Die vorliegende Erfindung betrifft 24-0κa-Derivate in der Vitamin D-Reihe der allgemeinen Formel I

R worin

1 2 5 R , R und R unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Acyl¬ gruppe mit 1 bis 9 Kohlenstoffatomen,

3 R ein Wasserstoffatom oder eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und R je ein Wasserstoffatom oder je eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, ein Verfahren zu deren Herstellung, pharmazeutische Präparate, die diese Verbindungen enthalten sowie deren Verwendung zur Herstellung von Arznei¬ mitteln.

Die für die Reste R 1 , R2 und R5 möglichen Acylgruppen mit 1 bis 9 Kohlen¬ stoffatomen sind insbesondere von gesättigten Carbonsäuren oder auch von der Benzoe-säure abgeleitet. Andere geeignete Acylreste R 1 , R2, R5 umfas¬ sen solche, die cyclisch, acyclisch, carbocyclisch oder heterocyclisch - alle gegebenenfalls auch ungesättigt - sind. Die bevorzugten Reste leiten sich von C - bis C-, insbesondere C - bis C,.-, Alkancarbonsäuren ab, wie 1 9 _ o beispielsweise Acetyl- , Propionyl-, Butyryl-.

3 4 Bei den Alkylgruppen R und R , die geradkettig oder verzweigt sein kön-

3 nen, kommen in erster Linie die Methyl-, Ethyl-, Propyl- und für R zu¬ sätzlich die Isopropylgruppe und für R zusätzlich die n-Butylgruppe inbe-

3 4 tracht. R und R können identisch oder unterschiedlich sein.

Besonders bevorzugt sind gemäß vorliegender Erfindung die folgenden

Verbindungen:

1α,25-Dihydroxy-2 -oxa-24-homo-cholecalciferol

1α,25-Dihydroxy-26,27-dimethyl-24-oxa-24-homo-cholecalci ferol

26,27-Diethyl-1α,25-dihydroxy-24-oxa-24-homo-cholecalcif erol

1α,25-Dihydroxy-24-oxa-26,27-di-n-propyl-24-homo-choleca lciferol

1α,26-Dihydroxy-24-oxa-cholecalciferol

1α,26-Dihydroxy-27-methyl-24-oxa-cholecalciferol

Die natürlichen Vitamine D und D (vgl. allgemeine Formel A) sind an sich biologisch inaktiv und werden erst nach Hydroxylierung in 25-Position in der Leber bzw. in 1-Position in der Niere in deren biologisch aktive Meta- boliten umgewandelt. Die Wirkung der Vitamine D und D, besteht in der

Stabilisierung des Plasma-Ca - und Plasma-Phosphat-Spiegels; sie wirken einem Absinken des Plasma-Ca -Spiegels entgegen.

Ergocalciferol: R =R =H, R ^C =CH. Vitamin D, Doppelbindung C-22/23 Cholecalciferol: R ^a =R =R ^C =H Vitamin D.

25-Hydroxycholecalciferol: R =R =H, R =0H 1α-Hydroxycholecalciferol: R ^a =OH, R ^b =R ^c =H 1α,25-Dihydroxycholecalciferol: R ^a =R =OH, R ^C =H Calcitriol

Auβer ihrer ausgeprägten Wirkung auf den Calcium- und Phosphatstoffwechsel besitzen Vitamin D und D_ und seine synthetischen Abkömmlinge auch proli- ferationshemmende und zeildifferenzierende Wirkungen (H.F. De Luca, The Hetabolism and Function of Vitamin D in Biochemistry of Steroid Hormones, Hrsg. H.L.J. Makin, 2nd Edition, Blackwell Scientific Publications 1984, S. 71-116). Bei Vitamin D-Anwendung kann es aber zu Überdosierungserschei¬ nungen kommen (Hypercalcämie) .

