PRINCIPE ACTIF COMPRENANT DES OLIGO-GLUCANES ISSUS

DE LA FRACTION CYTOSOLIQUE DE SACCHAROMYCES

CEREVISIAE ET SES UTILISATIONS COSMETIQUES

[0001] Domaine technique

[0002] L'invention concerne un principe actif comprenant des oligo-glucanes, obtenu à partir de la fraction cytosolique d'une levure de l'espèce Saccharomyces cerevisiae, une composition cosmétique le comprenant et ses utilisations cosmétiques, en particulier pour améliorer la régénération de la peau et lutter contre le vieillissement cutané.

[0003] Etat de l'art

[0004] Le processus de régénération, par exemple cutané, est un processus dynamique et complexe mettant en œuvre de nombreux acteurs cellulaires, au cours duquel un nouveau tissu se développe pour restaurer des zones préalablement endommagées et ainsi assurer sa cicatrisation.

[0005] Au niveau du tissu cutané, trois systèmes sont impliqués dans le processus de régénération tissulaire, le système cutané, vasculaire et immunitaire.

[0006] Le tissu cutané est aujourd'hui reconnu comme un organe complexe comprenant notamment des fibroblastes qui jouent le rôle pivot entre ces trois systèmes pour agir sur le renouvellement épidermique, le remodelage matriciel, mais également sur la vascularisation, permettant ainsi la régénération du tissu endommagé.

[0007] Au niveau du système cutané, le renouvellement de l'épiderme est sous la dépendance des kératinocytes qui arrêtent d'adhérer à la membrane basale pour migrer, proliférer et se différencier en cornéocytes fonctionnels. Dans le derme, le remodelage matriciel est réalisé par les fibroblastes, après qu'ils aient migré et se soient différenciés en myofibroblastes.

[0008] Le système vasculaire permet entre autres le transport des nutriments, des médiateurs et des cellules, indispensables à la régénération cutanée. Pour ce faire, les cellules endothéliales migrent pour se regrouper de manière cohésive, afin de former un réseau vasculaire organisé et régulier.

[0009] Enfin, au niveau du système immunitaire, il existe une population de macrophages dite pro-régénérante capable d'interagir avec les fibroblastes permettant de stimuler le remodelage matriciel et de favoriser la vascularisation. [0010] Au cours du processus de régénération, les fibroblastes sécrètent des facteurs de croissance qui vont agir sur ces systèmes en activant les voies de prolifération, de migration et de différenciation cellulaire. Ces facteurs agissent de manière paracrine sur le métabolisme des fibroblastes environnants mais également sur le métabolisme des autres types cellulaires présents dans le tissu cutané.

[0011] Cependant, au cours du vieillissement, le métabolisme cellulaire ralentit. La capacité des fibroblastes à sécréter des facteurs de croissance pour interagir avec leur environnement diminue. Le processus endogène de régénération ralentit alors et les dommages successifs que notre peau subit ne sont plus correctement réparés. La qualité du renouvellement épidermique diminue, la matrice dermique s'affaisse et le réseau vasculaire se désorganise.

[0012] Les premiers signes du vieillissement cutané apparaissent alors. Le teint devient terne, perd en uniformité, la peau est plus sujette aux rougeurs et les rides s'accentuent. Or, l'éclat du teint mais encore les rides traduisent la santé de la peau. Un teint terne donne un air fatigué et peut accentuer les signes de l'âge, ce qui peut avoir un impact important sur l'estime de soi et l'image que l'on renvoie.

[0013] De nombreux produits cosmétiques visent à lutter contre les signes du vieillissement cutané, par exemple pour lutter contre les rides, améliorer l'hydratation de la peau, ou améliorer l'éclat du teint. Or, ces ingrédients cosmétiques agissent sur l'un des systèmes et ne visent pas une action globale sur l'ensemble du processus de régénération.

[0014] L'apport exogène de facteurs de croissance dans le cadre de la régénération tissulaire a certes démontré son efficacité. Cependant, cette solution repose sur des techniques de médecine régénérative qui sont jugées très invasives. Elle ne peut donc pas s'inscrire dans une routine de beauté.

[0015] Une autre technique de rajeunissement appelée PRP (platelet-rich plasma), consiste en une injection intradermique d'un concentré autologue de facteurs de croissance présents dans les PRP, préalablement obtenu à partir d'un prélèvement sanguin du patient. Là encore, cette technique est controversée de par son caractère invasif et son efficacité qui est limitée par la concentration initiale du patient en PRP.

[0016] Faciliter les processus de régénération de la peau tout en minimisant l'impact pour le patient reste un enjeu majeur pour les industries du secteur dermatologique et cosmétique.

[0017] L'inventeur a ainsi étudié le métabolisme des fibroblastes âgés, mais également le métabolisme des kératinocytes, des cellules endothéliales et des macrophages en présence du sécrétome de fibroblastes âgés et a observé :

- un ralentissement de la migration des fibroblastes et de leur différenciation en myofibroblastes, conduisant à une réduction de la synthèse du réseau de collagène I ;

- une diminution de la migration kératinocytaire, étape clé du renouvellement de l'épiderme ;

- une diminution de la population immunitaire pro-régénérante, impliquée dans le remodelage matriciel ;

- une réduction du métabolisme des cellules endothéliales, entraînant un défaut de formation du réseau vasculaire.

[0018] Le métabolisme du système cutané, immunitaire et vasculaire est donc réduit ne permettant pas une régénération optimale.

[0019] A cet effet, il a été identifié par l'inventeur un actif spécifique obtenu à partir d'une fraction cytosolique de la levure de Saccharomyces cerevisiae permettant d'agir sur l'ensemble du processus de la régénération cutanée.

[0020] Certes, on connaît déjà des principes actifs cosmétiques obtenus à partir de Saccharomyces cerevisiae. On peut notamment citer une solution anti-âge contenant un lysat de culture de S. cerevisiae permettant de stimuler la biosynthèse des cellules de la peau (US5019391).

[0021] D'autres solutions cosmétiques anti-âge et hydratante reposent sur des hydrolysats de levure, notamment des hydrolysats de levure de S. cerevisiae. On peut ainsi citer une composition cosmétique comprenant des mannoprotéines issues de la paroi des cellules des levures telles que Saccharomyces décrite dans EP2567688. Ledit extrait est obtenu à partir d'une hydrolyse chimique, enzymatique ou physicochimique de la paroi des levures.

[0022] La demande WO 2009/101503 divulgue également l'utilisation d'hydrolysat de levure de S. cerevisiae constitué de protéines issues de la paroi des levures hydrolysées dont le poids moléculaire est compris entre 1 et 5 kDa.

[0023] Ainsi, les solutions déjà connues visent particulièrement un hydrolysat de S. cerevisiae et plus particulièrement un hydrolysat obtenu à partir de la paroi de la levure de S. cerevisiae. Cet hydrolysat est riche en protéines, connues pour lutter contre le vieillissement cutané.

[0024] Il existe donc un besoin pour une solution alternative cosmétique non-invasive, naturelle et permettant également d'agir sur le système cutané, vasculaire et immunitaire simultanément afin de stimuler les capacités endogènes de la peau pour améliorer ses capacités de régénération.

[0025] Résumé de l'invention

[0026] C'est l'objectif de la présente invention qui, à cet effet, propose un nouveau principe actif obtenu à partir de la fraction cytosolique de la levure de Saccharomyces cerevisiae.

[0027] Une levure est un micro-organisme eucaryote, composée d'une paroi cellulaire entourant la membrane plasmique. Cette paroi est constituée d'une couche externe de mannoprotéines associées à des glucanes et une couche interne de glucanes associés à des chitines. La membrane cytoplasmique est quant à elle composée principalement de phospholipides et de complexes protéiques. Le contenu de la cellule dont le noyau et les organites cytoplasmiques, est compris dans une phase liquide appelée cytosol.

[0028] La levure de Saccharomyces cerevisiae est un eucaryote unicellulaire bien connue de l'homme de l'art, qui se présente sous forme de cellules isolées, ovoïdes à arrondies. Elle est utilisée depuis l'antiquité pour la fabrication de boissons fermentées. Toutefois, elle a été isolée et identifiée qu'au milieu du XIX ^e siècle pour remplacer le levain traditionnel des boulangers à travers son utilisation dans un procédé de fermentation plus fiable et plus rapide que le levain.

[0029] Des utilisations comme médicament pour certaines maladies gastro-intestinales ont également été rapportées, mais également comme actif cosmétique, comme cité précédemment.

[0030] Or, l'inventeur a découvert de façon surprenante les effets associés à un extrait obtenu spécifiquement à partir de la fraction cytosolique d'une levure de Saccharomyces cerevisiae. Ledit extrait comprenant des oligo-glucanes de masse molaire compris entre 2 et 5 kDa.

[0031] Ainsi, l'invention concerne un principe actif comprenant au moins un extrait de Saccharomyces cerevisiae, ledit extrait correspondant à la fraction cytosolique comprenant des oligo-glucanes de masse molaire compris entre 2 et 5 kDa.

