3-(Mercaptoalkyl)- bzw. 3- (AlkyIthioalkyl )-pyrimidin-2, 4 ( 1H, 3H) -dione

Die Erfindung betrifft 3-(Mercaptoalkyl )- bzw. 3- ⁽ Alkylthio- alkyl) -pyrimidin-2,4(1H,3H)-dione der allgemeinen Formel I,

worin bedeuten:

R ¹ H, CH ₂ C00H, CH(CH ₃ )C00H, CH ₂ C00Alk oder CH(CH ₃ )C00Alk

R ² COOH, C0NH ₂ , CN und H

3 R H, Aryl oder substituiert Aryl

Alk Niederalkyl, C bis C _g

und

n 2 oder 3

einschließlich ihrer Tαutomere und pharmazeutisch unbe¬ denkliche Alkali- bzw. Ammoniumsalze, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung in pharmazeutischen Zubereitungen .

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I zeichnen sich durch vorteilhafte immunmodulierende, vorzugsweise immun¬ stimulierende, sowie die Phagozytoseaktivität von Granulo- zyten und Makrophagen steigernde Wirksamkeit aus, so daß sie günstig in der Human- und Veterinärmedizin zur Behandlung von Krankheiten einβetzbar sind, deren Ursache ein durch exogene und/oder endogene Einflüsse bzw. Faktoren verur¬ sachter erniedrigter Immunstatus bzw. verminderte Phago¬ zytoseaktivität von Granulozyten bzw. Makrophagen i∑3t.

Defekte des Immunsystems bei Mensch und (Nutz)Tier können angeboren sein oder im Laufe der Entwicklung durch innere und/oder äußere Faktoren "erworben" werden. So ist seit längerem bekannt, daß u.a. häufiger Streß, fortgeschrittenes Lebensalter, spezielle Arzneimittel, virale Infektionen und Mißbrauch von Alkohol den Immunstatus bei Mensch und ggf. Tier verringern und damit die Abwehrbereitschaft der ange¬ sprochenen Organismen gegenüber viralen und bakteriellen Infektionen schw chen. Auch Krebspatienten weisen eine ver¬ minderte Fähigkeit zur immunologischen Infektabwehr auf, die - unbeabsichtigt - durch (zumeist unverzichtbare) chemothe¬ rapeutische Maßnahmen und/oder durch Bestrahlung noch zu¬ sätzlich minimiert wird. Weiterhin kann auch die unspezi¬ fische Infektabwehr z.B. durch Umweltgifte und als Folge von Nebenwirkungen einiger Arzneimittel gehemmt sein, was sich u.a. in einer verminderten Aktivität von Makrophagen und Granulozyten zeigen kann.

Aus den dargelegten Gründen wird weltweit seit einer Reihe von Jahren nach Möglichkeiten zur Steigerung nicht optimal ablaufender Immunprozesse sowie zur raschen und möglichst vollständigen Wiederherstellung einer verminderten immuno¬ logischen Leistungsfähigkeit gesucht. Zahlreiche Substanzen unterschiedlicher Herkunft - zusammengefaßt unter der Bezeichnung "biological reβponse nodifiers" - wurden bisher auf ihre immunmodulierende Wirksamkeit geprü t. Darunter befinden sich auch verschiedene heteroσyclische Verbin¬ dungen, von denen vor allem Inoβin-benzoat und Levamisol- hydrochlorid als Arzneimittel in den Verkehr gebracht wurden. Andere Substanzen wie Azimexon, Dithiocarbum und Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)-hypoxanthin (NPT 15 392) wei¬ sen ebenfalls immunstimulierende und/oder immunrestaurative Wirkungen auf. Als Arzneimittel sind diese letztgenannten Verbindungen bisher jedoch nicht eingeführt.

Eine Standardisierung von bekannten und neuartigen Wirk-

Stoffen mit immunstiraulierender und/oder -restaurativer Wirkung ist derzeit nur schwer möglich. Das ergibt sich zum einen aus der Komplexizität des Immunsystems bei Mensch und Tier mit seinen vielfältigen Regulations- und Gegenregula¬ tionsmechanismen und hänBt zum anderen auch mit fehlenden, international verbindlich vereinbarten Versuσhsbedingungen bei Labortieren bzw. ebensolchen Bedingungen für klinische Untersuchungen am Menschen zusammen. Einer umfassenden Ver¬ gleichbarkeit immunstimulierend und/oder iπimunrestaurie- rend wirkender Verbindungen steht auch die unterschied¬ liche Beeinflussung der verschiedenen immunkompetenten Zellen durch die jeweiligen (potentiellen) Wirkstoffe ent¬ gegen, woraus sich eine nicht gleichartige Einflußnahme auf spezifische und unspezifische Abwehrmechanismen ergibt. Levamisol-hydrochlorid wirkt z.B. vorwiegend immunrestau¬ rierend bei immunsupprimierten Organismen. Es werden von diesem Arzneimittel vorwiegend T-Zellen stimuliert. Der Einfluß auf die humorale Immunantwort ist vergleichsweise gering. Eine Aktivierung unspezifisσher Abwehrmechanismen ist durch Stimulierung der Phagozytose sowie der Proli¬ feration und Bakterizidie von Makrophagen gegeben. Inosin- benzoat zeigt dagegen vor allem eine immunstimulierende Wirkung vor allem durch Steigerung der humoralen Immunant¬ wort. Die Proliferation und Differenzierung der T-Lympho- zyten werden ebenso gesteigert wie die über eine Induktion von Lymphokinen vermittelte Makrophagenfunktion.

Trotz der erzielten Fortschritte auf dem Gebiet der Ent¬ wicklung von immunstimulierend und/oder immunrestaurativ wirkenden Substanzen weisen die wenigen bei entsprechender Indikation verwendeten Arzneimittel Nachteile auf. So ruft z.B. das durch Diastereomerentrennung des racemischen Tetra- misolhydrochlorids darstellbare optische Isomer Levamisol- hydrochlorid beim Menschen nach oraler Applikation einen bitter-metallischen Geschmack hervor und kann zu Leukopenie, Agranulozytose, Nausea und Erbrechen führen.

