Derivados de 4-fenildihidropiridina para el tratamiento v/o prevención de una infección o enfermedad causada por Helicobacter

La presente invención se refiere a derivados de 4-fenildihidropiridina de fórmula I o a composiciones farmacéuticas de los mismos para su uso en el tratamiento y/o prevención de una infección o una enfermedad causada por dicha infección, donde la infección está causada por bacterias del género Helicobacter, preferiblemente por la especie Helicobacter pylori.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Helicobacter pylori está considerado como el patógeno de mayor prevalencia en humanos. Un estudio reciente sugiere que más de la mitad de la población mundial se encuentra infectada. La prevalencia de la infección varía usualmente según las condiciones socio-económicas, oscilando desde casi un 20% en países de elevados ingresos como Suiza o Suecia, hasta casi el 90% de la población infectada en países como Nigeria. La prevalencia de la infección por Helicobacter pylori en España se estima en la actualidad en el 54,9% de la población (Hooi J.K.Y., et al. Global prevalence of Helicobacter pylori infection: systematic review and meta-analysis. Gastroenterology 2017; 153 (2): 420-429).

Helicobacter pylori es una bacteria Gram-negativa microaerofílica de la clase Epsilonproteobacteria, a la cual pertenecen otros patógenos de relevancia clínica como Campylobacter jejuni. El mecanismo de transmisión de la infección por Helicobacter pylori no está perfectamente dilucidado. Es posible que la bacteria se transmita de persona a persona a través de la saliva o por vía fecal-oral, tras la ingesta de agua o alimentos contaminados. El microorganismo atraviesa la capa mucosa que protege al estómago con la ayuda de flagelos y se adhiere a las células epiteliales gástricas mediante adhesinas. La bacteria produce una variedad de enzimas como la ureasa, que le permiten neutralizar la acidez gástrica y crear un microambiente neutro a su alrededor. Helicobacter pylori sintetiza grandes cantidades de enzima ureasa que acumula en el citoplasma, espacio periplasmático y superficie celular. La enzima cataliza la hidrólisis de la urea presente en el estómago hasta amoníaco y dióxido de carbono. Los iones amonio son capaces de neutralizar la acidez estomacal, pero además generan daño en las células epiteliales estomacales produciendo necrosis y favoreciendo patologías gástricas diversas. Otras enzimas y citotoxinas producidas por Helicobacter pylori como VacA y CagA están igualmente asociadas al daño de la mucosa gástrica y al potencial oncogénico de este microorganismo (Kusters J.G., et al. Pathogenesis of Helicobacter pylori Infection. Clin Microbiol Rev 2006; 19 (3): 449-490).

El tratamiento erradicador actual de la infección por Helicobacter pylori consiste en la combinación de al menos dos antibióticos, asociados a un inhibidor de la bomba de protones (IBP). La pauta más utilizada actualmente y la aceptada como de“primera línea” por el Colegio Americano de Gastroenterología y el último consenso de Maastricht consiste en la administración de Amoxicilina (1 g cada 12 horas) junto a Claritromicina (500 mg cada 12 horas) y un IBP a dosis estándar cada 12 horas, o sustituyendo Amoxicilina por Metronidazol (400 mg cada 12 horas). Este tratamiento se conoce como la“triple terapia” y requiere habitualmente de 10 a 14 días, alcanzando tasas de erradicación de un 70-85%. Sin embargo, en los últimos años esta terapia de primera línea ha disminuido significativamente sus tasas de erradicación, hasta niveles tan bajos como el 50% de los casos tratados. La causa fundamental de esta pérdida de eficacia radica en el creciente desarrollo de resistencia antimicrobiana por parte del microorganismo (Yang J.C., et al. Treatment of Helicobacter pylori infection: current status and future concepts. World J Gastroenterol 2014; 20 (18): 5283-5293; y Safavi M., et al. Treatment of Helicobacter pylori infection: current and future insights. World J Clin Cases 2016; 4 (1 ): 5-19).

En Helicobacter pylori, la proteína HsrA constituye un regulador de respuesta que actúa como activador de la transcripción. HsrA regula la expresión de un gran número de genes y operones implicados en una variedad de procesos fisiológicos esenciales del microorganismo, sincronizando las funciones metabólicas y la virulencia con la disponibilidad de nutrientes, la división celular y la homeostasis redox. HsrA es una proteína esencial para la viabilidad de Helicobacter pylori, la deleción génica o la inhibición de la actividad biológica de la proteína implican la muerte celular. HsrA es una proteína de ~25 kDa, con dos dominios estructurales y funcionales definidos: un dominio N-terminal con función regulatoria y un dominio C-terminal de unión al DNA, ambos dominios están conectados por una corta secuencia de aminoácidos flexible sin estructura secundaria definida. La proteína dimeriza a través de su dominio N-terminal formando un dímero estable tanto in vitro como in vivo. El regulador reconoce y se une a los promotores de sus genes diana cubriendo una región de unos 30 pb cercana pero no solapante al elemento -10 del promotor. La unión del regulador a sus promotores diana pudiera favorecer el contacto de la RNA polimerasa con el DNA e influir positivamente en el reclutamiento de la enzima, ejerciendo un papel activador de la transcripción. La proteína HsrA ha sido clonada y caracterizada extensivamente en el laboratorio, se conoce su estructura cristalográfica y se cuenta con ensayos relativamente sencillos para evaluar su actividad biológica y la inhibición de esta actividad por potenciales inhibidores. HsrA es una proteína típica de las epsilonbacterias y no existe contraparte o proteína de secuencia similar en humanos, lo cual minimiza el riesgo de reactividad cruzada y efectos colaterales indeseables de potenciales inhibidores de HsrA sobre la microbiota normal o sobre biomoléculas humanas (Delany I., et al. Growth phase-dependent regulation of target gene promoters for binding of the essential orphan response regulator HP1043. J Bacteriol 2002; 184 (17): 4800-4810; Schár J., et al. Phosphorylation-independent activity of atypical response regulators of Helicobacter pylori. J Bacteriol 2005; 187 (9): 3100-3109; Hong E., et al. Structure of an atypical orphan response regulator protein supports a new phosphorylation-independent regulatory mechanism. J Biol Chem 2007; 282 (28): 20667- 20675; Olekhnovich I.N., et al. Mutations to essential orphan response regulator HP1043 of Helicobacter pylori result in growth-stage regulatory defects. Infect Immun 2013; 81 (5): 1439-49; y Olekhnovich I.N., et al. Response to metronidazole and oxidative stress is mediated through homeostatic regulator HsrA (HP1043) in Helicobacter pylori. J Bacteriol 2014; 196 (4):729-39).