[0032] Préférentiellement, ledit extrait est constitué de la fraction cytosolique d'une levure de Saccharomyces cerevisiae. Plus préférentiellement, l'extrait est une fraction cytosolique obtenu par un lysat mécanique de Saccharomyces cerevisiae.

[0033] L'invention se rapporte également à un procédé de préparation du principe actif selon l'invention, comprenant notamment une solubilisation de Saccharomyces cerevisiae dans l'eau par une homogénéisation mécanique, c'est-à-dire un lysat mécanique permettant de casser les membranes des levures pour extraire la fraction cytosolique, une séparation des phases soluble et insoluble, une ultrafiltration suivie de la récupération du filtrat et un tri moléculaire par chromatographie ionique ou filtration membranaire.

[0034] Le principe actif selon l'invention est d'origine naturelle et présente avantageusement une amélioration de la régénération cutanée. Pour y parvenir, le principe actif selon l'invention favorise l'interconnectivité du système cutané, vasculaire et immunitaire. Il agit sur ces trois systèmes ce qui permet de lutter contre le vieillissement cutané en apportant une solution globale. Ainsi, le principe actif permet de réduire les cernes, les rides et améliorer l'éclat du teint. Il répond ainsi aux problématiques de l'art antérieur.

[0035] Le principe actif selon l'invention peut être utilisé pour des applications cosmétiques, préférentiellement lorsqu'il est intégré dans une composition cosmétique, préférentiellement une composition sous une forme adaptée à une application topique.

[0036] L'invention se rapporte donc également à une utilisation cosmétique d'une composition comprenant au moins 0,1% en poids du principe actif selon l'invention, en particulier pour améliorer la régénération cutanée. Préférentiellement, l'invention améliore l'interconnectivité des systèmes cutanés, vasculaires et immunitaires.

[0037] D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l'invention et des exemples qui vont suivre.

[0038] Brève description des Figures

[0039] [Fig. 1] représente l'effet du principe actif selon l'invention sur la capacité de régénération cutanée, après 14 jours d'application biquotidienne.

[0040] [Fig. 2] représente l'effet du principe actif selon l'invention sur les propriétés biomécaniques de la peau après 21 et 42 jours de traitement biquotidien.

[0041] Description détaillée de l'invention

[0042] Définition

[0043] Par « principe actif cosmétique » au sens de l'invention, on entend un extrait comprenant au moins une molécule, préférentiellement un ensemble de molécules présentant un effet cosmétique sur la peau. Préférentiellement, l'effet cosmétique sur la peau est un effet anti-âge, en particulier un effet régénérant de la peau.

[0044] Par « effet régénérant », on entend au sens de l'invention, la capacité du vivant à se réparer et en particulier la faculté de la peau à se reconstituer en réponse à une agression (brûlure, griffure, coupure) ou à la dégradation naturelle. Il s'agit notamment d'un effet global qui agit sur le système cutané, vasculaire et immunitaire en améliorant l'inter-connectivité desdits systèmes.

[0045] Par « inter-connectivité » au sens de l'invention, on entend les échanges entre les différents systèmes (cutané, vasculaire et immunitaire) à l'intérieur du tissu cutané. Dans le cadre de l'invention, le fibroblaste joue un rôle pivot dans la régénération en interconnectant les trois systèmes via la sécrétion d'un pool de facteurs de croissance.

[0046] Par « système », on entend un ensemble d'éléments interdépendants le constituant. Dans le contexte de l'invention, on peut citer le système cutané, vasculaire mais également immunitaire. Le système vasculaire est constitué d'artérioles, de capillaires et de veinules. Le système cutané est la surface en contact avec l'environnement extérieur et comprend l'épiderme, le derme, l'hypoderme. Le système immunitaire est quant à lui constitué de plusieurs types de cellules immunitaires : notamment des cellules dendritiques, des lymphocytes T, des macrophages et des mastocytes.

[0047] Par « lysat mécanique » au sens de l'invention, on entend le produit résultant de la lyse mécanique c'est-à-dire la destruction de la membrane d'une cellule biologique par un agent physique tel qu'un moyen mécanique par opposition à un agent chimique ou biologique tel que la température ou une enzyme ou encore l'autolyse naturelle de la cellule.

[0048] Par « lysat mécanique de Saccharomyces cerevisiae » au sens de l'invention, on entend tout principe actif issu de la levure Saccharomyces cerevisiae, obtenu par un procédé comprenant au moins une étape de solubilisation de Saccharomyces cerevisiae consistant en une homogénéisation mécanique. La lyse mécanique c'est-à-dire la destruction de la membrane d'une cellule biologique est réalisée par une technique physique tel qu'un moyen mécanique par opposition à un agent chimique ou biologique tel qu'une enzyme, la température ou encore l'autolyse naturelle de la cellule. Le terme « lysat mécanique » excluent les molécules produites uniquement par fermentation de Saccharomyces cerevisiae mais également issue d'une hydrolyse enzymatique ou chimique.

[0049] Par « oligo-glucane » au sens de l'invention, on entend une fraction de glucane. Les glucanes et les oligo-glucanes sont des polysaccharides constitués exclusivement de glucose. Ces molécules de glucose peuvent être linéaires ou ramifiées. En particulier, un oligo-glucane est un oligomère de glucose de petite taille c'est à dire inférieure ou égale à 5 kDa.

[0050] Principe actif selon l'invention

[0051] La présente invention a donc pour objet un principe actif cosmétique comprenant au moins un extrait de levure de l'espèce Saccharomyces cerevisiae, particulièrement utile pour améliorer la régénération de la peau.

[0052] Le principe actif selon l'invention comprend au moins un extrait de Saccharomyces cerevisiae, ledit extrait correspondant à la fraction cytosolique comprenant des oligo-glucanes de masse molaire compris entre 2 et 5 kDa.

[0053] Ainsi, ledit extrait exclu tout autre partie ou élément de la levure telle que la paroi ou les membranes de la levure. Préférentiellement, ledit extrait est constitué de la fraction cytosolique de la levure de Saccharomyces cerevisiae. Avantageusement, l'extrait est un lysat mécanique de Saccharomyces cerevisiae.

[0054] Selon un objet particulièrement préféré, ledit extrait est susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant les étapes suivantes : a. solubilisation d'au moins 50 g/L de Saccharomyces cerevisiae dans l'eau, par homogénéisation mécanique, b. séparation des phases soluble et insoluble, c. ultrafiltration et récupération du filtrat, et d. tri moléculaire, en particulier par filtration membranaire.

[0055] Préférentiellement, l'extrait est obtenu à partir de la phase soluble.

[0056] L'extrait constituant le principe actif cosmétique selon l'invention a été caractérisé par l'inventeur. Celui-ci comprend des oligo-glucanes qui représentent préférentiellement entre 10% et 35% en poids de matières sèches de l'extrait.

[0057] Préférentiellement, l'extrait selon l'invention étant constitué de la fraction cytosolique de la levure, celui-ci ne comprend pas de membranes et par conséquent ledit extrait comprend peu de mannose. De façon encore plus préférentielle l'extrait selon l'invention comprend un ratio glucose/mannose supérieur à 60%.

[0058] De façon préféré, l'extrait selon l'invention comprend également une fraction protéique. La répartition et la quantité de la fraction protéique peut être déterminée par le dosage de l'azote total selon la méthode de KJELDHAL (référence : Official method of analysis of the A.O.C., 12th ed. W Horwitz, E.D., New-York, 15-60, 1975). Préférentiellement, l'extrait comprend entre 45 et 55% de peptides en poids de matières sèches de l'extrait selon la méthode de KJELDHAL, dont 96% sont des peptides ayant une masse moléculaire inférieure à 2 000 Da.

[0059] L'inventeur a également déterminé la teneur en cendres. La teneur en cendres peut être déterminée par la pesée des résidus issus de l'incinération des échantillons du principe actif selon l'invention à 550°C dans un four à moufle électrique. Préférentiellement, le principe actif selon l'invention présente une teneur en cendres comprise entre 10% et 22% en poids de matières sèches du principe actif.

[0060] En outre, l'extrait selon l'invention comprend également entre 0 et 31% en poids de matière sèche d'autres métabolites cellulaires présents dans le cytosol tels que des acides organiques, de l'ADN etc.

[0061] Le principe actif cosmétique selon l'invention peut se présenter sous forme liquide, sous forme solide ou sous forme de film.

[0062] Lorsque le principe actif selon l'invention se présente sous forme liquide, il est exclusivement constitué par l'extrait de la fraction cytosolique de la levure de Saccharomyces cerevisiae, éventuellement accompagné de stabilisant et/ou système de conservation.

[0063] L'extrait sous forme liquide se présente préférentiellement sous forme d'une solution aqueuse liquide limpide, avec une odeur caractéristique et une couleur jaune clair. Il peut toutefois être plus coloré et/ou être décoloré par tout procédé connu de l'homme du métier. [0064] La teneur en matières sèches peut être déterminée par la pesée des résidus issus du séchage de l'extrait selon l'invention à 105°C dans une étuve jusqu'à l'obtention d'un poids constant. Préférentiellement, l'extrait selon l'invention sous forme liquide a une teneur en matières sèches de : 10 g/L à 50 g/L, encore plus préférentiellement de 15 g/L à 35g/L.