Neben den erfindungsgemäßen Verbindungen gibt es bereits eine Reihe von Oxaderivaten in der Vitamin D-Reihe. Beschrieben sind 20-Oxa-, 22-0xa- und 23-Oxa-Analoga des Calcitriols (23-0xa: US-Patent 4 772 433, Erf. R.Hesse, 1988; 22-0xa: E. Murayama et al., Che . Phar . Bull. 34,4410, 1987; 20-0xa: 3 . Abe et al. , FEBS Lett. 222, 58, 1987). Ein 24-Oxa-Analoges des Calcitriols ist chemisch nicht vorstellbar, da es gemäß seiner Natur als offenkettiges Hemiacetal in wäßrigem Milieu sofort zerfallen würde. Wie DeLuca et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 2610, 1987) zeigen konn¬ ten, weisen auch 24-Homo-Derivate des Calcitriols noch hohe Affinität zum Calcitriol-Rezeptor auf.

Ein Teil der erfindungsgemäβen Verbindungen, die als 24-0xa-24-Homo-Ana- loga des Calcitriols klassifiziert werden müssen, stellen somit eine neu¬ artige Kombination von bekannten wirksamkeitssteigernden Strukturmerkmalen dar.

Es wurde nun gefunden, daß die erfindungsgemäβen 24-0xa Vitamin-D-Derivate der allgemeinen Formel I sich durch hohe Affinität zum Calcitriol-Rezeptor auszeichnen und auch in hoher Dosierung keine Anstiege des Calciumspiegels im Plasma bewirken. Die proliferationshemmenden Eigenschaften des Calci¬ triols bleiben jedoch unvermindert erhalten (Dissoziation).

Die Vitamin-D-Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen wird mittels des Calcitriol-Rezeptortests bestimmt. Er wird unter Verwendung eines spe¬ zifischen Rezeptorproteins aus dem Darm rachitischer Hühner durchgeführt.

3 Rezeptorhaltiges Bindungsprotein wird mit H-Calcitriol (0,5 ng/ml) in einem Reaktionsvolumen von 0,575 ml in Abwesenheit und in Anwesenheit der PrüfSubstanzen für eine Stunde in einem Teströhrchen inkubiert. Zur Tren¬ nung von freiem und rezeptorgebundenem Calcitriol wird eine Charcoal-Dex

tran-Absorption durchgeführt. Dazu werden 200 μl einer Charcoal-Dextran- Suspension jedem Teströhrchen zugeführt und bei 22°C für 30 Minuten inku¬ biert. Anschließend werden die Proben bei 1500 x g 10 Minuten bei 4°C zen- trifugiert. Der Überstand wird dekantiert und nach ca. 1stündiger Äquili- brierung in Atom-Light in einem ß-Zähler gemessen.

Die mit verschiedenen Konzentrationen der Prüfsubstanz sowie der Referenz-

3 Substanz (unmarkiertes Calcitriol) für die Verdrängung von H-markierter

3 Referenzsubsstanz ( H-Calcitriol) erhaltenen Kompetitionskurven werden in

Beziehung zueinander gesetzt und ein Ko petitionsfaktor (KF) ermittelt. Er ist definiert als Quotient aus den Konzentrationen der jeweiligen Pruf¬ substanz und der Referenzsubstaπz. die für SOZige Kompetition erforderlich sind:

Konzentration Prufsubstanz bei 50'/ Kompetition

_{KF =}

Konzentration Referenzsubstanz bei 50Z Kompetition Demnach besitzt

1α,25-Dihydroxy-26,27-dimethyl-24-oxa-24-homo-cholecalci ferol einen KF-Wert von 3 und 1α,25-Dihydroxy-24-oxa-24-homo-cholecalciferol einen KF-Wert von 7.

Durch das stark verminderte Hypercalciämie-Risiko eignen sich die erfin¬ dungsgemäßen Substanzen in besonderer Weise zur Herstellung von Arzneimit¬ teln für die Behandlung von Erkrankungen, die durch eine Hyperprolifera- tion gekennzeichnet sind, z.B. hyperproliferative Erkrankungen der Haut (Psoriasis) und maligne Tumoren (Leukämie, Coloncarcinom, Mam acarcinom) . In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden vor der Behandlung im Zielorgan Calcitriolrezeptoren nachgewiesen.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich somit auch auf pharmazeutische Präparate, die mindestens eine Verbindung gemäß der allgemeinen Formel I zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten. Die Verbindungen können formuliert werden als Lösungen in pharmazeutisch verträglichen Solventien oder als Emulsionen, Suspensionen oder Disper¬ sionen in geeigneten pharmazeutischen Solventien oder Trägern oder als Pillen, Tabletten

