Die Erfindung betrifft somit weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Glyco- konjugate der Formel (I)

worin R1 für eine sterisch anspruchsvolle unpolare Seitenkette einer Aminosäure steht und R2 für eine basische Seitenkette einer Aminosäure steht, oder von deren Salzen, dadurch gekennzeichnet da man das Isothiocyanat der Formel (II) mit dem gegebenenfalls in der Seitenkette eine Schutzgruppe tragenden Peptidyl- Camptothecin der Formel (III)

worin R1 die obengenannte Bedeutung hat und R2 die Bedeutung des obengenannten basischen Rests R2 hat, der darüberhinaus an der basischen Gruppe eine in der Peptidchemie übliche Schutzgruppe tragen kann zu dem Glycokonjugat der Formel (IV)

worin R1 und R2 die oben angegebenen Bedeutungen haben, umsetzt, die gegebenenfalls vorhandene Seitenketten-Aminoschutzgruppe nach üblichen Me- thoden abspaltet und die erhaltene Verbindung gegebenenfalls in das gewünschte Salz überführt.

Denkbar ist auch eine andere Abfolge der Reaktionsschritte beim Aufbau der Zielver- bindung. So kann gemä einer ebenfalls bevorzugten Variante das p-Isothiocyanato- phenyl-3-O-methyl- -L-fucosid auch zuerst mit der gegebenenfalls geeignet geschütz- ten terminalen basischen Aminosäure verknüpft werden, und dieser Baustein anschlie- end mit der freien Aminogruppe des Aminosäurekonjugats aus 20(S)-Camptothecin und der unpolaren, sterisch anspruchsvollen Aminosäure umgesetzt werden. Gegebe- nenfalls vorhandene Seitenkettenschutzgruppen werden abgelöst und die freie Amino- gruppe gegebenenfalls in ein geeignetes Ammoniumsalz überführt.

Die Erfindung betrifft daher weiterhin ein alternatives Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder von deren Salzen, dadurch gekenn- zeichnet, da man das Isothiocyanat der Formel (II) mit einer gegebenenfalls geeignet geschützten terminalen basischen Aminosäure der Formel (V)

worin R2 für eine basische Seitenkette einer Aminosäure steht, deren basische Gruppe geschützt sein kann, zu einem Aminosäurekonjugat der Formel (VI) worin R2 die vorstehend angegebene Bedeutung hat, umsetzt, diese dann mit Aminosäurekonjugaten der Formel (VII) worin R1 die vorstehend angegebene Bedeutung hat, umsetzt

die Seitenkettenschutzgruppe abspaltet und die Verbindungen gegebenenfalls in ein geeignetes Salz überführt.

Insbesondere nach Anknüpfung der ersten Aminosäure an Camptothecin können Diastereomerengemische entstehen. Reine Diastereomere der erfindungsgemä en Verbindungen lassen sich nach den oben angegebenen Verfahren beispielsweise herstellen, in dem man nach Anknüpfung des ersten Aminosäurebausteins an das Camptothecin und anschlie ender Schutzgruppenabspaltung die Diastereomere in geeigneter Weise trennt. Aus einer diastereomerenreinen Zwischenverbindung kann auf dem oben angegebenen Weg die diastereomerenreine Zielverbindung hergestellt werden.

Es kann auch das Diastereomerengemisch der Zielverbindung in üblicher Weise in die einzelnen Diasteromere aufgetrennt werden.

Die Reaktionen können bei verschiedenen Druck- und Temperaturverhältnissen, bei- spielsweise 0,5 bis 2 bar, bzw. -30 bis +1000C, in geeigneten Lösungsmitteln wie Dimethylformamid (DMF), Tetrahydrofuran (THF), Dichlormethan, Chloroform, niederen Alkoholen, Acetonitril, Dioxan, Wasser oder in Gemischen der genannten Lösungsmittel durchgeführt werden. In der Regel sind Reaktionen in Dichlormethan oder THF/Dichlormethan bei Raumtemperatur und Normaldruck bevorzugt.

Für die Aktivierung der Carboxylgruppen kommen die in der Peptidchemie bekannten Kupplungsreagenzien wie sie z.B. in Jakubke/Jeschkeit: Aminosäuren, Peptide, Proteine; Verlag Chemie 1982 oder Tetrahedr. Lett. 34, 6705 (1993) beschrieben sind, in Frage. Bevorzugt sind beispielsweise N-Carbonsäureanhydride, Säurechloride oder gemischte Anhydride.

Weiterhin geeignet zur Aktivierung der Carboxylgruppen ist die Bildung von Addukten mit Carbodiimiden z.B. N,N'-Diethyl-, N,N'-Diisopropyl-, N,N'-Dicyclo-

hexylcarbodiimid, N-(3 -Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carb odiimid-Hydrochlorid, N-Cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-metho-p-tolu olsulfonat, oder Car- bonylverbindungen wie Carbonyldiimidazol, oder 1,2-Oxazoliumverbindungen wie 2-Ethyl-5 -phenyl- 1 ,2-oxazolium-3 -sulfat oder 2-tert-Butyl-5 -methyl-isoxazolium-per- chlorat, oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy- 1 -ethoxycarbonyl- 1, 2-dihydro- chinolin, oder Propanphosphonsäureanhydrid, oder Chlorameisensäureisobutylester, oder BenzOtriazolylOxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium-hexafluor ophosphat, l-Hydroxybenzotriazol- oder N-Hydroxysuccinimidester. Weiterhin kann die Amino- säurekomponente auch in Form eines Leuchs'schen Anhydrids eingesetzt werden.

Als Basen können beispielsweise Triethylamin, Ethyl-diisopropylamin, Pyridin, N,N- Dimethylaminopyridin oder andere eingesetzt werden.

Als Schutzgruppen für Drittfunktionen der Aminosäuren können die in der Peptid- chemie bekannten Schutzgruppen beispielsweise vom Urethan-, Alkyl-, Acyl-, Ester- oder Amid-Typ eingesetzt werden.

Aminoschutzgruppen im Rahmen der Erfindung sind die üblichen in der Peptid- Chemie verwendeten Aminoschutzgruppen.

Hierzu gehören bevorzugt: B enzyloxycarbonyl, 3 ,4-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 2,4-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 4-Methoxy- benzyloxycarbonyl, 4-Nitrobenzyloxycarbonyl, 2-Nitrobenzyloxycarbonyl, 2-Nitro- 4,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, tert-Butoxy- carbonyl (Boc), Allyloxycarbonyl, Vinyloxycarbonyl, 3,4,5-Trimethoxybenzyloxy- carbonyl Phthaloyl, 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl, 2,2,2-Trichlor-tert-butoxy- carbonyl, Menthyloxycarbonyl, 4-Nitrophenoxycarbonyl, Fluorenyl-9-methoxy- carbonyl (Fmoc), Formyl, Acetyl, Propionyl, Pivaloyl, 2-Chloracetyl, 2-Bromacetyl, 2,2,2-Trifluoracetyl, 2,2,2-Trichloracetyl, Benzoyl, Benzyl, 4-Chlorbenzoyl, 4-Brom- benzoyl, 4-Nitrobenzoyl, Phthalimido, Isovaleroyl oder Benzyloxymethylen, 4-Nitro-

benzyl, 2,4-Dinitrobenzyl, 4-Nitrophenyl oder 2-Nitrophenylsulfenyl. Besonders bevorzugt sind die Fmoc-Gruppe und die Boc-Gruppe.