Por tanto, sería deseable disponer de nuevos fármacos inhibitorios frente al regulador transcripcional HsrA de Helicobacter pylori.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I para su uso en el tratamiento y/o prevención de una infección causada por una bacteria del género Helicobacter o para su uso en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad causada por una infección causada por una bacteria del género Helicobacter:

I

donde:

Ri es C _1-4 alquilo, -NH ₂ o -CN, donde C _1-4 alquilo está opcionalmente sustituido por un grupo -OCONH ₂ , -OR ₅ o -SR ₅ ;

R ₂ es C _1-4 alquilo opcionalmente sustituido por un grupo -OR ₅ o -SR ₅ ;

R ₃ es C _1-4 alquilo o Cyi, donde C _1-4 alquilo está opcionalmente sustituido por un grupo

R ₇ ;

A es un grupo de fórmula II, III, IV, V o VI:

V VI

R ₄ es -N0 ₂ , halógeno o -OCF ₃ ;

R ₅ es C _1-4 alquilo opcionalmente sustituido por un grupo -NH ₂ o -OR ₆ ;

Re es C _1-4 alquilo opcionalmente sustituido por un grupo -NH ₂ ;

R ₇ es -OC _1-4 alquilo, -NR ₈ Rg, Cy ₂ , -COC _1-4 alquilo o C _2-4 alquenilo, donde C _2-4 alquenilo está opcionalmente sustituido por un grupo fenilo;

Cyi es un heterociclo saturado de 4 a 6 miembros unido al resto de la molécula a través de un átomo de C o N disponible, que contiene 1 o 2 heteroátomos de N, donde Cyi está opcionalmente sustituido por un grupo Ci _-4 alquilo, y donde el grupo Ci _-4 alquilo está opcionalmente sustituido por uno o dos grupos fenilo;

Cy ₂ es un fenilo o un heterociclo saturado o aromático de 5 o 6 miembros que contiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N y O, donde Cy ₂ se une al resto de la molécula a través de un átomo de N o C, cuando Cy ₂ es un heterociclo saturado puede estar opcionalmente fusionado a un anillo de piperidina formando un anillo espiránico, y donde Cy ₂ está opcionalmente sustituido por uno o más grupos Ri ₀ ;

R ₈ es Ci- ₄ alquilo;

R ₉ es Ci- ₄ alquilo opcionalmente sustituido por uno o más grupos fenilo, y donde cada grupo fenilo está opcionalmente sustituido por un grupo halógeno;

cada R _í o independientemente es vinilo, fenilo o Cy ₃ , donde el grupo fenilo está sustituido por un grupo Rn ;

R1 1 es halógeno; y

Cy ₃ es un heterociclo saturado de 5 o 6 miembros, que contiene 1 o 2 heterátomos de N, que se une al resto de la molécula a través de un átomo de N o C disponible y que está opcionalmente sustituido por un grupo Ci _-4 alquilo, donde el grupo Ci _-4 alquilo está opcionalmente sustituido por uno o dos grupos fenilo.

En otra realización la invención se refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde la bacteria del género Helicobacter es de la especie Helicobacter pylori.

En otra realización la invención ser refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde Ri es metilo, isopropilo, -CH ₂ OR ₅ , -CH ₂ SR ₅ , -CH ₂ OCONH ₂ , -NH ₂ O -CN.

En otra realización la invención ser refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde Ri es metilo, isopropilo, -CH ₂ OCH ₂ CH ₂ NH ₂ , -CH ₂ OCH ₂ CH ₂ OR ₆ , -CH ₂ SCH ₂ CH ₂ NH ₂ , -CH ₂ SCH ₂ CH ₂ 0 Re, -CH ₂ OCONH ₂ , -NH ₂ O -CN.

En otra realización la invención ser refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde Ri es metilo, isopropilo, -CH ₂ OCH ₂ CH ₂ NH ₂ , -CH ₂ OCH ₂ CH ₂ OCH ₂ CH ₂ NH ₂ , -CH ₂ SCH ₂ CH ₂ NH ₂ , -CH ₂ S CH ₂ CH ₂ O CH ₂ CH ₂ N H ₂ , -CH ₂ OCONH ₂ , -NH ₂ O -CN. En otra realización la invención ser refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde Ri es C _1-4 alquilo, y preferiblemente donde Ri es metilo. En otra realización la invención ser refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde R ₂ es C _1-4 alquilo.

En otra realización la invención ser refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde R ₂ es metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec- butilo o tert-butilo, preferiblemente donde R ₂ es metilo, etilo o isopropilo, y más preferiblemente donde R ₂ es metilo.

En otra realización la invención ser refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde R ₃ es Ci _-4 alquilo opcionalmente sustituido por un grupo R ₇ .