oder Kapseln, die in an sich bekannter Weise feste Trägerstoffe enthalten. Für eine topische Anwendung werden die Verbindungen vorteilhafterweise als Cremes oder Salben oder in einer ähnlichen, zur topischen Anwendung geeig¬ neten Arzneimittelform formuliert. Jede derartige Formulierung kann auch eine andere pharmazeutisch verträgliche und nichttoxische Hilfsstoffe ent¬ halten, wie z.B. Stabilisatoren, Antioxidantien, Bindemittel, Farbstoffe, Emulgatoren oder Geschmackskorrigentien. Die Verbindungen werden vorteil¬ hafterweise durch Injektion oder intravenöse Infusion geeigneter steriler Lösungen oder als orale Dosierung über den Ernährungstrakt oder topisch in Form von Cremes, Salben, Lotions oder geeigneter transdermaler Pflaster appliziert, wie in der EP-A-0387 077 beschrieben ist. Die tägliche Dosis liegt bei

0,1 μg/Patient/Tag - 1000 μg/Patient/Tag, vorzugsweise

1,0 μg/Patient/Tag - 500 μg/Patient/Tag. Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden im allgemeinen verabreicht ana¬ log zur Verabreichung des bekannten Mittels "Calcipotriol" zur Behandlung der Psoriasis.

Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung der Verbindungen gemäß Formel I zur Herstellung von Arzneimitteln.

Die Herstellung der 24-Oxa-Vitamin D-Derivate der Formel I erfolgt erfin- dungsgemäβ dadurch, daß eine Verbindung der allgemeinen Formel II

worin

1 ' 2 ' 3 4

R und R für Hydroxyschutzgruppen stehen sowie R und R die in Formel

I angegebene Bedeutung haben, durch Abspaltung dieser Hydroxyschutzgruppen in die freie Trihydroxyverbindung (Verbindung der allgemeinen Formel I,

1 2 5 worin R =R =R =H) und gewünschtenfalls diese durch teilweise oder voll¬ ständige Veresterung der freien Hydroxygruppen in die entsprechende Acyl-

1 2

Verbindung (Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R und/oder R

5 und/oder R eine C -C _Q -Acylgruppe bedeutet(n)) überführt wird.

1 " 2' Als Hydroxyschutzgruppen R und R kommen in erster Linie tertiäre Si- lylgruppen, beispielsweise der Trimethylsilyl- oder der tert.-Butyl-dime- thylsilyl-Rest, infrage. Deren Abspaltung gelingt z.B. unter Verwendung von Tetra-n-butyl-ammoniumfluorid.

Nach der Schutzgruppenabspaltung können freie Hydroxygruppen gewünschten¬ falls verestert werden. Die Veresterung der verschiedenen freien Hydroxy¬ gruppen kann nach gängigen Verfahren partiell oder vollständig mit dem entsprechenden Carbonsäurehalogenid (Halogenid = Chlorid, Bromid) oder Carbonsäureanhydrid erfolgen.

Es ist auch möglich, eine tertiäre 25-Hydroxygruppe bereits vor der Schutzgruppenabspaltung oder vor der Photoisomerisierung zu verestern. Als Ausgangsmaterial für die Herstellung der erfindungsgemäß zu verwen¬ denden Ausgangsverbindungen der allgemeinen Formel II dienen Alkohole der allgemeinen Formel III

worin

1 ' 2 ' R und R die bereits angegebene Bedeutung haben.

1S,3R-Bis-(tert.-Butyldimethylsilyloxy)-24-nor-9, 10-secochola-5E,7E, 10(19!

-trien-23-ol kann z.B. nach US Patent 4,512,925 (Erf.: DeLuca et al. ,

1985) hergestellt werden.

Durch Umsetzung einer Verbindung der allgemeinen Formel III mit Bro essig- säuretert.-butylester im Zweiphasensystem Toluol/25Z Natronlauge in Gegen¬ wart eines Phasentransferkatalysators (im Rahmen vorliegender Erfindung wird Tetra-n-butyl-ammoniumhydrogensulfat oder -fluorid verwendet) gelangt man zu den Estern der Formel IV

in hoher Ausbeute.