Auch i9t bei diesem Arzneimittel die Abhängigkeit der Wirkung von Alter, Geschlecht und genetischen Faktoren zu beachten. Das in realtiv hohen Dosen zu applizierende Inosin-benzoat kann zu Hyperurikämie, Erbrechen und Anstieg von Haematokrit führen. Als Nebenwirkung beim Azimexon wer¬ den Kopfschmerz, Erbrechen, Hb- und Erythrozyten-Abnahrae registriert.

Als Gründe für die Nachteile der genannten Arzneimittel bzw. in klinischer Testung befindlichen Substanzen sind in der Art der bisher verwendeten Wirkstoffe zu suchen. Aus den dargelegten Gründen resultiert daher ein Bedürfnis nach Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen, die sich aus einem defizitären Immunstatus bzw. verminderter Phago- zytoseaktivität von Granulozyten bzw. Makrophagen ergibt.

Die Erfindung hat die Aufgabe, neue chemische Verbindungen aufzufinden, die immunstimulierende bzw. immunmodulierende Eigenschaften aufweisen und/oder eine die Phagozytose- leistung menschlicher Granulozyten verstärkende Wirkung hervorrufen, wenn sie menschlichen oder tierischen Orga¬ nismen intravenös, rektal oder vorzugsweise peroral zu¬ geführt werden. Es ist weiterhin die Aufgabe dieser Er¬ findung, Verfahren zur Herstellung solcher Verbindungen als auch entsprechender Arzneimittel zu entwickeln, die derar¬ tige Substanzen als wirksame Bestandteile aufweisen.

Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst.

Die erfindungsgemäßen 3-(Mercaptoalkyl)- bzw. 3-(Alkylthio- alkyl)-pyrimidin-2,4(1H,3H)-dione besitzen die allgemeine Form l I•

worin bedeuten:

R ¹ H, CH ₂ C00H, CH ₍ CH3 ^C00H ' ^COOAlk oder CH ⁽ CH ₃ ⁾ COOAlk

R ² COOH, C0NH ₂ , CN und H

3 R H, Aryl oder substituiert Aryl

Alk Niederalkyl CC _χ bis C ₃ >

n 2 oder 3.

Unter den erfindungsgemäßen Verbindungen werden auch pharmakologisch geeignete Alkali- und Ammoniumsalze sowie auch ihre Tautomeren verstanden.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I sind als neue chemische Substanzen vor allem aufgrund ihrer immunmodu¬ lierenden und die Phagozytoseaktivität menschlicher Granulo¬ zyten aktivierenden Wirkung vorteilhaft in der Human- und Veterinärmedizin einsetzbar.

Von den Verbindungen der allgemeinen Formel I sind als besondere Ausführungsform der Erfindung folgende Substanzen besonders hervorzuheben: .

3(2-Mercαptoethy1)-6-pheny1-pyrinidin-2,£<1H,3H)dion - 5-carbonitril (R ¹ = H, R ² = CN, R ³ = C 6,H5_ , n = 2) ;

3(3-Mercaptoprop-1-y1)-6-pheny1-pyri«idin-2,A(1H,3H)- dion-5-carbonitril (R ¹ = H, R ² = CN, R ³ = C 6,HO _C , n = 3) ;

3(3-Mercaptoprop-l-yl)-6-phenyl-pyrimidin-2,<4(lH,3H)- dion-55--σ( arbonsäureamid (R 1 = H, R2 = CONH-, R3 = C.H- , n = 3) ;

3(3-Mercαptoprop-l-y1) yrinidin-2,4(1H,3H)dion-5-car- bonsäure (R ¹ = H, R ² = COOH, R ³ = H, n = 3)

3[ (2-Carboxymethylthio)ethyl]-6-phenyl-pyrimidin- 2 _f Δ(lH,3H)dion-5-carbonitril (R ¹ = CH ₂ C00H, R ² = CN, R ³ = C ₆ H _5> n = 2)

31 (3-Cαrboxymethylthio)prop-l-yll-6-phenyl-pyriιaidin- carbonsäureamid (R ¹ = CH ₂ COOH, R ² = C0NH ₂ ,

Entsprechend vorliegender Erfindung können diese Verbin¬ dungen der allgemeinen Formel I in der formelmäßig ausge¬ wiesenen Lactamform als auch in der tautomeren Lactimform vorliegen, ferner auch als Salze, insbesondere pharmazeu¬ tisch unbedenkliche Alkali- oder Ammoniumsalze.

Das erfindungβgemäße Verfahren zur Herstellung der Verbin¬ dungen der allgemeinen Formel I ist durch folgende Ver¬ fahrensweisen gekennzeichnet:

Erhitzen von 2,3-Dihydrothiazolo[3,2-alpyrimidin-5-onen der allgemeinen Formel II bzw. von 3,4-Dihydro-2H-pyrimido- [2,3-b] [1,3]thiazin-6-onen der allgemeinen Formel III,

worin jeweils

R 2' COOH, COOAlk, CONH, und CN bedeutet und

R 3 und Alk die oben genannten Bedeutungen aufweisen, mit verdünnten Mineralsäuren, wie Salzsäure und/oder Schwefel¬ säure, vorzugsweise jedoch mit Mischungen dieser verdünnten Mineralsäuren mit Eisessig und/oder Ameisensäure unter Rück¬ fluß unter Erhalt der Verbindungen der allgemeinen Formel I

oder ihrer Tautomeren, worin R einem H-Atom entspricht und

R 2, R3 und n die obigen Bedeutungen aufweisen. Bei dem rüσk- fließenden Erhitzen der Verbindungen der allgemeinen Formel

II bzw. III mit R 2' = COOAlk unter den vorgenannten Bedingun¬ gen bilden sich Verbindungen der allgemeinen Formel I oder ihrer Tautomeren mit R 2 = COOH und R1 = H sowie n = 2 bzw.

3. Im Falle des Erhitzens der Verbindungen der allgemeinen

2.1

Formel II bzw. III mit R = COOH, CONH oder CN bilden sich unter den vorgenannten Bedingungen die Verbindungen der all-

2 gemeinen Formel I oder ihrer Tautomeren, wobei R jeweils die gleiche Bedeutung wie R 2'-der oben genannten Verbindungen der allgemeinen Formel II bzw. III aufweist.