En otra realización la invención ser refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde R ₄ es -N0 ₂ , -Cl o -OCF ₃ , y preferiblemente -N0 ₂ o -Cl. En otra realización la invención ser refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde A es un grupo de fórmula II o III.

En otra realización la invención ser refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde R ₇ es -OC _1-4 alquilo, -NR ₈ Rg, Cy ₂ o -COC _1-4 alquilo.

En otra realización la invención ser refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde R ₃ es metilo.

En otra realización la invención ser refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde R ₉ es Ci _-4 alquilo sustituido por uno o dos grupos fenilo, y donde cada grupo fenilo está opcionalmente sustituido por un grupo halógeno.

En otra realización la invención ser refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde Rg es -CH ₂ Ph o -CH ₂ CH ₂ C(Ph)(4-F-Ph).

En otra realización la invención ser refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde Cyi es un heterociclo saturado de 4 a 6 miembros, preferiblemente de 4 o 5 miembros, unido al resto de la molécula a través de un átomo de C disponible, que contiene 1 heteroátomo de N, donde Cyi está opcionalmente sustituido por un grupo Ci _-4 alquilo, y donde el grupo Ci _-4 alquilo está opcionalmente sustituido por uno o dos grupos fenilo.

En otra realización la invención ser refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde Cyi es un grupo de fórmula Vil o VIII:

Vil VIII

En otra realización la invención ser refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde Cy ₂ es un fenilo opcionalmente sustituido por uno o más grupos R _í o. En otra realización la invención ser refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde Rn es F o Cl, y preferiblemente Cl.

En otra realización la invención ser refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde Cy ₃ es 1 -vinilpiperazina o pirrolidina.

En otra realización la invención ser refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde el compuesto de fórmula I se selecciona de:

Amlodipino, Arandipino, Azelnidipino,

Barnidipino, Benidipino, Cilnidipino,

Clevidipino, Cronidipino, Darodipino,

Dexniguldipino, Elnadipino, Felodipino,

Furnidipino, Iganidipino, Isradipino,

Lemildipino, Lercanidipino, Levamlodipino,

Levniguldipino, Manidipino, Nicardipino,

Nifedipino, Niguldipino, Niludipino,

Nilvadipino, Nimodipino, Nisoldipino,

Nitrendipino, Olradipino, Palonidipino,

Pranidipino, Sornidipino, Teludipino,

Tiamdipino, Trombodipino, y Vatanidipino.

En otra realización la invención ser refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde el compuesto de fórmula I se selecciona de:

Nicardipino, Nisoldipino, Nimodipino,

Felodipino, Nitrendipino, Lercanidipino,

Amlodipino, y Nifedipino. En otra realización la invención ser refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde el compuesto de fórmula I se selecciona de:

Nicardipino, Nisoldipino, Nimodipino,

Nitrendipino, Lercanidipino, y Nifedipino.

En otra realización la invención se refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde el compuesto de fórmula I se selecciona de:

Nimodipino, y Nitrendipino. En otra realización la invención ser refiere al compuesto de fórmula I según el uso definido anteriormente, donde la enfermedad causada por una infección es una patología gastrointestinal, y preferiblemente donde la patología gastrointestinal se selecciona de gastritis aguda, gastritis crónica, duodenitis, dispepsia funcional, úlcera gástrica, úlcera duodenal, adenocarcinoma gástrico y linfoma de tejido linfoide asociado a mucosa (linfoma MALT).

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de la invención (o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo) y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Los excipientes deben ser“aceptables” en el sentido de ser compatibles con los demás ingredientes de la composición y de no ser perjudiciales para quién tome dicha composición.

Así, otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de fórmula I definido anteriormente, para su uso en el tratamiento y/o prevención de una infección causada por una bacteria del género Helicobacter o para su uso en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad causada por una infección causada por una bacteria del género Helicobacter, y preferiblemente donde la bacteria del género Helicobacter es de la especie Helicobacter pylori.

En otra realización la invención se refiere a la composición farmacéutica definida anteriormente, donde la enfermedad causada por una infección es una patología gastrointestinal, y preferiblemente donde la patología gastrointestinal se selecciona de gastritis aguda, gastritis crónica, duodenitis, dispepsia funcional, úlcera gástrica, úlcera duodenal, adenocarcinoma gástrico y linfoma de tejido linfoide asociado a mucosa (linfoma MALT). En las definiciones anteriores, el término Ci- ₄ alquilo, como grupo o parte de un grupo, significa un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que contiene de 1 a 4 átomos de C e incluye los grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo y tert-butilo. Un radical halógeno o su abreviatura halo significa fluoro, cloro, bromo o yodo.

La expresión "opcionalmente sustituido por uno o más" significa la posibilidad de un grupo de estar sustituido por uno o más, preferiblemente por 1 , 2, 3 ó 4 sustituyentes, más preferiblemente por 1 , 2 ó 3 sustituyentes y aún más preferiblemente por 1 ó 2 sustituyentes, siempre que dicho grupo disponga de suficientes posiciones disponibles susceptibles de ser sustituidas. Si están presentes, dichos sustituyentes pueden ser iguales o diferentes y pueden estar situados sobre cualquier posición disponible.

A lo largo de la presente descripción, el término“tratamiento” se refiere a eliminar, erradicar, erradicar totalmente, reducir o disminuir la causa o efectos de una enfermedad. Para los propósitos de esta invención, tratamiento incluye, aunque sin quedar limitados a los mismos, aliviar, disminuir o eliminar uno o más síntomas de la enfermedad; reducir del grado de enfermedad, estabilizar (es decir, no empeorar) el estado de la enfermedad, retrasar o ralentizar la progresión de la enfermedad, aliviar o mejorar el estado de la enfermedad y remitir (ya sea total o parcial). Ejemplos incluyen entre otros, “erradicar la infección”, “erradicación total del microorganismo” y “disminución de la colonización del microorganismo”.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término“prevención” se refiere a prevenir la aparición de la enfermedad que se presente en un paciente que está predispuesto o tiene factores de riesgo, pero que todavía no presenta síntomas de la enfermedad. Prevención también incluye prevenir la reaparición de una enfermedad en un sujeto que previamente ha padecido dicha enfermedad.