3 Werden Endprodukte der allgemeinen Formel I gewünscht in denen R eine

Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, so wird zunächst die

Zwischenstufe IV in Gegenwart einer starken Base wie etwa Lithiumdiisopro- pylamid in einem aprotischen Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran mit einem

3' 3*

Alkylhalogenid des allgemeinen Typs R Hai (R =C.-C, -Alkyl, Hal= Br, I) an ι . der der Carbonylgruppe benachbarten Methylengruppe alkyliert. Die so gewonnenen Verbindungen der allgemeinen Formel V

werden im allgemeinen als Diastereomerengemische erhalten und ohne Auf¬ trennung in die Folgereaktionen eingesetzt.

Diese Zwischenstufe IV läßt sich mit Grignardreagenzieπ der allgemeinen

4 4 Formel R MgX (R =C -C, -Alkyl, X=C1, Br, I) in einem Überschuß von 2 bis 10

Molequivalenten in die Zwischenprodukte der allgemeinen Formel VI

überführen.

Die Reduktion der Estergruppe in den Verbindungen der Formel IV oder der Formel V führt zu den Verbindungen der allgemeinen Formel VII

worin

3 R ein Wasserstoffatom oder eine lineare oder verzweigte C -C, -Alkylgruppe

1 ' ? ' bedeutet und R und R die bereits angegebene Bedeutung haben.

Nach Standardverfahren der Vitamin D-Chemie durch Bestrahlung mit ultra¬ violettem Licht in Gegenwart eines sogenannten "Triplettsensibilisators" (im Rahmen vorliegender Erfindung wird hierfür Anthracen verwendet) lassen sich anschliessend die Verbindungen der allgemeinen Formeln VI und VII in die Verbindungen der allgemeinen Formel II überführen. Durch Spaltung der pi-Bindung der 5,6-Doppelbindung, Rotation des A-Ringes um 180° um die 5,6-Einfachbindung und Reetablierung der 5,6-Doppelbindung wird die Ste- reoisomerie an der 5, 6-Doppelbindung umgekehrt.

Schlüsselschritt zur Synthese der Ausgangsverbindungen der allgemeinen Formel II ist die Umsetzung des Alkohols II mit Bromessigsäure-tert.-bu- tylester unter Phasentransferbedingungen. Dem Fachmann ist bekannt, daß entsprechende Umsetzungen mit Bromessigsäure-methyUethyD-ester äußerst unbefriedigend verlaufen, da es im wesentlichen nur zur Umesterung und nicht zur Bildung der gewünschten Veretherungsprodukte kommt.

Überraschend ist weiterhin die Tatsache, daß der tert.-Butylester IV sich problemlos mit Alkyl-Grignardreagenzien umsetzen läßt, obwohl die steri- sche Hinderung durch die tert.-Butylgruppe eine erheblich verminderte Reaktivität hätte erwarten lassen.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der näheren Erläuterung der Erfindung:

BEISPIEL 1

1α,25-Dihydroκy-26,27-dimβthyl-2_-oκa-2 -homo-cholecalciferol

a) Eine Lösung von 1S,3R-Bis-(tert.-butyldimethylsilyloxy)-24-nor-9, 10- secochola-5E,7E, 10(19)-trien-23-ol in 14 ml Toluol wird nach Zugabe von 1,49 ml Bromessigsäure-tert.-butylester und 5,5 ml 25Ziger Natronlauge und 26,6 mg Tetra-n-buty ammoniumhydrogensulfat 24 Stunden bei Raumtem¬ peratur gerührt. Anschließend gibt man erneut 30 mg Tetrabutyl-ammo- niumsalz hinzu und rührt weitere 24 Stunden bei 25°C. Zur Aufarbeitung verdünnt man mit Diethylether, wäscht mit Wasser und gesättigter Koch¬ salzlösung, trocknet die Etherphase über Na.SO, und engt ein. Das Roh-