In einer weiteren Ausführungεform der Erfindung können die

Verbindungen der allgemeinen Formel I oder ihre Tautomere mit R ¹ = CH ₂ C00H, CHCCH ₃ >C00H, CH ₂ C00Alk oder CHCCH ₃ >C00Alk in an sich bekannter Weise durch Umsetzung der Verbindungen der allgemeinen Formel I mit R = H mit den Halogencarbon¬ säuren bzw. den Halogencarbonsäurealkylestern

R*X

der allgemeinen Formel IV, worin

R ⁴ CH ₂ C00H _f CH(CH ₃ >C00H bzw. CH ₂ C00Alk oder CHCCHg)COOAlk;

X Cl oder Br und

Alk Niederalkyl, C- bis C ₃ ,

bedeuten, in Gegenwart von Alkalihydroxiden in wäßriger oder wäßrig-alkoholischer Lösung bzw. in Gegenwart von Alkali- alkoxiden, vorzugsweise Natriumethylat, in einem Tempera¬ turbereich von 10 - 60 ^β C, vorteilhafterweise unter Sσhutz- gasatmoshäre, gewonnen werden. In einer weiteren Ausfüh¬ rungsform der Erfindung können die Verbindungen der allge¬ meinen Formel I oder ihre Tautomere in an sich bekannter Weise in ihre Alkali- oder Ammoniumsalze übergeführt werden.

Ein weiterer Aspekt vorliegender Erfindung besteht in phar¬ mazeutischen Zubereitungen zur Behandlung von Imraunerkran- kungen und solchen Krankheiten, deren Ursache auf eine ver¬ minderte Phagozytoseaktivität von Granulozyten und Makro¬ phagen bei Mensch und Tier beruht, welche eine oder mehrere Verbindungen der allgemeinen Formel I und/oder deren Tauto¬ mere und/oder deren pharmazeutisch unbedenkliche Alkali¬ oder Ammoniumsalze und inerte, pharmazeutisch übliche Hilfs- und/oder Trägerstoffe enthalten.

Falch und Natvig (Acta Chem.Scand. 2_4, (1970) 1423) haben eine Verbindung, die unter die Definition der allgemeinen Formel I (R ¹ = R ² = H, R ³ = C,H _K , n = 2) fällt, beschrieben. Die genannten Autoren haben diese Verbindung hinsichtlich ihrer massenspektrometrischen Eigenschaften untersucht. Angaben über eine biologische Aktivität dieser Substanz wurden nicht gemacht.

Untersuchungen zur pharmakologischen Aktivität

Wie vorstehend ausgeführt, besitzen die Verbindungen der allgemeinen Formel I wertvolle immunmodulierende und die

Phagozytoβeaktiviät menschlicher Granulozyten aktivierende

Eigenschaften.

Im folgenden sind die Ergebnisse über

-immunregulatoriβche,

-immunstimulierende und

-phagozytoseaktivitätserhöhende

Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen aufgeführt.

Der Nachweis einer immunregulatorischen Wirksamkeit wurde

-5 nach peroraler Applikation (bevorzugte Dosierung: 1,0 x 10

Mol/Kg Körpermasse) am Meerschweinchen (Albino-Koloniezuσht) und u.a. mittels folgender Techniken geführt:

- Perkutaner Test zum Nachweis einer Kontaktüberempfind-

lichkeit vom verzögerten Typ (Effektor-T-Lymphozyten- Aktivität) ,

- Test nach Takatsy zum Nachweis TNP-spezifischer Serum¬ antikörper (humorale Immunantwort),

- In-vivo-Lymphoblastentransformationstest (aurikulärer Lymphknoten) .

Der Nachweis der hochsignifikanten phagozytoseaktivierenden Wirkung der Verbindungen der allgemeinen Formel I an menschlichen Granulozyten erfolgte in einer Konzentration von 200 μg/ml einmal durch den in bekannter Weise unter Verwendung von Lucigenin und opsoniertem Zymosan durch¬ geführten

- Chemilumineszenztestes unter Benutzung eines "Lu ino- meters" und von N-Formyl-Met-Phe, Firma Sigma, als Positivkontrolle sowie einer Negativkontrolle und durch

- Bestimmung des "Phagozytoseindex" als numerischer Ausdruck der durchschnittlichen Anzahl phagozytierter Zymosanpar- tikel pro Granulozyt.

1. Untersuchungen zur imaunregulatori sahen Wirksamkeit

1.1. Perkutaner Test zum Nachweis einer Kontaktüberempfind¬ lichkeit

Die epikutane Applikation von 2,4-Dinitrofluorbenzol (DNFB) führt bei Meerschweinchen und Maus zur Entwicklung einer verzögerten Überempfindlichkeit, eines Immunstatus, der an die klonale Vermehrung spezifischer T-Lymphozyten (auch als T-.- _u -Ly = T-Lymphozyten mit besonderer Rolle bei der Entwicklung einer "delayed-type hypersensitivity" bezeich¬ net) gebunden ist. Erfolgt nach einer Latenzzeit von mind. 5 d eine erneute DNFB-Applikation, kommt es zu einer Frei¬ setzung von Lymphökinen durch Reaktion mit den ^-„- y die¬ ses Hautareals und dadurch zu einer lokal begrenzten, gut auswertbaren Entzündungsreaktion.

7 d nach der Immunisierung mit lproz. DNFB-Lsg. wurden die Flanken der Versuchstiere enthaart und durch Aufbringen von je einem Tropfen (10 ul) 0,5, 0,1, 0,05, 0,025 und 0,01proz. DNFB-Lsg. getestet. Die noch positive Konzentration ist dem Grad der Sensibilierung umgekehrt proportional. Die Test¬ ergebnisse werden aus Anzahl und Umfang der positiven Haut¬ reaktionen ermittelt. Der Stimulationsindex (SD wird durch Vergleich zwischen Test- und Kontrolltieren bestimmt.