[0065] Le principe actif selon l'invention peut aussi être présenté sous forme d'un film. Dans ce cas, l'extrait de la fraction cytosolique de Saccharomyces cerevisiae représente préférentiellement au moins 0,1% en poids du film.

[0066] Lorsqu'il se présente sous forme de film, le principe actif comprend : a. au moins le lysat de la fraction cytosolique de Saccharomyces cerevisiae selon l'invention, et b. au moins une charge minérale, et/ou c. au moins un polymère d'origine naturelle, et/ou d. au moins un plastifiant, et/ou e. au moins un tensio-actif.

[0067] Le polymère d'origine naturelle peut être choisi parmi : Pectine, Gomme tamarin, Alginate, Pullulane, Psyllium, Xanthane, Guar, Tara, Caroube, Agar, Gomme arabique, Gellane, Dextran, Carraghénane, Cellulose, Konjac et le Chitosan. [0068] Le plastifiant peut être choisi parmi : Glycérol, Sorbitol, Saccharose, Erythritol, Urée, Propylène glycol et le Butylene glycol.

[0069] La charge minérale peut être choisie parmi : Carbonate de calcium, argile verte, kaolin, perlite, talc, silicate de magnésium, mica, sericite diatomée, silice, sulfate de calcium chlorure de calcium, chlorure de potassium, oxyde de fer et l'oxyde de zinc. Le principe actif peut comprendre en outre un pigment pour colorer le film.

[0070] Lorsque le principe actif selon l'invention se présente sous forme solide il est préférentiellement constitué par l'extrait de la fraction cytosolique de la levure de Saccharomyces cerevisiae tel que précédemment décrit et par un support choisi parmi la maltodextrine, la gomme arabique, la lécithine de soja ou l'isomalt. Selon un mode de réalisation, particulièrement adapté, l'extrait représente au moins 10% en poids du principe actif et le support au plus 90% en poids du principe actif.

[0071] Dans le cas d'une forme solide dans laquelle le principe actif est associé à un support, les teneurs en sucres, en fraction protéique et en cendres dans le principe actif sont modifiées, le support étant généralement constitué majoritairement de sucres.

[0072] Procédé d'extraction

[0073] L'extrait constituant ou contenu dans le principe actif selon l'invention peut être obtenu par tout procédé comprenant au moins une étape d'extraction de la fraction cytosolique de la levure de Saccharomyces cerevisiae, en particulier une étape de lyse mécanique.

[0074] Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, le principe actif selon l'invention est obtenu par la mise en œuvre des étapes suivantes : a. solubilisation d'au moins 50 g/L de Saccharomyces cerevisiae dans l'eau, par homogénéisation mécanique, b. séparation des phases soluble et insoluble, c. ultrafiltration et récupération du filtrat, et d. tri moléculaire, en particulier par filtration membranaire.

[0075] L'homogénéisation mécanique est réalisée par tout moyen connu de l'homme du métier, par exemple par broyage mécanique à l'aide d'un homogénéiseur.

[0076] La séparation des phases soluble et insoluble est réalisée par tout moyen connu de l'homme du métier, par exemple par centrifugation, filtration ou décantation. Préférentiellement la séparation des phases soluble et insoluble est réalisée par centrifugation, permettant ainsi la récupération de la phase soluble contenant entre autres les fractions sucres et protéiques solubles.

[0077] Le procédé comprend une étape d'ultrafiltration après la récupération de la phase soluble pour réaliser un tri moléculaire, par exemple par chromatographie ionique ou filtration membranaire. Ainsi, cette étape d'ultrafiltration permet la purification de la phase soluble récupérée. Elle est réalisée afin d'éliminer les molécules de haut poids moléculaire (les enzymes et les polymères, les éléments de la paroi, les membranes...), c'est-à-dire les molécules de poids moléculaire supérieur à lOkDa.

[0078] Le lysat obtenu à ce stade peut éventuellement être encore concentré et/ou purifié, préférentiellement par des étapes d'ultrafiltrations successives à travers des filtres de seuils de coupure différentes, en conservant les filtrats à chaque étape et/ou par une méthode de type chromatographique.

[0079] Le produit obtenu après lyse et ultrafiltration, avant ou après concentration et filtration stérilisante, est un lysat de la fraction cytosolique de Saccharomyces cerevisiae, et constitue la première forme du principe actif selon l'invention, se présentant alors sous forme liquide.

[0080] Le lysat obtenu peut ensuite être séché et associé à un support, pour se présenter sous forme solide. Cette phase peut être réalisée par la mise en œuvre des étapes suivantes : a. un support d'atomisation, de préférence la maltodextrine, est ajouté dans le produit sous forme liquide, d'au plus 90% (en masse/volume), b. cette solution est ensuite concentrée sous vide ; c. une élimination des bactéries éventuellement présentes est réalisée par traitement thermique ou filtration ; d. l'atomisation permet d'obtenir une poudre.

[0081] Les étapes des procédés décrits ci-avant, prises individuellement sont usuelles dans le domaine des extractions d'actifs à partir de matières premières naturelles et l'homme du métier est à même d'en ajuster les paramètres sur la base de ses connaissances générales.

[0082] Composition

[0083] Le principe actif selon l'invention peut être intégré dans une composition cosmétique, notamment une composition comprenant au moins 0,1% en poids dudit principe actif.

[0084] Ladite composition cosmétique selon l'invention comprend préférentiellement un milieu physiologiquement acceptable, préférentiellement un milieu cosmétiquement acceptable, c'est-à-dire qui ne provoque pas de sensations d'inconfort pour l'utilisateur telles que des rougeurs, tiraillements ou picotements. [0085] La composition peut se présenter sous différentes formes galéniques, adaptées à une application par voie topique sur la peau.

[0086] Ces compositions peuvent se présenter notamment sous forme d'émulsions huile- dans-eau, émulsions eau-dans-huile, émulsions multiples (Eau/Huile/Eau ou Huile/Eau/Huile) qui peuvent être éventuellement des microémulsions ou des nanoémulsions, ou sous forme de solutions, suspensions, hydrodispersions, gels aqueux, poudres, ou fond de teint. Elles peuvent être plus ou moins fluides et avoir l'aspect de crèmes, émulsions, gels, masques ou tous autres aspects des cosmétiques de soin de la peau saine.

[0087] Il peut s'agir de compositions comprenant au moins 0,1% du principe actif liquide selon l'invention, préférentiellement entre 0,5 et 10% ou comprenant au moins 0,01% d'un principe actif poudre selon l'invention.

[0088] Les compositions selon l'invention peuvent contenir comme adjuvant au moins un composé choisi parmi : a. les huiles, qui peuvent être choisies notamment parmi les huiles de silicone, linéaires ou cycliques, volatiles ou non volatiles, b. les cires, telles que l'ozokérite, la cire de polyéthylène, la cire d'abeille ou la cire de carnauba, c. les élastomères de silicone, d. les tensioactifs, de préférence émulsionnants, qu'ils soient non ioniques, anioniques, cationiques ou amphotères, e. les co-tensioactifs, tels que les alcools gras linéaires, f. les épaississants et/ou gélifiants, g. les humectants, tels que les polyols comme la glycérine, h. les colorants, les conservateurs, les charges, i. les tenseurs, j. les séquestrants, k. les parfums, l. et leurs mélanges, sans que cette liste soit limitative.

[0089] Des exemples de tels adjuvants sont cités notamment dans le Dictionnaire CTFA (International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook publié par le Personal Care Product Council).

[0090] Bien entendu, l'homme du métier veillera à choisir les éventuels composés complémentaires, actifs ou non-actifs, et leur quantité, de telle sorte que les propriétés avantageuses du mélange ne soient pas, ou sensiblement pas, altérées par l'adjonction envisagée.

[0091] Ces compositions sont destinées à être utilisées sur des peaux saines, notamment des peaux matures, en particulier pour améliorer la régénération cutanée et obtenir un effet antiâge global, préférentiellement un effet anti-ride et/ou pour améliorer l'éclat du teint et/ou réduire les cernes.

[0092] L'invention a donc également pour objet un procédé cosmétique de traitement de la peau pour améliorer la régénération cutanée, en particulier pour améliorer l'éclat du teint et/ou réduire les cernes et/ou réduire les rides qui consiste en l'application topique sur la peau d'une personne saine d'un tel principe actif selon l'invention ou d'une telle composition selon l'invention.

[0093] Utilisation

[0094] Le principe actif selon l'invention ou la composition selon l'invention présente des caractéristiques qui permettent son utilisation en cosmétique et en particulier pour limiter les effets naturels liés au vieillissement cutané et ainsi améliorer la régénération cutanée et obtenir un effet anti-âge global, préférentiellement réduire les rides et/ou réduire les cernes et/ou améliorer l'éclat du teint.

[0095] Pour y parvenir, le principe actif ou la composition selon l'invention améliore l'interconnectivité des systèmes cutanés, vasculaires et immunitaires. Préférentiellement, le principe actif ou la composition selon l'invention augmente la synthèse et la sécrétion des facteurs de croissance KGF, EGF, IGF, FGF, PDGF, TG F-0 et VEGF.