Bevorzugte Carboxylschutzgruppen sind lineare oder verzweigte C1- bis C4-Alkyl- ester.

Die Abspaltung von Schutzgruppen in entsprechenden Reaktionsschritten kann zum Beispiel durch Säure- oder Base-Einwirkung, hydrogenolytisch oder auf andere Weise reduktiv erfolgen.

Die erfindungsgemä en Glycokonjugate weisen sowohl in-vitro als auch in-vivo eine überraschend starke Antitumor-Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Tumoren, ins- besondere Lungen-, Brust-, Pankreas-, Melanom- und Dickdarm-Tumoren, verbunden mit einer gro en Selektivität gegenüber nicht-malignen Zellen auf.

Sie eignen sich daher zur Behandlung von Krebserkrankungen und zwar sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin.

Zur vorliegenden Erfindung gehören pharmazeutische Zubereitungen, die neben nicht- toxischen, inerten pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen eine oder mehrere erfin- dungsgemä e Verbindungen enthalten oder die aus einem oder mehreren erfindungs- gemä en Wirkstoffen bestehen, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Zuberei- tungen.

Die Wirkstoffe können gegebenenfalls in einem oder mehreren der oben angegebenen Trägerstoffe auch in mikroverkapselter Form vorliegen.

Die therapeutisch wirksamen Verbindungen sollen in den oben aufgeführten pharma- zeutischen Zubereitungen in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 99,5, vorzugsweise von etwa 0,5 bis 95 Gew.-%, der Gesamtmischung vorhanden sein.

Die oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen können au er der erfindungs- gemä en Verbindung auch weitere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten.

Im allgemeinen hat es sich sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin als vorteilhaft erwiesen, den erfindungsgemä en Wirkstoff in Gesamtmengen von etwa 0,5 bis etwa 500, vorzugsweise 5 bis 100 mg/kg Körpergewicht je 24 Stunden, gegebenenfalls in Form mehrerer Einzelgaben, zur Erzielung der gewünschten Ergeb- nisse zu verabreichen. Eine Einzelgabe enthält den oder die erfindungsgemä en Wirk- stoffe vorzugsweise in Mengen von etwa 1 bis etwa 80, insbesondere 3 bis 30 mg/kg Körpergewicht.

Biologische Testung 1. Wachstumsinhibitionstest zur Bestimmung der cytotoxischen Eigen- schaften: Die humanen Dickdarmzellinien SW 480 und HT 29 (ATCC-Nr. CCL 228 und HBT 38) sowie die Maus-Melanom-Zellinie B16F10 (CRL 6475) wurden in Rouxschalen in RPMI 1640 Medium unter Zusatz von 10 % FCS gezogen.

Anschlie end wurde trypsiniert und in RPMI plus 10 % FCS zu einer Zellzahl von 50.000 Zellen/ml für SW 480 und HT 29 und 20.000 Zellen für B16F10 aufgenommen. 100 ul Zellsuspension/Well wurden in eine 96 Mikrowellplatte gegeben und 1 Tag bei 37°C im CO2-Brutschrank inkubiert. Anschlie end wurden weitere 100 Cil RPMI Medium und 1 u1 DMSO mit den Prüfsub- stanzen zugesetzt. Das Wachstum wurde nach Tag 6 überprüft. Dazu wurde zu jedem Mikrowell 25 po MTT-Lösung (3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-- 2,5-diphenyltetrazolinbromid) mit einer Ausgangskonzentration von 5 mg/ml H2O zugesetzt. Es wurde 5 Stunden im CO2-Brutschrank bei 37°C inkubiert.

Anschlie end wurde das Medium abgesaugt und 100 kl i-Propanol/Well zugesetzt. Nach 30 min Schütteln mit 100 ul H20 wurde die Extinktion bei 595 nm mit einem Multiplate Reader (Bio..) 3550-UV gemessen.

Die cytotoxische Wirkung ist in der Tabelle 1 als IC50-Wert jeweils für die SW 480- und HT 29- und B16F10-Zellinie angegeben: Tabelle 1: Beispiel IC50/nM IC50/nM IC50/nM SW480 HT29 B16F10 20(S)-Camptothecin 10 5 20 Beispiel 1 70 40 200 Beispiel 2 100 40 300 Beispiel 3 100 20 500 Beispiel 4 100 20 500 Beispiel 5 80 50 200 Beispiel 6 60 30 300 Beispiel 7 80 30 20 Beispiel 8 200 100 800 Beispiel 9 200 70 400 Beispiel 10 100 50 300

2. Hämatopoetische Aktivität des Glycokonjugats im Vergleich zum zugrundeliegenden Wirkstoff: Material und Methoden: Knochenmarkzellen wurden aus dem Femur der Maus gespült. 105-Zellen wurden in McCoy 5A-Medium (0,3 % Agar) zusammen mit rekombinanten murinen GM-CSF (Genzyme; Stammzellen-Kolonienbildung) und den Sub- stanzen (10-4 bis 100 pg/ml) bei 37°C und 7 % CO2 inkubiert. 7 Tage später wurden die Kolonien (<50 Zellen) und Kluster (17-50 Zellen) ausgezählt.

Ergebnisse: Wie in Tab. 2 dargestellt, zeigen die untersuchten Glycokonjugate eine gegen- über dem zugrundeliegenden Wirkstoff drastisch verminderte Hemmung der Knochenmarkstammzellproliferation.

Tabelle 2: Hemmung der CSF-induzierten Proliferation von Knochenmarkstammzellen der Maus IC50 [ng/ml] 20(S)-Camptothecin 0,05 Beispiel 1 15 Beispiel 2 30 Beispiel 3 15 Beispiel 4 15 Beispiel 5 20 Beispiel 6 10 Beispiel 7 8 Beispiel 8 @ 45 Beispiel 9 15 Beispiel 10 30

3. In-vivo-Hemmung des Tumorwacbstums im Nacktmaus-Modell Material: Für alle in-vivo-Experimente zur Untersuchung der Hemmung des Tumor- wachstums wurden athymische Nacktmäuse (NMRI nu/nu-Stamm) verwendet.

Das ausgewählte gro zellige Lungenkarzinom LXFL 529 wurde durch serielle Passage in Nacktmäusen entwickelt. Der menschliche Ursprung des Tumors wurde durch isoenzymatische und immunohistochemische Methoden belegt.