Die Applikation der Verbindungen der allgemeinen Formel I wurde peroral mittels Schlundsonde vorgenommen. Es erfolgte an den Tagen +1 (einen Tag nach der Immunisierung) bis +6 jeweils eine Gabe des Wirkstoffes von 1x10 -5 Mol/Kg Körper¬ masse in mikronisierter Form als wäßrige Suspension, der in aller- Regel in bis zu vierfacher Gewichtsmenge die immuno¬ logisch indifferente Lactose beigefügt war. Die Kontroll¬ tiere erhielten nur eine wäßrige Lactoselösung.

1.2. Takatsy-Test

Nach Immunisierung mit 2,4-Dinitrofluorbenzol (DNFB) kommt es beim Meerschweinchen u.a. auch zur Bildung TNB-spezi- fischer Antikörper, die hauptsächlich der gGl-Subklasse angehören. 14 Tage nach primärer epikutaner Applikation von DNFB-Lsg. wurde den Versuchstieren durch Herzpunktion Blut entnommen. Die Bestimmung der Serum-Antikörperkonzentration erfolgte nach einer von Takatsy beschriebenen Methode (Takatsy,G.: A new method for the preparation of serial dilutions in a quick an accurate way. Kiserletes Orvostudo- many 2_ (1950) 263-396). Als Indikatorzellen wurden trinitro- phenylierte Schaferythrozyten verwendet (Kopplung nach Rittenbere und Pratt: Rittenberg, .B. and Pratt,K.L.: Antitrinitrophenyl (TNP) plaque assy. Primary response of BALB/c mice to soluble and particulate immunogen. tProc. Soσ. exp. Biol . Med. 132 (1969) 575-5791).

1.3. In-vivo-Lymphoblastentrans ormationstest

Eine perkutane (Ohr) Applikation von DNFB verursacht u.a. histologische Veränderungen im drainierenden (aurikulären) Lymphknoten. In den ersten Tagen nach Antigengabe kommt es zur Transformation TNP-spezifischer Zellen zu Blasten, deren Anzahl mit der Intensität einer anlaufenden zelIvermittelten Immunreaktion korreliert und am Tag 4 das Maximum erreicht. [Turk.J.L. and Stone,S.H.: Implications of cellular changes in lymph nodes during the develop ent and inhibition of delayed type hypersensitivity, Wiβtar Institute Press, 1963, 51-60]. In Schnitt- bzw. Ausstrichpräparaten läßt sich nach Anfärbung mit Methylgrün-Pyronin (Schulze,E. und Graup¬ ner,H. : Anleitung zum mikroskopisch-technischen Arbeiten in Biologie und Medizin, Akademische Verlagsgesellschaft Geest und Portzig KG, Leipzig, 1960) die Anzahl der pyroninophilen Lymphoblasten lichtmikroskopisch erfassen.

Weiterhin kam eine automatisierte Auswertung mittels Zell- βorter (fluorescence activated cell sorter, FACS) 440 der Firma Beσton Dickinson ( ountain View, USA) mit dem Aus¬ wertesystem Consort 40 zum Einsatz. Alle Proben - je Test 2 x 10 Lymphknotenzellen - wurden nach den Parametern Forward scαtter gegen 90°-sσatter (P1:P4) vermessen. Die Abtren¬ nung der Blasten erfolgte nach den Kriterien "Größe" und "Oberflächenbeschaffenheit" tEnzmann,V., Mehlhorn,G., Weichert,H. und Drößler,K. : Lokaler Lymphknotenassay zum Nachweis von Effekten i munmodulatorisch aktiver Verbindungen] .

1.4. Ergebnisse

1.4.1. Sensibilisierungsindex (SD und Serumantikörper¬ konzentration (AK-Titer-Differenz) nach Applikation von ausgewählten Verbindungen der allgemeinen Formel I, II und III

Tabelle 1

Sensibilisierungsindex (SD und Serumantikörperkonzentration (AK-Titer-Differenz) ausgewählter Verbindungen der allge¬ meinen Formel I, II und III jeweils im Vergleich zur Kontrollgruppe (Sσreening-Werte)

Verbindung Kontaktdermatitis TNP-spez. gemäß Antikörper

Beispiel 24h-Reaktion 48h-Reaktion (Titerdifferenz)

Aus den Werten der Tab. 1 ist ersichtlich, daß Verbindungen der allgemeinen Formel I, aber auch solche der allgemeinen Formeln II und III einen gut nachzuweisenden Effekt auf die Effektor-T-Lymphozyten-abhängige verzögerte Überempfind¬ lichkeit haben. Sl-Werte von 120 (und höher) bzw. 80 (und niedriger) sind als signifikanter Nachweis eines stimula- torischen bzw. suppressorischen Effektes anzusehen.

- 13 -

Seru antikörpertiter-Differenzen von >+l bzw. <-l belegen einen stimulatorischen bzw. suppreβsorischen Effekt der untersuchten Verbindungen auf die humorale Immunantwort.

1.4.2. Steigerung der Anzahl pyroninophiler Lymphoblasten (pB) im aurikulären Lymphknoten nach Applikation ausgewähl¬ ter Verbindungen der allgemeinen Formel I und von 2b

Tabelle 2

Verbindung Zunahme der Anzahl pB [%] im Ver¬ gemäß gleich zur sensibilisierten Kontrolle

Beispiel Auswertungsmethode Lichtmikroskop FACS

lc 33,6 55,0 2b 39,6 82,1 3 31,4 n.b.* 4 3,9 n.b.* 6 30,2 59,8

9c 34,5 58,7 MECH** 25,5 78,4

* n.b.: nicht bestimmt; ** BECH: 3(2-Bercapto-ethyl)chinazolin- 2,4(lH,3H)dion [EP 454060 A1;C.A. : 116, 83689u (1992);

Die Werte aus Tabelle 2 belegen, daß bis auf eine Ausnahme von den exemplarisch untersuchten Verbindungen der allge¬ meinen Formel I im Vergleich zur Kontrolle, bei der nur eine Senβibiliβierung mit DNFB erfolgte, eine signifikante Zu¬ nahme der Anzahl pyroninophiler Lymphoblasten erfolgte. Die

Testergebnisse weisen aus, daß die Verbindungen der allge¬ meinen Formel I eine deutliche immunstimulierende Wirkung auf die zellvermittelte Immunreaktion haben. Ein Vergleich der Testergebnisse mit dem hochsignifikant immunstimula- torisch und -immunrestaurativ wirksamen MECH ergibt, daß einige Verbindungen der allgemeinen Formel I in diesem Test eine vergleichbare und andere eine größere Aktivität ent¬ falten.