[0096] Or, au niveau du système cutané, dans l'épiderme : le KGF (kératinocyte growth factor) est connu pour stimuler la migration kératinocytaire, étape indispensable au renouvellement épidermique. De même, l'EGF (epidermal growth factor) favorise la prolifération des cellules épithéliales. Enfin, l'IGF (insulin growth factor) promeut la prolifération, la migration et la différenciation kératinocytaire. Dans le derme, le remodelage matriciel est induit par quatre principaux facteurs de croissance. Ainsi, l'IGF présente un rôle mitogène sur les fibroblastes, le FGF-2 ou bFGF, membre de la famille FGF (fibroblast growth factor) promeut la prolifération et la migration des fibroblastes. Le PDGF (platelet derived growth factor) stimule également la survie des fibroblastes et leur synthèse de collagènes. Enfin, le TGF- (transforming growth factor) stimule la prolifération des fibroblastes et induit leur différenciation en myofibroblastes. [0097] Au niveau du système immunitaire, le TGF-0 libéré par les fibroblastes est capable d'activer les macrophages résidents en macrophages pro-régénérants. Ils secrétent alors de nombreux facteurs de croissance, tels que le TGF-p.

[0098] Au niveau du réseau vasculaire : le VEGF (vascular endothelial growth factor) promeut la formation de nouveaux capillaires par les cellules endothéliales.

[0099] Le principe actif selon l'invention en augmentant la synthèse et la sécrétion de KGF, EGF, IGF, FGF, PDGF, TGF-|3 et VEGF permet ainsi de respectivement stimuler la migration kératinocytaire, la prolifération des cellules épithéliales, la différenciation kératinocytaire, promouvoir la prolifération et la migration des fibroblastes, stimuler la survie des fibroblastes et la synthèse de collagène, stimuler la prolifération des fibroblastes et induire leur différenciation en myofibroblastes et ainsi activer les macrophages résidents en macrophages pro-régénérants.

[0100] Par conséquent, le principe actif selon l'invention agit sur :

• le système cutané : en améliorant significativement la migration des fibroblastes (+97%), leur différenciation en myofibroblastes, acteurs essentiels de la régénération cutanée (a-SMA augmentée de 40%) et en favorisant la synthèse du réseau de collagène 1 (+53%), l'actif stimule le renouvellement matriciel. Cela se traduit in vivo par une amélioration de la structure du derme : la qualité de la matrice est augmentée de 32% et la qualité des fibres est augmentée de 20%, en comparaison au placebo. Dans l'épiderme, l'actif stimule également la migration kératinocytaire (+99%), indispensable à la dynamique épidermique.

• le système immunitaire : en favorisant la population pro-régénérante (+132%), capable d'interagir en retour avec les fibroblastes permet de favoriser le remodelage matriciel.

• le système vasculaire : en restaurant la migration des cellules endothéliales et leur cohésion (+93% et +77% respectivement), l'actif promeut la formation du réseau vasculaire (+55%).

[0101] En restaurant l'ensemble des facteurs de croissance, le principe actif selon l'invention présente ainsi une action anti-âge globale. Par conséquent, les rides et cernes sont significativement réduites, le réseau micro-vasculaire redevient homogène, la peau est plus ferme et l'éclat du teint ravivé. Il est particulièrement adapté aux peaux saines matures.

[0102] L'invention est à présent illustrée par des exemples non limitatifs de compositions selon l'invention et par des résultats d'essais.

[0103] Exemples

[0104] Exemple 1 - Principe actif selon l'invention

[0105] Le principe actif est obtenu par la mise en œuvre des étapes suivantes : a. Solubilisation par homogénéisation mécanique (lyse) des levures Saccharomyces cerevisiae, b. Séparation des phases soluble/insoluble, c. Ultrafiltration, d. Récupération du filtrat, e. Tri moléculaire par filtration membranaire, destinée à sélectionner les molécules, f. Décoloration et Désodorisation, et g. Filtrations et filtration stérilisante.

[0106] L'extrait constituant le principe actif selon l'invention est constitué de la fraction cytosolique des levures de S. cerevisae, les membranes sont éliminées et il ne subsiste quasiment aucun mannose dans ledit extrait (le taux de mannose de la fraction glycosidique est inférieur à 2%).

[0107] Le principe actif obtenu présente les caractéristiques analytiques suivantes :

- un taux de matière sèche : 24,4 g/L,

- une teneur en fraction protéique selon la méthode de Kjeldah 1 : 12,4 g/L (50,8%),

- une teneur en sucres totaux : 4 g/L (16,4%),

- un taux de cendres : 4,3 g/L (17,6%),

- métabolites cellulaires, acides organiques, ADN, etc. (15,20%).

[0108] La fraction glycosidique du principe actif obtenu est plus particulièrement constituée de 10% de monosaccharides de masse molaire inférieure à 180 Da et 90% d'oligosaccharides de masse molaire comprise entre 360 Da et 5 000 Da. Plus particulièrement, la fraction glycosidique est composée d'environ 0,5% de glucosamine, 1,7% de galactose, 1,4% de mannose et 96,4% de glucose. Soit un ratio de glucose/mannose de 68,9%.

[0109] Les sucres présents dans le principe actif sont sous forme d'oligo-glucanes, préférentiellement de taille comprise entre 2 et 5 kDa.

[0110] Exemple 2 - Principe actif hors invention

[0111] Le principe actif est obtenu par la mise en œuvre des étapes suivantes : a. Solubilisation de levures Saccharomyces cerevisiae dans un milieu aqueux basique à raison d'au moins 200g/L, b. Hydrolyse enzymatique, c. Séparation des phases solubles et insolubles par centrifugation, décantation ou filtration, d. Filtration stérilisante

[0112] Le principe actif obtenu présente les caractéristiques analytiques suivantes :

- un taux de matière sèche : 54,6 g/L,

- une teneur en protéine selon la méthode de Lowry : 23,2 g/L (42%),

- une teneur en sucres totaux : 18,3 g/L (34%),

[0113] Le principe actif selon l'exemple 2 est constitué de 34% de sucres dont 5% de disaccharide et 95% de saccharides de tailles supérieures à 1440Da. Et un ratio glucose/mannose de 14,0%.

[0114] Exemple 3 - Principe actif hors invention

[0115] Le principe actif est obtenu par la mise en oeuvre des étapes suivantes : a. Solubilisation de levures Saccharomyces cerevisiae dans un milieu aqueux légèrement basique à raison d'au moins 20% avec éventuellement l'ajout d'un alcool afin de favoriser la solubilisation des levures, b. hydrolyse des protéines en milieu basique, c. agitation de 8 à 52h, d. première filtration afin de séparer les phases soluble et insoluble, e. lavage contre eau afin de purifier la fraction active, f. concentrations et filtrations successives, et g. filtration stérilisante.

[0116] Le principe actif obtenu présente les caractéristiques analytiques suivantes :

- un taux de matière sèche : 42,7 g/L,

- une teneur en protéine selon la méthode de Lowry : 10,4 g/L (24%),

- une teneur en sucres totaux : 25,7 g/L (60%),

[0117] Le principe actif selon l'exemple 3 est ainsi majoritairement composé de mannanes.

[0118] Exemple 4 - Principe actif hors invention

[0119] Le principe actif est obtenu par la mise en oeuvre des étapes suivantes : a. Solubilisation par homogénéisation mécanique (lyse) des levures Saccharomyces cerevisiae, b. Séparation des phases soluble/insoluble, c. Récupération de la phase soluble, d. Tri moléculaire par filtration membranaire, destinée à sélectionner les molécules, e. Décoloration et Désodorisation, et f. Filtrations et filtration stérilisante.

[0120] Le principe actif obtenu présente les caractéristiques analytiques suivantes :

- un taux de matière sèche : 22g/L,

- une teneur en fraction protéique selon la méthode Kjeldahl : 12,2g/L (56%),

- une teneur en sucres totaux : 8,lg/L (37%),

- un taux de cendres : 6, 4g/L (17%).

[0121] Exemple 5 - Principe actif hors invention

[0122] Le principe actif est obtenu par la mise en oeuvre des étapes suivantes : a. Solubilisation par homogénéisation mécanique (lyse) des levures Saccharomyces cerevisiae, b. Séparation des phases soluble/insoluble, c. Ultrafiltration, d. Récupération du filtrat, e. Tri moléculaire par filtration membranaire, destinée à sélectionner les molécules, f. Récupération du rétentat, g. Décoloration et Désodorisation, et h. Filtrations et filtration stérilisante.

[0123] Le principe actif obtenu présente les caractéristiques analytiques suivantes :

- un taux de matière sèche : 29,7g/L,

- une teneur en fraction protéique selon la méthode de Kjeldahl : 6,2g/L (21%),

- une teneur en sucres totaux : 29,5g/L (99%),

- un taux de cendres : 7, 9g/L (16%).

[0124] Le principe actif obtenu est composé de molécules de tailles supérieures à 5 kDa.