Experimenteller Aufbau: Der Tumor wurde subcutan in beide Flanken von 6 bis 8 Wochen alten nu/nu- Nacktmäusen implantiert. Die Behandlung wurde abhängig von der Verdopp- lungszeit gestartet, sobald die Tumoren einen Durchmesser von 5-7 mm erreicht hatten. Die Mäuse wurden der Behandlungsgruppe und der Kontroll- gruppe (5 Mäuse pro Gruppe mit 8 - 10 auswertbaren Tumoren) durch Randomisieren zugeteilt. Die einzelnen Tumoren der Kontrollgruppe wuchsen alle progressiv.

Die Grö e der Tumoren wurde in zwei Dimensionen mittels Schieblehre ver- messen. Das Tumorvolumen, das gut mit der Zellzahl korreliert, wurde an- schlie end für alle Auswertungen verwendet. Das Volumen wurde gemä der Formel "Länge x Breite x Breite / 2" berechnet ([a x b2] / 2, a bzw. b stehen für zwei rechtwinklig angeordnete Durchmesser).

Die Werte des relativen Tumorvolumens (RTV) wurden für jeden einzelnen Tumor durch Dividieren der Tumorgrö e am Tag X mit der Tumorgrö e des Tages 0 (zum Zeitpunkt der Randomisierung) berechnet. Die mittleren Werte des RTV wurden dann für die weitere Auswertung verwendet.

Die Hemmung des Tumorvolumens (relatives Tumorvolumen der Test- gruppe/Kontrollgruppe x 100, T/C in %) war der abschlie ende Me wert.

Behandlung: Die Applikation der Verbindungen erfolgte beispielsweise an Tag 0, 1 und 2 nach Randomisierung intravenös (i.v.), wobei die Gesamtdosis pro Tag über 2 Gaben gesplittet wurde.

Ergebnisse: Die therapeutische Wirksamkeit der erfindungsgemä en Glycokonjugate aus Beispiel 1 und 2 ist beispielhaft am gro zelligen humanen Lungentumorxeno- graft LXFL 529 dargestellt. Die Therapie fuhrt bei der maximal tolerablen Dosis (MTD) und bei 1/2 MTD zur kompletten bis deutlichen Tumor- remission. Auch an anderen Tumoren kann eine exzellente Wirkung demon- striert werden.

Tabelle 3: Therapie Dosis Überlebens- Zahl der opt. relatives [mg/kg/Tag] zeit [Tage] Tumoren T/C Körpergewicht [%] an Tag 7 [% des Tages 0] Kontrolle - 7 >28 8 100 104 >28 >28 >28 Beispiel 1 16 >28 >28 10 0 95 >28 >28 (Tag 28) >28 Beispiel 1 8 0 >28 8 0 95 >28 >28 (Tag 14) >28 Beispiel 2 32 >28 >28 8 0 98 >28 20 (Tag 21) Beispiel 2 16 >28 >28 8 3,3 103 >28 >28 (Tag 28) >28

Die langanhaltende Komplettremission der Verbindung aus Beispiel 1 im Dosisbereich von 16 bis 8 mg/kg und die Dosisabhängigkeit der Wirkung ist in einem weiteren Experiment mit dem Therapieschedule Tag 1-3 i.v. in Fig. 1 dargestellt.

4. Hydrolytische Stabilität: Die erfindungsgemä en Verbindungen aus Beispiel 1, 2, 8 und 9 werden in Wasser gelöst und zeigen nach 24h Stehen bei Raumtemperatur im HPLC deulich unter 1% Camptothecin-Freisetzung nach Flächenprozent.

Bei Lösen von 10uM der Verbindungen aus Beispiel 1 und 2 in RPMI-Medium plus 10% FCS und in 30 %igem humanen Vollblut in PBS Puffer erfolgte nach 24 h Stehen nur eine Camptothecin-Freisetzung unter 5 %.

Methode: HPLC System Hewlett Packard HP 1050 Säule: Nucleosil 120-5 C 18 250 mm x 4 mm (Macherey & Nagel Germany) Eluent: A: 0,01m KH2PO4 in H2O (H2= Milli-Pore grade) B: 80% Acetonitril / 20% Eluent A Flu : 1,2ml Gradient: t0: 20%B - t40: 100%B t45: 100%B - t47: 20%B Detektion: 240 nm oder 370 nm 5. Lacton-Stabilisierung: Die erfindungsgemä en Glycokonjugate aus den Beispielen 1, 2, 8 und 9 werden in 80% Wasser und 20% Acetonitril gelöst und mit 2 Äquivalenten Natronlauge auf pH 9 eingestellt. Nach lh Stehen bei Raumtemperatur liegt die Lactonring-Öffnung (Detektion nach obiger Methode) unter 5%.

Beispiele Kohlenhvdrat-Edukt: I) p-Aminophenyl-3-O-methyl- -L=fucopyranosid: I.a) p-Nitrophenyl-3-O-methyl- -L,fucopyranosid: 6 g (21 mmol) p-Nitrophenyl- -L-fucopyranosid in 300 ml absol. Methanol werden mit 7,84 g (31,5 mmol) Dibutylzinnoxid versetzt und 2 h unter Rückflu erhitzt.

Anschlie end wird eingeengt, der Rückstand getrocknet und dann in 300 ml DMF aufgenommen. Nach Zugabe von 15,7 ml Methyliodid wird der Ansatz 40 h bei 70"C gerührt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der Rückstand in 300 ml Dichlormethan aufgenommen. Die Suspension wird filtriert, die verbleibende Lösung erneut eingeengt und einer Flash-Chromatographie (Dichlormethan/Methanol 99:1) unterzogen. Nach Einengen erhält man 3,82 g (61%) des Zielproduktes.

I) p-Aminophenyl-3-O-methyl- -lnfucopyranosid: 3,81 g (12,73 mmol) p-Nitrophenyl-3-O-methyl- -L-fucopyranosid werden in Metha- nol gelöst und nach Zusatz von Platindioxid in einer Wasserstoffatmosphäre bei geringem Überdruck hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators und Fällen mit Ether erhält man 3 g (88 %) des Zielprodukts. [DC: Dichlormethan/Methanol 9:1 Rf 0,53].

Peptidvl-Camptothecin-Edukte: II) 20(S)-20-O-{N#-[Fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-L-lysyl-L/D-leu cyl}- camptothecin, Trifluoracetat: II) L 20(S)-20-O-{N#-[Fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-L-lysyl-L-leucy l}- camptothecin, Trifluoracetat: II) D 20(S)-20-O- { N£-[Fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-L-lysyl-D-leucyl } - camptothecin, Trifluoracetat: II.a) 20(S)-20-0-[N-(tert-Butoxycarbonyl)-L/D-leucyll-camptothecin : Eine Suspension von 10 g (28,7 mmol) 20(S)-Camptothecin in 250 ml absolutem Dimethylformamid wird unter Rühren mit 11,1 g (43 mmol) N-(tert-Butoxycarbonyl)- leucin-N-carbonsäureanhydrid sowie 1 g 4-(N,N-Dimethylamino)-pyridin versetzt.