1.4.3 Ergebnisse des Chemilumineszenztestes und Bestimmung der Phagozytoserate

Die Untersuchungen ausgewählter Verbindungen im Chemilu- mineszenztest ergaben, daß z.B. die nach den Beispielen 1, 3, 4, 5, 7, 8, und 9b synthetisierten Verbindungen im Ver¬ gleich zu den Negativkontrollen ausnahmslos Steigerungen aufweisen, die im Bereich zwischen 60 und 373% liegen. Die gemäß Beispiel 4 und 9b synthetisierten Verbindungen der allgemeinen Formel I erwiesen sich in diesem Test als die mit Abstand wirkungsstärksten Substanzen (s. Tab. 3). Die vergleichsweise untersuchte Substanz N-Formyl-Met-Phe (Sigma) als Positivkontrolle erbrachte dagegen im Vergleich zur Kontrolle Steigerungen um 146 bzw. 156%.

Bei der Untersuchung des "Phagozytoβeindex" (durchschnitt¬ liche Anzahl von phagozytierten Zymosanpartikeln pro Gra- nulozyt) der nach den Beispielen 1, 3, 4, 5, 7, 8, und 9b synthetisierten Verbindungen der allgemeinen Formel I wurden im Vergleich zur Kontrolle Steigerungen um 25 bis 51% re¬ gistriert. Als wirkungsstärkste Verbindungen der allge¬ meinen Formel I erwiesen sich die gemäß der Beispiele 3, 1 und 5 synthetisierten Substanzen mit einer Erhöhung des Phagozytoseindex um 51, 44 bzw. 40%. Nähere Einzelheiten sind in Tabelle 3 aufgeführt.

Tabel le 3

Testserie II

Integr. Integral; Fläche unter der Chemilumineszenzkurve. KKontr. X Kontrolle; Haß für die Stimulation der Substanzen, angegeben als Quotient der Integrale der Chemilumineszenzkurven bzw. der

PI zu denen der Negativkontrolle x 100.

PI: Phagozytoseindex. P: Signifikanzniveau: 0.01: 99,9 signifikant. s: signifikant. B*: hergestellt nach Beispiel ...

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert

Beispiel 1

3(3-Mercaptoprop-l-y1)-6-pheny1-pyrimidin-2,4(1H,3H>di on-5-

1 2 3 carbonsäure (Formel I; R = H, R = COOH, R = C 6.HD _C , n = 3)

a) 8-Phenyl-3,4-dihydro-2H-pyrimido[2,3-b] [1,3]thiazin-6-on- 7-carbonsäureamid (Formel III; R ² = C0NH ₂ , R ³ = C _fe H ₅ )

2,69 g (10 mmol) 8-Phenyl-3,4-dihydro-2H-pyrimido[2,3-b]-

2 3 Il,3]thiazin-6-on-7-σarbonitril (Formel III; R = CN, R =

C.H _C ) werden unter Rühren in 15 ml konz. Schwefelsäure ein- getragen und anschließend vorzugsweise unter weiterem Rühren und Feuchtigkeitsausεchluß am Rückflußkühler 2h bei einer Temperatur von σa. 100 °C erhitzt. Nach dem Erkalten wird der Ansatz in ca. 200 ml Eiswasser gegossen und mit lOproz. Natronlauge ein pH-Wert von etwa 7 eingestellt. Nach 2stdg. Aufbewahrung bei Zimmertemperatur wird der gebildete Nieder¬ schlag abgesaugt, gründlich mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet. Es werden 2,18 g (Ausbeute: 81%) nahezu de reines Rohprodukt erhalten. Farblose Kristalle. ^C _{I Λ} H ₁₃ N_0 ₂ S (287,3). Schmb. 265-268 °C (1-Propanol) . IR(KBr) : CO-Bande bei 1650 cm ^"1 . MS (70 eV) : m/e 286 (14%) IM* '-ll. UV/VIS

(Ethanol):λ max Inm] lg (8) 250 (4.28), 258 (4.27), 337

(4.14) .

b) 8-Phenyl-3,4-dihydro-2H-pyrimido[2,3-b] 11 ,3]thiazin-6-on- 7-carbonsäure (Formel III; R ² = COOH, R ³ = C ₆ H ₅ )

2,87 g (10 mmol) des nach a) erhaltenen Pyrimidothiazin- carbonsäureamid-Derivates, ggf. auch als Rohprodukt einsetzbar, werden in gepulverter Form zu 25 ml 32proz. Salzsäure gegeben. Anschließend wird der Reaktionsansatz bis

zur vollständigen Auflösung der Substanz gelinde erwärmt. Nach dem Erkalten wird unter Eiskühlung und Rühren die aus 2,65 g Natriumnitrit und 15,0 ml Wasser bereitete Lösung tropfenweise dem Ansatz hinzugefügt, und das Rühren wird 30 min fortgeführt. Anschließend wird die Reaktionsmischung auf 90 °C erwärmt und 5 min bei dieser Temperatur gehalten. Nach dem Erkalten wird der Ansatz in 500 ml Eiswasser eingerührt, der gebildete Niederschlag nach 2 h abgesaugt, mit reichlich Wasser gewaschen und anschließend an der Luft getrocknet. Es werden 1,85 g (Ausbeute: 65%) de nahezu reines Rohprodukt erhalten. Farblose Kristalle. ^{" C} _1Λ ^H ₁₂ ^N 2°3 ^{S (288} » ³ - Schmb. 228-231 °C (nach Umfällung aus 5% NaHCOg/verd. Salzsäure ⁾ . IR (KBr): 1740 (-C00H) und 1595 cm-1 (-C0) asymm. breit. MS