[0125] Exemple 6 - Principe actif hors invention

[0126] Le principe actif est obtenu par la mise en œuvre des étapes suivantes : a. Solubilisation par homogénéisation mécanique (lyse) des levures Saccharomyces cerevisiae, b. Séparation des phases soluble/insoluble, c. Ultrafiltration, d. Récupération du filtrat, e. Tri moléculaire par filtration membranaire, destinée à sélectionner les molécules, f. Récupération du filtrat, g. Décoloration et Désodorisation, et h. Filtrations et filtration stérilisante

[0127] Le principe actif obtenu présente les caractéristiques analytiques suivantes :

- un taux de matière sèche : 35, 6g/L, - une teneur en fraction protéique selon la méthode de Lowry : 9g/L (25%),

- une teneur en sucres totaux : 9,9g/L (28%),

- un taux de cendres : 4, 7g/L (8%).

[0128] Le principe actif obtenu est composé de molécules de tailles inférieures à 2 KDa.

[0129] Exemple 7 - Composition selon l'invention [0130] Un exemple de formulation comprenant le principe actif selon l'invention sous forme de gel-crème anti-âge caractérisé par une texture fraîche et onctueuse est présenté dans le tableau 1 ci-après.

[0131] [Tableauxl]

0132] La composition de l'exemple 7 peut notamment être obtenue par le procédé suivant : a. Ajouter A2 dans Al sous agitation et homogénéiser pendant 20 minutes. b. Ajouter B puis C dans A sous forte agitation. Agiter pendant 20 minutes. c. Ajouter D et E sous agitation modérée. [0133] La composition est alors sous forme d'un gel crème épais et brillant, blanc cassé.

[0134] Exemple 8 - Composition selon l'invention

[0135] Un exemple de formulation comprenant le principe actif selon l'invention sous forme de crème de jour réparatrice est présenté dans le tableau 2 ci-après.

[0136] [Tableaux2]

[0137] La composition de l'exemple 8 peut notamment être obtenue par le procédé suivant : a. Ajouter A2 dans Al sous agitation modérée, agiter jusqu'à obtention d'un gel homogène et chauffer à 80°C, b. Placer B sous agitation magnétique et chauffer à 80°C, c. Emulsionner B dans A sous agitation cisaillante pendant 10 minutes, d. A 30°C, sous agitation modérée, ajouter C, et e. Ajuster le pH à 5,0 - 5,5 avec D.

[0138] La composition est alors sous forme d'une crème gélifiée souple et brillante, blanc cassé. [0139] Exemple 9 - Composition selon l'invention

[0140] Un exemple de formulation comprenant le principe actif selon l'invention sous forme de crème hybride, mi-soin, mi-fond de teint est présenté dans le tableau 3 ci-après.

[0141] [Tableaux3]

[0142] La composition de l'exemple 9 peut notamment être obtenue par le procédé suivant : a. Ajouter A2 dans Al sous agitation, agiter jusqu'à homogénéité et chauffer à 80°C, b. Placer Bl sous agitation et chauffer à 80°C. Ajouter B2 dans B1 juste avant l'émulsion, c. Emulsionner B dans A sous agitation cisaillante pendant 10 minutes, d. A 50°C, sous agitation modérée, ajouter C puis D, E et F, et e. A température ambiante, ajouter G sous agitation très douce.

[0143] La composition est alors sous forme d'une émulsion souple, brillante, gris pâle avec particules grises en suspension.

[0144] Exemple 10 - Composition selon l'invention [0145] Un exemple de formulation comprenant le principe actif selon l'invention sous forme de crème de nuit régénérante est présenté dans le tableau 4 ci-après.

[0146] [Tableaux4]

[0147] La composition de l'exemple 10 peut notamment être obtenue par le procédé suivant : a. Ajouter A2 dans Al sous agitation modérée, agiter jusqu'à obtention d'un gel homogène et chauffer à 80°C, b. Placer B sous agitation magnétique et chauffer à 80°C, c. Emulsionner B dans A sous agitation cisaillante pendant 10 minutes, et d. A 50°C, sous agitation modérée, ajouter C puis D.

[0148] La composition est alors sous forme d'une émulsion souple, brillante, beige pâle. A 1 mois, le pH est égal à 5,4 et la viscosité est égale à (C/5rpm) 57400 cP.

[0149] Evaluation de l'effet cosmétique du principe actif selon l'invention [0150] Essai 1 - Effet du principe actif selon l'invention sur sa capacité à restaurer le complexe régénérant fibroblastique.

[0151] L'objectif de cet essai est d'évaluer l'impact du vieillissement sur l'expression et la synthèse des facteurs de croissance : TGF-(31, KGF, VEGF, FGF2, EGF, IGF1 et PDGFA présents au sein du complexe régénérant fibroblastique.

[0152] Pour cette étude, les paramètres suivants ont été analysés sur des fibroblastes humains issus de plasties visages, jeunes et âgés.

[0153] L'expression de EGF, IGF1 et PDGFA a été évaluée par QPCR et la synthèse de TGF-pl, KGF, VEGF et FGF2 a été évaluée par dosage ELISA.

[0154] Le protocole opératoire de l'étude est décrit en suivant.

[0155] Les fibroblastes humains jeunes et âgés sont ensemencés et incubés à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2.

[0156] Puis les cellules sont traitées avec les extraits à 0,25% et 1,00% (V/V). Elles sont ensuite incubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2.

[0157] Les fibroblastes sont récupérés et les ARN totaux extraits.

[0158] Les ARN ont été reverse-transcrits et les ADN complémentaires obtenus ont été analysés par la technique de PCR quantitative. Les ARNm de témoins internes de référence, ont été analysés en parallèle des ARNm de EGF, IGF1 et PDGFA.

[0159] L'incorporation de fluorescence (SYBR Green) est mesurée en continu à l'aide d'un thermocycleur. L'analyse des Ct (quantification relative) est réalisée à l'aide d'un logiciel.

[0160] Les surnageants sont récupérés et stockés à -80°C en attente des dosages ELISA du TGFpl, KGF, VEGF, FGF2.

[0161] L'objectif de cette étude est d'évaluer l'effet des exemples selon l'invention sur l'expression des facteurs de croissance : EGF, IGF1 et PDGFA du complexe régénérant fibroblastique.

[0162] Les résultats sont donnés dans le tableau 5.

[0163] [Tableaux5]

[0164] En comparaison à des fibroblastes jeunes, les fibroblastes âgés présentent une capacité réduite à exprimer : l'EGF de -44% ; l'IGF-1 de -42% ; le PDGFA de -41%.

[0165] Le vieillissement entraîne un appauvrissement significatif des facteurs de croissance du complexe régénérant fibroblastique. [0166] Le principe actif selon l'invention quant à lui, restaure significative l'expression des facteurs de croissance : EGF, IG Fl et PDGFA.

[0167] Cet essai a également été effectué afin d'évaluer l'effet du principe actif selon l'invention sur la synthèse des facteurs de croissance : TGF01, VEGF, KGF et FGF2 du complexe régénérant fibroblastique. [0168] Les résultats sont donnés dans le tableau 6.

[0169] [Tableaux6]

[0170] En comparaison à des fibroblastes jeunes, les fibroblastes âgés présentent une capacité réduite à synthétiser : le TGF-|31 de -19% ; le VEGF de -36% ; le KGF de -44% ; le FGF2 de -29%. [0171] Le vieillissement entraîne un appauvrissement significatif des facteurs de croissance du complexe régénérant fibroblastique.

[0172] Le principe actif selon l'invention restaure significativement la synthèse des facteurs de croissance tandis que les exemples hors invention ne présentent pas un effet sur l'ensemble des facteurs de croissance étudiés.

[0173] Testé à 1% sur fibroblastes humains âgés, le principe actif selon l'invention restaure significativement l'expression ou la synthèse des facteurs de croissance : EGF de 98%, IGF1 de 75%, PDGFA de 76%, TGFpl de 135%, KGF de 48%, VEGF de 73%, et FGF2 de 49%.

[0174] Le principe actif selon l'invention permet ainsi d'enrichir le complexe régénérant fibroblastique des cellules âgées en facteurs de croissance.

[0175] Essai 2 - Effet du principe actif selon l'invention sur la migration des fibroblastes.

[0176] L'objectif de cette étude est d'évaluer l'effet du principe actif selon l'invention sur la migration des fibroblastes humains âgés.

[0177] En réponse à un stress mécanique, les cellules se déplacent au sein du tissu afin de se localiser au niveau de la zone de pression. A ce niveau, des forces de contraction sont alors générées afin de maintenir l'intégrité de la peau. Avec l'âge, la capacité migratoire des cellules est réduite.

[0178] Cette étude a été réalisée par un test de migration cellulaire en « time-lapse » sur des fibroblastes humains issus de plasties visages, jeunes et âgés.

[0179] L'effet est mesuré en évaluant la capacité des cellules à recoloniser une zone blessée. [0180] Les fibroblastes humains jeunes et âgés sont ensemencés et incubés à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2. [0181] La zone blessée est réalisée après quatre jours. Les cellules sont traitées avec les extraits à 0,25% et/ou 1,00% et/ou 2% (V/V). Elles sont ensuite incubées dans une atmosphère contenant 5% de CO2 à 37°C.