Nach 16 h Behandlung im Ultraschallbad bei Raumtemperatur setzt man weitere 3,7 g N-(tert-Butoxycarbonyl)-leucin-N-carbonsäureanhydrid zu und belä t weitere 2h bei Raumtemperatur. Anschlie end wird von restlichem nicht gelösten Camptothecin abgetrennt und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird durch Flash- chromatographie {Petrolether/Ethylacetat 1:1 -> 1:4] gereinigt. Man erhält 13,55 g (84 %) der Zielverbindung IIa). [DC: Acetonitril Rf = 0,47].

II.b) 20(S)-20-O-L/D-leucyl-camptothecin, Trifluoracetat: II. b) L 20(S)-20-O-L-Leucyl-camptothecin, Trifluoracetat II. b) D 20(S)-20-O-D-Leucyl-camptothecin, Trifluoracetat: Eine Lösung von Verbindung II.a (13,55 g, 24,1 mmol) in einer Mischung aus 100 ml Dichlormethan und 40 ml wasserfreier Trifluoressigsäure wird für 30 min. bei Raum- temperatur gerührt. Nach Einengen im Vakuum auf ein kleines Volumen wird das

Produkt mit Diethylether ausgefällt und gründlich mit Diethylether gewaschen. Im Dünnschichtchromatogramm (Acetonitril/Wasser 20:1) erkennt man einen Doppel- fleck mit RrWerten von 0,4 und 0,32 [Ausb. 9,5 g (68 %)].

Durch mehrmaliges Fällen aus Dichlormethan/Methanol mit Diethylether kann das Gemisch in beide Einzelkomponenten II.b) L und II.b) D aufgetrennt werden. Beide Formen erweisen sich als Diastereomere, die geringfügig unterschiedliche 1H-NMR- Spektren ergeben: polares Diastereomer: 400-MHz-1H-NMR (CD2Cl2/CD3OD 1:1): s C-H (B-Ring) 8,63 ppm s C-H (D-Ring) 7,4 ppm unpolares Diastereomer: 400-MHz-1H-NMR (CD2Cl2/CD3OD 1:1): 5 s C-H (B-Ring) 8,60 ppm s C-H (D-Ring) 7,32 ppm In die weiteren Stufen können sowohl das Gemisch der beiden Formen als auch die aufgereinigten diastereomerenreinen Formen eingesetzt werden.

II.c) 20(S)-20-O-[Nα-(tert-Butoxycarbonyl)-N#-(fluorenyl-9-methox y- carbonyl)-L-lysyl-L/D-leucyl]-camptothecin: II.c) L 20(S)-20-O-[Nα-(tert-Butoxycarbonyl)-N#-(fluorenyl-9-methox ycarbonyl)-L- lysyl-L-leucyl]-camptothecin: II.c) D 20(S)-20-O-[Nα-(tert-Butoxycarbonyl)-N#-(fluorenyl-9-methox ycarbonyl)-L- lysyl-D-leucyl]-camptothecin: 25,6 g (54,6 mmol) Nα-(tert-Butoxycarbonyl)-N#-(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-L - lysin und 11,1g (82 mmol) l-Hydroxy-1H-benzotriazol Hydrat werden in 500 ml Di- methylformamid gelöst. Nach Zugabe von 12,6 g (1,2 Äq.) N-Ethyl-N'-(dimethyl- aminopropyl)-carbodiimid Hydrochlorid rührt man für 1 h bei Raumtemperatur. An- schlie end setzt man Verbindung II.b (26,2 g, 0,83 Äq.) und 7,83 ml (1 Äq.) Ethyl-di-

isopropylamin zu und rührt den Ansatz für weitere 16 h bei Raumtemperatur. Nach Einengen im Vakuum und Reinigung durch Flashchromatographie [Petrolether/Ethyl- acetat 1:2 -> Ethylacetat] erhält man die Zielverbindung (43,5 g, 87 %) [DC: Aceto- nitril Rf= 0,44].

Wie auch in den weiteren Beispielen kann der Ansatz völlig analog auch mit jeder der aufgereinigten diastereomerenreinen Formen in II.b durchgeführt werden.

II) 20(S)-20-O-{N#-[Fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-L-lysyl-L/D-leu cyl}- camptothecin, Trifluoracetat: II) L 20(S)-20-O-{N#-[Fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-L-lysyl-L-leucy l } - camptothecin, Trifluoracetat II) D 20(S)-20-O- {N#-[Fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-L-lysyl-D-leucyl } - camptothecin, Trifluoracetat Die Verbindung II.c (43,3 g, 47,5 mmol) wird in 150 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 50 ml wasserfreier Trifluoressigsäure versetzt. Die resultierende Lösung wird für 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Einengen auf ein kleines Volumen im Vakuum wird das Produkt durch Zugabe von Diethylether ausgefällt. Man erhält 39,4 g (90 %) der Zielverbindung [DC: Acetonitril/Wasser 10:1 Rf= 0,35].

III) 20(S)-20-O-(L-Histidyl-L/D-valyl)-camptothecin, Trifluoracetat: III.a) 20(S)-20-0-[N-(tert-Butoxycarbonyl)-L/D-valyll-camptothecin: Eine Suspension von 10 g (28,7 mmol) 20(S)-Camptothecin in 500 ml absolutem Dimethylformamid wird unter Rühren mit 21,5 g (3 Äquivalenten) N-(tert-Butoxy- carbonyl)-valin-N-carbonsäureanhydrid sowie 1 g 4-(N,N-Dimethylamino)-pyridin versetzt. Nach 16 h Behandlung im Ultraschallbad bei Raumtemperatur wird von rest- lichem nicht gelösten Camptothecin abgetrennt und das Filtrat im Vakuum eingeengt.

Der Rückstand wird durch Flashchromatographie [Petrolether/Ethylacetat 1:3 -> Ethylacetat] gereinigt. Man erhält 11,65 g (73 %) der Zielverbindung. [DC: Aceto- nitril Rf = 0,44]. Wird die gleiche Reaktion statt in Dimethylformamid in Dichlor- methan unter Rückflu bedingungen durchgeführt, so wird die Entstehung des Diastereomers mit L-Konfiguration des Valin-Bausteins stärker begünstigt. nI.b) 20(S)-20-O-L/D-Valyl-camptothecin, Trifluoracetat: III.b) L 20(S)-20-O-L-Valyl-camptothecin, Trifluoracetat III .b) D 20(S)-20-O-D-Valyl-camptothecin, Trifluoracetat Eine Lösung von Verbindung III.a (11,65 g, 21 mmol) in einer Mischung aus 100 ml Dichlormethan und 100 ml wasserfreier Trifluoressigsäure wird für 1 h bei Raum- temperatur gerührt. Nach Einengen im Vakuum auf ein kleines Volumen wird das Produkt mit Diethylether ausgefällt und gründlich mit Diethylether gewaschen. Das Produkt wird nochmals aus Dichlormethan/Methanol mit Diethylether gefällt und als Gemisch von diastereomeren Formen isoliert. Ausb.. 10,9 g (92 %) [DC: Aceto- nitril/Wasser 20:1 Rf = 0,31 und 0,39]. Eine höhere Aufreinigung des unpolaren Diasteromers mit L-Konfiguration des Valin-Bausteins ist auf dieser Stufe durch Kristallisation aus Methanol möglich: 8g des erhaltenen Produkts mit angereichertem unpolarem Diastereomers werden in 80ml Methanol gelöst, auf 0°C abgekühlt und in 10ml Schritten mit Diethylether

versetzt. Nach Zugabe von insgesamt 60 ml Diethylether wird das ausgefallene Produkt abgesaugt und getrocknet. Man erhält 4,6g (58%) an reinem unpolarem Diasteromer mit L-Konfiguration des Valin-Bausteins. Eine Nachfällung der Mutter- lauge mit Diethylether ergibt weitere 730mg (9%) einer Produktfraktion mit einem Diastereomerenverhältnis von 1:18.