(70 eV) : m/e 288 (100%; Basiβpeak) . UV/VIS (Ethanol):λ ma.„x

Inm] lg (6) 256 (4.31), 319 (4.05).

c) 3(3-Mercaptoprop-l-y1)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion- 5-σarbonsäure (Formel I; R ¹ = H, R ² = COOH, R ³ = C ₆ Hg , n = 3)

1.5 g (5,2 mmol) des nach b) gewonnenen Pyrimidothiazin- carbonsäure-Derivat-Rohproduktes werden zu einer aus 3 ml konz. Schwefelsäure, 9 ml Eisessig und 115 ml Wasser be¬ reiteten Lösung gegeben und der Ansatz danach, vorzugs¬ weise unter Stickstoff-Begasung 8 h rückfließend erhitzt. Nach dem Erkalten wird der gebildete Niederschlag abgesaugt, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet. Es werden

1.06 g (Ausbeute: 66%) fast de reines Rohprodukt erhalten.

Farblose Kristalle. C 14H1.4 _/ N2_04.S (306,3). Schmb. >170 °C Zers .

(nach Umfällung aus 5% NaHC0 ₃ /verd. Salzsäure). IR(KBr) :

1740(-COOH) und 1590 cm-1(-CO)asymm.breit.UV/VIS (Ethanol): λ max (n l lg ^ö (£) 220 (4.20), 283 (4.03).

Beispiel 2

3(2-Merσaptoethyl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-5-c ar- bonsäure (Formel I; Rl = H, R ² = COOH, R ³ = ^C ₆ ^H _{5 >} n = 2)

a) 7-Pheny1-2,3-dihydrothiazolo13,2-a]pyri.midin-5-on-6-car- bonsäureamid (Formel II; R ² = C0NH ₂ , R = C^Hg ^")

Aus 2,55 g (10 mmol) 7-Phenyl-2,3-dihydrothiazoloI3,2-a]py- rimidin-5-on-6-carbonitril (Formel II; R 2 = CN, R3 = C,H_ ) und 15 ml konz. Schwefelsäure ^" analog der in Beispiel 1 unter a) aufgeführten Verf hrensweise. Es werden 2,24 g (Ausbeute 82%) de fast reines Rohprodukt erhalten. Farblose Kristalle. ^C 13 ^H 11 ^N 3°2 ^{S (273} ' ³⁾ - Schmb. 262-265 °C ⁽ Ethanol ⁾ . IR ⁽ KBr ⁾ : CO-Banden bei 1640 und 1660 cm ^**1 . MS (70 eV) : m/e 272 (53% ⁾ tM ^+* -11. UV/VIS (Ethanol) :λ Inm] lg (E) 248 (4.33), 308 max °

(4.02) .

b) 7-Phenyl-2,3-dihydrothiazoloI3,2-a]pyrimidin-5-on- 6-carbonsäure (Formel II; R ² = COOH, R ³ = C,H _C )

Aus 2,73 g (10 mmol) des nach a) gewonnenen Thiazolopyrimi- dincarbonsäureamid-Derivates, eingesetzt als Rohprodukt, analog der in Beispiel 1 unter b) aufgeführten Verfahrens¬ weise. Es werden 1,64 g (Ausbeute: 60%) de nur geringfügig verunreinigtes Rohprodukt erhalten. Farblose Kristalle. ^C 13 ^H 10 ^N 2°3 ^{S ( 7} *' ³ - Schmb. 211-215 °C ⁽ nach Umfallen aus 5% NaHC0 ₃ /verd. Salzsäure). IR(KBr) : 1740 (-C0) und 1610 nm (-C0 asymm. breit). MS(70eV): M ^{+ *} m/e 274 (100%; Basispeak) .

UV/VIS (Ethanol) :λ max [mnl(lg ) 247 (4.19), 307 (3.90).

c) 3(2-Mercaptoethyl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(lH,3H)dion-5-

1 2 3 carbonsäure (Formel I; R = H, R = COOH, R = C 6,HO_ , n = 2)

Aus 1,5 g des nach b) erhaltenen Thiazolopyrimidincarbon- säure-Derivates , eingesetzt als Rohprodukt, analog der in Beispiel 1 unter c) aufgeführten Verfahrensweise. Es werden 1,1 g (Ausbeute: 70%) de nahezu reines Rohprodukt erhalten. Farblose Kristalle. ^C ₁₃ ^H ₁₂ ^N 2 ⁰ 4 ^{S (292} » ³⁾ - Schmb. ab 185 °C Braunfärbung/Zers. bis 240 °C sintern (nach Umfallen aus 5% NaHC0 ₃ /verd. Salzsäure). IR(KBr) : CO bei 1730 und 1610 nm

(asy m . breit ) . MS (70eV) : m/e 189 (52%) IM ⁺ ' -C, H_ CN] . ι 6 5

UV/VIS (Ethanol ) : λ max [ nraK lg f. ) 220 ( 4. 17) , 282 (4.01 ) .

Beispiel 3

3 (3-Mercaptoprop-l-yl ) -6-phenyl-pyrimidin-2 , 4< 1H, 3H)dion-5- σarbonsβureamid ( Formel I ; R 1 = H, R2 = C0 n = 3)

Aus 1,5 g des nach Beispiel 1 a) synthetisierten 8-Phenyl-

3,4-dihydro-2H-pyrimido[2,3-b] [1 ,3]thiazin-6-on-7-carbon- säureamids analog der in Beispiel 1 unter c) angegebenen

Verfahrensweise. Es werden 1,3 g (Ausbeute: 78%) de reines

Rohprodukt erhalten. Farblose Kristalle. C _« 14.H _« 15 _c N3_03S-

(305,4). Schmb. 199-201 °C (Ethanol). IR(KBr) lern ] : 2570

(-SH), 1680 und 1640 (-C0). MS(70eV) : M ^{+ *} m/e 305 (100%;

Basispeak). UV/VIS (Ethanol):λ max tnm](lg£ ) 283 (4.08).