Los compuestos de la presente invención contienen uno o más nitrógenos básicos y podrían por tanto formar sales con ácidos, tanto orgánicos como inorgánicos. Algunos compuestos de la presente invención podrían contener uno o más protones ácidos y por tanto podrían formar también sales con bases.

No hay limitación en el tipo de sal que se puede utilizar, con la condición de que cuando se usen con fines terapéuticos sean farmacéuticamente aceptables. Se entiende por sales farmacéuticamente aceptables aquellas sales que, a criterio médico, son adecuadas para el uso en contacto con los tejidos de seres humanos u otros mamíferos sin provocar una toxicidad indebida, irritación, respuesta alérgica o similar. Las sales farmacéuticamente aceptables son ampliamente conocidas por cualquier experto en la materia.

Los compuestos de fórmula I y sus sales pueden diferir en ciertas propiedades físicas, pero son equivalentes a efectos de la invención. Todas las sales de los compuestos de fórmula I quedan incluidas dentro del ámbito de la invención.

Los compuestos de la presente invención pueden formar complejos con disolventes en los que se hacen reaccionar o desde los que se hacen precipitar o cristalizar. Estos complejos se conocen como solvatos. Tal como se utiliza aquí, el término solvato se refiere a un complejo de estequiometría variable formado por un soluto (un compuesto de fórmula I o una sal del mismo) y un disolvente. Ejemplos de disolventes incluyen los disolventes farmacéuticamente aceptables como agua, etanol y similares. Un complejo con agua se conoce como hidrato. Los solvatos de los compuestos de la invención (o sus sales), incluyendo hidratos, quedan incluidos dentro del ámbito de la invención.

Los compuestos de fórmula I pueden existir en diferentes formas físicas, es decir en forma amorfa y formas cristalinas. Asimismo, los compuestos de la presente invención pueden tener la capacidad de cristalizar de más de una forma, una característica que se conoce como polimorfismo. Los polimorfos se pueden diferenciar por varias propiedades físicas bien conocidas por los entendidos en la materia como por ejemplo sus difractogramas de rayos X, puntos de fusión o solubilidad. Todas las formas físicas de los compuestos de fórmula I, incluyendo todas sus formas polimórficas (“polimorfos”), quedan incluidas dentro del ámbito de la presente invención.

Algunos compuestos de la presente invención podrían existir en forma de varios diastereoisómeros y/o varios isómeros ópticos. Los diastereoisómeros pueden separarse mediante técnicas convencionales como la cromatografía o la cristalización fraccionada. Los isómeros ópticos pueden ser resueltos mediante el uso de técnicas convencionales de resolución óptica, para dar los isómeros ópticamente puros. Esta resolución puede realizarse sobre los intermedios de síntesis que sean quirales o bien sobre los productos de fórmula I. Los isómeros ópticamente puros también pueden ser obtenidos individualmente empleando síntesis enantioespecíficas. La presente invención cubre tanto los isómeros individuales como sus mezclas (por ejemplo mezclas racémicas o mezclas de diastereoisómeros), tanto si se obtienen por síntesis como mezclándolos físicamente.

Los compuestos de la presente invención pueden ser administrados en forma de cualquier formulación farmacéutica, la naturaleza de la cual, como es bien sabido, dependerá de la naturaleza del principio activo y de su vía de administración. En principio se puede utilizar cualquier vía de administración, por ejemplo oral, parenteral, nasal, ocular, rectal, y tópica. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Inhibición de la actividad de unión al ADN de HsrA por compuestos de fórmula I. (A) Bajo condiciones in vitro apropiadas, según se ha descrito en el procedimiento, la proteína HsrA recombinante reconoce y se une específicamente a las secuencias de ADN de sus promotores diana. La unión de la proteína al ADN diana determina la formación de un complejo ADN-proteína estable, con un tamaño molecular superior al del ADN libre, experimentando un retardo en la movilidad electroforética. La unión específica del HsrA a su promotor diana PporGDAB y la formación de un complejo HsrA-ADN detectable por la técnica de EMSA es directamente proporcional a la concentración de la proteína recombinante y no logra ser inhibido por la presencia de un fragmento de ADN competidor inespecífico. El ADN diana libre va desapareciendo en presencia de concentraciones crecientes de la proteína recombinante para formar un complejo estable ADN-proteína de mayor peso molecular. Sin embargo, la concentración de ADN competidor se mantiene inalterable, dado que la proteína no reconoce ni se une a esta secuencia inespecífica. (B) Compuestos de fórmula I inhiben la unión de la proteína HsrA recombinante a sus promotores diana, evitando la formación de complejos HsrA-ADN. La capacidad de inhibición de los compuestos de fórmula I sobre la actividad de HsrA es directamente proporcional a la concentración del inhibidor. Según se aprecia en la figura 1 B, compuestos de fórmula I logran inhibir totalmente la actividad de la proteína HsrA recombinante.

Fig. 2. Estudio del efecto antimicrobiano de Nimodipino y Nitrendipino in vivo frente a la infección con Helicobacter pylori. A. Datos cuantitativos de conteos bacterianos expresados en UFC/mg de estómago. B. Resultados de PCR cuantitativa presentados como relación Helicobacter/10,000 células murinas. Los resultados son presentados en diagramas de cajas. Cada caja representa el 50% de los valores alrededor de la mediana (línea horizontal divisoria de las cajas). Las líneas que se extienden verticalmente desde la caja (bigotes) representan el mínimo y el máximo de todos los datos. ^* P<0,05 o ^** P<0,01 entre animales infectados no tratados (Hp + Om) y animales infectados y tratados (Hp + Nimodipino/Nitrendipino + Om).