[0182] La visualisation de la migration des fibroblastes est réalisée en « time-lapse » grâce à un système entièrement automatisé qui permet de suivre la migration des cellules lors de la culture.

[0183] La vitesse de migration des cellules au sein de la blessure est calculée grâce à un script d'analyse d'images développé en interne. Les résultats sont exprimés en pm ² /min.

[0184] Les résultats sont donnés dans le tableau 7.

[0185] [Tableaux7]

[0186] La vitesse de migration des fibroblastes humains âgés est significativement diminuée de 27% par rapport aux fibroblastes humains jeunes.

[0187] Testé à 1,0% sur fibroblastes humains âgés, le principe actif selon l'invention restaure significativement la vitesse de migration de 97%. Contrairement à l'exemple 2 hors invention qui présente une vitesse de migration lente.

[0188] Le principe actif selon l'invention favorise ainsi une recolonisation plus rapide du derme blessé âgé, étape-clé de la régénération cutanée.

[0189] Essai 3 - Effet du principe actif selon l'invention sur la différenciation en myofibroblastes.

[0190] L'objectif de cette étude est d'évaluer l'effet du principe actif selon l'invention sur la synthèse de l'alpha-Smooth muscle actin (a-SMA), microfilaments d'actine caractéristiques des myofibroblastes, dans une zone blessée.

[0191] Dans les tissus lésés, les fibroblastes sont activés et se différencient en myofibroblastes, qui se contractent et participent à la cicatrisation par la réduction de la taille de la plaie et par la sécrétion de protéines de la matrice extracellulaire. [0192] L'étude a été réalisée par immunocytofluorescence, sur des fibroblastes humains issus de plasties visages, jeunes et âgés.

[0193] Le protocole opératoire de l'étude est décrit en suivant. Les fibroblastes humains jeunes et âgés sont ensemencés et incubés à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2 et cultivés pendant plusieurs jours.

[0194] La blessure est réalisée. Les cellules sont traitées avec le principe actif selon l'invention à 0,25% et 1,00% (V/V) pendant 72h. Elles sont ensuite incubées dans une atmosphère contenant 5% de CO2 à 37°C.

[0195] Le marquage immunocytologique de l'a-SMA est réalisé par fixation et perméabilisation à l'aide d'un anticorps primaire et d'un anticorps secondaire couplé à un fluorophore.

[0196] La visualisation est réalisée à l'aide d'un microscope couplé à une caméra et à un système d'analyse d'images.

[0197] L'intensité du marquage d'a-SMA est proportionnelle à l'intensité de coloration (fluorescence) présente dans le cytoplasme des fibroblastes. Plus la fluorescence est importante, plus le taux de synthèse d'a-SMA est élevé.

[0198] Une analyse quantitative des images a été réalisée grâce à un script d'analyse d'images développé en interne. Les résultats sont exprimés en unités arbitraires (UA).

[0199] Les résultats sont donnés dans le tableau 8.

[0200] [Tableaux8]

[0201] La synthèse d'a-SMA, marqueur caractéristique des myofibroblastes, est significativement réduite de 75% dans un modèle blessé chez les cellules âgées par rapport aux cellules jeunes. [0202] Testé à 1% sur fibroblastes âgés, le principe actif selon l'invention stimule significativement la synthèse d'ot-SMA de 40%.

[0203] Le principe actif selon l'invention permet ainsi la transformation des fibroblastes en myofibroblastes, acteurs-clefs de la régénération dermique.

[0204] Essai 4 - Effet du principe actif selon l'invention sur la migration des kératinocytes.

[0205] L'objectif de cette étude est d'évaluer l'impact du complexe régénérant fibroblastique âgé traité avec le principe actif selon l'invention sur la migration des kératinocytes humains âgés.

[0206] En réponse à un stress mécanique, les cellules se déplacent au sein du tissu afin de se localiser au niveau de la zone de pression. A ce niveau, des forces de contraction sont alors générées afin de maintenir l'intégrité de la peau. Avec l'âge, la capacité migratoire des cellules est réduite.

[0207] Cette étude a été réalisée par un test de migration cellulaire en « time-lapse » sur des kératinocytes humains issus de donneurs jeunes et âgés. L'effet est mesuré en évaluant la capacité des cellules à recoloniser une zone de blessure.

[0208] Les kératinocytes humains jeunes et âgés sont ensemencés et incubés à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2.

[0209] La blessure est réalisée. Les cellules sont traitées par les sécrétomes issus des fibroblastes jeunes (SFJ) ou âgés (SFA) en présence ou non du principe actif selon l'invention à 0,25% et 1,00% (V/V). Les cellules sont ensuite incubées dans une atmosphère contenant 5% de CO ₂ à 37°C.

[0210] La visualisation de la migration des kératinocytes est réalisée en « time-lapse » grâce à un système entièrement automatisé qui permet de suivre la migration des cellules lors de la culture.

[0211] La vitesse de migration des cellules au sein de la blessure est calculée grâce à un script d'analyse d'images développé en interne. Les résultats sont exprimés en pm ² /min.

[0212] Les résultats sont donnés dans le tableau 9.

[0213] [Tableaux9]

[0214] La migration des kératinocytes humains âgés est significativement diminuée de 45% par rapport aux kératinocytes humains jeunes.

[0215] Testé sur kératinocytes humains âgés, le sécrétome issu de fibroblastes humains âgés prétraités avec 1,0% du principe actif selon l'invention restaure significativement la vitesse de migration cellulaire de 99%. Tandis qu'en présence de l'exemple 2 hors invention, la vitesse de migration cellulaire n'est restaurée que de 39%.

[0216] Le principe actif selon l'invention accélère ainsi la migration kératinocytaire, étape-clé de la régénération cutanée.

[0217] Essai 5 - Effet du principe actif selon l'invention sur le système immunitaire et la polarisation des macrophages.

[0218] L'objectif de cette étude est d'évaluer l'impact du complexe régénérant fibroblastique âgé traité avec le principe actif selon l'invention sur la polarisation des macrophages prorégénérants.

[0219] Le système immunitaire est impliqué dans les défenses contre les pathogènes mais participe également à l'homéostasie tissulaire. Lors de la cicatrisation, la phase de régénération est notamment guidée par une population de macrophages pro-régénérants à l'action anti-inflammatoire et capables, entre autres, de stimuler le remodelage matriciel. Avec l'âge, l'activité de ces macrophages décroit, avec notamment une réactivité moins forte aux stimuli extérieurs entraînant une moins bonne différenciation et une diminution d'expression de certains récepteurs de surface nécessaires à leur fonctionnalité.

[0220] Cette étude a été réalisée sur macrophages humains dérivés de monocytes extraits de sang périphérique humain. La polarisation en macrophages pro-régénérants a été évaluée en analysant par cytométrie en flux la synthèse de CD163 marqueur spécifique de cette population et contribuant à la réponse anti-inflammatoire. Afin de s'assurer qu'aucune population de macrophages pro-inflammatoires n'était induite par les traitements, la synthèse de HLA-DR, marqueur préférentiel de cette population, a été analysée par cytométrie en flux et a été complémentée par l'analyse de la synthèse de TNFa par un dosage ELISA.

[0221] Le protocole opératoire de l'étude est décrit en suivant. Les monocytes humains sont isolés de cellules mononuclées du sang périphérique (PBMCs) et sont ensemencés dans un milieu de différenciation pour macrophages avant d'être incubés à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2.

[0222] Les macrophages sont ensuite traités par les sécrétomes issus des fibroblastes jeunes (SFJ) ou âgés (SFA) en présence ou non du principe actif selon l'invention à 0,25% et 1,00% (V/V). Les cellules sont ensuite incubées dans une atmosphère contenant 5% de CO2 à 37°C.

[0223] Les macrophages sont récupérés et marqués avec des anticorps conjugués spécifiques de CD163 et HLA-DR. Les cellules sont ensuite fixées dans une solution de paraformaldéhyde à 1% avant d'être analysées sur un cytomètre en flux doté d'un logiciel d'analyse.

[0224] Le taux de synthèse de CD163 et HLA-DR est évalué via la médiane de fluorescence associée à chacun de ces marqueurs et est exprimée en unités arbitraires (UA).

[0225] Parallèlement, les surnageants sont prélevés et stockés à -80°C jusqu'à l'analyse par dosage ELISA du TNFa.

[0226] Les résultats sont donnés dans le tableau 10.

[0227] [TableauxlO]

[0228] Le sécrétome de fibroblastes jeunes ou âgés traités ou non avec le principe actif selon l'invention ne modifie pas le taux de synthèse de HLA-DR et n'induit pas de synthèse de TNFa. [0229] Le sécrétome issu de fibroblastes humains favorise la génération de macrophages prorégénérants sans induire des macrophages pro-inflammatoires.

[0230] Le taux de synthèse de CD163, récepteur spécifique participant à la fonctionnalité des macrophages pro-régénérants, est diminué de 23% en présence de sécrétome issu de fibroblastes humains âgés par rapport au sécrétome issu de fibroblastes humains jeunes. [0231] Le sécrétome issu de fibroblastes humains âgés prétraités avec 0,25% du principe actif selon l'invention restaure l'expression de surface de CD163 de 132%.