Beispiel 4

3(2-Mercaptoethyl)-6-phenyl-pyrimidin-2 _> 4(lH _f 3H)dion-5- oarbonitril (Formel I; R ¹ = H, R ² = CN, R ³ = C ₆ H ₅ , n = 2)

Aus 1,5 g 7-Phenyl-2,3-dihydrothiazolot3,2-a]pyrimidin-5-on-

6-carbonitril (Formel II; R 2 = CN, R3 = C.Hg) analog der in

Beispiel 1 unter c) angegebenen Vorschrift. Es werden 1,35 g (Ausbeute: 84%) nahezu de reines Rohprodukt erhalten. Färb-

lose Kristalle. C1,3_H1-1-N302„S. (273,3). Schmb. 236-241 °C

(1-Propanol) . IR(KBr) [ora 1: 2570 (-SH), 2245 (-CN), 1610 und 1640 (-C0). MS(70eV) : M ⁺ ' m/e 273 (5% B) . UV/VIS

(Ethanol) : Λ max InmHl E, ) ³ 8 ⁽ 4.04 ⁾ , 307 ⁽ 4.36 ⁾ .

Beispiel 5

3(3-Mercaptoprop-l-yl)pyrimidin-2,4(lH,3H)dion-5-carbon- säure (Formel I; R ¹ = R ³ = H, R ² = COOH, n = 3)

a) 3,4-Dihydro-2H-pyrimidot2,3-b] [1 ,3]thiazin-6-on-7-carbon-

2 säureethylester (Formel III; R = C00C ₂ H ₅ , R _g = H)

4,0 g (20 mmol) 4-0xo-2-thioxo-l,2,3,4-tetrahydropyrimidin- 5-carbonsäureethyleβter werden in 60 ml abs . Dimethylform- amid gelöst und dem Ansatz 4,04 g (bzw. 2,04 ml) 1,3-Di- brompropan und 2,8 g getr. Kaliumcarbonat hinzugefügt. An¬ schließend wird der Reaktionsansatz unter Ausschluß von Feuchtigkeit 6 h am Rückflußkühler erhitzt. Nach dem Erkal¬ ten wird die Reaktionslösung in 400 ml Eiswasser eingegos¬ sen, bis zum pH von etwa 11 mit verd. Natronlauge versetzt und bis zur Sättigung unter Rühren Natriumchlorid hinzuge¬ fügt. Die filtrierte Reaktionslösung wird anschließend drei¬ mal mit je 100 ml Essigsäureethylester ausgeschüttelt, die vereinigten und getrockneten Essigester-Lösungen werden im Vakuum bis zur Trockene gebracht und der verbleibende Rück¬ stand aus wenig 1-Propanol umkristallisiert. Es werden 1,6 g (Ausbeute: 40%) Reinprodukt erhalten. Farblose Kristalle. ^C 10 ^H 12 ^N 2°3 ^{S (240} ' ³⁾ - Schmb.108,5-109 °C ⁽ 1-Propanol ⁾ .

IR(KBr) tcm ^"1 ]: 1670 und 1740 (C0) . UV/VIS (Ethanol) :λ ma.,x,

Inm](lg£ ) 239 (3.86), 323 (4.28).

b) 3(3-Mercaptoprop-1-yl)pyrimidin-2,4(lH,3H)dion-5-car¬ bonsäure (Formel I; R ¹ = R ³ = H, R ² = COOH, n = 3)

- 21 - Aus 2,4 g des nach a) synthetisierten Pyrimidothiazincarbon- säureethylester-Derivates analog der in Beispiel 1 unter c) angegebenen Verf hrensweise. Verwendung einer aus 2 ml konz. Schwefelsäure, 6 ml Essigsäure und 78 ml Wasser bereiteten Lösung. Rückfließendes Erhitzen: 5 h. Es werden 1,84 g (Aus¬ beute: 80 %) de nahezu reines Rohprodukt erhalten. Farblose Kristalle. Positiver Nachweis auf SH-Gruppen mit wäßr. Nat- riumpentacyanonitrosylferrat(III)-Lsg./verd. Natronlauge. ^C 8 ^H 10 ^N 2°4 ^{S (230} ' ²⁾ - Schmb. 167-171 °C ⁽ Zers. ^{) (} nach Umfallen aus 5proz. NaHC0 ₃ -Lsg./verd. Salzsäure). IR(KBr) [cm ]: 1770, 1740, 1630 (-C0); 1600 (-C=C-). MS(70 eV) : m/e = 186 (27% ⁾ [M ^+' -C0_,.. UV/VIS (Ethanol):λ [nmldgE ^{) 2} 18 (4.10), 276 (3.96).

Beispiel 6

3(2-Mercaptoethyl)-pyrimidin-2,4(lH _f 3H)dion-5-carbon8äure

(Formel I: R ¹ = R ³ = H, R ² = COOH)

Aus 2,26 g 6-Ethoxycarbonyl-2,3-dihydrothiazoloI3,2-a]- pyrimidin-5-on analog der in Beispiel 5 b) beschriebenen

Verfahrensweise. Es werden 1,52 g

(Ausbeute: 70%) nahezu de reines Rohprodukt erhalten.

Farblose Kristalle. C _? H ₈ N ₂ 0^S (216,2). Schmb.: >179 °C

Braunf rbung, zwischen 183-186 °C sintern (5proz. NaHC0_-

Lsg./verd.Salzsäure) . IR(KBr) lαm ] : 2570 (-SH), 1740, 1710,

1630 (-C0), 1595 (-C=C-). UV/VIS (Ethanol):λ max. [nml(lg& )

218 (4.12), 277 (3.98) .