In die weiteren Reaktionen kann sowohl das Diastereomerengemisch als auch das aufgereinigte unpolare oder das polare Diastereomer eingesetzt werden. Die Um- setzungen laufen völlig analog.

1TI.c) 20(S)-20-0-[N-(tert-Butoxycarbonyl)-L-histidyl-L/D-valyll- camptothecin: III. c) L 20(S)-20-O- [N-(tert-Butoxycarbonyl)-L-histidyl-L-valyl] -camptothecin III.c) D 20(S)-20-O-[N-(tert-Butoxycarbonyl)-L-histidyl-D-valyl]- camptothecin 5,95 g (23,3 mmol) N-(tert-Butoxycarbonyl)-L-histidin und 4,73 g l-Hydroxy-lH benzotriazol Hydrat werden in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach Zugabe von 5,38 g N-Ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)-carbodiimid Hydrochlorid rührt man für 1 h bei Raumtemperatur. Anschlie end setzt man Verbindung III.b (10,9 g, 19,44 mmol) und 6,7 ml Ethyl-diisopropylamin zu und rührt den Ansatz für weitere 16 h bei Raum- temperatur. Nach Einengen im Vakuum und Reinigung durch Flashchromatographie [Acetonitril/Wasser 50:1 -> 20:1] erhält man die Zielverbindung, [DC: Aceto- nitril/Wasser 10:1 Rf = 0,42] die sofort weiter umgesetzt wird.

1II) 20(S)-20-O-(L-Histidyl-L/D-valyl)-camptothecin, Bis-Trifluoracetat: III) L 20(S )-20-O-(L-Histidyl-L-valyl)-camptothecin, Bis-Trifluoracetat III) D 20(S)-20-O-(L-Histidyl-D-valyl)-camptothecin, Bis-Trifluoracetat

Die Verbindung III.c wird in 100 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 50 ml wasserfreier Trifluoressigsäure versetzt. Die resultierende Lösung wird für 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Nach Einengen auf ein kleines Volumen im Vakuum wird das Produkt durch Zugabe von Diethylether ausgefällt. Man erhält 13,05 g (83 %) der Zielverbindung [DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5:1:0,2 Rf = 0,2].

IV) 20(S)-20-O-{N#-[Fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-D-lysyl-L/D-leu cyl} camptothecin, Trifluoracetat: IV) L 20(S)-20-O- {Ng-[Fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-D-lysyl-L-leucyl } - camptothecin, Trifluoracetat: IV) D 20(S)-20-O- { NE- [Fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-D-lysyl-D-leucyl } - camptothecin, Trifluoracetat: Die Synthese dieser Verbindung erfolgt in völliger Analogie zu der diastereomeren Verbindung II. In der Stufe II.c wird anstelle von Na-(tert-Butoxycarbonyl)-Ng- (fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-L-lysin das entsprechende D-Isomer eingesetzt [DC: Acetonitril/Wasser 10:1 Rf = 0,4].

V) 20(S)-20-O-{N#-[Fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-L-ornithyl-L/D- leucyl}- camptothecin, Trifluoracetat: V) L 20(S)-20-O- {NE [Fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-L-ornithyl-L-leucyl } - camptothecin, Trifluoracetat V) D 20(S)-20-O- { N£-[Fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-L-ornithyl-D-leucyl 3 - camptothecin, Trifluoracetat Die Synthese dieser Verbindung erfolgt in völliger Analogie zu der entsprechenden Lysin-Verbindung II. In der Stufe II.c wird anstelle von N-(tert-Butoxycarbonyl)-

N#-(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-L-lysin Nα-(tert-Butoxycarbonyl)-N#-(fluorenyl-9- methoxycarbonyl)-L-ornithin eingesetzt. [DC: Acetonitril/Wasser 20:1 Rf = 0,125].

VI) 20(S)-20-O-(L-Arginyl-L/D-leucyl)-camptothecin, Tri-Trifluoracetat: VI) L 20(S)-20-0-( L-Arginyl-L-leucyl) -camptothecin, Tri-Trifluoracetat VI) D 20(S )-20-O- { L-Arginyl-D-leucyl} -camptothecin, Tri-Trifluoracetat VI.a) 20(S)-20-O-(Tri-tert-butoxycarbonyl-L-arginyl-L/D-leucyl)-ca mptothecin VI. a) L 20(S)-20-O- (Tri-tert-butoxycarbonyl-L-arginyl-L-leucyl }- camptothecin VI. a) D 20(S)-20-O- f Tri-tert-butoxycarbonyl-L-arginyl-D-leucyl }- camptothecin 200 mg (0,42 mmol) Tri-tert-butoxycarbonyl-L-arginin und 80 mg l-Hydroxy-lH benzotriazol Hydrat werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst. Nach Zugabe von 97 mg N-Ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)-carbodiimid Hydrochlorid rührt man für 1 h bei Raumtemperatur. Anschlie end setzt man Verbindung II.b (200 mg, 0,35 mmol) und 217 u1 Ethyl-diisopropylamin zu und rührt den Ansatz für weitere 3 d bei Raum- temperatur. Nach Einengen im Vakuum und behandeln mit Wasser erhält man die Zielverbindung [DC: Acetonitril/Wasser 5:1:0,2 Rf = 0,77] die sofort weiter umge- setzt wird.

VI) 20(S)-20-O-{L-Arginyl-L/D-leucyl}-camptothecin, Tri-Trifluoracetat VI) L 20(S)-20-0-( L-Arginyl-L-leucyl) -camptothecin, Tri-Trifluoracetat VI) D 20(S)-20-O- {L-Arginyl-D-leucyl} -camptothecin, Tri-Trifluoracetat 0,35 mmol der Verbindung aus VI.a) werden in 10 ml Dichlormethan mit 5 ml wasserfreier Trifluoressigsäure für 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Man engt ein und

fällt zweimal aus Dichlormethan/Methanol mit Diethylether um. Man erhält 280 mg (82%) der Zielverbindung [DC: Acetonitril/Wasser 10:3:1,5 Rf = 0,42].