2 4 produkt wird an 160 g Kieselgel mit Hexan/ Ethylacetat (0-5Z) gradien- tenchromatographiert. Man erhält 1,15 g 1S,3R-Bis(tert.-butyldimethyl- silyloxy)-25-(tert.-butylcarbonyloxy)-24-oxa-26,27-dinor-9,1 0-secocho- lesta-5E,7E, 10(19)-trien als farbloses öl.

b) Aus 297 mg Magnesium (Späne) und 0,91 ml Bromethan in 7 ml Tetrahydro- furan stellt man in üblicher Weise Ethylmagnesiumbromid her und tropft bei Raumtemperatur eine Lösung von 750 mg des unter a) erhaltenen Oxa- esters in 10 ml abs. THF hinzu. Nach Zugabe rührt man 1,5 Stunden bei 25°C, gießt in Wasser und extrahiert mit Ethylacetat. Chromatographie des Rohprodukts an Kieselgel mit Hexan/Ethylacetat ergibt 520 mg 1S.3R- Bis-(tert.-butyldimethyl-silyloxy)-26,27-dimethyl-24-oxa-24- homo-9, 10-s ecocholesta-5E,7E, 10(19)-trien -25-ol als farbloses Öl.

¹ H-NMR (CDC1 ): 6=0.54 ppm(s.3H.H-18) ; 3,37(AB-qu..J=10,5Hz.2H.OCH ₂ ) ; 3,48 (m.2H,CH 0); 4.22( , 1H.H-3) ; 4 ,53(m,1H.H-1 ) ; 4,93 u. 4,98 (m.je 1H.H-19); 5.82 u. 6.46(d,J=11HZ,je 1H.H-6.H-7).

c) Eine Lösung von 500 mg des unter b) erhaltenen Produkts in 90 ml Toluol wird nach Zusatz von 88 mg Anthracen und 0,05 ml Triethylamin 18 Minu¬ ten bei Raumtemperatur in einer Tauchapparatur (Pyrex-Glas) mit einer Quecksilberhochdrucklampe (Heraeus TQ 150) bestrahlt. Nach dem Einengen der Reaktionslösung wird der Rückstand an Kieselgel mit Hexan/Ethylace-

tat chromatographiert. Man erhält 490 mg 1S,3R-Bis-(tert.-butyldi e- thylsilyloxy)-26,27-dimethyl-24-oxa-24-homo-9, 10-secocholesta-5Z,7E, 10- (19)-trien -25-ol als farbloses Öl.

d) Eine Lösung von 480 mg des unter c) erhaltenen Produkts in 15 ml THF wird nach Zusatz von 3 ml einer Imolaren Lösung von Tetra-n-butylam- oniu fluorid in THF 60 Minuten bei 50°C gerührt. Nach dem Abkühlen verdünnt man mit Ethylacetat, wäscht mit NaHCO -Lösung und Wasser, trocknet über Na SO, und engt ein. Chromatographie des Rohprodukts an Kieselgel mit Heκan/Ethylacetat ergibt 200 mg 1α,25-Dihydroxy-26,27- dimethyl-24-oxa-24-homo-cholecalciferol als amorphen Feststoff. ¹ H-NMR(CDC1 ₃ ): δ=0,55 ppm(s.3H,H-18) ; 0,87(t, =7Hz.CH ₂ CH ₃ ) ; 0,94(d,J=7Hz.3H, H-21 ) ; 1 ,50(m,CH ₂ CH ₃ ) ; 3,26(AB-qu. ,J=10,5Hz,2H,CHgO) ; 3,4β(m.2H.CH ₂ 0) ; 4,22 (m.1H,H-3); 4 ,43(m, 1H.H-1 ) ; 5,00 u. 5,32(m,je 1H.H-19); 6,02 u. 6,38(d,J= 11Hz, je 1H.H-6.H-7).