EJEMPLOS

A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.

Procedimiento

Clonaje del gen del regulador de respuesta HsrA

El ADN genómico de Helicobacter pylori cepa 26695 (ATCC 700392) se purificó mediante el método de fenol-cloroformo. La biomasa obtenida a partir de 100 mL de cultivo de Helicobacter pylori 26695 en caldo infusión cerebro corazón (BHI) suplementado con 4% de suero fetal bovino (SFB) durante 48 h en condiciones microaeróbicas fue resuspendida en 400 pL de tampón 10 mM Tris-CI (pH 8) y 1 mM EDTA. A esta suspensión celular se adicionó 1 % SDS y 10 pL de proteinasa K (10 mg/mL) y se incubó durante 1 h a 55 ^e C. Al cabo de este tiempo, la muestra se lavó con 1 volumen (mismo volumen de la muestra) de fenol, luego con 1 volumen de fenol- cloroformo (1 :1 ) y finalmente se realizaron dos lavados con 1 volumen de cloroformo. El DNA genómico se precipitó toda la noche a -20 ^e C con 2 volúmenes de etanol absoluto frió y 0,1 volumen de 3M acetato de sodio (pH 5,2), el precipitado se lavó con etanol 70% y finalmente se resuspendió en tampón 10 mM Tris-CI (pH 8) y 1 mM EDTA.

La secuencia completa del gen hsrA (hp1043) se amplificó por PCR a partir del ADN genómico purificado de la cepa 26695 (ATCC 700392) de Helicobacter pylori empleando los cebadores 5 ^' -GGAATT CCAT AT GCGCGTT CT ACT GATT G-3 ^' (SEQ ID NO: 1 ) y 5 ^' - CCCAAGCTTTTACT CTT CACACGCCGG-3 ^' (SEQ ID NO: 2) y la enzima Pfu DNA polimerasa de alta fidelidad (Agilent). El producto de PCR resultante fue digerido con las enzimas de restricción Ndel y Hindlll y clonado entre los mismos sitios de restricción del vector de expresión pET-28a (Novagen). El vector final fue parcialmente secuenciado para comprobar la integridad del gen.

Expresión y purificación de HsrA recombinante

Se transformaron células competentes de E. coli BL21 (DE3) con el vector pET-28a conteniendo el gen hsrA de Helicobacter pylori ATCC 700392. Este vector permite expresar la proteína recombinante como una proteína de fusión a un péptido de 6 residuos de histidinas en su extremo N-terminal. Las células de E. coli transformadas fueron cultivadas en medio Luria-Bertani (LB) suplementado con 50 pg/mL de kanamicina bajo condiciones de agitación vigorosa y 37 ^e C hasta alcanzar una densidad óptica de 0,8 medida a una longitud de onda de 600 nm. La expresión de la proteína HsrA recombinante se indujo mediante la adición al medio de cultivo de 1 mM de IPTG, tras lo cual las células se dejaron crecer bajo las mismas condiciones de temperatura y agitación durante 6 horas. Transcurrido este tiempo, el cultivo se centrifugó a 8,000 rpm durante 10 min a 4 ^e C y la biomasa celular obtenida fue lavada con PBS pH 7,4 frió.

La proteína HsrA recombinante es expresada en forma soluble en el citoplasma de E. coli BL21 (DE3). Para la purificación proteica, las células fueron resuspendidas en tampón 50 mM Tris-CI (pH 8), con 500 mM NaCI, 10 mM imidazol y 1 mM PMSF. La ruptura celular se realizó mediante 10 ciclos ultrasónicos de 45 segundos en baño de hielo, con descansos de 30 segundos entre cada ciclo. Los detritos celulares se eliminaron mediante centrifugación a 18,000 rpm durante 20 min a 4 ^e C. La proteína recombinante con cola de histidinas contenida en el sobrenadante fue purificada mediante cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC) empleando la matriz Chelating Sepharose Fast Flow (GE Flealthcare) cargada con iones Ni ²⁺ , previamente equilibrada con el tampón empleado en la lisis celular. La proteína recombinante unida a la matriz fue eluida empleando un gradiente de imidazol (0,01 a 1 M) y dializada frente al tampón 50 mM T ris-HCI (pH 8), 300 mM NaCI y 10% glicerol. La concentración de proteína fue determinada mediante el kit comercial BCA™ Protein Assay (Thermo Fisher Scientific). La cola de poli-histidinas fue eliminada del extremo N- terminal de HsrA recombinante mediante tratamiento con trombina (GE Flealthcare), empleando 10 U de enzima por cada miligramo de proteína recombinante. Tras la restricción enzimática, la proteína HsrA recombinante fue obtenida en el volumen muerto de un segundo paso de purificación mediante IMAC-Ni ²⁺ . La proteína así purificada fue conservada a -20 ^e C.