[0232] Le principe actif selon l'invention renforce ainsi la fonctionnalité des macrophages prorégénérants, éléments essentiels de la régénération cutanée.

[0233] Essai 6 - Effet du principe actif selon l'invention sur le système vasculaire et la migration des cellules endothéliales.

[0234] L'objectif de cette étude est d'évaluer l'effet du principe actif selon l'invention sur la migration des cellules endothéliales humaines âgées.

[0235] Les cellules endothéliales composant les micro-vaisseaux cutanés sont normalement quiescentes dans les capillaires. Néanmoins, en réponse à un stimulus du microenvironnement (hypoxie, blessure), les cellules endothéliales sont activées, migrent et sont capables de remodeler le réseau vasculaire afin de subvenir aux besoins du tissu lésé. Avec l'âge, les cellules endothéliales sénescentes sont dysfonctionnelles entraînant des défauts de remodelage vasculaire ainsi qu'une diminution du nombre de capillaires dans la peau.

[0236] Cette étude a été réalisée par un test de migration cellulaire en « time-lapse » sur des cellules endothéliales jeunes et âgées. L'effet est mesuré en évaluant la capacité des cellules à recoloniser une zone de blessure.

[0237] Les cellules endothéliales (HUVEC : Human umbilical vein endothelial cells) jeunes et âgées sont ensemencées et incubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2.

[0238] La zone de blessure est réalisée. Les cellules sont traitées par les sécrétomes issus des fibroblastes jeunes (SFJ) ou âgés (SFA) en présence ou non du principe actif selon l'invention à 0,25% et 1,00% (V/V). Les cellules sont ensuite incubées dans une atmosphère contenant 5% de CO ₂ à 37°C.

[0239] La visualisation de la migration des cellules endothéliales est réalisée en « time-lapse » grâce à un système entièrement automatisé qui permet de suivre la migration des cellules lors de la culture.

[0240] La vitesse de migration des cellules au sein de la blessure est calculée grâce à un script d’analyse d'images développé en interne. Les résultats sont exprimés en pm ² /min.

[0241] Les résultats sont donnés dans le tableau 11.

[0242] [Tableauxll]

[0243] La migration des cellules endothéliales humaines âgées est significativement diminuée de 47% par rapport aux cellules endothéliales jeunes.

[0244] Testé sur cellules endothéliales humaines âgées, le sécrétome issu de fibroblastes humains âgés prétraité avec 1,0% du principe actif selon l'invention, restaure significativement la vitesse de migration des cellules endothéliales de 93%.

[0245] Le principe actif selon l'invention accélère ainsi la migration des cellules endothéliales âgées, indispensable à la régénération du réseau vasculaire (blessé).

[0246] Essai 7 - Effet du principe actif selon l'invention sur le système vasculaire et la cohésion des cellules endothéliales.

[0247] L'objectif de cette étude est d'évaluer l'effet du principe actif selon l'invention, au sein du complexe régénérant fibroblastique, sur la synthèse de ZO-1 (Zonula Occludens -1), protéine de jonctions entre les cellules endothéliales.

[0248] L'intégrité vasculaire est assurée par l'établissement de jonctions adhérentes et serrées entre les cellules endothéliales. Ces jonctions permettent une perméabilité sélective des vaisseaux. ZO-1 est un composant constitutif des jonctions serrées endothéliales. Avec l'âge, les cellules endothéliales sont dysfonctionnelles et présentent une diminution de l'expression et de l'adressage membranaire des composants des jonctions serrées induisant une perméabilité augmentée.

[0249] L'étude a été réalisée par immunocytofluorescence, sur des cellules endothéliales jeunes et âgées.

[0250] Les cellules endothéliales humaines (HUVEC : Human umbilical vein endothelial cells) jeunes et âgées sont ensemencées et incubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2. [0251] Les cellules sont traitées par les sécrétomes issus des fibroblastes jeunes (SFJ) ou âgés (SFA) en présence ou non du principe actif selon l'invention à 0,25% et 1,00% (V/V). Elles sont ensuite incubées dans une atmosphère contenant 5% de CO2 à 37°C.

[0252] Le marquage immunocytologique des ZO-1 est réalisé par fixation et perméabilisation à l'aide d'anticorps primaire et d'anticorps secondaire couplé à un fluorophore.

[0253] La visualisation est réalisée à l'aide d'un microscope couplé à un système d'analyse d'image.

[0254] La surface de fluorescence, correspondant au marquage ZO-1, est proportionnelle à l'établissement de jonctions serrées entre les cellules endothéliales. Une analyse quantitative des images a été réalisée grâce à un script d'analyse d'images développé en interne en langage python. Les résultats sont exprimés en unités arbitraires (UA).

[0255] Les résultats sont donnés dans le tableau 12.

[0256] [Tableauxl2]

[0257] La synthèse de ZO-1, protéine constitutive des jonctions intercellulaires, est significativement réduite de 52% dans les cellules endothéliales âgées par rapport aux cellules jeunes.

[0258] Testé à 1,0% sur cellules endothéliales âgées, le principe actif selon l'invention restaure significativement la synthèse de ZO-1 de 77%.

[0259] Le principe actif selon l'invention permet ainsi de renforcer la cohésion cellulaire.

[0260] Essai 8 - Effet du principe actif selon l'invention sur le système vasculaire et la formation du réseau vasculaire.

[0261] L'objectif de cette étude est d'évaluer l'effet du principe actif selon l'invention sur la formation d'un réseau capillaire de cellules endothéliales âgées.

[0262] Le remodelage du réseau vasculaire cutané chez l'adulte en réponse à un stimulus (hypoxie, blessure) se fait via un mécanisme d'angiogenèse. Ce processus se définit comme la formation de vaisseaux à partir de vaisseaux préexistants. Il est le résultat de spécification, de migration et de prolifération des cellules endothéliales. L'angiogenèse physiologique permet à la peau de cicatriser correctement. Avec l'âge, la formation de capillaires par angiogenèse est altérée et empêche la bonne cicatrisation et homéostasie des tissus.

[0263] L'étude a été réalisée par immunocytofluorescence, sur cellules endothéliales jeunes et âgées grâce au marqueur spécifique des cellules endothéliales : PECAM-1 (CD31).

[0264] Des fibroblastes jeunes ou âgés sont ensemencés et incubés à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2.

[0265] Les cellules sont traitées avec les extraits 1,00% (V/V) puis incubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2.

[0266] Les cellules endothéliales humaines (HUVEC : Human Umbilical Vein Endothelial Cells) jeunes et âgées sont ensemencées sur les tapis de fibroblastes jeunes ou âgés et incubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2.

[0267] Les cellules sont ensuite traitées avec un extrait à 1,00% (V/V) et incubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2.

[0268] Le marquage immunocytologique des CD31 est réalisé par fixation et perméabilisation à l'aide d'anticorps primaire et d'anticorps secondaire couplé à un fluorophore.

[0269] La visualisation est réalisée à l'aide d'un microscope couplé à une caméra et à un système d'analyse d'images.

[0270] La surface de fluorescence correspondant au marquage CD31 est proportionnelle à l'étendue du réseau vasculaire formée par les cellules endothéliales.

[0271] Une analyse quantitative des images a été réalisée grâce à un script d'analyse d'images développé en interne. Les résultats sont exprimés en unités arbitraires (UA).

[0272] Les résultats sont donnés dans le tableau 13.

[0273] [Tableauxl3]

[0274] Testé à 1,0% sur cellules endothéliales âgées, le principe actif selon l'invention permet de restaurer significativement la formation d'un réseau capillaire de 101%. Tandis que l'exemple 3 hors invention présente une efficacité plus faible.

[0275] Le principe actif selon l'invention favorise ainsi l'angiogenèse.

[0276] Essai 9 - Etude de l'activité biologique du principe actif selon l'invention in vivo.

[0277] L'objectif de cette étude est d'évaluer in vivo l'activité biologique du principe actif selon l'invention formulé à 2,5% en émulsion, en comparaison à une formule placebo, sur des volontaires caucasiens et asiatiques.

[0278] Le panel caucasien est composé de 19 volontaires sains, de sexe féminin, âgés de 70 à 78 ans, présentant des rides de la patte d'oie et un teint terne.

[0279] Le panel asiatique était constitué de 33 personnes âgées de 60 à 69 ans et le groupe placebo de 32 personnes âgées de 60 à 68 ans.

[0280] Effet du principe actif selon l'invention sur le renouvellement cellulaire.

[0281] Dans un premier temps, l'effet du principe actif selon l'invention a été évalué au niveau des avant-bras sur le panel caucasien en étudiant sa faculté à accélérer le renouvellement cellulaire après 14 jours d'application biquotidienne.

[0282] Le renouvellement cellulaire est mesuré grâce à la capacité de la peau à éliminer la DHA (dihydroxyacetone) qui est un marqueur colorant les protéines. Le renouvellement des cellules entraîne la disparition de la coloration induite par la DHA.