VII) L 20(S)-20-O- {N8- [Fluorenyl-9-methoxycarbonyli-Elysyl-Evalyl} camptothecin, Trifluoracetat VII.a) L 20(S)-20-O- [Ncc-(tert-butoxycarbonyl)-NE-(fluo renyl-9-methoxycar- bonyl)-Glysyl-Evalyl]-camptothecin 10,02 g (21,4 mmol) N -(tert-butoxycarbonyl)-N -(fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-L- lysin und 4,4g (32,1 mmol) l-Hydroxy-lH-benzotriazol Hydrat werden in 400 ml Dimethylformamid gelöst. Nach Zugabe von 4,92 g (1,2Äq.) N-Ethyl-N'-(dimethyl- aminopropyl)-carbodiimid Hydrochlorid rührt man für 30 min bei 0°C. Anschlie end setzt man 10g (17,8 mmol) des unpolaren Diastereomers III.b Lvon Verbindung III.b und 9,2 ml (3Äq.) Ethyl-diisopropylamin zu und rührt den Ansatz für weitere 16 h bei Raumtemperatur. Nach Einengen im Vakuum wird der Rückstand 30 min mit 500ml Wasser verrührt und abgesaugt. Das Produkt wird in 400 ml Dichlormethan aufge- nommen, das restliche Wasser entfernt, die Lösung auf 200ml aufkonzentriert und dann mit 800 ml Diethylether gefällt. Man saugt ab und wäscht den Rückstand mit Diethylether. Man erhält 14,712 g der Zielverbindung (92 %) [DC: Acetonitril Rf= 0,6].

VII) L 20(S)-20-O-{N-[Fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-L-lysyl-L-valyl} - camptothecin, Trifluoracetat Die Verbindung VII.a) L (14,65 g, 16,3 mmol) wird in 300 ml Dichlormethan aufge- nommen und bei 0°C mit 50 ml wasserfreier Trifluoressigsäure versetzt. Die resultie- rende Lösung fur 2 h unter Eiskühlung gerührt. Nach Einengen auf ein kleines Volumen im Vakuum wird das Produkt durch Zugabe von Diethylether ausgefällt.

Man erhält 13,8g (93%) der Zielverbindung [DC: Acetonitril/Wasser 10:1 Rf = 0,35].

Beispiel 1: <BR> <BR> <BR> <BR> 20(S)-20-O-{Nα-[O-(3-O-Methyl- -L-fucopyranosyl)-4-hydroxy-phenylamino- thiocarbonylj-Elysyl-L/D-leucyl}-camptothecin, Hydrochlorid: 1.a) 20(S)-20-O-{Nα-[O-(3-O-Methyl- -L-fucopyranosyl)-4-hydroxyphenyl amino-thiocarbonyl]-N-{iluorenyl-9-methoxycarbonyli-lysyl-L/ D- leucyl}-camptothecin: Eine Lösung von 9,82 g (36,5 mmol) p-Aminophenyl-3-O-methyl- -L-fucopyranosid (Beispiel I) in 500 ml Dioxan/Wasser 1:1 wird unter Rühren mit 3,94 ml Thiophosgen (1,4 Äq.) versetzt. Nach 10 min. versetzt man mit 4 Äquivalenten Ethyldiisopropyl- amin, engt anschlie end im Vakuum ein und trocknet den Rückstand für 1 h im Ölpumpenvakuum. Das erhaltene Isothiocyanat wird in 500 ml absolutem Dimethyl- formamid gelöst und mit 30,4 g (32,8 mmol) von Verbindung II sowie 22,6 ml Ethyl- diisopropylamin versetzt. Man rührt für 16 h bei Raumtemperatur, engt dann im Vakuum ein und verrührt mit Wasser. Den Rückstand reinigt man durch Flash- Chromatographie [Acetonitril -> Acetonitril/Wasser 30:1]. Das Produkt wird aus

Dichlormethan/Methanol mit Diethylether umgefällt und mit Diethylether gewaschen.

Man erhält 28,7 g (78 %) des Zielproduktes [DC: Acetonitril/Wasser 10:1 Rf= 0,44].

1.b) 20-O-{Nα-[O-(3-O-Methyl- -L-fucopyranosyl)-4-hydroxy-phenylamino- thiocarbonyli-Lrlysyl-L/D-leucyl}-camptothecin: 28,6 g (25,5 mmol) des Konjugats l.a) werden in 200 ml Dimethylformamid mit 5 ml Piperidin versetzt. Nach 2 h Rühren bei Raumtemperatur engt man ein und digeriert den Rückstand zweimal mit Dichlormethan und setzt Diethylether zu. Dann wird in Dimethylformamid/Dichlormethan aufgenommen und mit Ether gefällt. Dieser Reini- gungsprozess wird zweimal wiederholt. Das Produkt wird abgesaugt und mit Ether gewaschen. Ausb.. 19,5 g (85%) [DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5:1:0,2 Rf = 0,3].

1) 20(S)-20-O-{Nα-[O-(3-O-Methyl- -L-fucopyranosyl)-4-hydroxy-phenyl amino-thiocarbonyl]-L-lysyl-L/D-leucyl}-camptothecin, Hydrochlorid: 10 g (11,1 mmol) der Verbindung aus Beispiel l.b werden in 100 ml Wasser auf- genommen, mit 11,1 ml (1 Äq.) einer 1N HCl-Lösung versetzt und lyophilisiert.

Anschlie end wird das Produkt mehrmals aus Dichlormethan/Methanol mit Diethyl- ether gefällt. Ausb. 9,15 g (88%) [DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5:1:0,2 Rf = 0,3].

Beispiel 2: 20(S)-20-O-{N -[0-(3-O-Methyl- -L-fucopyranosyl)-4-hydroxy-phenylamino- thiocarbonyll-L-histidyl-L/D-valyl}-camptothecin, Hydrochlorid:

Eine Lösung von 7,14 g (26,5 mmol) p-Aminophenyl-3-O-methyl- -L-fucopyranosid (Kohlenhydrat-Edukt I) in 300 ml Dioxan/Wasser 1:1 wird unter Rühren mit 2,86 ml Thiophosgen (1,4 Äq.) versetzt. Nach 10 min. versetzt man mit 4 Äquivalenten Ethyl- diisopropylamin, engt anschlie end im Vakuum ein und trocknet den Rückstand für 1 h im Ölpumpenvakuum. Das erhaltene Isothiocyanat wird in 500 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und mit 17,45 g (22 mmol) von Verbindung III sowie 22,7 ml Ethyl-diisopropylamin versetzt. Man rührt für 16 h bei Raumtemperatur, engt dann im Vakuum ein und nimmt den Rückstand in Wasser auf. Man stellt mit 1N wä riger Natronlauge auf pH 7,8 ein und saugt ab. Der Rückstand wird nach Trocknung im Hochvakuum zweimal aus Dichlormethan/Methanol mit Diethylether umgefällt und mit Diethylether gewaschen. Man erhält 17,97 g (91 %) des Ziel- produktes, das anschlie end mit 1 Äquivalent 0,1 N wä riger Salzsäure in das Hydrochlorid überführt wird [DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5:1:0,2 Rf = 0,36] [FAB-MS: m/z = 896 (M + Beispiel 3: <BR> <BR> <BR> <BR> 20(S)-20-O-{Nα-[O-(3-O-Methyl- -L-fucopyranosyl)-4-hydroxy-phenylamino- thiocarbonyl]-D-lysyl-D-leucyl}-camptothecin, Hydrochlorid; Die Synthese erfolgt völlig analog zu Beispiel 1. Hierbei wird von den Edukten I und IV.D ausgegangen, wobei ab der Stufe des 20-O-Leucyl-Camptothecins II.b das polare Diasteromer II.b) D eingesetzt wurde. [DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5:1:0,2 Rf = 0,31] [FAB-MS: m/z = 901 = M + H+] Beispiel 4: <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 20(S)-20-O-{Nα-[O-(3-O-Methyl- -L-fucopyranosyl)-4-hydroxy-phenylamino- thiocarbonyl]-L-ornithyl-D-leucyl}-camptothecin, Hydrochlorid;