Actividad biológica y ensayos de inhibición

La proteína HsrA es un regulador de respuesta con actividad de unión al ADN, que actúa como regulador transcripcional. La actividad biológica de esta proteína se determina mediante el ensayo del cambio de movilidad electroforética (EMSA). En este ensayo, el regulador transcripcional se pone en contacto con un fragmento de ADN correspondiente a la región promotora de sus genes diana. Si la proteína es activa, se unirá de forma específica a sus promotores diana y formará un complejo proteína-ADN que experimentará un retardo en la movilidad electroforética respecto al DNA libre, dado el mayor tamaño molecular del complejo. Como región promotora diana de HsrA se amplificó por PCR una secuencia de 288 pb correspondiente al promotor del operón porGDAB a partir del ADN genómico de Helicobacter pylori ATCC 700392 empleando como cebadores 5 ^' - CCCCACACTTGCCCCATACAGAC-3 ^' (SEQ ID NO: 3) y 5 ^' - GCAT GCCAT CT AATTT GAAACAT GG-3 ^' (SEQ ID NO: 4). El promotor sintetizado fue purificado mediante el kit comercial ¡Ilustra™ GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit (GE Healthcare) y su concentración fue cuantificada mediante espectrofotómetro NanoVue Plus (GE Healthcare). Para los ensayos de actividad biológica de la proteína HsrA recombinante recién purificada, se mezclaron concentraciones crecientes de la proteína, desde 2 hasta 7 mM, con 120 ng de ADN en tampón 10 mM bis-Tris (pH 7,5), 40 mM KCI, 100 pg/mL BSA, 1 mM DTT y 5% (v/v) de glicerol, en un volumen final de mezcla de reacción de 20 mI_. Como ADN competidor inespecífico se adicionó a todas las mezclas 120 ng de un fragmento de 121 pb correspondiente a una porción de la secuencia codificadora del gen pkn22 (alr2502) de la cianobacteria Anabaena sp. PCC 7120. La mezcla de proteína y ADN se incuba a 25 ^e C durante 30 minutos y posteriormente se separa mediante electroforesis no desnaturalizante en gel de poliacrilamida 6% empleando el tampón 25 mM Tris y 190 mM glicina para la cámara electroforética. Los geles de poliacrilamida fueron teñidos con el colorante SYBR® Safe DNA gel stain (Invitrogen) y procesados con Gel Doc 2000 Image Analyzer (Bio-Rad).

Para los ensayos de inhibición de la actividad biológica, 6 mM de la proteína HsrA recombinante se mezclaron con 2; 1 ; 0,5 y 0,1 mM del compuesto de fórmula I descrito en la presente invención. Dado que los compuestos analizados se encontraban disueltos al 100% en DMSO, se incluyó como control negativo de inhibición la proteína en presencia de la misma cantidad de DMSO, en sustitución de los compuestos. La mezcla de proteína e inhibidor en tampón 10 mM bis-Tris (pH 7,5), 40 mM KCI, 100 pg/mL BSA, 1 mM DTT y 5% (v/v) de glicerol se incubó durante 10 min a 25°C. Transcurrido este tiempo se adicionó a cada mezcla 120 ng de promotor diana (porGDAB) y 120 ng de ADN competidor (pkn22). El resto del procedimiento se llevó a cabo en las mismas condiciones del ensayo de actividad anteriormente descrito. Cada ensayo se realizó por triplicado y se analizó la actividad inhibitoria de al menos 6 compuestos diferentes con fórmula I descrita en la presente invención.

Actividad antibacteriana frente a Helicobacter pylori de inhibidores de HsrA

La actividad antibacteriana de 6 compuestos inhibitorios de fórmula I de la presente invención fue testada frente a dos cepas diferentes de Helicobacter pylori, la cepa AT CC 700392 y la cepa resistente a claritromicina ATCC 700684. Ambas cepas fueron cultivadas en agar sangre (base) N ^e 2 (OXOID) suplementado con 8% de sangre de caballo desfribinada (OXOID) en atmósfera microaeróbica húmeda (85% N ₂ , 10% C0 ₂ , 5% 0 ₂ ) a 37 °C. Se determinó la concentración mínima inhibitoria (MIC) de cada compuesto mediante el método de microdilución empleando placas de poliestireno de 96 pocilios con fondo plano. Para los ensayos, las bacterias fueron subcultivadas en caldo infusión cerebro corazón (BHI) suplementado con 4% de suero fetal bovino (SFB) durante 48 h en condiciones microaeróbicas. Al cabo de este tiempo, los cultivos fueron diluidos con caldo BHI + 4% SFB hasta una densidad óptica de 0,01 medida a una longitud de onda de 600 nm. Para el ensayo de microdilución en placas, 100 pL de los cultivos bacterianos así ajustados fueron dispensados en cada uno de los pocilios de la placa, excepto la primera columna de la placa, que recibió 200 pl_ de suspensión bacteriana con 5 mI_ del compuesto inhibitorio de fórmula I, a una concentración de 10,24 mg/ml_ en 100% DMSO. Cada uno de los compuestos de fórmula I ensayados fue adicionado al primer pocilio de cada fila de la placa. Se realizaron diluciones dobles seriadas de cada compuesto, evaluando la actividad antibacteriana de un rango de concentraciones entre 256 y 0,125 pg/mL de cada uno de los compuestos. En todas las placas se incorporaron controles de crecimiento positivo y negativo con caldo BHI + 4% SFB sin la presencia de inhibidores, inoculado y no inoculado con las bacterias. Se incorporaron además controles con DMSO y claritromicina. Todas las placas fueron incubadas bajo condiciones microaeróbicas a 37 ^e C y examinadas visualmente tras 48 h de incubación. El valor MIC de cada compuesto se definió como la mínima concentración del compuesto que inhibió completamente el crecimiento visible de la bacteria tras 48 h.

Se determinó además la concentración mínima bactericida (MBC) de cada uno de los 6 compuestos de fórmula I de la presente invención. Una vez culminado en el ensayo de MIC, se extrajeron alícuotas de 10 pL de dos diluciones anteriores y dos posteriores al valor MIC y se sembraron en agar sangre (base) N ^e 2 (OXOID) suplementado con 8% de sangre de caballo desfribinada (OXOID) en atmósfera microaeróbica húmeda (85% N ₂ , 10% C0 ₂ , 5% 0 ₂ ). Las placas de agar se incubaron a 37°C durante 48 h. El valor MBC de cada compuesto se definió como la mínima concentración del compuesto que impidió el crecimiento de ³99,9% de las células de Helicobacter pylori subcultivadas sobre este medio libre de inhibidores. Cada experimento se realizó por triplicado, dos veces, para confirmar los resultados.