Beispiel 7

[3(5-Aminocarbony1-6-phenyl-pyriβidin-2, (1H,3H)dion-3-y1 ⁾

1 2 prop-l-yllthioeβsigsäure (Formel I; R = CR-C00H, R =

3 ^Δ

C0NH ₂ , R = C ₆ H ₅ , n = 3)

3,05 g (10 mmol) des nach Beispiel 3 synthetisierten 3(3-

Mercapto-prop-1-yl)-6-phenyl-pyrimidin-2, (1H,3H)dion-5-car- bonβäureamides werden unter N_-Begasung in einer aus 15 ml Ethanol und 30 ml verd. Natronlauge (0,5 Mol/1) bestehenden Mischung gelöst. Unter Rühren und weiterer N_-Begaβung wird dem Reaktionsansatz die aus 1,05 g (11 mmol) Chloressigsäure und 10 ml Wasser hergestellte Lösung hinzugefügt. Nach 6 h Rühren unter inerten Bedingungen wird zu dem filtrierten Reaktionsansatz bis zur deutlich saueren Reaktion verd. Salzsäure hinzugefügt. Nach dem Absaugen wird der gebildete Niederschlag mit reichlich Wasser gespült und anschließend an der Luft getrocknet. Es werden 2,05 g (Ausbeute: 56 %) geringfügig mit dem entsprechenden Disulfan-Derivat der Ausgangsverbindung verunreinigtes Rohprodukt erhalten. Für die Reindarstellung des Finalproduktes wird aus 5proz. NaHCOg-Lsg./verd.Salzsäure umgefällt. Farblose Kristalle. ^C 15 ^H 13 ^N 3°4 ^{S (363} ' ⁴⁾ - Sσh b. >220 °C Zers. IR ⁽ KBr ^{) [} cm ^"1 1 : 1720, 1670, 1650 (-C0); 1620 (-C=C-) . UV/VIS (Ethanol): λ ma . [nm) (lgL): 212 (4.22), 282 (4.01).

Beispiel 8

[2(5-Cyan-6-phenyl-pyrimidin-2,4(lH,3H)dion-3-yl)ethyl]th io- essigsäure (Formel I; R ¹ = CH ₂ C00H, R ² = CN, R ³ = C ₆ Hg , n = 2)

a) [2(5-Cyan-6-phenyl-pyrimidin-2,4(lH,3H)dion-3-yl)ethyl]- thioessigβäureethyleβter (Formel I; Rl = CH ₂ C00C ₂ Hg,

Aus 2,73 g (10 mmol) des nach Beispiel 4 synthetisierten 3(2-Mercaptoethyl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(lH,3H)dion-5- carbonitrils und 1,35 g (11 mmol) Chloressigsäureethylester analog Beispiel 6 unter Verzicht auf Zugabe von verd. Salz¬ säure. Statt dessen werden dem Ansatz nach beendeter Um¬ setzung 75 ml Wasser zugefügt. Es werden 1,9 g (Ausbeute: 52 %) mit dem entsprechenden Disulfan-Derivat der Ausgangs-

Verbindung verunreinigtes Rohprodukt erhalten. Für die Ge¬ winnung eines Reinproduktes wird aus 1-Propanol umkristalli¬ siert. Farblose Kristalle. C _H ₁₇ N ₃ 0,S (359,4). Schmb. 163- 165 °C (1-Propanol) . IR(KBr) [cm ^" ] : 2240 (-CN), 1730, 1650,

1630 (-C0). UV/VIS(Ethanol) :λ max. Inm] (lgE): 218 (4.24),

244 (4.04) , 292 (4.05) .

b) l2(5-Cyan-6-phenyl-pyrimidin-2,4(lH,3H)dion-3-yl)ethyl]-

2 thioessigsäure (Formel I; Rl = CH ₂ C00H, R = CN,

1,8 g (5 mmol) des nach a) erhaltenen Pyri idinylethylthio- essigsäureethylester-Derivates, ggf. auch als Rohprodukt einsetzbar, werden in 30 ml verd. Natronlauge (0,5 Mol/1) 150 min am Rückflußkühler erhitzt. Die filtrierte Reaktions¬ lösung wird mit verd. Salzsäure angesäuert, der gebildete Niederschlag abgesaugt und umgefällt (δproz. Natriumhydro- gencarbonat-Lsg./verd.Salzsäure) . Nach dem Trocknen bei etwa 35 °C werden 1,15 g (Ausbeute: 70%) reines Finalprodukt erhalten. Farblose Kristalle ₁ . C„15 _e H ₄ 13-N3„04.S (331,3). Schmb.

>183 °C (Zers.). IR(KBr) [cm~ ] : 2240 (-CN), 1720, 1650, 1630

(-C0). UV/VIS (Ethanol) :λ ma . [nm] (lg£): 218 (4.24), 244

(4.02), 291 (4.05) .

Beispiel 9

Analog Beispiel 1 c) wurden u.a. noch folgende Verbindungen hergestellt :

a) 3(2-Mercaptoethyl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4<lH,3H)dion-5- carbonβäureamid (Formel I; R 1 = H, R2 = CONH»,

Farblose Kristalle. Ausbeute: 80%. ^C ₁₃ ^H ₁₃ ^N 3 ⁰ 3 ^{S (} 291,3 ⁾ .

Schmb. 226-229 °C (Ethanol). IR(KBr) lern ^"1 ]: 2570 (-SH),

1640 und 1680 (CO) . MS(70eV): M ⁺ " m/e 291 (100%; Basispeak).

UV/VIS (Ethanol) :λ max [nnldgi) 283 (4.02).

b) 3(3-Merσaptopropy1)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(1H,3H)dion-

5-carbonitril (Formel I; R ¹ = H, R ² = CN, R ³ = C 6,H5 _c , n = 3)

Farblose Kristalle. Ausbeute: 84%. C H ₁₃ N ₃ 0 ₂ S (287,3). Schmb. 197-201 (1-Propanol) . IR(KBr) [cπf ¹ ]: 2570 (-SH) ,

2245 (-CN), 1610 und 1640 (-C0). UV/VIS (Ethanol) :Λ max InnKlgζ.) 237 (4.09), 307 (4.40).

c) 3(3-Mercaptopropyl)-6-phenyl-pyrimidin-2,4(lH,3H)dion (Formel I; R ¹ = R ² = H, R ³ = C ₆ H ₅ , n = 3)

Farblose Kristalle. Ausbeute: 79%.C _« 13,H,14,N2_02_S (262,3).

Schmb. 211-213 (1-Propanol/H ₂ 0 1:2). IR(KBr) [cm ^" 1: 2570

⁽ -SH), 1615 und 1650 (-C0). UV/VIS (Ethanol) :λ max [nml(lgf)

224[SJ (4.14), 287 (4.09).