Die Synthese erfolgt völlig analog zu Beispiel 1. Hierbei wird von den Edukten I und V) D ausgegangen, wobei ab der Stufe des 20-O-Leucyl-Camptothecins II.b das polare Diasteromer II.b) D mit D-Leu-Konfiguration eingesetzt wurde. [DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5:1:0,2 Rf = 0,25].

Beispiel 5: <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 20(S)-20-O-{Nα-[O-(3-O-Methyl- -L-fucopyranosyl)-4-hydroxy-phenylamino- thiocarbonyl]-L-arginyl-D-leucyl}-camptothecin;

Eine Lösung von 73 mg (0,27 mmol) p-Aminophenyl-3-O-methyl- -L-fücopyranosid (Edukt I) in 20 ml Dioxan/Wasser 1:1 wird unter Rühren mit 30 u1 Thiophosgen (1,4 Äq.) versetzt. Nach 10 min. versetzt man mit 4 Äquivalenten Ethyldiisopropyl- amin, engt anschlie end im Vakuum ein und trocknet den Rückstand für 1 h im Öl- pumpenvakuum. Das erhaltene Isothiocyanat wird in 20 ml absolutem Dimethylform- amid gelöst und mit 175 mg (0,18 mmol) von Verbindung VI) D sowie 620 u1 Ethyl- diisopropylamin versetzt. Zur Synthese von Verbindung VI) D wird hier ab der Stufe des 20-O-Leucyl-Camptothecins II.b das polare Diastereomer II.b) D eingesetzt. Man rührt für 16 h bei Raumtemperatur, engt dann im Vakuum ein und verrührt mit Dichlormethan. Der Rückstand wird anschlie end aus Dichlormethan/Methanol mit Diethylether umgefällt und mit Diethylether gewaschen. Man lyophilisiert an- schlie end aus Dioxan/Wasser und kristallisiert dann erneut aus Dichlor- methan/Methanol mit Diethylether. Man erhält 154 mg (90 %) des Zielproduktes [DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5:1:0,2 Rf= 0,39] [FAB-MS: m/z = 929 = M+H+].

Beispiel 6: <BR> <BR> <BR> <BR> 20(S)-20-O-{Nα-[O-(3-O-Methyl- -L-fucopyranosyl)-4-hydroxy-phenylamino thiocarbonyl]-L-lysyl-D-leucyl}-camptothecin, Hydrochlorid; Die Verbindung wird in Analogie zu Beispiel 1 hergestellt wobei auf der Stufe des 20-O-Leucyl-Camptothecins II.b das polare Diastereomer II.b) D mit D-Leucin- Konfiguration eingesetzt wurde.

Alternativ kann die Verbindung aus Beispiel 1 z.B. auch durch präparative KPLC in die einzelnen isomeren Formen aufgetrennt werden.

Bedingungen: Trennsäule: Macherey & Nagel 250 x 21 mm Nucleosil 100-7 C18 AB Laufmittel A: H2O + 0, 1M KH2PO4 Laufmittel B: Acetonitril / Wasser 4:1 + 0,02M KH2PO4 Flu : 10 ml/min Inj.-Volumen: 1500u1 Gradient: 0-30 % B

4-30 20-90 22-90 24-30 Wellenlänge: 215 nm Nach der HPLC-Trennung werden die entsprechenden Fraktionen lyophilisiert und der Rückstand dann mehrmals aus Dichlormethan/Methanol mit Diethylether gefällt.

Anschlie end stellt man auf pH 8-9 ein, filtriert ab und überführt den Rückstand mit 0,1N Salzsäure in das Hydrochlorid.

Im 1H-NMR-Spektrum zeigen die Isomeren in Beispiel 6 und 7 unterschiedliche chemische Verschiebungen insbesondere für die beiden Singuletts der aromatischen H-Atome im Camptothecin-B-Ring bzw. D-Ring.

Diasteromer mit D-Leucin: 400-MHz-lH-NMR (CD2C12/CD3OD 1:1): 5 s C-H (B-Ring) 8,52 ppm s C-H (D-Ring) 7,42 ppm [FAB-MS: m/z = 901 = M + H+] Beispiel 7: <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 20(S)-20-O-{Nα-[O-(3-O-Methyl- -L-fucopyranosyl)-4-hydroxy-phenylamino- thiocarbonyll-L-lysyl-L-leucyl}-camptothecin, Hydrochlorid;

Die Verbindung wird in Analogie zu Beispiel 1 hergestellt, wobei auf der Stufe des 20-O-Leucyl-Camptothecins II.b das unpolare Diastereomer II.b) L mit L-Konfigu- ration des Leucins eingesetzt wurde.

Alternativ kann die Verbindung aus Beispiel 1 z.B. auch durch präparative HPLC in die einzelnen isomeren Formen aufgetrennt werden.

Bedingungen: wie in Beispiel 6 angegeben Nach der HPLC-Trennung werden die entsprechenden Fraktionen lyophilisiert und der Rückstand dann mehrmals aus Dichlormethan/Methanol mit Diethylether gefällt.

Anschlie end stellt man auf pH 8-9 ein, filtriert ab und überführt den Rückstand mit 0,1 N Salzsäure in das Hydrochlorid.

Im 1H-NMR-Spektrum zeigen die Isomeren in Beispiel 6 und 7 unterschiedliche chemische Verschiebungen insbesondere z.B. für die beiden Singuletts der aroma- tischen H-Atome im Camptothecin-B-Ring bzw. D-Ring.

Diastereomer mit L-Leucin: 400-MHz-1H-NMR (CD2Cl2/CD3OD 1:1): s C-H (B-Ring) 8,6 ppm s C-H (D-Ring) 7,35 ppm [FAB-MS: m/z = 901 = M + H+] Beispiel 8: <BR> <BR> <BR> <BR> 20(S)-20-O-{Nα-[O-(3-O-Methyl- -L-fucopyranosyl)-4-hydroxy-phenylamino thiocarbonyl]-L-lysyl-L-valyl}-camptothecin, Hydrochlorid; Die Verbindung wird in der unpolaren Serie ausgehend von der Verbindung VII) L in Analogie zu Beispiel 1 hergestellt.