BEISPIEL 2

1α,25-Dihydroκy-2*-oκa-24-ho o-choleca_ciferol

Die Herstellung der Titelverbindung erfolgt in Analogie zu dem unter Bei¬ spiel 1 beschriebenen Verfahren. Im Verfahrensschritt 1b) wird lediglich Ethylmagnesiumbromid durch Methylmagnesiumbromid (1,5 molare Lösung in THF/Toluol) ersetzt. Man erhält die Titelverbindung als farbloses Öl. ¹ H-NMR(CDC1 ₃ ): 5=0,53 ppm(s,3H.H-18) ; 0,95(d,0=7Hz.3H.H-21 ) ; 1,20(s,6H,H-26.H27); 3,23{AB-qu. , =10,5Hz.2H.CH ₂ 0) ; 3 ,50(m.2H,CH ₂ <D) ; 4,23(m,1H,H-3); 4.43(m. 1H.H-1); 5,00 u. 5,32(m, je 1H.H-19); 6,02 u. 6.38 (d,J=11Hz, je 1H.H-6.H-7).

BEISPIEL 3

1α.26-Dihydroκy-2--oκa-cholecalciferol

a) Eine Lösung von 0,6 ml Diisopropylamin in 6 ml THF wird bei 0°C tro¬ pfenweise mit 2,54 ml einer 1,6 molaren Lösung von n-Buthyllithium in

Hexan versetzt. Man rührt 15 Minuten bei 0°C, kühlt dann auf -70°C und tropft eine Lösung von 1,00 g 1S,3R-Bis-(tert.-butyldimethylsilyloxy)- 25- ⁽ tert.-butylcarbonyloxy)-24-oxa-26,27-dinor-9,l0-secoch olesta- 5E,7E.10 ⁽ 19 ⁾ -trien ⁽ s. Beispiel 1a) in 15 ml THF hinzu. Nach Zugabe rührt man 60 Minuten bei -70°C und gibt dann tropfenweise 0,36 ml Jod _¬ methan hinzu. Die Reaktionslösung wird 30 Minuten bei -70°C und weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, in Wasser gegossen und mit Ethylacetat extrahiert. Chromatographie des Rohprodukts an Kieselgel mit Hexan/ Ethylacetat ergibt 730 mg 1S,3R-Bis-(tert.-butyldimethylsi- lyloxy)-25(tert.-butylcarbonyloxy)-24-oxa-27-nor-9,10-secoch olesta- 5E.7E, 10 ⁽ 19 ⁾ -trien als öliges Gemisch der C-25-Epimeren.

b) Das unter a) erhaltene Produkt (730 mg) wird in 100 ml Toluol, 140 mg Antracen und 0,05 ml Triethylamin unter den Bedingungen des Beispie _ls

1c> photoisomerisiert. Man erhält 610 mg 1S,3R-BΪS-(tert..-butyldimβt yl silyloxy .-25-ltert.-butylcarbonyloκy)-24-oxa-27-nor-9, ,0-secocholesta- 52,7E.10(19)-trien als farbloses Öl.

c) 380 mg des unter b) erhaltenen Epimerengemisches werden in 10 ml THF gelöst und bei 5°C tropfenweise zu einer Suspension von 65 mg Lithium- alumiπiumhydrid in 10 ml THF gegeben. Man rührt 45 Minuten bei 5°C, zerstört dann überschüssiges Reduktionsmittel durch vorsichtige Zugabe von wäßrigem THF, filtriert und engt das Filtrat ein. Das so erhaltene rohe 1S,3R-Bis-(tert.-butyldimethylsilyloxy)-24-oxa-9, 10-secocholesta- 5Z.7E, 10(19)-trien-26-ol wird unter den Bedingungen des Beispiels 1 d) mit Tetra-n-butylammoπiumfluorid desilyliert. Nach chromatographischer Reinigung erhält man 110 mg lα,26-Dihydroxy-24-oxa-cholecalciferol als öliges Gemisch der C-25 Epimeren im ungefähren Verhältnis 1:1.

¹ H-NMR(CDC1 ₃ ): 6=0,54 ppm(s.3H,H-18) ; 0,96(d, =7Hz.3H,H-21 ) ; 1,10(2d,J=6Hz. 3H.H-27); 4 ,22(m, 1H,H-3) ; 4 ,42(m.1H.H-1 ⁾ ; 5.00 u. 5.32(s. je 1H.H-19); 6.00 u. 6,38(d.J=11Hz. je1H.H-6.H-7 ⁾ .