Energética de unión de los inhibidores a HsrA

La unión específica de 6 compuestos inhibitorios de fórmula I de la presente invención al regulador de respuesta esencial HsrA de Helicobacter pylori fue confirmada mediante calorimetría de titulación isoterma (ITC). Esta técnica no sólo mide la afinidad de cada compuesto por la proteína diana, sino que determina la contribución de las componentes entálpica y entrópica, así como la estequiometría de la unión.

Los experimentos de unión se llevaron a cabo en el microcalorímetro de alta sensibilidad MicroCal Auto-iTC200 (Malvern Instruments). Una solución de 20 mM de HsrA en tampón 50 mM Tris-CI (pH 8), 150 mM NaCI, 10% glicerol y 1 % DMSO ubicada en la celda de medida, fue titulada con una solución de 200 mM del correspondiente compuesto inhibitorio disuelto en el mismo tampón anterior, ubicado en la jeringa de inyección.

Actividad antimicrobiana in vivo de compuestos de fórmula I frente a la infección por Helicobacter pylori en ratones.

La actividad antibacteriana frente a Helicobacter pylori de 2 compuestos de fórmula I de la presente invención fue testada en el modelo de ratón C57BL/6. El estudio fue realizado en instalaciones con nivel de bioseguridad A2 para animales de laboratorio de la Universidad de Burdeos (Francia) y aprobado por un Comité de Ética local de la Universidad de Burdeos, conforme a las Normativas del Ministerio de Agricultura de Francia sobre el cuidado de los animales de laboratorio y del Comité francés de Ingeniería Genética. Ratones C57BL/6 hembras (libres de organismos patógenos específicos, SPF) de 6 semanas de nacidos fueron mantenidos en condiciones climatizadas y dispuestos en cajas de policarbonato durante una semana antes del inicio de los experimentos. Dos grupos de 9 ratones fueron mantenidos en ayunas para facilitar la colonización bacteriana y luego alimentados a la fuerza con una dosis de 10 ⁸ UFC de Helicobacter pylori cepa PMSS1 durante 3 días consecutivos. Los inóculos bacterianos fueron preparados frescos en medio caldo Brucella a partir de cultivos crecidos durante 48 h a 35 ^e C en placas de agar Wilkins Chalgren enriquecido con 10% (v/v) de sangre humana y suplementado con una mezcla de antibióticos (10 pg/mL de vancomicina, 5 pg/mL de trimetoprima, 1 pg/mL de anfotericina B y 2 pg/mL de cefsulodina) bajo condiciones de microaerobiosis (85% N ₂ , 10% C0 ₂ , 5% 0 ₂ ). Tras 4 semanas de la inoculación, los ratones de cada grupo fueron tratados por vía oral con 100 mg/kg/día de Nimodipino o Nintrendipino (formulación comercial en tabletas orales, STADA S.L.) en combinación con omeprazol (140 mg/kg/día), diariamente durante 7 días. Como ambas drogas son altamente sensibles a la luz, todas las manipulaciones se realizaron alejadas de la luz. Dos grupos adicionales de 10 ratones se emplearon como controles, un grupo control de animales no infectados y otro grupo control de animales infectados no tratados. Ambos grupos controles recibieron 140 mg/kg/día de omeprazol durante los 7 días de tratamiento.

Transcurrido un mes de finalizado el tratamiento, todos los animales fueron sacrificados por dislocación cervical y sus estómagos fueron convenientemente aislados (corte en esófago y duodeno) y lavados con solución salina estéril. Los órganos fueron primeramente cortados a lo largo del eje de la curvatura mayor y luego a lo largo del eje de la curvatura menor. Seguidamente, la mitad derecha del estómago, una vez liberado del cardias, se cortó en dos fragmentos iguales. Uno de estos fragmentos fue tomado para cultivos bacteriológicos y estudios moleculares, mientras el segundo fragmento se conservó a -80 ^e C para experimentos complementarios. Los fragmentos destinados a estudios bacteriológicos y moleculares fueron pesados, triturados usando un mortero estéril y resuspendidos en 200 pL de tampón fosfato salino estéril. Para el conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC) de Helicobacter pylori que se encontraban colonizando el estómago de los animales de cada grupo de estudio, se realizaron diluciones seriadas de la suspensión celular de estómago y se sembraron en placas de agar Wilkins Chalgren enriquecido con 10% (v/v) de sangre humana y suplementado con una mezcla de antibióticos (10 pg/mL de vancomicina, 5 pg/mL de trimetoprima, 1 pg/mL de anfotericina B y 2 pg/mL de cefsulodina) bajo condiciones de microaerobiosis (85% N ₂ , 10% C0 ₂ , 5% 0 ₂ ). Las placas así sembradas fueron incubadas bajo condiciones de microaerobiosis (85% N ₂ , 10% C0 ₂ , 5% 0 ₂ ) durante al menos 5 días. La identidad de las colonias de Helicobacter pylori fue confirmada según las características fenotípicas y bioquímicas del microrganismo (morfología, test de ureasa, test de oxidasa). El conteo de colonias se realizó en dos experimentos independientes y los resultados fueron expresados como UFC/mg de estómago. La eficacia del Nimodipino y del Nitrendipino en la erradicación de la colonización gástrica de Helicobacter pylori en el modelo ratón fue determinada además mediante PCR cuantitativa (qPCR). Las muestras de estómago previamente homogenizado fueron tratadas con el sistema Arrow (Nordiag) para la extracción de DNA. Sobre la muestra de DNA extraído de la biopsia estomacal se realizó una qPCR basada en la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), tomando como dianas el gen para el RNA ribosomal (rRNA) 23S de Helicobacter pylori (oligonucleótidos: 5'- AGGTTAAGAGGAT GCGT CAGT C-3' [HPY-S] (SEQ ID NO: 5) y 5'-