Das Diastereomerenverhältnis kann durch analytische HPLC ermittelt werden. Gege- benenfalls durch Kristallisation aus Methanol kann eine weitere Aufreinigung des Diastereomers mit L-Konfiguration des Valins erreicht werden (>20: 1).

HPLC-Bedingungen: Trennsäule: Macherey & Nagel 250 x 4 mm Nucleosil 100-7 C18 AB Laufmittel A: H2O + 0, IM KH2PO4 Laufmittel B: Acetonitril / Wasser 4:1 + 0,02M KH2PO4 Flu : 1 ml/min Inj.-Volumen: 15 u1 Im 1H-NMR-Spektrum zeigt das reine Diastereomer nur einen Signalsatz z.B. für die beiden Singuletts der aromatischen H-Atome im Camptothecin-B-Ring bzw. D-Ring.

400-MHz-1H-NMlR (CD2Cl2/CD3OD 1:1): 6 s C-H (B-Ring) 8,55 ppm s C-H (D-Ring) 7,35 ppm [FAB-MS: m/z = 887 = M + H+] Eine alternative Vorgehensweise beim Aufbau der Verbindung aus Beispiel 8 ist eben- falls möglich. Dabei wird der Kohlenhydratbaustein aus Beispiel I zuerst mit einem seitenkettengeschützten Lysin-Derivat verknüpft: 8a) Nα-[O-(3-O-Methyl- -L-fucopyranosyl)-4-hydroxyphenylamino-thiocarbo- nyIj-N- [fluorenyl-9-methoxycarbonylj Ulysin Eine Lösung von 6,8 g (25,3 mmol) p-Aminophenyl-3-O-methyl- -L-fucopyranosid (Beispiel I) in 600 ml Dioxan/Wasser 1:1 wird unter Rühren mit 2,72 ml Thiophosgen (1,4 Äq.) versetzt. Nach 10 min. versetzt man mit 26 ml Ethyldiisopropylamin, rührt weitere 5 min bei RT und engt anschlie end im Vakuum auf ein Volumen von 150 ml ein. Man setzt 800 ml Dichlormethan zu und trennt die Phasen. Die organische Phase wird zweimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt.

Der Rückstand wird mit 200 ml Methyl-tert.butylether und 200 ml Petrolether ver- rührt und abgesaugt. Man erhält 7,26 g (92 %) des Isothiocyanats.

2,92 g (9,4 mmol) des erhaltenen Isothiocyanats werden in 200 ml Dioxan/Wasser 1:1 gelöst und mit 3,11 g (0,9 Äq) von N£-[Fluorenyl-9-methoxyzarbonyl]-lysin sowie

3,2 ml Ethyl-diisopropylamin versetzt. Man rührt für 16 h bei Raumtemperatur, engt dann im Vakuum ein und nimmt den Rückstand mit Wasser auf. Durch Einstellen des pH-Werts auf 2 mit 1 N HCI wird das Produkt ausgefällt und nach 30 min abgesaugt.

Der Rückstand wird in Dichlormethan suspendiert und das Lösungsmittel zweimal abgezogen. Nach mehrmaligem Waschen mit Ether und Petrolether erhält man 5,3 g (92 %) Zielproduktes [DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5:1:0,2 Rf = 0,69].

8b) 20(S)-20-O-{N- iO-(3-O-Methyl- -Ufucopyranosyl)-4-hydroxy-phenyl- <BR> <BR> <BR> amino-thiocarbonyl]-N#-[fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-L-lysyl -L-valyl}-cam- ptothecin 1,2 g (1,76 mmol) Nα-[O-(3-O-Methyl- -L-fucopyranosyl)-4-hydroxy-phenylamino- thiocarbonyl]-Ng-[fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-L-lysin (Beispiel 8a) und 675 mg (1,2 mmol) der Verbindung III.b)L werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst, die Mischung auf 0°C abgekühlt und anschlie end mit 346 mg (1,8 mmol) N-Ethyl-N'- (dimethylaminopropyl)-carbodiimid Hydrochlorid versetzt. Unter Rühren lä t man die Temperatur über Nacht auf RT ansteigen. Das Lösungsmittel wird i. vac. abgedampft und der Rückstand mit Wasser verrührt. Man reinigt durch Flash-Chromatographie an Kieselgel, wobei man mit Acetonitrol als Laufmittel startet und später auf Aceto- nitril/Wasser 50:1 übergeht. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen erhält man 1,06 g (76 %) des Zielprodukts [DC: Acetonitril/Wasser 20:1 Rf 0,34].

Die Deblockierung und die anschlie ende Überführung in das Hydrochlorid erfolgt in Analogie zu Beispiel 1.

Beispiel 9: <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 20(S)-20-O-{Nα-[O-(3-O-Methyl- -L-fucopyranosyl)-4-hydroxy-phenylamino- thiocarbonyl]-L-histidyl-L-valyl}-camptothecin, Hydrochlorid,:

Die Verbindung wird ausgehend von dem unpolaren Diastereomer von 20-O-Valyl- Camptothecin, Trifluoracetat (III. b) L in Analogie zu Beispiel 2 hergestellt.

Das Diastereomerenverhältnis kann durch analytische HPLC ermittelt werden.

Gegebenenfalls durch Kristallisation aus Methanol kann eine weitere Aufreinigung des unpolaren Diastereomers mit L-Konfiguration des Valins erreicht werden (>20: 1) HPLC-Bedingungen: Trennsäule: Macherey & Nagel 250 x 4 mm Nucleosil 100-7 C18 AB Laufmittel A: H2O + 0,lM KH2PO4 Laufmittel B: Acetonitril / Wasser 4:1 + 0,02M KH2PO4 Flu : 1 ml/min Inj.-Volumen: 15 u1 Im 1H-NMR-Spektrum zeigt das reine Diastereomer nur einen Signalsatz z.B. für die beiden Singuletts der aromatischen H-Atome im Camptothecin-B-Ring bzw. D-Ring.

Diastereomer mit L-Valin: 400-MHz-1H-NMR (CD2Cl2/CD3OD 1:1): 6 s C-H (B-Ring) 8,58 ppm (über- lagert von einem CH arom. von Histidin) s C-H (D-Ring) 7,35 ppm

[DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5:1:0,2 Rf = 0,36] [FAB-MS: m/z = 896 (M + Beispiel 10: <BR> <BR> <BR> <BR> 20(S)-20-O-{Nα-[O-(3-O-Methyl- -L-fucopyranosyl)-4-hydroxy-phenylamino-<BR> <BR> <BR> thiocarbonyl]-barginyl-Ileucyl}-camptothecin; Das Produkt wird in Analogie zu Beispiel 5 hergestellt. Dabei wird auf der Stufe des 20-O-Leucyl-Camptothecins II.b das unpolare Diastereomer II.b) L eingesetzt.

[DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5:1:0,2 Rf= 0,4] [FAB-MS: m/z 929 = M+H+].

Mit den unter Beispiel 8 und 9 angegebenen HPLC-Bedingungen kann man die Diastereomeren aus Beispiel 5 und 10 unterscheiden.