[0283] Un gel contenant 8% de DHA est appliqué à la surface de la peau des volontaires. Le suivi de la couleur obtenue après application du gel de DHA démarre 72 heures après coloration sur des zones non traitées, traitées biquotidiennement avec une formule placebo ou traitées biquotidiennement avec une formule contenant 5% du principe actif selon l'invention. L'évaluation est réalisée à partir de photographies de la peau prise à intervalles réguliers pendant 14 jours, à l'aide d'un dermatoscope.

[0284] Les résultats correspondant à l'effet du principe actif selon l'invention formulé à 2,5% en émulsion, sur la capacité à éliminer la DHA est présenté sur la figure 1.

[0285] En comparaison au placebo, le principe actif selon l'invention formulé à 2,5% en émulsion, favorise la dynamique épidermique en augmentant la capacité de la peau à éliminer la DHA.

[0286] Cet effet est observé et significatif dès 2 jours après l'application des produits et se poursuit tout au long de l'étude (J14).

[0287] En effet, avec le principe actif selon l'invention en moins de 7 jours, la coloration à la DHA est éliminée à plus de 80%, contre 11 jours pour la zone traitée par le placebo.

[0288] Effet du principe actif selon l'invention sur la structure du derme.

[0289] Dans un second temps, l'effet du principe actif selon l'invention sur la structure du derme a été évalué au niveau du visage après 21 et 42 jours d'application en évaluant la qualité de la matrice par LC-OCT (pour Line-Field Optical Cohérence Tomography ou tomographie par cohérence optique confocale à balayage linéaire). Cette étude a été réalisée sur les panels caucasien et asiatique.

[0290] Les résultats présentant l'effet sur le panel caucasien du principe actif selon l'invention sur la qualité de la matrice dermique évaluée sur une épaisseur de 50 pm sous la JDE est présenté dans le tableau 14 ci-après.

[0291] [Tableauxl4]

[0292] Dès 21 jours de traitement, le principe actif selon l'invention formulé à 2,5% améliore significativement la qualité de la matrice de volontaires caucasiens de 32% par rapport au placebo.

[0293] Cet effet a été observé chez 89% des sujets. Ainsi, la dynamique matricielle du derme est restaurée. Cet effet se prolonge après 42 jours de traitement.

[0294] Les résultats présentant l'effet du principe actif selon l'invention sur la qualité des fibres dermiques de volontaires asiatiques est présenté dans le tableau 15 ci-après. [0295] [Tableauxl5]

[0296] Dès 21 jours de traitement, le principe actif selon l'invention formulé à 2,5% améliore significativement la qualité des fibres de volontaires asiatiques de 20% par rapport au placebo. Cet effet a été observé chez 97% des sujets asiatiques. Cet effet se prolonge après 42 jours de traitement.

[0297] Essai 10 - Evaluation des bénéfices cosmétiques du principe actif selon l'invention

[0298] L'objectif de cette étude est d'évaluer in vivo les bénéfices cosmétiques du principe actif selon l'invention formulé à 2,5% en émulsion, en comparaison à une formule placebo, chez des volontaires caucasiens et asiatiques. L'effet du principe actif selon l'invention a été évalué après 21 et 42 jours d'application biquotidienne.

[0299] Le panel caucasien est composé de 19 volontaires sains, de sexe féminin, âgés de 70 à 78 ans, présentant des rides au niveau de la patte d'oie et un teint terne.

[0300] Le panel asiatique est constitué de 33 personnes âgées de 60 à 69 ans et le groupe placebo de 32 personnes âgées de 60 à 68 ans.

[0301] Action sur les propriétés biomécaniques de la peau sur panel caucasien

[0302] Les résultats correspondant à l'effet du principe actif selon l'invention sur les propriétés biomécaniques de la peau de volontaires caucasiens sont présentés sur la figure 2.

[0303] Le principe actif selon l'invention en comparaison au placebo, améliore les propriétés biomécaniques de la peau de volontaires caucasiens.

[0304] En effet, dès 21 jours de traitement, le principe actif selon l'invention augmente de :

- 10% de la fermeté de la peau, effet observé chez 84% des sujets

- 14% de l'élasticité cutanée, effet observé chez 68% des sujets

- 25% de la tonicité de la peau, effet observé chez 84% des sujets.

[0305] De plus, 79% des volontaires trouve leur peau plus ferme et 79% plus tonique avec le principe actif selon l'invention contre respectivement 68% et 74% pour le côté placebo. Cet effet se prolonge après 42 jours d'application biquotidienne.

[0306] Action anti-rides sur panel caucasien

[0307] Les résultats correspondant à l'effet anti-rides du principe actif selon l'invention évalué sur la zone de la patte d'oie de volontaires caucasiens par scorage visuel sur photographies numériques en comparaison au placebo sont présentés dans le tableau 16.

[0308] [Tableauxl6]

[0309] Dès 21 jours de traitement, en comparaison au placebo, le principe actif selon l'invention formulé à 2,5% en émulsion présente un effet anti-rides, en diminuant significativement de 10% le stade de rides de la patte d'oie. Cet effet est observé chez 74% des volontaires.

[0310] De plus, 74% des sujets ont constaté que leurs rides et ridules étaient moins visibles avec le principe actif selon l'invention contre seulement 58% pour le traitement placebo. Cet effet se prolonge après 42 jours de traitement.

[0311] Action sur le réseau micro-vasculaire cutané du panel caucasien

[0312] Les résultats correspondant à l'effet du principe actif selon l'invention sur la visibilité des micro-vaisseaux de la peau de volontaires caucasiens est présenté dans le tableau 17.

[0313] [Tableauxl7]

[0314] Dès 21 jours de traitement et en comparaison au placebo, le principe actif selon l'invention formulé à 2,5%, atténue la visibilité des vaisseaux dystrophiques au niveau des joues (-6%).

[0315] Cet effet se poursuit après 42 jours de traitement où une diminution significative de 7% est observée ; effet validé chez 63% des sujets.

[0316] En diminuant la visibilité des micro-vaisseaux dystrophiques le principe actif selon l'invention améliore la vascularisation cutanée.

[0317] Action sur les cernes du panel caucasien

[0318] Les résultats correspondant à l'effet du principe actif selon l'invention sur les cernes de volontaires caucasiens est présenté dans le tableau 18 ci-après. [0319] [Tableauxl8]

[0320] En comparaison au placebo, le principe actif selon l'invention formulé à 2,5% en émulsion limite les cernes en diminuant le paramètre b* de 2,9% dès 21 jours d'application et se prolonge jusqu'à la fin de l'étude. Le paramètre b* représente la gamme des bleus aux jaunes lors des mesures colorimétriques, il est caractéristique de la pigmentation jaune mélanique cutanée. Plus ce paramètre diminue plus la peau s'éclaircit.

[0321] Cet effet est visible chez 68% des volontaires et 79% d'entre eux ont perçu le produit comme un anti-cernes contre seulement 53% pour le traitement placebo.

[0322] Action sur l'éclat du teint du panel caucasien

[0323] Les résultats correspondant à l'effet du principe actif selon l'invention formulé à 2,5% sur les principaux paramètres caractéristiques de l'éclat du teint évalués par experts sur le panel caucasien, est présenté dans le tableau 19 ci-après.

[0324] [Tableauxl9]

[0325] Dès 21 jours d'application biquotidienne et en comparaison au placebo, le principe actif selon l'invention formulé à 2,5% en émulsion : o donne un teint plus lumineux et plus frais en augmentant significativement le rayonnement de la peau de 9% et la couleur rose, de 15%. Effet observé chez respectivement 74% et 84% des volontaires. o diminue significativement la couleur olive de 7% et l'état de fatigue des yeux de 6%. Effet observé chez respectivement 79% et 89% des volontaires

[0326] Cet effet est conforté par l'évaluation des volontaires : 84% à J21 ont trouvé leur peau plus éclatante avec le principe actif selon l'invention contre 63% pour le traitement placebo. [0327] Action anti-rides sur panel asiatique

[0328] Les résultats correspondant à l'effet anti-rides du principe actif selon l'invention étudié par scorage visuel par experts sur des volontaires asiatiques est présenté dans le tableau 20. Un jury composé de 3 personnes a évalué le stade de rides de la patte d'oie de chaque photo sur une échelle de score préalablement définie.

[0329] [Tableaux20]

[0330] Dès 21 jours de traitement, en comparaison au placebo, le principe actif selon l'invention formulé à 2,5% en émulsion présente un effet anti-rides chez des volontaires asiatiques, en diminuant significativement de 6% le stade de rides de la patte d'oie. Cet effet est observé chez 58% des volontaires. Cet effet se prolonge après 42 jours de traitement.

[0331] Conclusion

[0332] Le principe actif selon l'invention formulé à 2,5% en émulsion, apporte des bénéfices cosmétiques dès 21 jours de traitement qui se poursuivent après 42 jours de traitement.

[0333] En effet, le principe actif selon l'invention permet : une amélioration des propriétés biomécaniques de la peau une réduction des rides chez des volontaires caucasiens et asiatiques une amélioration de la vascularisation cutanée, en réduisant les microvaisseaux dystrophiques ainsi que les cernes une amélioration de l'éclat du teint.