CGCAT GAT ATT CCCATT AGCAGT -3' [HPY-A] (SEQ ID NO: 6)) y el gen para la enzima gliceraldehido-3P deshidrogenasa (oligonucleótidos: 5 ^' - CT GCAGGTT CT CCACACCT ATG-3 ^' [mGapdh1 -F] (SEQ ID NO: 7) y 5 ^' -

GAATTT GCCGT GAGT GGAGT C-3 ^' [mGapdh1 -R] (SEQ ID NO: 8)). Cada diana fue testada por duplicado en todas las muestras. Se preparó una curva patrón empleando diluciones seriadas de DNA extraído de suspensiones bacterianas calibradas de Helicobacter pylori SS1 con valores de UFC/mL conocidos. Para las amplificaciones se empleó LightCycler ^® 480 SYBR ^® Green I Master Mix (Roche Diagnostics), compatible con el termociclador LightCycler ^® 480 (Roche Diagnostics), siguiendo las instrucciones del fabricante. Asimismo, se empleó SYBR® Premix Ex Taq™ Mix (Tli RNaseH Plus) (Takara) compatible con el termociclador CFX96™ (Bio-Rad) disponible en la plataforma de real-time PCR TBMCore de la Universidad de Burdeos, según las instrucciones del fabricante. La PCR comenzó con un paso de desnaturalización de 3 min a 95 °C, seguida de 40 ciclos con 2 pasos: desnaturalización a qd'Ό durante 5 seg e hibridación de los oligonucleótidos a 60 °C durante 30 seg. Tras cada ciclo, la fluorescencia fue medida con el objetivo de cuantificar el DNA recién sintetizado. Al final del procedimiento se generó una curva de fusión mediante la elevación lenta de la temperatura de 65 a 95 ^e C y la medición continua de la fluorescencia. La generación de esta curva de fusión permitió la verificación de un pico específico a la temperatura de fusión esperada para cada producto, demostrando la especificidad de la PCR. Los resultados finales fueron expresados como la relación (ratio) bacterias/células murinas. DNA extraído de la línea celular epitelial murina m-ICcl2 disponible en el laboratorio fue empleado para expresar los resultados como relación bacterias/células murinas. El límite de detección del método fue de aproximadamente 0,001 bacteria/célula murina.

Los resultados obtenidos por ambos métodos de cuantificación (UFC/mg de estómago y qPCR) en los grupos de ratones tratados fueron comparados con aquellos obtenidos en el grupo de ratones infectados no tratados. Se realizó un análisis estadístico de los mismos mediante el test no paramétrico Mann-Whitney. Las diferencias entre las muestras fueron consideradas significativas para un valor p < 0,05. El análisis estadístico se realizó empleando GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, Inc.).

Resultados a) Inhibición de la actividad de HsrA

Los compuestos de fórmula I inhiben la función biológica de la proteína esencial HsrA de Helicobacter pylori. La proteína HsrA es un regulador de respuesta con actividad de unión al ADN. Esta proteína actúa en la célula como regulador transcripcional, se une específicamente a la región promotora de genes diana y regula la transcripción de estos genes. Se demuestra que los compuestos de fórmula I inhiben la unión de HsrA a sus promotores diana, según se demuestra en la figura 1 . b) Actividad antimicrobiana de inhibidores de HsrA sobre Helicobacter pylori El empleo de HsrA como diana terapéutica puede resultar efectivo para el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por Helicobacter pylori y patologías asociadas, dado que inhibidores de la actividad biológica de esta proteína demuestran una elevada actividad bactericida sobre cepas de este patógeno. La proteína HsrA es esencial para la viabilidad del microorganismo, por lo que la inhibición de su actividad biológica conlleva a la muerte del patógeno y potencialmente a la erradicación de la infección. En la tabla 1 se describen los valores de concentración mínima bactericida (MBC) de varios compuestos de fórmula I frente a dos cepas de Helicobacter pylori.

Tabla 1. Actividad bactericida de compuestos de fórmula I sobre Helicobacter pylori

c) Afinidad y estequiometría de unión entre compuestos de fórmula I y HsrA

La unión específica de los compuestos de fórmula I a la proteína HsrA fue confirmada mediante Calorimetría de Titulación Isotérmica (ITC). Como se aprecia en la tabla 2, todos los compuestos ensayados se unen a la proteína con una afinidad en el orden micromolar. En todos los casos, la estequiometría de unión fue de 1 :1 ; es decir, una molécula de inhibidor por cada molécula de proteína monomérica.

Tabla 2. Afinidad de unión HsrA/inhibidores

d) Evaluación in vivo de la actividad anti-Helicobacter pylori de compuestos de fórmula I en ratones. Los compuestos de formula I de la presente invención testados en estudios de eficacia preclínica en el modelo ratón demostraron una significativa actividad antimicrobiana in vivo frente a Helicobacter pylori. Tanto la terapia con Nimodipino + omeprazol como la terapia con Nitrendipino + omeprazol determinaron una disminución significativa de la colonización por Helicobacter pylori de la mucosa gástrica del modelo animal, en comparación con los animales infectados no tratados, a los cuales se les suministró solo omeprazol (figura 2). La disminución de la carga bacteriana en las biopsias de estómago de los animales tratados con los compuestos de fórmula I se apreció tanto en los estudios de conteo de UFC/mg de estómago, como en los análisis de qPCR (células de Helicobacter/10,000 células murinas).